用于促进结缔组织中弹性蛋白和胶原蛋白生物合成的组合物的制作方法

发明背景

发明领域

本发明涉及用于促进弹性蛋白和/或胶原蛋白的生物合成的组合物，更具体地涉及包含甘氨酸、l-脯氨酸和二价金属离子的用于促进弹性蛋白或胶原蛋白的生物合成的组合物。

相关技术的描述

弹性蛋白是这样的蛋白质，其与胶原一起存在于结缔组织中，并且具有像橡胶一样的弹性，并且涉及组织柔韧性和弹性，即使在被拉伸或收缩之后，由于这些性质也能够恢复到其原始形状，并且在皮肤弹性、防止皱纹、血管的收缩和舒张、肺的收缩和舒张等方面发挥重要作用。

弹性蛋白纤维由弹性蛋白和原纤蛋白(fibrillin)组成，所述弹性蛋白和原纤蛋白(tropoelastins)由诸如甘氨酸、缬氨酸、丙氨酸、脯氨酸等简单氨基酸组成。弹性蛋白是通过多种原弹性蛋白之间的结合产生的。构成弹性蛋白的氨基酸是疏水性氨基酸,包括诸如甘氨酸和脯氨酸等氨基酸。这些氨基酸与赖氨酸残基交联，形成可自由移动的疏水区域。

成纤维细胞、内皮细胞、平滑肌细胞和软骨细胞负责体内弹性蛋白的生物合成。弹性蛋白可被拉伸至其长度的7倍，恢复至其原始尺寸模量而没有显著的分子变形，并且理论上可无限地重复这种拉伸和恢复。

同时，胶原蛋白是主要的组织形成蛋白，其填充动物体内各种结缔组织的细胞外区域。胶原蛋白也是最丰富的蛋白质，在哺乳动物中占所有蛋白质的25％至35％。根据矿化程度的不同，胶原可以像骨一样硬，可以像腱一样柔韧，或者可以像软骨一样从硬变化至柔韧。胶原呈非常长的原纤维形式，通常存在于诸如肌腱、韧带和皮肤等纤维组织中，也存在于角膜、软骨、骨骼、血管、消化道、椎间盘和牙齿的牙本质中。胶原是肌肉组织中肌内膜的主要组分。胶原占肌肉组织的1-2％，占有许多肌腱的强壮肌肉的6％。成纤维细胞是机体内最常见的细胞，产生并分泌胶原蛋白。

皮肤老化和光老化会导致皮肤表面出现皱纹，位于真皮组织远端部分(网状真皮)的弹性蛋白纤维网络减少，导致皮肤整体弹性明显丧失，最终降低皮肤结缔组织适应机械拉伸的能力，导致组织松垂和皮肤弹性丧失。

编码作为弹性蛋白前体的蛋白质原弹性蛋白的基因(eln基因)编码各种形式的原弹性蛋白，并且该基因开始在胎儿期表达，并且在生命的前5年期间保持活性，然后其活性迅速减慢并停止(bashir,mm等人，j.biol.chem.264:8887,1989)。也就是说，结缔组织，特别是真皮、粘膜、软骨组织、血管内膜、肺和瓣膜/心肌结缔组织的弹性成分(elasticelement)的合成在生命的早期阶段停止。除了发生严重组织损伤诸如烧伤或严重光老化的情况外，不发生补充，并且这种情况涉及例如lox(赖氨酸氧化酶)基因的过表达，所述基因编码催化原弹性蛋白前体分子中赖氨酸残基氧化的五种不同酶，并且这种表达是功能性弹性蛋白合成和随后将其引入粘附于细胞表面的微纤维所需的阶段。特别是，酶依赖性过程由赖氨酸氧化以及同时在l-lys的氨基和醛糖之间形成交联的分子内键而形成的席夫碱组成(maki等人，am.j.pathol.167:927,2005)。弹性蛋白是唯一几乎不可替代的结缔组织蛋白，在70多年内保持不变(平均半衰期为74年)。

同时，i型胶原蛋白是占人胶原蛋白比例最大的胶原蛋白，是存在于诸如皮肤、血管、器官和骨骼等各个部位的蛋白质，在组织细胞外基质(ecm)以及维持结缔组织结构和功能方面发挥重要作用。i型胶原蛋白缺乏与人皮肤的营养作用和弹性的丧失密切相关，特别是在皮肤衰老和光老化所特有的皮肤变性现象中。

已知某些氨基酸和寡肽可促进基因表达，当适当地递送和局部或口服施用时，导致真皮和表皮结缔组织，特别是胶原和原弹性蛋白的生物合成(lupomp等人，cosmeceuticalpeptides.dermatol.ther.20:343,2007)，并且已公开了使用包含以适当的比例混合的甘氨酸、脯氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和赖氨酸盐酸盐的氨基酸混合物的局部或口服组合物，但没有公开促进胶原蛋白和弹性蛋白的合成(参见wo2016/088078a、ep2033689a和wo2007/048522a等)。

因此，作为开发包含能够促进弹性蛋白和胶原蛋白的生物合成的最佳氨基酸的组合物的广泛努力的结果，本发明人发现，当用包含甘氨酸、脯氨酸和二价金属离子的组合物处理成纤维细胞时，弹性蛋白和i型胶蛋白原的表达水平得以升高。基于该发现完成了本发明。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供促进弹性蛋白或胶原蛋白的生物合成的组合物。

根据本发明的一个方面，上述和其它目的可通过提供用于促进弹性蛋白或胶原蛋白的生物合成的组合物来实现，所述组合物包含甘氨酸、l-脯氨酸和二价金属离子，其中甘氨酸与l-脯氨酸的含量比为1:0.9至1:1.1。

根据本发明的另一方面，提供了包含所述组合物的用于促进弹性蛋白或胶原蛋白的生物合成的药物组合物。

根据本发明的另一方面，提供了包含所述组合物的用于促进弹性蛋白或胶原蛋白的生物合成的功能性化妆品组合物。

根据本发明的另一方面，提供了用于预防肌肉骨骼疾病的美容产品或健康功能食品，其包含用于促进弹性蛋白或胶原蛋白的生物合成的组合物作为活性成分。

根据本发明的另一方面，提供了用于促进弹性蛋白或胶原蛋白的生物合成的方法，其包括施用所述组合物。

根据本发明的另一方面，提供了所述组合物用于增强弹性蛋白或胶原蛋白生物合成的用途。

根据本发明的另一方面，提供了所述组合物在制备用于促进弹性蛋白或胶原蛋白生物合成的药物方面的用途。

附图简述

通过下面结合附图的详细描述，将更清楚地理解本发明的上述和其它目的、特征和其它有利方面，其中：

图1显示了证实根据本发明的组合物生长成纤维细胞(hs27细胞)的能力的结果。

图2显示了证实在用根据本发明的组合物处理后，成纤维细胞中col1a2、eln和col4a1基因表达水平变化的qpcr结果。

图3显示了证实在用根据本发明的组合物处理成纤维细胞后，其中i型胶原蛋白和弹性蛋白的生产性能的westernblot结果。

具体实施方式

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员所理解的相同的含义。通常，本文所用的命名法是本领域公知的，并且按常规使用。

为了增强作为真皮组织的组分的胶原蛋白和弹性蛋白的生物合成，已知当某些氨基酸和寡肽被适当地转运和被局部或口服施用时，引起真皮和表皮结缔组织，特别是胶原蛋白和原弹性蛋白的生物合成的基因表达会被促进。然而，关于能够促进成纤维细胞中胶原蛋白和弹性蛋白的产生的最佳氨基酸组合以及支持其的矿物质组合物的研究不足。在本发明中，发现含有甘氨酸、l-脯氨酸和二价金属离子的组合物增强成纤维细胞中胶原蛋白和弹性蛋白的生物合成所涉及的基因的表达，并促进成纤维细胞中胶原蛋白和弹性蛋白的产生。

一方面，本发明涉及包含甘氨酸、l-脯氨酸和二价金属离子的用于促进弹性蛋白或胶原蛋白的生物合成的组合物，其中甘氨酸与l-脯氨酸的含量比为1:0.9至1:1.1。

在本发明中，甘氨酸与l-脯氨酸的含量比优选地为1:0.9至1:1.1，更优选地为1:0.95至1:1.05，最优选地为1:0.99至1:1.01。

本发明的组合物还可包含一种或多种选自下周的氨基酸：l-丙氨酸、l-缬氨酸、l-亮氨酸和l-赖氨酸盐酸盐，并且各氨基酸与甘氨酸的以重量计的含量比优选地为如下：

-l-丙氨酸：0.40至0.90，

-l-缬氨酸：0.30至0.80，

-l-亮氨酸：0.10至0.30，

-l-赖氨酸盐酸盐：0.10至0.25；

更优选地，

-l-丙氨酸：0.60至0.85，

-l-缬氨酸：0.40至0.75，

-l-亮氨酸：0.15至0.25，

-赖氨酸盐酸盐：0.12至0.20；以及

最优选地，

-l-丙氨酸：0.70至0.80，

-l-缬氨酸：0.55至0.70,

-l-亮氨酸：0.18至0.23，

-l-赖氨酸盐酸盐：0.14至0.18。

本发明的组合物还可包含基于总氨基酸组合物的0.1重量％至30.0重量％，优选地0.5重量％至25.0重量％，更优选地1.0重量％至20重量％的l-半胱氨酸或n-乙酰基-l-半胱氨酸。

根据本发明的组合物可具有1至700g/l、优选地5至650g/l、更优选地10至600g/l、最优选地15至500g/l的总氨基酸含量，但不限于此。

在本发明中，二价金属可选自下组：铜(cu)、钴(co)、钙(ca)、镁(mg)、锰(mn)和锌(zn)。基于金属离子，相对于总组合物，二价金属离子可以以0.001重量％至5.0重量％、优选地0.003重量％至4.5重量％、最优选地0.005重量％至4.0重量％的量存在，但不限于此。

优选地，根据本发明的组合物中存在的二价金属离子是铜。铜本身可以作为铜金属存在，但优选地以铜盐化合物或其水合物的形式存在，更优选地以硫酸铜水合物的形式存在，最优选地以五水硫酸铜的形式存在，但不限于此。

在本发明的组合物中使用的铜(cu)是必需的微量矿物质，其作为包括酶在内的各种蛋白质的一部分存在于体内，同时与铁一样，两种价态的元素(cu⁺和cu²⁺⁾之间发生转化。铜参与线粒体中电子转运系统的最后过程中atp的产生，并且铜与超氧化物歧化酶(sod)结合，因此具有防止对细胞氧化损伤的抗氧化功能，并且除此之外还具有在皮肤中与锰和酪氨酸(氨基酸)一起沉积黑色素的功能。

在本发明的一个实施方案中，当用含有甘氨酸、l-脯氨酸和铜的组合物处理成纤维细胞(hs27细胞)并通过qpcr检测作为参与i型胶原蛋白生物合成的基因的col1a2基因、作为参与弹性蛋白生物合成的基因的eln基因和col4a1基因的表达水平的变化时，发现col1a2基因和eln基因的表达增加(见图2)。

在本发明的另一个实施方案中，用含有甘氨酸、l-脯氨酸和铜的组合物处理成纤维细胞(hs27细胞)，并通过蛋白质印迹(westernblot)检测i型胶原蛋白和弹性蛋白的产生变化。结果，发现i型胶原蛋白和弹性蛋白的产生能力增加(见图3)。

另一方面，本发明涉及包含所述组合物的用于促进弹性蛋白或胶原蛋白的生物合成的药物组合物。

本发明的药物组合物可用于预防或治疗弹性蛋白相关疾病、由血管弹性降低和血液循环减少引起的高血压、肌腱和韧带弹性降低、关节弹性降低、光老化引起的弹性纤维化、表皮萎缩、真皮萎缩性皮肤病、烧伤、辐射烧伤、皮肤损伤、褥疮、药物施用引起的真皮再生障碍或肌肉和关节损伤，但不限于此。

另外，本发明的药物组合物可用于通过诱导弹性蛋白和/或胶原蛋白来改善血管弹性，以及通过所述方式来治疗疾病或改善健康状况。

本发明的药物组合物可以配制成口服施用、肌内注射、经皮注射、外敷药物或者注射或外敷医疗装置。

根据本发明的药物组合物还以总组合物的0.01重量％至3重量％的量包含平均分子量为500,000至3,000,000da的透明质酸或其盐，特别是透明质酸或其盐，优选地透明质酸钠盐。

含有上述氨基酸和透明质酸或其盐的混合物的组合物适合以口服施用、肌内注射、经皮注射、外用药物或医疗装置的形式使用，并且可以配制成适合于此的形式并使用。

可使用的制剂的非限制性实例包括注射剂、凝胶剂、软膏剂、乳剂、透皮贴剂、无菌溶液、填充剂、伤口包衣剂和设计成用透明质酸或其盐的无菌水溶液复原的氨基酸粉末。

通过将粉末形式的氨基酸溶解在透明质酸或其盐的无菌溶液中，优选地通过将透明质酸或其盐，优选地透明质酸钠凝胶直接引入到装有粉末的小瓶中(例如，使用皮肤移植注射器)，制备用于注射的制剂。完全溶解后，将所得凝胶溶液注射到真皮部位。透明质酸或其盐的无菌水溶液可含有ph调节缓冲剂(例如磷酸盐缓冲剂)或渗透压调节剂(例如氯化钠)和其它技术佐剂，这可以确保无菌可注射药物制剂所需的物理化学和组织相容性。

另一方面，本发明涉及化妆品组合物，特别是功能性化妆品组合物，其包含根据本发明的用于促进弹性蛋白或胶原蛋白的生物合成的组合物。

根据本发明的功能性化妆品组合物可用于改善皮肤弹性和去除皱纹和/或面纹，但不限于此。

根据其使用目的和功能，本发明的化妆品组合物可以配制成各种形式，诸如溶液(洗剂型组合物)、浓缩液、凝胶、软膏、乳液(霜剂、乳液)、囊泡分散体、粉剂、致密粉末、糊剂或固体，并且可以作为功能性化妆品提供。

具体地，包含根据本发明的化妆品组合物的化妆品包括所有产品，包括霜剂诸如面霜、护手霜、保湿霜和防晒霜、溶液或浓缩液、洗剂、霜粉、粉底、微乳液、软膏、糊剂、包(packs)和喷雾剂，但不限于此。

当本发明的组合物用于改善弹性和去除皱纹和面纹，以及作为保湿剂时，用于这些应用的组合物优选地以乳剂诸如霜剂、凝胶剂、洗剂、软膏剂或囊泡分散体的形式提供，并且还可包括其它药物或功能活性成分。

所述功能性化妆品组合物可含有改性或未改性的植物油或动物油。这些油的实例包括甜杏仁油、鳄梨油、蓖麻油、橄榄油、霍霍巴油、葵花籽油、小麦粉油、芝麻油、花生油、葡萄籽油、豆奶、红花油、椰子油、玉米油、榛子油、乳油木黄油(karitebutter)、棕榈油、杏仁油、轻粉油(calophyllumoil)或全氢化角鲨烯。此外，油相可以是无机油诸如液体石蜡或液体凡士林。油可以是脂肪酸酯诸如肉豆蔻酸异丙酯、棕榈酸异丙酯、棕榈酸2-乙基己酯、青霉素油(辛酸硬脂酸酯)、不饱和脂肪酸诸如油酸、棕榈酸、硬脂酸、山嵛酸、亚油酸和亚麻酸，或者挥发性或非挥发性异链烷烃诸如脂肪酸或c8-c16异链烷烃。油可以是c12-c18脂肪醇，诸如油醇、十六醇或硬脂醇。

当组合物以乳液形式提供时，本发明的乳化组合物包含油相和水相。基于组合物的总重量，油相优选地以约1重量％至约75重量％，更优选地约5重量％至约60重量％，最优选地约40重量％至约60重量％的范围提供。

水相含有常用于水性凝胶和化妆品乳液的佐剂。水相可以以约0.5重量％至约20重量％的量提供，并且可包含低级c2-c6一元醇和/或多元醇，诸如甘油、丁二醇、异戊二烯二醇、丙二醇、乙二醇等。

乳化剂可用于制备乳化化妆品组合物。化妆品可接受的乳化剂可以以任何量使用，只要其表现出所需的乳化效果。乳化剂选自已知的盐和表面活性剂。乳化剂优选地选自硬脂酸、山梨糖醇酐倍半油酸酯(sorbitansesquioleate)、聚乙二醇(peg-30)、二聚羟基硬脂酸酯、卵磷脂、硬脂酸镁及其衍生物和混合物。基于组合物的总重量，乳化剂优选地以约0.5重量％至约30重量％，更优选地约1重量％至约12重量％，更优选地约4重量％至约8重量％的范围提供。

另一方面，本发明涉及包含根据本发明的用于促进弹性蛋白或胶原蛋白的生物合成的组合物作为活性成分的健康功能性食品。

根据本发明的功能性食品可用于皮肤健康、改善血液循环、血压控制或者预防和治疗肌肉骨骼疾病，包括关节疾病，特别是改善皮肤弹性、去除皱纹、去除面纹、缓解高血压、改善血液循环、改善腱和韧带的弹性、改善关节弹性，以及预防或治疗由于光老化引起的弹性纤维化、真皮表皮萎缩、真皮萎缩性皮肤病、烧伤、辐射烧伤、皮肤损伤、褥疮和由药物施用引起的皮肤再生障碍或肌肉和关节损伤，以及优选地用于美容应用或关节疾病预防。

另外，本发明的功能性食品可用于各种应用，包括用于防止氧化的药物、食品和饮料。本发明的功能性食品可以用作例如各种食品、糖果、巧克力、饮料、树胶、茶、维生素复合物、健康补充剂等，并且可以以粉剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂或饮料的形式使用。

本发明的组合物包括各种营养物、维生素、矿物质(电解质)、调味剂诸如合成调味剂和天然调味剂、着色剂和填充剂(干酪、巧克力等)、果胶酸及其盐、藻酸及其盐，以及有机酸、保护胶体增稠剂、ph调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇、碳酸饮料中使用的碳酸化剂等。另外，本发明的组合物可含有用于生产天然果汁、果汁饮料和蔬菜饮料的果肉。这些成分可以单独使用，也可以联合使用。

另一方面，本发明涉及用于促进弹性蛋白或胶原蛋白的生物合成的方法，包括施用所述组合物。

另一方面，本发明涉及所述组合物用于增强弹性蛋白或胶原蛋白生物合成的用途。

另一方面，本发明涉及所述组合物在制备用于促进弹性蛋白或胶原蛋白生物合成的药物方面的用途。

实施例

在下文中，将参考实施例更详细地描述本发明。然而，对于本领域技术人员显而易见的是，提供这些实施例仅用于说明本发明，而不应被解释为限制本发明的范围。

实施例1根据本发明的组合物对成纤维细胞的毒性的证实

如下表1所示制备根据本发明的组合物，并测定表1的组合物对成纤维细胞的细胞毒性。

本文所用的成纤维细胞是人来源的成纤维细胞hs27(atcc,#crl1634)，将细胞在含有10％fbs(胎牛血清)和1％青霉素-链霉素的dmem(dulbecco's改良eagle培养基)中进行培养。

将以1000μg/10μl的剂量制备的药物稀释于含有1％青霉素-链霉素的无血清dmem培养基中以用于细胞处理。

[表1]

将1x10⁵个hs27细胞接种于48孔板中并培养24小时。24小时后，用上述制备的药物处理细胞。为了观察细胞毒性，在24小时、48小时和72小时后使用ez-cytox(dogenbio，korea)试剂盒测量细胞存活率。处理与kit中含有的活细胞中存在的酶反应的水溶性四唑鎓盐(wst)，测量450nm处的吸光度，并计算细胞存活率。

结果，如图1所示，与仅用溶剂处理的nc组相比，发现用d、el1、el11和el12处理的细胞即使在24小时、48小时或72小时后也不显示细胞毒性。发现用el4处理的细胞在24小时或48小时后没有表现出毒性，但是其细胞存活率在72小时后略微降低。

实施例2用根据本发明的组合物处理时col1a2、col4a1和eln基因表达水平的测定

测定了根据本发明组合物的处理的hs27细胞中参与胶原蛋白和弹性蛋白生物合成的基因的表达水平的变化。

将5x10⁶个hs27细胞接种于100π培养皿中并培养24小时。24小时后，用制备的组合物(d、el1、el11和el12)处理细胞。72小时后使用trizol提取rna以测定基因表达水平。使用cdna逆转录酶将1μg从每个样品提取的rna合成cdna，并使用实时pcr检测系统(bioradcfxconnect)检测col1a2、eln、col4a1和actb基因的表达水平。为鉴定各基因，使用表2的引物，并使用actb(β-肌动蛋白)作为内部对照计算相对表达水平。

[表2]

用于检测基因表达水平的引物序列

结果，如图2所示，与仅用溶剂处理的nc组相比，发现在用组合物d、el1和el12处理的细胞中col1a2基因和eln基因的表达水平在72小时后没有显著变化，并且发现在用el4和el11处理的细胞组中col1a2基因和eln基因的表达水平在72小时后显著增加。另外，与col1a2基因和eln基因不同，发现在所有组合物处理条件下，col4a1基因的表达水平没有变化。

实施例3在用根据本发明的组合物处理时，col1a2、col4a1、eln的蛋白质产生能力的确认

检测了用本发明的组合物处理后hs27细胞中产生胶原蛋白和弹性蛋白的能力的变化。

将5x106个hs27细胞接种于100π培养皿中并培养24小时。24小时后，用制备的组合物(d、el1、el11和el12)处理细胞。为了检测蛋白表达水平，72小时后，使用蛋白裂解缓冲液(cellsignaling,#9803)提取蛋白。通过以下方法对每种蛋白进行蛋白质印迹，以鉴定i型胶原蛋白、弹性蛋白和β-肌动蛋白。

i型胶原蛋白：在自然环境(非变性条件)下进行蛋白质印迹，测定i型胶原蛋白的蛋白质表达水平。通过在天然样品缓冲液(biorad,#1610738)中稀释30μg提取的蛋白质来制备样品。

使用不含sds的8％丙烯酰胺凝胶和罐缓冲液(tankbuffer)(tris-甘氨酸缓冲液)进行电泳，将凝胶上分离的蛋白质转移到pvdf膜上，然后用脱脂乳封闭2小时。然后，使用抗i型胶原抗体(abcam，ab34710)将蛋白在4℃静置过夜，然后与二抗反应1小时。使用ecl溶液和amersham成像仪600成像系统检测抗体反应。

弹性蛋白和β-肌动蛋白：在一般蛋白质印迹环境(非天然和变性条件)下进行蛋白质印迹，以检测弹性蛋白和β-肌动蛋白的蛋白质表达水平。通过将30μg提取的蛋白质稀释在4xlaemmli样品缓冲液(biorad,#1610747)中来制备样品。使用含sds的10％丙烯酰胺凝胶和罐缓冲液(tris-甘氨酸缓冲液)进行电泳。然后，将凝胶上分离的蛋白转移到pvdf膜上，用脱脂乳封闭2小时。然后，使用抗弹性蛋白抗体(santacruz,sc-166543)和抗β-肌动蛋白抗体(santacruz，sc-47778)将蛋白在4℃静置过夜，然后与二抗反应1小时。使用ecl溶液和amersham成像仪600成像系统检测抗体反应。

结果，如图3所示，与用溶剂处理的nc组相比，发现用d、el1和el12组合物处理的细胞在72小时后显示i型胶原蛋白的蛋白质表达水平升高。弹性蛋白在d和el1处理组中没有变化，但在el4、el11和el12组合物处理组中显著增加。

工业可用性

根据本发明的组合物可增强成纤维细胞的弹性蛋白和胶原蛋白的生物合成，因此可用于恢复由于老化或暴露于光而退化的皮肤弹性和用于去除皱纹和面纹。

尽管已经详细描述了本发明的具体配置，但本领域技术人员将理解，提供该描述是为了阐述用于说明目的的优选地实施方案，并且不应当被解释为限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围由所附权利要求书及其等同物限定。

序列表

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