用美氟芬治疗AL淀粉样变性的制作方法

用美氟芬治疗al淀粉样变性
技术领域
1.本发明涉及免疫球蛋白轻链(al)淀粉样变性的治疗和/或预防。本发明还涉及在治疗和/或预防al淀粉样变性中发现效用的剂量方案和试剂盒。


背景技术：

2.免疫球蛋白轻链(al)淀粉样变性是一种由淀粉样原纤维积聚引起的衰弱性终末期疾病。在al淀粉样变性中，淀粉样原纤维由异常骨髓浆细胞产生的聚集免疫球蛋白轻链形成。淀粉样原纤维在重要器官中的积累可导致进行性器官衰竭。根据器官受累的程度，患有al淀粉样变性的患者的预期寿命可显著缩短。例如，患有严重心肌病的al淀粉样变性患者的预期寿命可从几年到不到6个月不等(jaccard等人2007年，《新英格兰医学杂志(n engl j med)》,357(11),1083-93)。
3.目前可用的al淀粉样变性治疗基于抗骨髓瘤疗法，该疗法可减少或消除异常骨髓浆细胞，从而减少由聚集的免疫球蛋白轻链形成的淀粉样原纤维的形成。al淀粉样变性的一线治疗是美法仑(melphalan)，它通常与类固醇联合使用。例如，美法仑(例如，20-25mg/m2体表面积)与泼尼松龙(prednisolone)联合施用已被证明可降低浆细胞水平并增加几个月的存活率(kyle等人，1997年，《新英格兰医学杂志》,336(17),1202-7和skinner等人，1996年，《新英格兰医学杂志》,100(3),290-298)。后来的研究还报告，标准剂量的美法仑联合地塞米松(dexamethasone)对al淀粉样变性的治疗也是有效的(palladini等人，2004年，《血液学(blood)》,103(8),2936-8，lebovic等人，2008年，《英国血液学杂志(br j haematol)》,143(3),369-73和dietrich等人，2010年，《血液学》,116(4),522-8)。
[0004]“高剂量”美法仑(例如，200mg/m2的体表面积)联合自体造血干细胞拯救也显示出治疗al淀粉样变性的前景(jaccard等人，2007年)。高剂量的美法仑用于消融患者的浆细胞水平，然后通过造血干细胞移植恢复浆细胞水平。这种治疗的一个主要问题是显著的治疗相关毒性和较高的治疗相关死亡率(wechalekar等人，2015年，《英国血液学杂志》,168(2),186-206)。
[0005]
对al淀粉样变性的治疗前景良好的其他疗法包括蛋白酶抑制剂硼替佐米(bortezomib)和免疫调节药物沙利度胺(thalidomide)和来那度胺(lenalidomide)(wechalekar等人，2015年)。
[0006]
目前可用的治疗方法的一个主要局限性是，在治疗后的许多月内，临床益处不会出现。此外，al淀粉样变性患者经常经历基于美法仑的疗法的显著治疗相关毒性。al淀粉样变性患者的毒性增加意味着在使用足够高的剂量为患者提供临床益处的同时避免使用具有不可忍受的毒副作用的剂量之间存在折衷。因此，非常需要更有效的治疗方法。特别是，需要安全的治疗方法，为al淀粉样变性患者提供临床益处，同时也显示出可控的副作用。


技术实现要素：

[0007]
本发明提供用于治疗和/或预防免疫球蛋白轻链(al)淀粉样变性的美氟芬
(melflufen)及其盐。
[0008]
本发明还提供治疗和/或预防al淀粉样变性的方法，包括向患有al淀粉样变性的患者或有发展为al淀粉样变性风险的患者施用美氟芬或其盐的步骤。
[0009]
本发明人已经发现，美氟芬及其盐对于治疗和预防al淀粉样变性具有惊人的效果。特别是，本发明人已经发现，在使用从患有该疾病的患者获得的浆细胞的体外al淀粉样变性细胞模型中，美氟芬具有高度细胞毒性。本发明人假设，美氟芬惊人的高效力将允许使用比现有al淀粉样变性治疗更安全和更有效的治疗有效剂量。
[0010]
因此，美氟芬提供一种新的治疗方法，比现有的al淀粉样变性治疗方法更有效、更安全。
[0011]
在本发明的优选实施方案中，美氟芬或其盐以约15mg至150mg(不包括任何抗衡离子的质量)的剂量施用，优选以35mg至45mg(不包括任何抗衡离子的质量)的剂量施用。优选地，美氟芬或其盐与类固醇(例如选自泼尼松、泼尼松龙和地塞米松)同时、依次或单独施用。优选地，美氟芬或其盐与地塞米松同时、依次或单独施用。
[0012]
本发明的剂量和剂量方案特别耐受良好，并且它们在治疗和/或预防al淀粉样变性方面有效。
[0013]
本发明还提供美氟芬或其盐在制造用于治疗和/或预防al淀粉样变性的药物中的用途。
[0014]
本发明另外提供一种试剂盒，其包含美氟芬和例如选自泼尼松、泼尼松龙和地塞米松的类固醇。优选地，类固醇为地塞米松。本发明的试剂盒可用于治疗和/或预防al淀粉样变性。
附图说明
[0015]
图1显示了用美氟芬治疗后骨髓单个核细胞样本(al-2983、al-4847、al-5691、al-5807和al-400081)中浆细胞(cd138
+
细胞)的存活率百分比。
[0016]
图2显示了用美氟芬(mf)或美法仑(mp)治疗后骨髓单个核细胞样本al-5691、al-4847、al-2983和al-5807中浆细胞(cd138+细胞)的存活率百分比。
[0017]
图3显示了三种产生轻链的浆细胞系(jjn3、almc-1和almc-2)中美氟芬介导和美法仑介导的敏感性。
[0018]
图4显示了在三种产生轻链的浆细胞系(jjn3、almc-1和almc-2)中，美氟芬介导和美法仑介导的κ或λ轻链分泌减少。
[0019]
图5a显示了用不同浓度的美氟芬或美法仑治疗后4个细胞系(mm.is、rpmi-8826、u266和almc-2)中凋亡细胞的百分比(*p《0.5，**p《0.01，***p《0.001)。
[0020]
图5b显示了用不同浓度的美氟芬或美法仑治疗12小时后，通过pcr的在4个细胞系(mm.is、rpmi-8826、u266和almc-2)中进行xbp-1剪接的结果。
[0021]
图5c显示了用不同浓度的美氟芬或美法仑治疗后多个时间点(6小时、12小时和24小时)的upr和凋亡标志物免疫印迹(蛋白质印迹法)分析结果。
[0022]
图6a显示了肿瘤接种后第9天和第16天施用荧光素后5只小鼠的体内生物发光成像。
[0023]
图6b显示了在肿瘤接种后第6、9、13和16天的5只小鼠腹侧、背侧或平均腹侧和背
侧测量的荧光素酶(lucerifase)辐射水平(每秒光子数(p/s))。
具体实施方式
[0024]
本发明的发明人已经发现，美氟芬对于治疗和/或预防al淀粉样变性具有惊人的效果。
[0025]
al淀粉样变性的特征在于免疫球蛋白轻链聚集形成淀粉样原纤维。淀粉样原纤维在重要器官中的积累导致器官衰竭。根据器官受累的程度，al淀粉样变性患者的预期寿命可显著缩短。
[0026]
由于与治疗相关的高毒性和低应答率，目前可用的al淀粉样变性治疗的疗效有限。al淀粉样变性病的一线治疗方法是美法仑。已经描述了使用美法仑的各种治疗方案。例如，标准剂量的美法仑(例如，10-20mg/m2的体表面积)与泼尼松龙或地塞米松联合施用，以及高剂量的美法仑(例如，200mg/m2的体表面积)与自体造血干细胞拯救(jaccard等人，2007年和wechalekar等人，2015年)联合施用。这些治疗的一个主要限制是与治疗相关的毒性水平高和不良反应率低。
[0027]
如下文更详细论述的，本发明人惊奇地发现，在体外al淀粉样变性细胞模型中，美氟芬具有高度的细胞毒性。在从al淀粉样变性患者群体中获得的细胞样本中，观察到了低至1nm的美氟芬的ec
50
值。与现有治疗方法相比，美氟芬惊人的高效力有望允许使用更安全和更有效的治疗和/或预防al淀粉样变性的治疗有效剂量。
[0028]
值得注意的是，发明人发现，在体外al淀粉样变性细胞模型中，美氟芬的细胞毒性至少是美法仑的100倍。
[0029]
美氟芬及其盐
[0030]
美氟芬(也称为美法仑氟苯酰胺和l-美法仑基-4-氟-l-苯丙氨酸乙酯)是一种用于治疗癌症，特别是治疗多发性骨髓瘤的抗肿瘤剂。例如，从wo 01/96367和wo 2014/065751中已知美氟芬及其盐，尤其是其盐酸盐。美氟芬盐酸盐的结构如下所示：
[0031][0032]
为免生疑问，在本文件中，除非另有说明，否则当使用术语“美氟芬”时，它包括美氟芬的同位素衍生物。
[0033]
此外，为免生疑问，当本文件中提及时，除非另有明确说明，否则美氟芬的质量是美氟芬分子的质量，不包括任何抗衡离子的质量。
[0034]
适于在本发明中使用的美氟芬的盐是其中抗衡离子为药学上可接受的盐。合适的盐包括那些与有机酸或无机酸形成的盐。具体而言，根据本发明的与酸形成的合适的盐包括与无机酸、强有机羧酸，如1-4个碳原子的未取代或被例如卤素取代的链烷羧酸，如饱和或不饱和二羧酸，如羟基羧酸，如氨基酸，或与有机磺酸，如未取代或被例如卤素取代的(c
1-c4)烷基或芳基磺酸形成的盐。药学上可接受的酸加成盐包括由盐酸、氢溴酸、硫酸、硝
酸、柠檬酸，酒石酸、乙酸、磷酸、乳酸，丙酮酸、乙酸、三氟乙酸、琥珀酸、高氯酸、富马酸、马来酸、乙醇酸、乳酸、水杨酸、草酸、草酰乙酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、萘-2-磺酸、苯磺酸、羟乙磺酸、抗坏血酸、苹果酸、邻苯二甲酸、天冬氨酸和谷氨酸、赖氨酸和精氨酸形成的那些。
[0035]
美氟芬的优选盐包括酸加成盐，诸如由盐酸、氢溴酸、乙酸、对甲苯磺酸、酒石酸、硫酸、琥珀酸、磷酸、草酸、硝酸、甲磺酸、苹果酸、马来酸和柠檬酸形成的酸加成盐。更优选地，根据本发明使用的美氟芬盐是盐酸盐(即，由盐酸形成的加成盐)。
[0036]
有机化学领域的技术人员将认识到，许多有机化合物可与溶剂形成络合物，它们在该溶剂中反应或从该溶剂中沉淀或结晶。这些络合物被称为“溶剂化物”。例如，与水的络合物被称为“水合物”。该络合物可按化学计量或非化学计量的量掺入溶剂。溶剂化物描述于《水不溶性药品配制物(water-insoluble drug formulation)》，第2版，r.lui编，crc出版社(crc press)，第553页和byrn等人的《药物研究(pharm res)》12(7)，1995，945-954中。在溶液制造之前，用于本发明的美氟芬或其盐可呈溶剂化物的形式。根据本发明的适合使用的美氟芬的溶剂化物为其中相关联的溶剂为药学上可接受的溶剂化物。例如，水合物为药学上可接受的溶剂化物。
[0037]
制剂
[0038]
尽管美氟芬及其盐可单独施用，但优选其存在于制剂中，特别是药物制剂中。药物制剂包括适用于口服、肠胃外(包括皮下、皮内、骨内输注、肌肉内、血管内(团注或输注)和髓内)、腹腔内、跨粘膜、经皮、直肠和局部(包括皮肤、口腔、舌下和眼内)施用的那些，尽管最合适的途径可取决于例如接受治疗的受试者的病状和疾病。
[0039]
在本发明的一个实施方案中，美氟芬作为适于口服或肠胃外(包括皮下、皮内、骨内输注、肌肉内、血管内(团注或输注)和髓内)施用的药物制剂施用。
[0040]
适于口服施用的美氟芬的药物制剂可呈现为离散单元，诸如胶囊、扁囊剂或片剂，每一种均含有预定量的活性成分；呈现为粉末或颗粒；呈现为水性液体或非水性液体中的溶液或悬浮液；或者呈现为水包油液体乳液或油包水液体乳液。美氟芬也可呈现为丸剂、冲剂或膏剂的形式。各种药学上可接受的载体及其制剂在标准制剂论文中有所描述，例如，e.w.martin的《雷明顿制药科学(remington's pharmaceutical sciences)》。另见wang,y.j.和hanson,m.a.，《胃肠胃外科学和技术杂志(journal of parenteral science and technology)》，第10号技术报告，补编42:2s,1988。
[0041]
用于肠胃外施用的制剂包括水性和非水性无菌注射溶液，其中可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和溶质，使制剂与预期受体的血液等渗；以及水性和非水性无菌悬浮液，其可包括悬浮剂和增稠剂。优选地，制剂可按单位剂量或分剂量容器呈现，例如密封安瓿和小瓶。制剂可在冷冻干燥(冻干)条件下储存，仅需在使用前添加无菌液体载体，例如盐水、生理上可接受的溶液或注射用水。
[0042]
即时注射和输注溶液和悬浮液可由无菌粉末、颗粒或其他干燥组合物制备。用于肠胃外施用的示例性组合物包括可注射溶液或悬浮液，其可含有例如合适的无毒、肠胃外可接受的稀释剂或溶剂，诸如甘露醇、1,3-丁二醇、水、林格溶液、等渗氯化钠溶液，或其他合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂，包括合成的甘油一酯或甘油二酯，以及脂肪酸，包括油酸或cremaphor。
[0043]
在本发明的优选实施方案中，用于本发明的美氟芬包括美氟芬或其盐的冻干药物配制物。术语“美氟芬或其盐的冻干药物配制物”应理解为意指将美氟芬或其盐冻干(“冻干(lyophilization)”、“冻干(lyophilized)”等在本文中可与“冻干(freeze-drying)”、“冻干(freeze-dried)”等)互换使用)。如本文所述的美氟芬或其盐的冻干药物配制物可为白色蓬松粉末，与非冻干的美氟芬或其药学上可接受的盐形成对比，后者通常是致密的微黄色粉末的形式。
[0044]
用于本发明的美氟芬或其盐的冻干药物配制物可包含选自以下各项的至少一种赋形剂：聚山梨酯；聚乙二醇；β-环糊精；α-环糊精；羟丙基-β-环糊精；磺丁基醚-3-环糊精；乳糖；苯甲醇；琥珀酸二钠；丙二醇；聚氧乙烯蓖麻油；二甲基亚砜；d-甘露醇；海藻糖；蔗糖和氨基酸(特别是选自包含β-环糊精；α-环糊精；羟丙基-β-环糊精；磺丁基醚-3-环糊精；海藻糖；和蔗糖的赋形剂)。
[0045]
在一个实施方案中，用于本发明的美氟芬或其盐的冻干药物配制物可包含蔗糖。蔗糖的加入提供一种冻干配制物，其本身是稳定的，并且是水溶性的，不存在有机溶剂，与降解速率相比具有足够的速率，因此在治疗中是有用的，并且没有有机溶剂带来的毒性。由于在蔗糖存在下冷冻干燥后，美氟芬或其盐的溶解度和/或溶解速率增加，因此可制备溶解的美氟芬或其盐溶液，诸如包含美氟芬或其盐的药物组合物，其具有有用的高浓度美氟芬且基本上不含有机溶剂。
[0046]
在wo 2012/146625和wo 2014/065741中详细描述了美氟芬或其盐的冻干药物配制物、冻干药物组合物和用于制备这种组合物的试剂盒的制备，其内容通过引用并入本文。
[0047]
用于本发明的美氟芬或其盐的药物制剂可包含含有美氟芬或其盐的冻干药物配制物。在某些实施方案中，该制剂包含蔗糖。例如，该制剂包含蔗糖，其美氟芬与蔗糖之间的重量比(w/w)约为1:25至1:75，例如1:50。
[0048]
在制剂是药物溶液的情况下，它可由包含美氟芬或其盐的5-冻干药物配制物制备，并且另外包含生理上可接受的溶剂，诸如葡萄糖溶液和/或盐溶液。
[0049]
应当理解，除了上述特别提到的成分之外，考虑到所论述的制剂的类型，本发明中所使用的制剂可包括本领域中常规的其他制剂。
[0050]
剂量方案
[0051]
美氟芬或其盐以及包含美氟芬的药物制剂可用于治疗和/或预防al淀粉样变性。
[0052]
根据gertz等人，《美国放射学杂志(am j hematol)》,2004.79,319-328中提出的指南，可评估美氟芬及其盐在治疗和预防al淀粉样变性中的有效性。积极临床反应的特征可能是已知受淀粉样原纤维影响的器官功能的改善。对治疗的积极反应也可表现为对治疗的血液学反应。积极血液学反应可定义为患者血清或尿液样本中免疫球蛋白或轻链减少或完全消失。美氟芬及其盐可有效地对患有al淀粉样变性或有发展成al淀粉样变性风险的患者产生积极的临床反应。
[0053]
达到治疗效果所需的美氟芬的量将随着特定的施用途径和接受治疗的受试者的特征而变化，例如物种、年龄、体重、性别、医疗条件、特定疾病及其严重程度，以及其他相关医疗和身体因素。普通熟练的医师可很容易地确定和施用治疗和/或预防al淀粉样变性所需的有效剂量的美氟芬。
[0054]
根据待治疗的受试者和al淀粉样变性的严重程度，美氟芬可每天、每两天或每三
天、每周、每两周、每三周或每四周或甚至以高的单剂量施用。
[0055]
在本发明的一个实施方案中，美氟芬或其盐可按约15mg至150mg(不包括任何抗衡离子的质量)的量施用。例如，15、20、25、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140或150mg(不包括任何抗衡离子的质量)。优选地，每次施用的美氟芬或其盐的剂量为25mg至75mg(不包括任何抗衡离子的质量)。更优选地，每次施用的美氟芬或其盐的剂量为35mg至45mg(不包括任何抗衡离子的质量)。在另一优选实施方案中，每次施用的美氟芬或其盐的剂量为20mg至40mg(不包括任何抗衡离子的质量)，例如20、30或40mg。在另一优选实施方案中，每次施用的美氟芬或其盐的剂量为15mg至35mg(不包括任何抗衡离子的质量)，且更优选20mg至30mg，例如20、25或30mg。
[0056]
在另一优选实施方案中，每次施用的美氟芬或其盐的剂量为15mg至25mg(不包括任何抗衡离子的质量)，例如20mg。在另一优选实施方案中，每次施用的美氟芬或其盐的剂量为25mg至35mg(不包括任何抗衡离子的质量)，例如30mg。
[0057]
在本发明的另一个实施方案中，美氟芬或其盐可按单次高剂量施用。单次高剂量可能约为150mg至800mg。例如，单次剂量为150、200、300、400、500、600、700和800mg(不包括任何抗衡离子的质量)。
[0058]
在本发明的另一实施方案中，美氟芬或其盐与造血干细胞拯救一起使用。在此类实施方案中，美氟芬或其盐可按单次高剂量施用。单次高剂量可为约150mg至800mg。例如，150、200、300、400、500、600、700和800mg。
[0059]
美氟芬或其盐可作为肠胃外或口服剂量施用。在本发明的优选实施方案中，将美氟芬或其盐作为肠胃外剂量施用。因此，适于根据本发明使用的药物制剂是适于肠胃外施用的制剂。
[0060]
肠胃外施用包括静脉注射(进入静脉，例如中央静脉或外周静脉、团注或输注)、动脉内注射(进入动脉，例如中央动脉或外周动脉)、骨内输注(进入骨髓)、肌肉内注射(进入肌肉)、皮内注射(进入真皮)和皮下注射(皮肤下)施用。优选地，本发明的剂量经静脉或动脉内施用，且更优选通过静脉输注(例如，中央静脉输注或外周静脉输注)施用。因此，对本发明特别有用的药物制剂是那些适合于静脉施用的制剂，更特别是静脉输注的药物制剂。
[0061]
在本发明的一个实施方案中，以约1.0至1.8毫克/分钟(例如1.0至1.7毫克/分钟、1.0至1.6毫克/分钟、1.2至1.6毫克/分钟、1.2至1.5毫克/分钟、1.2至1.4毫克/分钟(例如1.2、1.3或1.4毫克/分钟))的输注速率将美氟芬的剂量(不包括任何抗衡离子的质量)作为肠胃外剂量施用。
[0062]
在本发明的优选实施方案中，约35mg至45mg的美氟芬剂量(不包括抗衡离子的质量)在约25-35分钟内作为肠胃外剂量施用。优选地，40mg的美氟芬剂量(不包括抗衡离子的质量)在约30分钟内作为肠胃外剂量施用。
[0063]
在本发明的另一个实施方案中，约15至25mg的美氟芬剂量(不包括抗衡离子的质量)在约8-25分钟、优选11至18分钟内作为肠胃外剂量施用。优选地，20mg的美氟芬剂量(不包括抗衡离子的质量)在约15分钟内作为肠胃外剂量施用。
[0064]
在本发明的另一个实施方案中，约25-35mg的美氟芬剂量(不包括抗衡离子的质量)在约16-35分钟(优选18-25分钟)内作为肠胃外剂量施用。优选地，30mg的美氟芬剂量(不包括抗衡离子的质量)在约22分钟内作为肠胃外剂量施用。
[0065]
在本发明的另一个实施方案中，约20至40mg的美氟芬剂量(不包括抗衡离子的质量)在约25-35分钟内作为肠胃外剂量施用。优选地，将20、30或40mg的美氟芬剂量(不包括抗衡离子的质量)在约30分钟内作为肠胃外剂量施用。
[0066]
在本发明的另一个实施方案中，约15至25mg的美氟芬剂量(不包括抗衡离子的质量)在约25至35分钟、优选11至18分钟内作为肠胃外剂量施用。优选地，20mg的美氟芬剂量(不包括抗衡离子的质量)在约30分钟内作为肠胃外剂量施用。
[0067]
在本发明的另一实施方案中，约25至35mg的美氟芬剂量(不包括抗衡离子的质量)在约25至35分钟、优选18至25分钟内作为肠胃外剂量施用。优选地，30mg的美氟芬剂量(不包括抗衡离子的质量)在约30分钟内作为肠胃外剂量施用。
[0068]
关于用于本发明的美氟芬的剂量，当提及美氟芬或其盐的质量时，即在计算美氟芬的剂量质量时不包括抗衡离子时的质量。无抗衡离子的美氟芬的分子量为498.42g/mol。对于美氟芬盐的剂量，施用给患者的实际剂量质量必须考虑抗衡离子的质量。这对于本领域技术人员来说是常规的。
[0069]
例如，当美氟芬以其盐酸(hc1)盐(分子量为534.88g/mol)的形式存在时，美氟芬盐酸盐(包括抗衡离子的质量)的等效剂量率将为1.1至1.9毫克/分钟。对于35至40mg的美氟芬剂量，美氟芬盐酸盐的等效剂量约为37.6至48.3mg。
[0070]
本发明的剂量方案是作为肠胃外剂量施用，因此美氟芬的剂量必须为液体形式，例如包含美氟芬的溶液或悬浮液。
[0071]
优选地，将本发明的美氟芬或其盐作为治疗周期的一部分。在一个周期中，可在周期的第1天施用美氟芬，其中该周期持续x天，在接下来的x-1天内不再施用美氟芬。x可为，例如，14至42天，优选14至35天，更优选21至28天；例如21天或28天。
[0072]
在本发明的优选实施方案中，在21天周期的第1天施用美氟芬或其盐，然后休息20天，在此期间不再施用美氟芬；或在28天周期的第1天施用，然后休息27天，在此期间不再施用美氟芬。优选地，治疗周期为28天。
[0073]
该周期可重复一次或多次，取决于al淀粉样变性的种类、类别或阶段。例如，周期可重复1至15次，例如2至12次，例如2至7次，例如2、3、4，5、6次或更多次。该周期可重复3、4或5次。
[0074]
普通熟练的医师或临床医生可很容易地确定预防、对抗或阻止al淀粉样变性进展所需的美氟芬或其盐的周期数。
[0075]
本发明的剂量方案对于治疗和/或预防al淀粉样变性患者或有发展为al淀粉样变性风险的患者的al淀粉样变性特别安全和有效。
[0076]
尽管美氟芬或其盐可用作本发明中的唯一活性成分，但也可与一种或多种另外的治疗剂组合使用，并且此类组合的使用提供本发明的一个优选实施方案。此类另外的治疗剂可为在治疗和/或预防al淀粉样变性中有用的制剂，或其他药物活性材料。此类制剂为本领域所知。本发明中使用的另外的治疗剂的示例包括类固醇(泼尼松、泼尼松龙和地塞米松)、imid(沙利度胺、来那度胺和泊马度胺(pomalidomide))、pi(硼替佐米、卡非佐米(carfdzomib)和伊沙唑米(ixazomib))、组蛋白脱乙酰酶(hdac)抑制剂(帕比司他(panobinostat))、常规化疗剂(烷基化剂(例如，美法仑、环磷酰胺、苯达莫司汀(bendamustine))、阿霉素)、抗cd38抗体(达雷妥尤单抗(daratumumab))和抗slamf7抗体
(埃罗妥珠单抗(elotuzumab))；例如类固醇(泼尼松和地塞米松)、imid(沙利度胺、来那度胺和泊马度胺)、pi(硼替佐米和卡非佐米)、组蛋白脱乙酰酶(hdac)抑制剂(帕比司他)和常规化疗剂(烷基化剂(例如美法仑、环磷酰胺和阿霉素))。
[0077]
一种或多种另外的治疗剂可与施用剂量的美氟芬或其盐同时、依次或单独使用。此类组合的各个组分可在治疗过程期间的不同时间单独施用，或者以分开或单一组合的形式同时施用。
[0078]
在本发明的一个实施方案中，一种或多种另外的治疗剂中的至少一种是类固醇。例如，泼尼松、泼尼松龙和地塞米松。优选地，一种或多种另外的治疗剂中的至少一种为地塞米松。
[0079]
和美氟芬同时、依次或单独施用类固醇(诸如地塞米松)进一步提高美氟芬治疗al淀粉样变性的疗效。
[0080]
在另外的治疗剂为地塞米松的本发明的实施方案中，优选地塞米松的剂量为1mg至200mg，优选5mg至100mg，更优选10mg至80mg，且最优选20mg至60mg，例如20、30、40、50和60mg。优选地，地塞米松作为口服剂量或静脉剂量施用。更优选地，地塞米松作为口服剂量施用。
[0081]
优选地，地塞米松与美氟芬的施用在同一天施用。例如，地塞米松在同一天与美氟芬同时、依次或单独施用。更优选地，与美氟芬分开并在同一天施用。
[0082]
例如，当在本发明中使用的美氟芬或其盐作为治疗周期的一部分时(例如，在持续x天的周期的第1天施用美氟芬或其盐，在接下来的x-l天不再施用美氟芬)，地塞米松可在施用美氟芬的同一天(即第1天)同时、依次或单独施用。x可为，例如，14至42天，优选14至35天，更优选21至28天；例如21天或28天。
[0083]
在本发明的一个实施方案中，在21天周期的第1天施用美氟芬，并且在周期的第1天同时、依次或单独施用地塞米松，随后休息20天，在此期间不再施用美氟芬；或者在28天周期的第1天施用，并且在周期的第1天同时、依次或单独施用地塞米松，然后休息27天，在此期间不再施用美氟芬。
[0084]
在本发明的一个实施方案中，地塞米松在治疗周期的第1天施用，随后在持续x天的周期(例如持续21天或28天的周期)的第1、2、3、4、5、6、7和/或8天再施用一种或多种另外剂量的地塞米松。
[0085]
在本发明的实施方案中，其中在此类治疗周期期间施用一种或多种另外剂量的地塞米松，另外剂量的地塞米松可独立地为1mg至200mg，例如5mg至100mg，10mg至80mg，以及20mg至60mg(例如20、30、40、50和60mg)。优选地，另外一种或多种剂量的地塞米松作为口服剂量或静脉注射剂量施用。
[0086]
在本发明的一个优选实施方案中，地塞米松在第1天与美氟芬同时、依次或单独施用，随后在持续x天的周期的第2天施用第二单独剂量的地塞米松。例如，在28天周期的第1天施用美氟芬，然后休息27天，在此期间不再施用美氟芬，并且在周期的第1天同时、依次或单独施用地塞米松，随后在28天周期的第2天施用第二单独剂量。
[0087]
例如，在第1天与美氟芬同时、依次或单独施用40mg地塞米松，随后在持续x天的周期第2天施用40mg地塞米松。例如，在28天周期的第1天施用20至40mg(例如，20、30或40mg)美氟芬，然后休息27天，在此期间不再施用美氟芬，并且在周期的第1天同时、依次或单独施
用40mg地塞米松，随后在28天周期的第2天施用第二单独的40mg剂量。
[0088]
该周期可重复一次或多次，取决于al淀粉样变性的种类、类别或阶段。例如，周期可重复1至15次，例如2至12次、1至9次和2至7次(例如2、3、4、5或6次)。
[0089]
普通熟练的医师或临床医生可很容易地确定预防、对抗或阻止al淀粉样变性进展所需的美氟芬或其盐的周期数。
[0090]
试剂盒
[0091]
本发明提供一种试剂盒，其包含美氟芬或其盐，以及一种或多种可用于治疗和/或预防al淀粉样变性的另外的治疗剂。本发明中使用的另外的治疗剂的实例包括类固醇(泼尼松、泼尼松龙和地塞米松)、imid(沙利度胺、来那度胺和泊马度胺)、pi(硼替佐米、卡非佐米和伊沙唑米)、组蛋白脱乙酰酶(hdac)抑制剂(帕比司他)、常规化疗剂(烷基化剂(例如，美法仑、环磷酰胺、苯达莫司汀)、阿霉素)、抗cd38抗体(达雷妥尤单抗)和抗slamf7抗体(埃罗妥珠单抗)；例如类固醇(泼尼松和地塞米松)、imid(沙利度胺、来那度胺和泊马度胺)、pi(硼替佐米和卡非佐米)、组蛋白脱乙酰酶(hdac)抑制剂(帕比司他)和常规化疗剂(烷基化剂(例如美法仑、环磷酰胺和阿霉素))。
[0092]
在本发明的优选实施方案中，包括在本发明试剂盒中的一种或多种另外的治疗剂中的至少一种是类固醇。优选地，该类固醇选自泼尼松、泼尼松龙和地塞米松。更优选地，该类固醇是地塞米松。
[0093]
在本发明的一个实施方案中，本发明的试剂盒可用于治疗和/或预防al淀粉样变性。
[0094]
为免生疑问，美氟芬或其盐以适合于根据本发明使用的形式和数量存在于根据本发明的试剂盒中。本文描述了合适的药物制剂。本领域技术人员可容易地确定适用于根据本发明的用途的美氟芬或其盐的量。
[0095]
al淀粉样变性患者
[0096]
根据本发明使用的美氟芬或其盐可用于治疗可分类为难治性、复发性和难治性复发性al淀粉样变性的al淀粉样变性。
[0097]
复发性al淀粉样变性可定义为在最后一次治疗剂量后复发的al淀粉样变性。难治性al淀粉样变性可定义为对现有治疗无效的al淀粉样变性。难治性复发性al淀粉样变性可定义为最初对治疗有反应，但复发后对治疗无反应的al淀粉样变性。
[0098]
美氟芬或其盐可用于治疗难治性、复发性和/或难治性复发性al淀粉样变性。例如，美氟芬可用于治疗和/或预防既往接受过现有治疗(诸如美法仑、美法仑和地塞米松的单次或重复治疗周期，和/或高剂量美法仑和造血干细胞拯救)的患者中的难治性、复发性和/或难治性复发性al淀粉样变性。
[0099]
因此，在本发明的一个实施方案中，美氟芬或其盐可用于治疗和/或预防难治性、复发性和/或难治性复发性al淀粉样变性患者的免疫球蛋白轻链(al)淀粉样变性。
[0100]
美氟芬或其盐可用于预防已知或怀疑有发展为al淀粉样变性风险的患者的al淀粉样变性。此类患者包括但不限于患有以下疾病的患者：慢性炎症性疾病、遗传性炎症性疾病和慢性微生物感染，例如类风湿性关节炎、青少年慢性关节炎、强直性脊柱炎、银屑病、银屑病性关节病、雷特综合征(reiter's syndrome)、成人斯蒂尔病(adult still's disease)、白塞综合征、克罗恩病、家族性地中海热、麻风病、结核病、支气管扩张、褥疮、慢
性肾盂肾炎、骨髓炎、惠普尔病、骨髓瘤、巨球蛋白血症、免疫细胞缺陷、单克隆丙种球蛋白病、隐匿性缺陷。
[0101]
美氟芬或其盐也可用于治疗被视为“高风险”群体的al淀粉样变性患者组，该患者组可能对现有的al淀粉样变性治疗不耐受或无积极反应。高风险患者包括，例如，总体健康状况和生活质量较差的患者(例如，通过karnofsky评分、lansky评分和/或东部肿瘤协作组(ecog)评分进行测量)、心脏病、水盐潴留、淀粉样蛋白相关自主神经病变和/或肝功能障碍。
[0102]
本发明人假设，美氟芬的惊人高效力将能够有效治疗对现有al淀粉样变性治疗无反应或被认为不适合现有al淀粉样变性治疗的al淀粉样变性患者组，例如，患有难治性和/或复发性al淀粉样变性的患者，以及被归类为“高风险”al淀粉样变性患者的al患者。
[0103]
以下实施例说明本发明。
[0104]
实施例
[0105]
实施例1：美氟芬对源自al淀粉样变性患者的浆细胞的细胞毒性
[0106]
材料和方法
[0107]
患者来源的单核细胞
[0108]
11例淀粉样变性患者的存活冷冻骨髓单个核细胞(mnc)源自生物库。
[0109]
细胞培养和分析条件
[0110]
将存活冷冻的细胞解冻并培养过夜，以排除凋亡细胞。第1天，在rpmi 1640培养基(lonza)中制备2
×
106细胞/毫升密度的均质细胞悬浮液，该培养基补充有10％胎牛血清、2mm l-谷氨酰胺、青霉素(100u/ml)、链霉素(100μg/ml)和来自hs-5人bm基质细胞系的25％条件培养基。美氟芬粉末以预先称重的量储存在无氧和无水分储存舱的小瓶中。在dmso中制备新鲜的10mm美氟芬等分试样。在细胞培养基中制备系列稀释液，并且立即转移到含有单核细胞的96孔板中。
[0111]
多路高通量流式细胞术
[0112]
应用了基于多路高通量流式细胞仪的分析(screener plus)，允许同时监测多个造血细胞亚群中的药物反应。购买了一组针对cd8、cd14、cd19、cd38、cd45、cd56、cd138和cd269的八种抗体。annexin-v和7-aad被纳入分析，以排除死亡或凋亡细胞。确定最佳抗体浓度并计算荧光补偿，以校正不同荧光色素之间的光谱重叠。含有美氟芬处理的细胞的平板在37℃和5％co2的增湿环境中孵育。72小时后，将抗体混合物添加到孔中并孵育30分钟，然后使用screener plus仪器读取平板。使用forecyt软件(intellicyt)对数据进行分析。graphpad prism 7.0生成剂量响应图。使用dna染色染料7-aad和膜联蛋白-v表面抗原的表达，对单重态单核细胞进行死亡和凋亡细胞排除。每个细胞群的活细胞计数用于分析不同剂量对细胞活力的影响。存活细胞分数通过用每个细胞亚群的未处理细胞的活力归一化来计算。
[0113]
在超过100000倍稀释液(1至100000nm)的六种浓度下测试美氟芬。在测试的12个细胞样本中，有两个样本因生活力差而被排除。存活的样本被指定参考号为al-1886、al-2983、al-4839_2、al-4839_3、al-4847、al-5691、al-5716、al-5807、al-7219、al-400081。
[0114]
样本al-2983、al-4847、al-5691、al-5807和al-400081的浆细胞(cd138+细胞)显
示出对美氟芬的敏感性(图1)。值得注意的是，观察到al-5807的ec
50
为1nm，观察到al-2983的ec
50
为7nm，观察到al-4847的ec
50
为32nm。样本al-1886、al-4839_2、al-4839_3、al-5716和al-7219的浆细胞对美氟芬无明显反应。出于比较目的，对每个细胞样本进行相同浓度的美法仑测试。与美法仑相比，美氟芬的细胞毒性高100倍(图2)。
[0115]
实施例2：淀粉样变性患者来源的轻链分泌细胞系对美氟芬或美法仑的细胞毒性反应
[0116]
在淀粉样变性患者来源的轻链分泌almc-1和almc-2细胞系以及轻链分泌细胞系jjn3中，测定了对美氟芬或美法仑的细胞毒性反应。
[0117]
将细胞以96孔的形式在37℃下以0.014至10mm的剂量在指示化合物的存在下接种72小时。细胞活力通过celltiter-bluetm使用制造商的标准方案测定。elisa法测定细胞上清液中λ和κ轻链分泌。
[0118]
更详细地说，对于每个细胞系(jjn3、almc-1和almc-2)，收集细胞，洗涤，重新悬浮到完全生长培养基中并计数。用于每个细胞系的生长培养基如下表1所示。将细胞以下表1所示的细胞密度接种到96孔分析板(corning，黑壁板，cat#3904)的内部60孔中，每孔等分50μl。将板在37℃下在5％增湿co2中孵育过夜。使用10mm的美法仑或美氟芬-hc1原液，通过稀释原液从10mm的美法仑或美氟芬-hcl原液制备亚等分试样。将将稀释的原液以实验中指定的浓度(0.014至10mm)添加到细胞培养基中。
[0119]
将每孔50微升化合物/载体稀释液以3次重复的方式添加到板中，并在37℃下在5％增湿co2中孵育72小时。为了在72小时后显色板，向每个测试/空白孔中加入20μl的celltiter-bluetm试剂。将板在37℃下在5％增湿co2下孵育1.5/3小时。使用varioskan闪光板读取器(570nm激发波长，600nm发射波长)测量荧光。
[0120]
对于分泌蛋白的分析，孵育72小时后，通过在300rcf、4℃条件下离心5分钟使细胞沉淀，取上清液并立即使用商业elisa试剂盒(如下)和制造商的方案进行elisa分析：
[0121]
人κelisa(bethyl laboratories，#e80-115)
[0122]
人λelisa(bethyl laboratories，#e80-116)
[0123]
表1：
[0124]
[0125][0126]
结果：
[0127]
图3显示了3种产生轻链的浆细胞系中美氟芬介导和美法仑介导的敏感性。下表2显示了3种产生轻链的浆细胞系中每种细胞系中的美氟芬和美法仑的ic
50
值。图4显示了在3种产生轻链的浆细胞系中，美氟芬介导的和美法仑介导的轻链分泌减少。下表3显示了almc-1和almc-2细胞系中美氟芬和美法仑的人λelisa结果。下表4显示了jjn3细胞系中美氟芬和美法仑的人κelisa结果。
[0128]
从图3和表2可看出，与美法仑相比，所有3种轻链分泌细胞系(jjn3、almc-1和almc-2)测试均显示出对美氟芬的敏感性增加。从图4和表3和表4中可看出，与美法仑相比，在所有3种轻链分泌细胞系中，melfulfen还表现出对轻链分泌的优异抑制作用。因此，结果表明，与美法仑相比，美氟芬在淀粉样变性浆细胞系中表现出更好的功效，浆细胞死亡增加，轻链分泌减少。
[0129]
表2：
[0130] almc-1ic
50
(μm)almc-2 ic
50
(μm)jjn3 ic
50
(μm)美法仑
‑‑
5.4美氟芬1.61.21.2
[0131]
表3：
[0132] almc-1ic
50
(μm)almc-2ic
50
(μm)美法仑2.55.1美氟芬0.200.45
[0133]
表4：
[0134] jjn3 ic
50
(μm)
美法仑-美氟芬2.9
[0135]
实施例3：美氟芬对细胞凋亡和未折叠蛋白反应(upr)标志物的影响
[0136]
在恶性细胞系(包括rpmi-8826、almc-2、mm1s和u266)中比较了美氟芬和美法仑的毒性作用，以证实美氟芬比美法仑的毒性增强。almc-2细胞来源于淀粉样变性患者。mm.1s、rpmi-8826、u266或almc-2细胞在存在或不存在图5a所示浓度的美氟芬-hcl或美法仑的情况下孵育6小时、12小时或24小时。然后收集细胞，通过基于流式细胞术的膜联蛋白v/碘化丙啶和活/死细胞染色，以及通过蛋白质印迹法分析切割的半胱氨酸蛋白酶(caspases)3、8和9以及parp，测定美氟芬和美法仑对细胞凋亡和细胞死亡的反应。通过使用商用检测试剂和标准方案进行免疫印迹分析，对包括磷酸化eif2a、atf4、irela和perk在内的upr相关分子进行分析，并且通过使用基因特异性引物组的实时qpcr对atf4、atf6、perk、ire1和chop进行分析，检测美氟芬和美法仑对upr的影响。此外，通过pcr分析评估xbp-1剪接。
[0137]
结果：
[0138]
流式细胞术对膜联蛋白v/碘化丙锭的分析结果如图5a所示(早期凋亡细胞对膜联蛋白v呈阳性，晚期凋亡细胞对两者均呈阳性)，pcr对xbp-1剪接的结果如图5b所示，并且多个时间点(6小时、12小时和24小时)的upr和蛋白质印迹对凋亡标志物的免疫印迹分析结果如图5c所示。
[0139]
从图5a至5c的结果可看出，在诱导凋亡、刺激内质网应激(如xbp-1剪接所示)以及刺激多种upr和凋亡标志物方面，所有受试细胞系对美氟芬的敏感性明显高于美法仑。因此，这些结果表明，与美法仑相比，美氟芬对细胞凋亡具有显著的影响，诱导凋亡和upr标志物增加。
[0140]
实施例4：人浆细胞瘤异种移植小鼠研究，以测试美氟芬在淀粉样变性模型中的疗效
[0141]
建立异种移植模型，评估美氟芬治疗淀粉样变性的疗效。如上文实施例3的结果所示，体外对美氟芬敏感的轻链分泌人骨髓瘤细胞系jjn3用荧光素酶转导并过继转移到nsg小鼠中。该模型用于分析美氟芬对淀粉样浆细胞毒性(通过体内生物发光测定)和血清b细胞成熟抗原(bcma)和轻链水平的体内效应。
[0142]
异种移植模型
[0143]
jjn3人骨髓瘤细胞使用标准方案用萤火虫荧光素酶基因稳定转导(brennan等人，《bio protoc.》2018；8(8):e2817)。5只雌性nsg小鼠以每只小鼠1
×
107个细胞的速度接受腹腔内注射所得jjn3-荧光素酶细胞的细胞悬浮液。经验丰富的技术人员每天至少观察一次小鼠的外观、行为和临床变化。在研究期间(16天)，每周对小鼠称重三次。通过生物发光成像(bli)每周检查一次或两次肿瘤生长(例如在肿瘤接种后第6、9、13和16天)。简而言之，在成像前15分钟，给小鼠皮下注射150mg/kg d-荧光素。施用d-荧光素10分钟后，对小鼠进行麻醉并将其放入成像室(光谱ct)中，并且对其进行发光成像(腹侧视图/背侧/左侧，用黑色吸管覆盖尾部；多达5只小鼠按笼子顺序并排放置)。在整个研究过程中，顺序和位置保持不变。图像采集的持续时间和分箱(敏感性)取决于存在的病变强度，并且使用living image软件(caliper ls，us)进行捕获和处理。在肿瘤接种后第9天和第16天，使用商业elisa试剂盒(如下)和制造商的方案分析血清中κ和λ轻链以及bcma的水平：
[0144]
人κelisa(bethyl laboratories，#e80-115)
[0145]
人λelisa(bethyl laboratories，#e80-116)
[0146]
人bcma elisa(r&d systems，#dy193)。
[0147]
结果：
[0148]
图6a显示了肿瘤接种后第9天和第16天对5只小鼠给予荧光素后的体内生物发光成像结果，而图6b显示了每只小鼠肿瘤接种后第6天、第9天、第13天和第16天腹部、背部或平均腹部和背部测量的荧光素酶辐射水平(每秒光子数(p/s))。下表5显示了在肿瘤接种后一天通过elisa监测的bcma、κ和λ轻链的血清水平，以及通过生物发光成像监测的每只小鼠的肿瘤负荷。
[0149]
从图6a和6b以及表5第3行可看出，在所有接种的小鼠中均可检测到jjn3肿瘤，且肿瘤负荷各不相同。如表5第1行和第2行所示，在3/5小鼠的血清中可检测到bcma和κ轻链，这对应于检测到最大肿瘤负荷的小鼠。这些结果表明，已经建立了使用体外转移对美氟芬敏感的淀粉样变性浆细胞的动物模型，并且可用于分析美氟芬对淀粉样浆细胞毒性和血清bcma和轻链水平的体内效应。
[0150]
表：5
[0151][0152]
使用异种移植模型的疗效研究
[0153]
上述异种移植模型用于评估美氟芬的体内疗效。如上所述，在第0天过继转移jjn3-荧光素酶细胞后，在例如第0、2、4、6、8、10、12和14天对10只nsg小鼠施用美氟芬-hcl。如上文所述，在例如第5、9和13天，通过体内生物发光来测量对美氟芬的反应引起的细胞死亡，并且如上文所述，在例如第7天监测血清轻链。
[0154]
另选地，cb17 nod scid小鼠在气态麻醉下，在用70％乙醇皮肤消毒后，用27号针头将存在于200μl还原matrigel中的1
×
107jjn-3细胞接种于左后侧皮下。肿瘤长度(l)和宽度(w)每周使用电子测径器监测三次。当平均肿瘤体积达到100mm3(使用公式：0.5(l
×
w2)计算)时，将动物随机分为三个治疗组(每组n＝10只小鼠)。随机分组后，将美法仑或美氟芬-hcl溶解在dmso中至6mg/ml的原液浓度，并进一步稀释1:20至实验浓度，以便通过静脉尾静脉施用在磷酸盐缓冲盐水中以每千克体重3mg药物的浓度(与接受美法仑或美氟芬-hcl或媒介物对照的组)施用于动物，并在初始施用后每周重复施用两次，并在整个研究过程中保持。每周对动物进行3次一般行为和身体状况、肿瘤生长和体重变化的监测。如果出现不良临床症状，体重比原始重量减少20％，或者肿瘤体积达到平均直径15mm，则对动物实施安乐死。血样(《50μl)通过隐静脉获得，并且在开始施用后一天、此后每周以及实验结束时处理成血清。使用商业的人κ、λ和bcma elisa试剂盒分析血清样本的轻链浓度，如本文所
述。
[0155]
实施例5：患有al淀粉样变性的患者的治疗
[0156]
临床上有一名患有al淀粉样变性的患者，此前曾接受过大剂量美法仑和自体造血干细胞拯救治疗。该患者未经历al淀粉样变性的明显消退和/或经历al淀粉样变性的复发。患者在治疗第1天服用40mg美氟芬。另选地，患者在治疗的第一天服用20mg或30mg美氟芬。在第1天，患者另外服用40mg或20mg地塞米松。在治疗周期的第2天再次施用20mg或40mg剂量的地塞米松。地塞米松的剂量由临床医生根据患者的特殊特征决定，诸如治疗周期开始时al淀粉样变性的严重程度和其他相关的物理因素。休息27天后，可开始第二个28天的美氟芬/地塞米松治疗周期。根据al淀粉样变性的严重程度，可使用若干个治疗周期。