一种具有群体感应抑制能力的可可发酵物的制备方法和产品与流程

本发明属于植物发酵技术领域，具体涉及到一种具有群体感应抑制能力的可可发酵物的制备方法和产品。

背景技术：

群体感应现象是指微生物菌群在生长过程中，基于群体密度的增加，演化出不同于单个菌体及少量菌体的生理和生化特性。同种微生物之间可以通过特定的信号分子进行信号传递，当微生物种群密度达到一定的阈值后，信号分子的浓度也达到一定的水平。此时，信号分子水平控制整个微生物种群的特定基因的表达和生理特征的调控，使微生物菌群在复杂的环境中协调一致，提高生存能力。

皮肤是人体最大的外在器官，含有丰富的微生物种类和数量。人体皮肤菌群保持动态平衡，当铜绿假单胞菌、紫色色杆菌、金黄色葡萄球菌、马拉色菌等有害菌大量增殖，使皮肤菌群失衡时，将导致皮肤炎症、痤疮、湿疹等症状。通过群体感应抑制剂，可以破坏有害菌群之间的信号传递，从而打破群体感应能力，使有害菌群的种群优势丧失，恢复皮肤表面原有的菌群平衡。目前对人体皮肤表面菌群的群体感应调控的研究模型主要为抑制紫色色杆菌或铜绿假单胞菌的毒力因子——紫色色素或绿脓毒素的生成。

可可是一种风靡全球的植物原料，主要用于生产巧克力和饮料等食品。由于其富含生物碱、黄酮和多酚类物质，具有优异的抗氧化性和清除自由基的能力，也被用作化妆品原料。根据《已使用化妆品原料名称目录》(2015版)，目前涉及的可可相关的化妆品原料有以下几种：可可果粉、可可壳粉、可可提取物、可可籽提取物和可可籽脂。这些原料在化妆品领域中已有广泛的应用，例如：中国专利202010207343公开了一种可食用天然果蔬可可唇棒及其制备方法；中国专利202010512457.6公开了一种具有抗蓝光功效修护眼霜及其制备方法；中国专利202010021813.4公开了一种含有植物提取物的防老化防蓝光化妆品制备方法。但是，目前化妆品领域中对可可的利用只有两个方面：1.直接利用，如可可果粉、可可壳粉；2.提取加工的产物，如可可提取物、可可籽提取物和可可籽脂。直接利用的方式提高了原料的利用率，但其中功效成分未经富集，含量较低，如可可壳粉中存在的大量纤维素，只能少量应用于化妆品中。而采用提取加工产物的形式可以提高功效成分的浓度，但生产过程需要大量能耗，同时部分过程需要消耗化学溶剂。此外，目前对于可可类原料在调控皮肤菌群群体感应能力方面的研究也尚未有报道。

技术实现要素：

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述和/或现有技术中存在的问题，提出了本发明。

因此，本发明的目的是，补充和完善现有的可可类化妆品原料种类，改进生产工艺，利用植物发酵技术提供一种具有群体感应抑制能力的可可发酵物。

为解决上述技术问题，本发明提供了如下技术方案：一种具有群体感应抑制能力的可可发酵物的制备方法，包括，

将可可豆粉以及植物乳杆菌和酿酒酵母在液体培养基中，共同发酵，得所述可可发酵物；

其中，所述可可发酵物具有调节皮肤表面菌群的作用。

作为本发明所述具有群体感应抑制能力的可可发酵物的制备方法的一种优选方案，其中：所述乳酸杆菌(lactobacilusplantarum)，其保藏编号为cgmccno.21528，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心。

作为本发明所述具有群体感应抑制能力的可可发酵物的制备方法的一种优选方案，其中：所述酿酒酵母为商业来源酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)，资源编号为atcc9080。

作为本发明所述具有群体感应抑制能力的可可发酵物的制备方法的一种优选方案，其中：所述皮肤表面菌群的调节作用，为发酵物具有对紫色色杆菌、铜绿假单胞菌等皮肤表面有害菌的群体感应产生抑制的能力。

作为本发明所述具有群体感应抑制能力的可可发酵物的制备方法的一种优选方案，其中：所述液体培养基按重量份数包括以下组分：大米粉0.1～10份，脱脂奶粉0.1～10份，葡萄糖1～25份。

作为本发明所述具有群体感应抑制能力的可可发酵物的制备方法的一种优选方案，其中：所述液体培养基，按重量份数计，大米粉与脱脂奶粉的比例为1:1.5。

作为本发明所述具有群体感应抑制能力的可可发酵物的制备方法的一种优选方案，其中：所述可可豆粉在发酵培养基中的含量为100g/l。

作为本发明所述具有群体感应抑制能力的可可发酵物的制备方法的一种优选方案，其中：所述植物乳杆菌，其接种量为：种子菌液培养至od600nm＝7～8，按体积分数5％接种；所述酿酒酵母，其接种量为：种子菌液培养至od600nm＝1～3，按体积分数5％接种。

本发明的再一个目的是，提供一种具有群体感应抑制能力的可可发酵物。

本发明的另一个目的是，提供具有群体感应抑制能力的可可发酵物在化妆品中的应用。

本发明有益效果：

(1)本发明可可发酵物生产过程不涉及有机溶剂，产物滤液全部作为产品，污染低，功效成分的生物转化率、获取率和利用率高。

(2)本发明通过本发明提供的混菌发酵，可可发酵物具备对有害菌的群体感应进行抑制的能力，可用于调节皮肤表面菌群的平衡，拓展了可可类原料的应用领域，提高了产品附加值。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1为本发明可可未发酵物、可可发酵物与无可可发酵物对紫色色素清除效果的对比图。从左至右分别为：可可未发酵物、可可发酵物、无可可发酵物、水。

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

本发明中乳酸杆菌(lactobacilusplantarum)，于2020年12月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmccno.21528。

本发明实验方法：

紫色杆菌素含量的测定：

将紫色色杆菌在营养肉汤培养基中，37℃摇床培养48h，用营养肉汤培养基稀释菌悬液至吸光度值为0.1(od600nm)。取2ml菌悬液加入12ml摇菌管中，并加入可可发酵物，使发酵物终浓度为0.5％。随后，将摇菌管置于37℃，140rpm摇床培养24h。

24h后，将菌悬液于10000rpm离心5min，弃去培养基，加入1mldmso，涡旋10min溶解紫色素。待紫色色素溶解后，再次离心5min以沉淀细菌，取上清液测定od580nm。并按下式计算紫色色素的抑制率。

紫色杆菌素生成抑制率(％)＝(1-odsample,580nm/odcontrol,580)×100

绿脓菌素含量的测定：

将铜绿假单胞菌在胰酪胨培养基中，37℃摇床培养48h，用绿脓菌素测定培养基稀释菌悬液至吸光度值为0.1(od600nm)。取2ml菌悬液加入12ml摇菌管中，并加入可可发酵物，使发酵物终浓度为0.5％。随后，将摇菌管置于37℃，140rpm摇床培养24h。

24h后，将菌悬液于10000rpm离心5min，收集上清液。向上清液中加入1ml氯仿，涡旋后静置分层，取氯仿层。向氯仿相中加400μl0.2mol/l盐酸溶液，待出现淡红色后，测定od520nm。并按下式计算绿脓菌素的抑制率。

绿脓菌素生成抑制率(％)＝(1-odsample,520nm/odcontrol,520)×100

本发明培养基：

植物乳杆菌培养基(mrs培养基)(g/l):

蛋白胨10.0，牛肉膏10.0，酵母粉5.0，柠檬酸氢二铵2.0，葡萄糖20，吐温801ml，乙酸钠5.0，磷酸氢二钾2.0，硫酸镁0.58，硫酸锰0.25，蒸馏水1.0l，ph6.5，121℃灭菌20min。

酿酒酵母培养基(pda培养基)(g/l)：

马铃薯200g加入1l纯化水，煮沸30min，用纱布过滤浸汁，加入20g葡萄糖，加水定容至1000ml，ph5.0，121℃灭菌20min。

可可发酵培养基：

称取市售可可粉按重量份数1:10与液体培养基混匀；

液体培养基中含特定比例的大米粉、脱脂奶粉和葡萄糖，调节ph5.5，121℃灭菌20min后作为可可发酵培养基。

实施例1：

植物乳杆菌发酵可可的筛选过程：

在筛选过程中，9种菌来自于江苏瑞霆生物科技有限公司自建菌种库，分别在植物乳杆菌培养基中增菌培养，再接种至可可发酵培养基中。

可可发酵培养基(g/l)：

可可粉100，大米粉4，脱脂奶粉4，葡萄糖12，纯水1.0l，ph5.5，121℃灭菌20min。

发酵过程：将植物乳杆菌增菌培养至od600nm＝7～8，随后按体积份数10％(即20ml)，接种至200ml可可发酵培养基中，用摇瓶在37℃、220rpm恒温培养摇床中培养24h。发酵结束的发酵液在121℃灭菌20min。发酵液分别通过200目滤袋和0.2μm微滤膜过滤，滤液即为可可发酵物。

测定可可发酵物对紫色色杆菌紫色色素和铜绿假单胞菌绿脓菌素的抑制能力。根据测试结果，筛选出一系列植物乳杆菌的可可发酵物中，具有最佳群体感应抑制能力的菌株。

筛选结果如表1所示：

表1植物乳杆菌和酿酒酵母单独发酵的可可发酵物的群体感应抑制能力

优选lp-2、lp-6，其中，lp-6来自于江苏瑞霆生物科技有限公司自建菌种库，并保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为：cgmccno.21528。

实施例2：

酿酒酵母发酵可可的筛选过程：

在筛选过程中，8种来自于江苏瑞霆生物科技有限公司自建菌种库，1种为商业来源酿酒酵母saccharomycescerevisiae(atcc8090)，分别在酿酒酵母培养基中增菌培养，再接种至可可发酵培养基中。

可可发酵培养基(g/l)：

可可粉100，大米粉4，脱脂奶粉4，葡萄糖12，纯水1.0l，ph5.5，121℃灭菌20min。

发酵过程：将酿酒酵母增菌培养至od600nm＝1～3，随后按体积份数10％(即20ml)，接种至200ml可可发酵培养基中200ml可可发酵培养基中，用摇瓶在30℃、220rpm恒温培养摇床中培养24h。发酵结束的发酵液在121℃灭菌20min。发酵液分别通过200目滤袋和0.2μm微滤膜过滤，滤液即为可可发酵物。

测定可可发酵物对紫色色杆菌紫色色素和铜绿假单胞菌绿脓菌素的抑制能力。根据测试结果，筛选出一系列酿酒酵母的可可发酵物中，具有最佳群体感应抑制能力的菌株。

筛选结果如表1所示：

优选sc-5、sc-7和sc-9，其中，sc-5为商业来源酿酒酵母saccharomycescerevisiae(atcc9080)。

实施例3：

植物乳杆菌和酿酒酵母共同发酵可可的筛选过程：

采用实施例1和实施例2中筛选得到的最佳植物乳杆菌和酿酒酵母，组合后再接种至可可发酵培养基中进行共同发酵。

可可发酵培养基(g/l)：

可可粉100，大米粉4，脱脂奶粉4，葡萄糖12，纯水1.0l，ph5.5，121℃灭菌20min。

发酵过程：将植物乳杆菌增菌培养至od600nm＝7～8，将酿酒酵母增菌培养至od600nm＝1～3，随后分别按体积份数5％(即各10ml)，共同接种至200ml可可发酵培养基中，用摇瓶在30℃、220rpm恒温培养摇床中培养24h。发酵结束的发酵液在121℃灭菌20min。发酵液分别通过200目滤袋和0.2μm微滤膜过滤，滤液即为可可发酵物。

测定可可发酵物对紫色色杆菌紫色色素和铜绿假单胞菌绿脓菌素的抑制能力。根据测试结果，筛选出具有最佳群体感应抑制能力的菌株组合。

筛选结果如表2所示：

通过比较抑制率，可以发现可可发酵物的群体感应抑制能力在菌种组合为lp-6&sc-5时，对紫色色杆菌紫色色素和铜绿假单胞菌绿脓毒素的抑制能力最强。其中，lp-6保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为：cgmccno.21528；sc-5，为商业来源酿酒酵母saccharomycescerevisiae(atcc9080)。

表2植物乳杆菌和酿酒酵母共同发酵的可可发酵物的群体感应抑制能力

实施例4：

可可发酵培养基的优化过程：

采用实施例3中筛选得到的菌种最佳组合，接种至可可发酵培养基中进行共同发酵，对可可发酵培养基中的大米粉和脱脂奶粉比例进行优化。

可可发酵培养基(g/l)：

可可粉100，大米粉0.1～10，脱脂奶粉0.1～10，葡萄糖12，纯水1.0l，ph5.5，121℃灭菌20min。其中大米粉与脱脂奶粉的比例分别为：1:0.1，1:0.5，1:1，1:1.5，1:2，加入总量保持为8g/l。

发酵过程：将增菌培养的lp-6和sc-5按实施例3的方法共同接种至200ml可可发酵培养基中，用摇瓶在30℃、220rpm恒温培养摇床中培养24h。发酵结束的发酵液在121℃灭菌20min。发酵液分别通过200目滤袋和0.2μm微滤膜过滤，滤液即为可可发酵物。

测定可可发酵物对紫色色杆菌紫色色素和铜绿假单胞菌绿脓菌素的抑制能力。根据测试结果，筛选出具有最佳群体感应抑制能力的培养基组合。

筛选结果如表3所示：

通过比较抑制率，可以发现可可发酵物的群体感应抑制能力随培养基中脱脂奶粉的比例提高而增强，但当比例超过1:1.5之后，虽然抑制能力仍有提升，但提升幅度不大，结合发酵成本考虑，优选大米粉和脱脂奶粉的比例为1:1.5。

表3大米粉和脱脂奶粉对可可发酵物的群体感应抑制能力的影响

实施例5：

可可未发酵物、可可发酵物与无可可发酵物对紫色色素清除效果的对比可可未发酵物配制方法：

称取可可粉100g，大米粉3.2g，脱脂奶粉6.4g，葡萄糖12g，分散于纯水1.0l中，调节ph5.5，随后121℃灭菌20min。产物分别通过200目滤袋和0.2μm微滤膜过滤，滤液即为可可发未酵物。

可可发酵物配制方法：

称取可可粉100g，大米粉3.2g，脱脂奶粉6.4g，葡萄糖12g，分散于纯水1.0l中，调节ph5.5，随后121℃灭菌20min。将增菌培养的lp-6和sc-5按实施例3的方法共同接种至200ml可可发酵培养基中，用摇瓶在30℃、220rpm恒温培养摇床中培养24h。发酵结束的发酵液在121℃灭菌20min。发酵液分别通过200目滤袋和0.2μm微滤膜过滤，滤液即为可可发酵物。

无可可发酵物配制方法：

称取大米粉3.2g，脱脂奶粉6.4g，葡萄糖12g，分散于纯水1.0l中，调节ph5.5，随后121℃灭菌20min。将增菌培养的lp-6和sc-5按实施例3的方法共同接种至200ml可可发酵培养基中，用摇瓶在30℃、220rpm恒温培养摇床中培养24h。发酵结束的发酵液在121℃灭菌20min。发酵液分别通过200目滤袋和0.2μm微滤膜过滤，滤液即为无可可发酵物。

对紫色色素清除效果的对比试验：

将牛肉膏-蛋白胨培养基(牛肉膏5g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂20g，水1l)在121℃灭菌20min。降温至60℃时，加入1ml溶有紫色色素的dmso溶液，使紫色色素在培养基中的含量为0.01％。随后，趁热浇注平板，凝固后备用。

用5mm打孔器将定性滤纸裁剪为直径5mm的纸片，纸片经121℃灭菌20min处理。将纸片贴于上述固体培养基表面，随后在不同的纸片中心分别滴加10μl可可未发酵物、可可发酵物与无可可发酵物。在37℃下静置24h后观察纸片周围紫色色素的消失情况。结果如图1所示，显然可可未发酵物和无可可发酵物对紫色色素有一定的清除作用，而可可发酵物具有最大的紫色色素溶解环，效果优于可可未发酵物和无可可发酵物的叠加。

本发明所述的可可发酵物生产过程不涉及有机溶剂，产物滤液全部作为产品，污染低，功效成分的生物转化率、获取率和利用率高，具有良好的群体感应抑制能力。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。