胰岛素基因疗法

id no:7和9
‑
15，更优选地，所述基因构建体包含microrna
‑
122a的靶序列(seq id no:7)和microrna
‑
1的靶序列(seq id no:8)。
12.在另一个优选的实施方案中，编码胰岛素的核苷酸序列选自由以下组成的组：
13.(a)编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与seq id no:1、2或3的氨基酸序列具有至少60％序列同一性的氨基酸序列；
14.(b)与seq id no:4、5或6的核苷酸序列具有至少60％序列同一性的核苷酸序列；和
15.(c)核苷酸序列，其序列由于遗传密码的简并性而与(b)的核苷酸序列的序列不同。
16.在第二方面，提供了包含根据第一方面的基因构建体的表达载体，用于治疗和/或预防神经炎症、神经变性和/或认知下降、或与其相关的疾病或病症。
17.在优选的实施方案中，表达载体是病毒载体，优选其中所述表达载体是选自由腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体和慢病毒载体的组成的组的病毒载体，更优选腺伴随病毒载体。
18.在优选的实施方案中，表达载体是血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、rh10、rh8、cb4、rh74、dj、2/5、2/1、1/2或anc80的腺伴随病毒载体，优选血清型1、2或9的腺伴随病毒载体，更优选血清型1或9的腺伴随病毒载体。
19.在第三方面，提供了药物组合物，其包含根据第一方面的基因构建体和/或根据第二方面的表达载体以及一种或多种药学上可接受的成分，用于治疗和/或预防神经炎症、神经变性和/或认知下降，或与其相关的疾病或病症。
20.还提供了根据第一方面使用的基因构建体和/或根据第二方面使用的表达载体和/或根据第三方面使用的药物组合物，其中与神经炎症、神经变性和/或认知障碍相关的疾病或病症选自由以下组成的组：认知障碍，痴呆，阿尔茨海默氏病，血管性痴呆，路易体痴呆，额颞叶痴呆(ftd)，帕金森病，帕金森样疾病，帕金森综合征，亨廷顿氏病，创伤性脑损伤，朊病毒病，由于hiv感染引起的痴呆/神经认知问题，由于衰老引起的痴呆/神经认知问题、tau蛋白病、多发性硬化症和其他神经炎症/神经退行性疾病，优选阿尔茨海默氏病、帕金森病和/或帕金森样疾病，更优选阿尔茨海默氏病或帕金森病。
21.在一些实施方案中，基因构建体和/或表达载体和/或药物组合物通过脑脊液内施用来施用。
22.在另一方面，提供了基因构建体，其包含编码胰岛素的核苷酸序列，其中编码胰岛素的核苷酸序列与遍在启动子可操作地连接，并且其中所述基因构建体包含在想要防止胰岛素表达的组织中表达的microrna的至少一个靶序列，优选地，其中microrna的至少一个靶序列选自与在哺乳动物的心脏和/或肝脏中表达的microrna结合的那些靶序列。
23.在优选的实施方案中，基因构建体包含至少一个在肝脏中表达的microrna的靶序列和至少一个在心脏中表达的microrna的靶序列，优选地，在心脏中表达的microrna选自seq id no:8和16
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20，在肝脏中表达的microrna的靶序列选自seq id no:7和9
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15，更优选地，所述基因构建体包含microrna
‑
122a的靶序列(seq id no:7)和microrna
‑
1的靶序列(seq id no:8)。
24.在另一方面，提供了表达载体，其包含如前述方面所定义的基因构建体，优选地，
其中所述表达载体是病毒载体，更优选地，其中所述表达载体是选自由腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体和慢病毒载体组成的组的病毒载体，最优选地其中所述表达载体是腺伴随病毒载体。
25.说明
26.本发明人基于针对中枢神经系统(cns)的胰岛素基因疗法开发了改进的基因疗法策略，以对抗神经炎症、神经变性和/或认知下降。本发明载体的单次脑脊液内施用提供的胰岛素的长期和有效表达代表了优于其他疗法的显著优势。特别地，如实验部分所述，本发明人发现了脑定向胰岛素基因疗法的以下意想不到的优点：
27.·
如本文所述的基因构建体和载体可以在脑，包括下丘脑、皮质、海马、小脑和嗅球(实施例1、2、3、5)中获得稳健和广泛的过度表达。
28.·
在广泛使用的具有与年龄相关的脑病理例如神经炎症的衰老小鼠模型中，使用根据本发明的基因构建体和载体在脑中表达胰岛素导致神经炎症的明显减少、神经发生增加和星形胶质细胞数量增加(实施例1)以及改善短期记忆、长期记忆和学习能力(实施例5)。
29.·
在广泛使用的与神经炎症和认知下降相关的肥胖和糖尿病小鼠模型中，使用根据本发明的基因构建体和载体在脑中表达胰岛素导致神经炎症明显减少和星形胶质细胞数量增加(实施例2)。
30.因此，本文所述的本发明的方面和实施方案解决了本文所述的至少一些问题和需求。
31.基因构建体
32.在第一方面，提供了包含编码胰岛素的核苷酸序列的基因构建体。优选地，如本文所述的基因构建体用作药物。更优选地，如本文所述的基因构建体用于治疗和/或预防神经炎症、神经变性和/或认知下降、或与其相关的疾病或病症。
33.如本文所述的“基因构建体”具有其通常的和普通的含义，如本领域技术人员鉴于本公开所理解的。“基因构建体”也可以称为“表达盒”或“表达构建体”，是指一个基因或一组基因，包括编码目的蛋白的基因，该基因与控制其表达的启动子可操作地连接。本技术的标题为“基本信息”的部分包括关于“基因构建体”的更多详情。如本文所使用的“可操作地连接”在本技术的标题为“基本信息”的部分中进一步描述。
34.在一些实施方案中，如本文所述的基因构建体适合在哺乳动物中表达。如本文所用，“适合在哺乳动物中表达”可以意指基因构建体包括一个或多个调控序列，其基于用于表达的哺乳动物宿主细胞而选择，其可操作地连接至待表达的核苷酸序列。优选地，所述用于表达的哺乳动物宿主细胞是人、鼠或犬细胞。
35.在一些实施方案中，如本文所述的基因构建体包含待在哺乳动物的cns中，优选地在脑中，任选地在cns和/或脑中表达的编码胰岛素的核苷酸序列。在一些实施方案中，如本文所述的基因构建体适合在cns中表达，优选在脑中表达。在一些实施方案中，基因构建体在脑中的表达可以意指基因构建体在下丘脑和/或皮质和/或海马和/或小脑和/或嗅球中的表达。因此，基因构建体在脑中的表达可以意指基因构建体在选自由下丘脑、皮质、海马、小脑和嗅球组成的组的至少一个或至少两个或至少三个或所有脑区域中的表达。如在标题为“基本信息”章节所述，可以使用诸如qpcr、蛋白质印迹分析或elisa等技术评估表达。
36.在本发明的实施方案的上下文中，待在cns和/或脑中表达的胰岛素；以及适合在cns和/或脑中表达的基因构建体，指的是与其他器官或组织相比，优先或主要(至少高10％，至少高20％，至少高30％，至少高40％，至少高50％，至少高60％，至少高70％，至少高80％，至少高90％，至少高100％，至少高150％，至少高两倍，至少高三倍，至少高四倍，至少高五倍，至少高六倍，至少高七倍，至少高八倍，至少高九倍，至少高十倍或更多)在中枢神经系统和/或脑中表达胰岛素。其他器官或组织可以是肝脏、胰腺、脂肪组织、骨骼肌、心脏、肾脏、结肠、造血组织、肺、卵巢、脾脏、胃、睾丸等。优选地，其他器官是肝脏和/或心脏。其他器官也可能是骨骼肌。在实施方案中，在肝脏、胰腺、脂肪组织、骨骼肌、心脏、肾脏、结肠、造血组织、肺、卵巢、脾脏、胃和/或睾丸中检测不到表达。在优选的实施方案中，在肝脏和/或心脏中检测不到表达。在另一个优选的实施方案中，在骨骼肌中检测不到表达。在一些实施方案中，在选自由肝脏、胰腺、脂肪组织、骨骼肌、心脏、肾脏、结肠、造血组织、肺、卵巢、脾脏、胃、和睾丸组成的组的至少一个，至少两个，至少三个，至少四个或所有器官中检测不到表达。如在标题为“基本信息”章节所述，可以使用诸如qpcr、蛋白质印迹分析或elisa等技术评估表达。
37.在一些实施方案中，编码胰岛素的核苷酸序列与遍在启动子可操作地连接。
38.在一些实施方案中，如本文所述的遍在启动子选自由cag启动子、cmv启动子、迷你cmv启动子、β
‑
肌动蛋白启动子、劳斯肉瘤病毒(rsv)启动子、延伸因子1α(ef1α)启动子、早期生长反应因子1(egr
‑
1)启动子、真核起始因子4a(elf4a)启动子、铁蛋白重链编码基因(ferh)启动子、铁蛋白轻链编码基因(ferl)启动子、甘油醛
‑3‑
磷酸脱氢酶(gapdh)启动子、grp78启动子、grp94启动子、热休克蛋白70(hsp70)启动子、泛素b启动子、sv40启动子、β
‑
驱动蛋白启动子、rosa26启动子和pgk
‑
1启动子组成的组。
39.在优选的实施方案中，遍在启动子选自由cag启动子和cmv启动子组成的组。在优选的实施方案中，遍在启动子是cag启动子。在实施例中证明cag启动子适合用于根据本发明的基因构建体。
40.在一些实施方案中，cag启动子包含，基本上由或由与seq id no:22具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性的核苷酸序列组成。在一些实施方案中，可以相对于seq id no:22的一部分，例如seq id no:22的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％，评估同一性。
41.另一个优选的遍在启动子是巨细胞病毒(cmv)启动子。在一些实施方案中，cmv启动子包含，基本上由或由与seq id no:23具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性的核苷酸序列组成。在一些实施方案中，可以相
对于seq id no:23的一部分，例如seq id no:23的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％评估同一性。
42.优选地，所述cmv启动子与内含子序列一起使用。在一些实施方案中，内含子序列包含，基本上由或由与seq id no:21具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性的核苷酸序列组成。在一些实施方案中，可以相对于seq id no:21的一部分，例如seq id no:21的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％，评估同一性。
43.另一个优选的遍在启动子是迷你cmv启动子。在一些实施方案中，迷你cmv启动子包含，基本上由或由与seq id no:25具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性的核苷酸序列组成。在一些实施方案中，可以相对于seq id no:25的一部分，例如seq id no:25的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％，评估同一性。
44.另一个优选的遍在启动子是ef1α启动子。在一些实施方案中，ef1α启动子包含，基本上由或由与seq id no:26具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性的核苷酸序列组成。在一些实施方案中，可以相对于seq id no:26的一部分，例如seq id no:26的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％，评估同一性。
45.另一个优选的遍在启动子是rsv启动子。在一些实施方案中，rsv启动子包含，基本上由或由与seq id no:27具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性的核苷酸序列组成。在一些实施方案中，可以相对于seq id no:27的一部分，例如seq id no:27的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％，评估同一性。
46.在一些实施方案中，基因构建体包含在想要防止胰岛素在其中表达的组织中表达
的microrna的至少一个靶序列。在一些实施方案中，编码胰岛素的核苷酸序列可操作地连接至遍在启动子，基因构建体包含microrna的至少一个靶序列，所述microrna的至少一个靶序列在想要阻止胰岛素表达的组织中表达。
47.在标题为“基本信息”章节提供了“遍在启动子”、“可操作地连接”和“microrna”的描述。如本文所使用的，“在组织中表达的microrna的靶序列”或“与在组织中表达的microrna结合的靶序列”或“在组织中表达的microrna的结合位点”是指与在所述组织中表达的microrna的至少一部分互补或部分互补的核苷酸序列，如本文其他地方所述。如在标题为“基本信息”章节所述，可以使用诸如qpcr、蛋白质印迹分析或elisa等技术评估表达。
48.在一些实施方案中，microrna的至少一个靶序列选自与在哺乳动物的心脏和/或肝脏中表达的microrna结合的那些靶序列。优选地，在一些实施方案中，基因构建体包含至少一个在肝脏中表达的microrna的靶序列和至少一个在心脏中表达的microrna的靶序列。
49.如本文所使用的，“在肝脏中表达的microrna的靶序列”或“与在肝脏中表达的microrna结合的靶序列”或“在肝脏中表达的microrna的结合位点”是指与在肝脏中表达的microrna的至少一部分互补或部分互补的核苷酸序列。类似地，如本文所使用的，“在心脏中表达的microrna的靶序列”或“与在心脏中表达的microrna结合的靶序列”或“在心脏中表达的microrna的结合位点”是指与在心脏中表达的microrna的至少一部分互补或部分互补的核苷酸序列。
50.如本文所述，在肝脏中表达的microrna的一部分或在心脏中表达的microrna的一部分是指所述microrna的至少四个，至少五个，至少六个或至少七个连续核苷酸的核苷酸序列。结合位点序列可以与表达的microrna的至少一部分具有完美的互补性，这意味着该序列是完美的匹配而没有发生任何错配。或者，结合位点序列可以与表达的microrna的至少一部分部分互补，这意味着可能发生四个、五个、六个或七个连续核苷酸中的一个错配。部分互补的结合位点优选包含与microrna种子区域的完美或接近完美的互补性，这意味着在microrna的种子区域及其结合位点之间不会发生错配(完美的互补性)或每四个、五个、六个或七个连续核苷酸一个错配(接近完美的互补性)。microrna的种子区域由microrna的5'区域的microrna的大约第二核苷酸到大约第八核苷酸组成。本文所述的部分优选是所述microrna的种子区域。包含在肝脏中表达的microrna或在心脏中表达的microrna的靶序列的信使rna(mrna)的降解可能是通过rna干扰途径或通过mrna的直接翻译控制(抑制)来实现的。本发明决不受限于mirna在抑制转基因或编码蛋白表达中最终使用的途径。
51.在本发明的上下文中，与肝脏中表达的microrna结合的靶序列可以被如下核苷酸序列取代，所述核苷酸序列包含与seq id no:7或9
‑
15具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案，与肝脏中表达的microrna结合的靶序列可以被如下核苷酸序列取代，所述核苷酸序列包含与seq id no:7或9
‑
15的4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或更多核苷酸的连续段具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至
no:8或16
‑
20的4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或更多核苷酸的连续段具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性的核苷酸序列。
55.在优选的实施方案中，在心脏中表达的microrna的靶序列可以被如下核苷酸序列取代，所述核苷酸序列包含与seq id no:8具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性的核苷酸序列。在一些实施方案，在心脏中表达的microrna的靶序列可以被如下核苷酸序列取代，所述核苷酸序列包含与seq id no:8的4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或更多核苷酸的连续段具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性的核苷酸序列。
56.在进一步的实施方案中，如本文所述的在心脏中表达的microrna的靶序列的至少一个拷贝存在于本发明的基因构建体中。在进一步的实施方案中，如本文所述的在心脏中表达的microrna的靶序列的两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个拷贝存在于本发明的基因构建体中。在优选的实施方案中，编码mirt
‑
1(seq id no:8)的核苷酸序列的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个拷贝存在于本发明的基因构建体中。如本文所述的在心脏中表达的microrna的靶序列的优选拷贝数为四个。
57.如本文所使用的，在心脏中表达的microrna的靶序列发挥在心脏中表达的microrna的靶序列的至少可检测水平的活性，如本领域技术人员已知的。在心脏中表达的microrna的靶序列的活性是与其在心脏中表达的同源microrna结合，并且当与转基因可操作地连接时，介导心脏中转基因表达的脱靶。可以通过本领域技术人员已知的标准测定法，例如qpcr，蛋白质印迹分析或elisa，通过测量mrna或蛋白质水平上心脏中转基因表达的水平来评估该活性。
58.在一些实施方案中，如本文所述的在肝脏中表达的microrna的靶序列的至少一个拷贝，以及如本文所述的在心脏中表达的microrna的靶序列的至少一个拷贝，存在于本发明的基因构建体中。在进一步的实施方案中，如本文所述的在肝脏中表达的microrna的靶序列的两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个拷贝，以及如本文所述的在心脏中表达的microrna的靶序列的两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个拷贝存在于本发明的基因构
建体中。在进一步的实施方案中，编码mirt
‑
122a(seq id no:7)的核苷酸序列的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个拷贝和编码mirt
‑
1(seq id no:8)的核苷酸序列的一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个拷贝组合在本发明的基因构建体中。在进一步的实施方案中，编码mirt
‑
122a(seq id no:7)的核苷酸序列的四个拷贝和编码mirt
‑
1(seq id no:8)的核苷酸序列的四个拷贝组合在本发明的基因构建体中。
59.在一些实施方案中，提供了如上所述的基因构建体，其中在肝脏中表达的microrna的靶序列和在心脏中表达的microrna的靶序列选自由序列seq id no:7至20和/或其组合组成的组中。在一些实施方案中，提供了如上所述的基因构建体，其中在心脏中表达的microrna的靶序列选自seqid no:8和16
‑
20，并且在肝脏中表达的microrna的靶序列选自seq idno:7和9
‑
15。在一些实施方案中，提供了如上所述的基因构建体，其中所述基因构建体包含microrna
‑
122a的靶序列(seq id no:7)和microrna
‑
1的靶序列(seq id no:8)。
60.如本文所述的在肝脏中表达的microrna的靶序列和/或在心脏中表达的microrna的靶序列发挥至少可检测水平的活性。microrna的靶序列的活性可以是包含所述microrna的靶序列的mrna的降解。这种降解可以使用技术人员已知的任何技术来评估，例如通过测量所述mrna的表达/存在。如在标题为“基本信息”章节所述，可以使用诸如qpcr、蛋白质印迹分析或elisa等技术评估表达。
61.根据本发明的基因构建体中存在的编码胰岛素的核苷酸序列可以源自任何胰岛素基因或胰岛素编码序列，包括突变的胰岛素基因或胰岛素编码序列，或密码子优化的胰岛素基因或胰岛素编码序列。在一些实施方案中，编码胰岛素的核苷酸序列是鼠、犬或人胰岛素基因或胰岛素编码序列，鼠、犬或人突变的胰岛素基因或胰岛素编码序列，或鼠、犬或人密码子优化的胰岛素基因或胰岛素编码序列。在一些实施方案中，编码胰岛素的核苷酸序列是来自人、黑猩猩、小鼠、大鼠或狗的胰岛素基因或胰岛素编码序列；或来自人、黑猩猩、小鼠、大鼠或狗的突变的胰岛素基因或胰岛素编码序列；或来自人、黑猩猩、小鼠、大鼠或狗的密码子优化的胰岛素基因或胰岛素编码序列。优选人序列。
62.在优选的实施方案中，根据本发明的基因构建体中存在的编码胰岛素的核苷酸序列编码具有弗林蛋白酶切割位点的改造的胰岛素。已知这种具有弗林蛋白酶切割位点的改造胰岛素以高效的方式加工以在非胰腺组织中产生成熟的胰岛素。在一些实施方案中，编码具有弗林蛋白酶切割位点的改造的胰岛素的核苷酸序列选自由以下组成的组：
63.(a)编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与seq id no:41或42的氨基酸序列具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性或相似性的氨基酸序列；
64.(b)核苷酸序列，所述核苷酸序列与seq id no:45或46的核苷酸序列具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少
77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性；和
65.(c)核苷酸序列，其序列由于遗传密码的简并性而与(a)或(b)的核苷酸序列的序列不同。
66.因此，在一些实施方案中，编码胰岛素的优选核苷酸序列编码多肽，所述多肽包含与seq id no:1
‑
3或41
‑
44具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％同一性或相似性的氨基酸序列。seq id no:1代表人胰岛素的氨基酸序列。seq id no:2代表鼠胰岛素的氨基酸序列。seq id no:3代表犬胰岛素的氨基酸序列。seq id no:41代表具有弗林蛋白酶切割位点的人胰岛素的氨基酸序列。seq id no:42代表具有弗林蛋白酶切割位点的人胰岛素突变体his
‑
b10
‑
asp的氨基酸序列。seq id no:43代表鼠胰岛素的氨基酸序列。seq id no:44代表黑猩猩胰岛素的氨基酸序列。在一些实施方案中，可以相对于seq id no:1
‑
3或41
‑
44的一部分，例如seq id no:1
‑
3或41
‑
44的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％，评估同一性。
67.在一些实施方案中，存在于根据本发明的基因构建体中的编码胰岛素的核苷酸序列与选自由seq id no:4
‑
6或45
‑
48组成的组的任何序列具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的同一性。seq id no:4代表人胰岛素的核苷酸序列。seq id no:5代表鼠胰岛素的核苷酸序列。seq id no:6代表犬胰岛素的核苷酸序列。seq id no:45代表具有弗林蛋白酶切割位点的人胰岛素的核苷酸序列。seq id no:46代表具有弗林蛋白酶切割位点的人胰岛素突变体his
‑
b10
‑
asp的核苷酸序列。seq id no:47代表鼠胰岛素的核苷酸序列。seq id no:48代表黑猩猩胰岛素的核苷酸序列。在一些实施方案中，可以相对于seq id no:4
‑
6或45
‑
48的一部分，例如seq idno:4
‑
6或45
‑
48的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％，评估同一性。
68.在标题为“基本信息”的章节下提供了“同一性”或“序列同一性”和“相似性”或“序列相似性”的描述。
69.在一些实施方案中，存在于根据本发明的基因构建体中的编码人胰岛素的核苷酸序列与seq id no:4具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％
或100％的同一性。在一些实施方案中，可以相对于seq id no:4的一部分，例如seq id no:4的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％，评估同一性。
70.在一些实施方案中，存在于根据本发明的基因构建体中的编码鼠胰岛素的核苷酸序列与seq id no:5或47具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的同一性。在一些实施方案中，可以相对于seq id no:5或47的一部分，例如seq id no:5或47的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％，评估同一性。
71.在一些实施方案中，存在于根据本发明的基因构建体中的编码犬胰岛素的核苷酸序列与seq id no:6具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的同一性。在一些实施方案中，可以相对于seq id no:6的一部分，例如seq id no:6的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％，评估同一性。
72.在一些实施方案中，存在于根据本发明的基因构建体中的编码人胰岛素的核苷酸序列与seq id no:45或46具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的同一性。在一些实施方案中，可以相对于seq id no:45或46的一部分，例如seq id no:45或46的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％，评估同一性。
73.在一些实施方案中，存在于根据本发明的基因构建体中的编码黑猩猩胰岛素的核苷酸序列与seq id no:48具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的同一性。在一些实施方案中，可以相对于seq id no:48的一部分，例如seq id no:48的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％，评估同一性。
74.在一些实施方案中，提供了如本文所述的基因构建体，其中编码胰岛素的核苷酸序列选自由以下组成的组中：
75.(a)编码多肽的核苷酸序列，所述多肽包含与seq id no:1
‑
3或41
‑
44的氨基酸序列具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，
至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性或相似性的氨基酸序列；
76.(b)核苷酸序列，所述核苷酸序列与seq id no:4
‑
6或45
‑
48的核苷酸序列具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性；和
77.(c)核苷酸序列，其序列由于遗传密码的简并性而与(a)或(b)的核苷酸序列的序列不同。
78.由本文所述的核苷酸序列编码的胰岛素(尤其是当胰岛素序列被描述为与给定的seq id no具有最小同一性百分比时)发挥至少可检测水平的胰岛素活性。胰岛素的活性可以是高血糖的调节。更合适地，在本公开内容的上下文中，可以在胰岛素信号级联的水平评估胰岛素的活性。例如，可以确定胰岛素信号级联的不同蛋白质的磷酸化状态，例如irs
‑
1/2的酪氨酸磷酸化、akt的磷酸化等。磷酸化状态可以例如通过蛋白质印迹分析来评估，所述蛋白质印迹分析使用识别磷酸化酪氨酸残基的抗体和/或特异性识别蛋白质例如irs
‑
1/2和akt的磷酸化形式的抗体。胰岛素的活性还可以是减少神经炎症、增加神经发生或增加星形胶质细胞。这种活性可以通过本领域技术人员已知的方法来评估，例如通过测量炎症分子、星形胶质细胞标志物和/或神经源性标志物的表达水平来评估，如实验部分所述。
79.下表总结了适用于本发明基因构建体的代表性数量的胰岛素序列在dna和蛋白质水平上的序列同一性。
80.表1通过成对比对确定的同一性％。homologene与默认参数一起使用(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/homologene)。
81.[0082][0083]
在一些实施方案中，编码胰岛素的核苷酸序列与组织特异性启动子可操作地连接。在优选的实施方案中，组织特异性启动子是cns特异性启动子，更优选脑特异性启动子。如本文所使用的，cns和/或脑特异性启动子还涵盖引导在cns和/或脑的特定区域或细胞亚群中表达的启动子。因此，cns
‑
和/或脑特异性启动子也可以选自海马特异性启动子、小脑特异性启动子、皮质特异性启动子、下丘脑特异性启动子和/或嗅球特异性启动子，或其任何组合。
[0084]
在标题为“基本信息”章节提供了“组织特异性启动子”的描述。
[0085]
在一些实施方案中，本文所述的cns特异性启动子选自由突触蛋白1启动子，神经元特异性烯醇酶(nse)启动子，钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶ii(camkii)启动子，酪氨酸羟化酶(th)启动子，叉头盒a2(foxa2)启动子，α
‑
丝联蛋白(ina)启动子，巢蛋白(nes)启动子，胶质细胞原纤维酸性蛋白(gfap)启动子，乙醛脱氢酶1家族成员l1(aldh1l1)启动子，髓磷脂相关少突胶质细胞碱性蛋白(mobp)启动子，同源框蛋白9(hb9)启动子、促性腺激素释放激素(gnrh)启动子和髓磷脂碱性蛋白(mbp)启动子组成的组。
[0086]
在一些实施方案中，本文所述的脑特异性启动子选自由突触蛋白1启动子，神经元特异性烯醇酶(nse)启动子，钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶ii(camkii)启动子，酪氨酸羟化
酶(th)启动子，叉头盒a2(foxa2)启动子，α
‑
丝联蛋白(ina)启动子，巢蛋白(nes)启动子，胶质细胞原纤维酸性蛋白(gfap)启动子，乙醛脱氢酶1家族成员l1(aldh1l1)启动子，髓磷脂相关少突胶质细胞碱性蛋白(mobp)启动子、促性腺激素释放激素(gnrh)启动子和髓磷脂碱性蛋白(mbp)启动子组成的组中。
[0087]
在优选的实施方案中，cns和/或脑特异性启动子是突触蛋白1启动子。在一些实施方案中，突触蛋白1启动子包含，基本上由或由与seq idno:28具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性的核苷酸序列组成。在一些实施方案中，可以相对于seq id no:28的一部分，例如seq idno:28的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％，评估同一性。
[0088]
另一个优选的cns和/或脑特异性启动子是钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶ii(camkii)启动子。在一些实施方案中，钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶ii(camkii)启动子包含，基本上由或由与seq id no:29具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性的核苷酸序列组成。在一些实施方案中，可以相对于seq id no:29的一部分，例如seq id no:29的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％，评估同一性。
[0089]
另一个优选的cns和/或脑特异性启动子是胶质细胞原纤维酸性蛋白(gfap)启动子。在一些实施方案中，胶质细胞原纤维酸性蛋白(gfap)启动子包含，基本上由或由与seq id no:30具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性的核苷酸序列组成。在一些实施方案中，可以相对于seq id no:30的一部分，例如seq id no:30的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％，评估同一性。
[0090]
另一个优选的cns和/或脑特异性启动子是巢蛋白启动子。在一些实施方案中，巢蛋白启动子包含，基本上由或由与seq id no:31具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性的核苷酸序列组成。在一些实施方案中，可
以相对于seq id no:31的一部分，例如seq id no:31的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％，评估同一性。
[0091]
另一个优选的cns特异性启动子是同源框蛋白9(hb9)启动子。在一些实施方案中，同源框蛋白9(hb9)启动子包含，基本上由或由与seqid no:32具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性的核苷酸序列组成。在一些实施方案中，可以相对于seq id no:32的一部分，例如seq id no:32的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％，评估同一性。
[0092]
另一个优选的cns和/或脑特异性启动子是酪氨酸羟化酶(th)启动子。在一些实施方案中，酪氨酸羟化酶(th)启动子包含，基本上由或由与seq id no:33具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性的核苷酸序列组成。在一些实施方案中，可以相对于seq id no:33的一部分，例如seq id no:33的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％，评估同一性。
[0093]
另一个优选的cns和/或脑特异性启动子是髓磷脂碱性蛋白(mbp)启动子。在一些实施方案中，髓磷脂碱性蛋白(mbp)启动子包含，基本上由或由与seq id no:34具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的序列同一性的核苷酸序列组成。在一些实施方案中，可以相对于seq id no:34的一部分，例如seq id no:34的至少50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％，评估同一性。
[0094]
在一些实施方案中，本文所述的cns和/或脑特异性启动子引导所述核苷酸序列在cns和/或脑的至少一个细胞中表达。优选地，所述启动子引导在至少10％，20％，30％，40％，40％，60％，70％，80％，90％或100％的cns和/或脑的细胞中表达。如本文所使用的，cns和/或脑特异性启动子还涵盖引导在cns和/或脑的特定区域或细胞亚群中表达的启动子。因此，本文所述的cns和/或脑特异性启动子也可以引导在至少10％，20％，30％，40％，40％，60％，70％，80％，90％或100％的海马、小脑、皮质、下丘脑和/或嗅球的细胞中表达。如在标题为“基本信息”章节所述，可以使用诸如qpcr、蛋白质印迹分析或elisa等技术评估表达。
[0095]
如本文所用的启动子(特别是当启动子序列被描述为与给定seq idno具有最小同一性百分比时)应发挥至少本领域技术人员已知的启动子活性。优选地，被描述为与给定
seq id no具有最小同一性百分比的启动子应控制与其可操作地连接的核苷酸序列(即，至少编码胰岛素的核苷酸序列)的转录，如在本领域技术人员已知的测定中所评估的那样。例如，这种测定可以涉及测量转基因的表达。如在标题为“基本信息”章节所述，可以使用诸如qpcr、蛋白质印迹分析或elisa等技术评估表达。
[0096]
其他序列可以存在于本发明的基因构建体中。适用于本文的示例性额外的序列包括反向末端重复(itr)，sv40聚腺苷酸化信号(seq id no:37)，兔β
‑
珠蛋白聚腺苷酸化信号(seq id no:38)，cmv增强子序列(seq idno:24)。在本发明的上下文中，“itr”旨在涵盖一个5
′
itr和一个3
′
itr，每个都衍生自aav的基因组。优选的itr来自aav2，并由seq id no:35(5
′
itr)和seq id no:36(3
′
itr)表示。在本发明的上下文中，包括使用cmv增强子序列(seq id no:24)和cmv启动子序列(seq id no:23)作为两个单独的序列或作为单个序列(seq id no:39)。这些另外的序列中的每一个都可以存在于根据本发明的基因构建体中。在一些实施方案中，提供了基因构建体，其包含如本文所述的编码胰岛素的核苷酸序列，进一步包含一个5'itr和一个3'itr，优选aav2 itr，更优选由seq id no:30(5'itr)和seq id no:31(3'itr)代表的aav2 itr。在一些实施方案中，提供了基因构建体，其包含如本文所述的编码胰岛素的核苷酸序列，进一步包含聚腺苷酸化信号，优选sv40聚腺苷酸化信号(优选由seq id no:32表示)和/或兔β
‑
珠蛋白聚腺苷酸化信号(优选由seq id no:33表示)。
[0097]
任选地，额外的核苷酸序列可以可操作地连接至编码胰岛素的核苷酸序列，例如编码信号序列、核定位信号、表达增强子等的核苷酸序列。
[0098]
在一些实施方案中，提供了基因构建体，其包含编码胰岛素的核苷酸序列，任选地，其中所述基因构建体不包含在想要阻止胰岛素表达的组织中表达的microrna的靶序列。
[0099]
在一些实施方案中，本文所用的序列同一性或相似性水平优选为70％。另一个优选的序列同一性或相似性水平是80％。另一个优选的序列同一性或相似性水平是90％。另一个优选的序列同一性或相似性水平是95％。
[0100]
另一个优选的序列同一性或相似性水平是99％。
[0101]
表达载体
[0102]
可以将本文所述的基因构建体置于表达载体中。因此，在另一方面，提供了表达载体，其包含如本文所述的基因构建体。优选地，如本文所述的表达载体用作药物。更优选地，如本文所述的表达载体用于治疗和/或预防神经炎症、神经变性和/或认知下降、或与其相关的疾病或病症。
[0103]
在标题为“基本信息”章节提供了“表达载体”的描述。
[0104]
在一些实施方案中，表达载体是病毒表达载体。在一些实施方案中，病毒载体可以是选自由腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体和慢病毒载体组成的组的病毒载体。优选的病毒载体是腺伴随病毒载体。
[0105]
在标题为“基本信息”章节提供了“病毒表达载体”的描述。腺病毒载体也称为腺病毒衍生的载体，腺伴随病毒载体也称为腺伴随病毒衍生的载体，逆转录病毒载体也称为逆转录病毒衍生的载体，慢病毒载体也称为慢病毒衍生的载体。优选的病毒载体是腺伴随病毒载体。在标题为“基本信息”章节提供了“腺伴随病毒载体”的描述。
[0106]
在一些实施方案中，载体是腺伴随载体或腺伴随病毒载体或腺伴随病毒衍生的载
体(aav)，其选自由血清型1的aav(aav1)，血清型2的aav(aav2)，血清型3的aav(aav3)，血清型4的aav(aav4)，血清型5的aav(aav5)，血清型6的aav(aav6)，血清型7的aav(aav7)，血清型8的aav(aav8)，血清型9的aav(aav9)，血清型rh10的aav(aavrh10)，血清型rh8的aav(aavrh8)，血清型cb4的aav(aavcb4)，血清型rh74的aav(aavrh74)，血清型dj的aav(aavdj)，血清型2/5的aav(aav2/5)，血清型2/1的aav(aav2/1)，血清型1/2的aav(aav1/2)，血清型anc80的aav(aavanc80)组成的组。在优选的实施方案中，载体是血清型1、2或9的aav(aav1、aav2或aav9)。在实施例中证明这些aav血清型适合用作根据本发明的表达载体。在特别优选的实施方案中，表达载体是血清型9或1的腺伴随病毒载体。
[0107]
在优选的实施方案中，表达载体是aav1或aav9，优选aav9，并且包含基因构建体，所述基因构建体包含编码胰岛素的核苷酸序列，其中所述基因构建体包含在想要阻止胰岛素表达的组织中表达的microrna的至少一个靶序列。
[0108]
在另一个优选的实施方案中，表达载体是aav1或aav9，优选aav1，并且包含基因构建体，所述基因构建体包含编码胰岛素的核苷酸序列，任选地，其中所述基因构建体不包含在想要阻止胰岛素表达的组织中表达的microrna的靶序列。
[0109]
在优选的实施方案中，表达载体是aav9
‑
cag
‑
hins
‑
dmirt，包含与cag启动子和mirna靶序列mirt
‑
1和mirt
‑
122a可操作地连接的编码人胰岛素的基因构建体。任选地，基因构建体还包括兔β
‑
珠蛋白聚腺苷酸化信号。在另一个优选的实施方案中，表达载体是aav1
‑
cag
‑
hins，包含与cag启动子可操作地连接的编码人胰岛素的基因构建体。任选地，基因构建体还包括兔β
‑
珠蛋白聚腺苷酸化信号。
[0110]
组合物
[0111]
在进一步的方面，提供了组合物，其包含如本文所述的基因构建体和/或如本文所述的病毒载体，以及任选地一种或多种药学上可接受的成分。优选地，如本文所述的组合物用作药物。优选地，如本文所述的组合物用于治疗和/或预防神经炎症、神经变性和/或认知下降、或与其相关的疾病或病症。优选地，在一些实施方案中，组合物是药物组合物。如本文所述的此类组合物也可称为基因疗法组合物。
[0112]
如本文所使用的，“药学上可接受的成分”包括药学上可接受的载体，填充剂，防腐剂，增溶剂，运载体，稀释剂和/或赋形剂。因此，一种或多种药学上可接受的成分可以选自由药学上可接受的载体，填充剂，防腐剂，增溶剂，运载体，稀释剂和/或赋形剂组成的组。这样的药学上可接受的载体，填充剂，防腐剂，增溶剂，运载体，稀释剂和/或赋形剂可以例如在《雷明顿：药学科学与实践》第22版,药学出版社(2013)中找到。
[0113]
其他化合物可以存在于本发明的组合物中。所述化合物可以帮助递送组合物。在本发明的上下文中，合适的化合物是：能够形成复合物、纳米颗粒、胶束和/或脂质体的化合物，所述复合物、纳米颗粒、胶束和/或脂质体递送如本文所述的每种成分，通过细胞膜复合或捕获在囊泡或脂质体中。这些化合物中的许多是本领域已知的。合适的化合物包括聚乙烯亚胺(pei)，或类似的阳离子聚合物，包括聚丙烯亚胺或聚乙烯亚胺共聚物(pec)和衍生物；合成的亲水脂分子(saint
‑
18)；lipofectin
tm
，dotap。本领域技术人员将知道哪种制剂类型最适合如本文所述的组合物。
[0114]
方法与用途
[0115]
在进一步的方面，提供了如本文所述的基因构建体，用作药物。进一步提供了如本
文所述的表达载体，用作药物。进一步提供了如本文所述的药物组合物，用作药物。还提供了如本文所述的基因构建体，用于治疗和/或预防神经炎症、神经变性和/或认知下降、或与其相关的疾病或病症。进一步提供了如本文所述的表达载体，用于治疗和/或预防神经炎症、神经变性和/或认知下降、或与其相关的疾病或病症。进一步提供了如本文所述的药物组合物，用于治疗和/或预防神经炎症、神经变性和/或认知下降、或与其相关的疾病或病症。
[0116]
因此，在一些实施方案中，如本文所述的基因构建体和/或如本文所述的表达载体和/或如本文所述的药物组合物用于治疗和/或预防神经炎症。在一些实施方案中，如本文所述的基因构建体和/或如本文所述的表达载体和/或如本文所述的药物组合物用于治疗和/或预防神经变性。在一些实施方案中，如本文所述的基因构建体和/或如本文所述的表达载体和/或如本文所述的药物组合物用于治疗和/或预防认知下降。在本发明的上下文中，“神经炎症”、“神经变性”和“认知下降”可以分别替换为“神经炎症或其相关的疾病或病症”、“神经变性或其相关的疾病或病症”和“认知下降或与其相关的疾病或病症”。
[0117]
在一些实施方案中，与神经炎症、神经变性和/或认知下降相关的疾病或病症可以是认知障碍、痴呆、阿尔茨海默氏病、血管性痴呆、路易体痴呆、额颞叶痴呆(ftd)、帕金森病、帕金森样疾病、帕金森综合征、亨廷顿氏病、创伤性脑损伤、朊病毒病、由于hiv感染引起的痴呆/神经认知问题、由于衰老引起的痴呆/神经认知问题、tau蛋白病、多发性硬化症和其他神经炎症/神经退行性疾病。在优选的实施方案中，与神经炎症、神经变性和/或认知下降相关的疾病或病症可以是阿尔茨海默氏病、帕金森病和/或帕金森样疾病，优选阿尔茨海默氏病和/或帕金森病。
[0118]
因此，如本文所述的基因构建体和/或如本文所述的表达载体和/或如本文所述的药物组合物可被视为抗神经炎症药物、抗神经变性药物和/或抗认知下降药物。因此，它也可以被视为一种抗衰老药物。
[0119]
本文公开的实施方案还可用于治疗和/或预防与任何前述病症相关的神经炎症、神经变性和/或认知下降。
[0120]
在一些实施方案中，如本文所述使用的基因构建体和/或使用的表达载体和/或使用的药物组合物涉及基因构建体在cns，优选在脑中的表达。
[0121]
优选地，根据一些实施方案，如本文所述使用的基因构建体和/或使用的表达载体和/或使用的药物组合物通过csf内施用来施用。
[0122]
在另一方面，提供了治疗方法，包括施用如本文所述的基因构建体、表达载体或药物组合物。优选地，治疗方法用于治疗和/或预防神经炎症、神经变性和/或认知下降，或与其相关的疾病或病症。在一些实施方案中，施用基因构建体、表达载体或药物组合物是指向有需要的受试者施用治疗有效量的基因构建体、表达载体或药物组合物。
[0123]
在另一方面，提供了如本文所述的基因构建体、表达载体或药物组合物用于制造药物的用途。优选地，在一些实施方案中，所述药物用于治疗和/或预防神经炎症、神经变性和/或认知下降、或与其相关的疾病或病症。
[0124]
在另一方面，提供了如本文所述的基因构建体、表达载体或药物组合物用于医疗的用途。优选地，在一些实施方案中，所述医疗是治疗和/或预防神经炎症、神经变性和/或认知下降、或与其相关的疾病或病症。
[0125]
在另一方面，提供了用于改善受试者的记忆和/或学习的方法，该方法包括向受试者施用如本文所述的基因构建体和/或如本文所述的表达载体和/或如本文所述的组合物。在优选的实施方案中，施用有效量的基因构建体、表达载体或组合物。如本文所使用的，“有效量”是足以发挥有益或期望结果的量。在优选的实施方案中，待治疗的受试者是老年受试者和/或被诊断患有代谢紊乱或疾病，优选肥胖症和/或糖尿病的受试者。在一些实施方案中，记忆可以是再认记忆和/或回忆记忆，优选地再认记忆。在一些实施方案中，记忆可以是感觉记忆；短期和/或长期记忆，优选短期记忆和/或长期记忆。在一些实施方案中，记忆可以是内隐(或程序)和/或外显(或陈述性)记忆。在优选实施方案中，记忆也可以是空间记忆。在一些实施方案中，学习可以是空间学习。对不同类型记忆的进一步描述包含在标题为“基本信息”的章节中。
[0126]
在根据本发明使用的基因构建体、使用的表达载体、使用的组合物、方法和用途的优选实施方案中，待治疗的受试者是老年受试者和/或被诊断患有代谢紊乱或疾病的的受试者。换言之，在一些实施方案中，根据本发明使用的基因构建体、使用的表达载体、使用的组合物、方法和用途、神经炎症、神经变性和/或认知下降、或其相关的疾病或病症，是与衰老和/或代谢紊乱或疾病相关和/或由其引起。也可包括代谢紊乱或疾病的并发症。
[0127]
如本文所用，老年受试者可优选指50岁或以上、优选55岁或以上、更优选60岁或以上且最优选65岁或以上的受试者。
[0128]
在根据本发明使用的基因构建体、使用的表达载体、使用的组合物、方法和用途的其他实施方案中，待治疗的受试者不是老年受试者和/或是为50岁或以下、45岁或以下、40岁或以下、35岁或以下、30岁或以下、25岁或以下的受试者。
[0129]
在根据本发明使用的基因构建体、使用的表达载体、使用的组合物、方法和用途的其他实施方案中，待治疗的受试者是未诊断出患有代谢紊乱或疾病的受试者。换言之，在根据本发明使用的基因构建体、使用的表达载体、使用的组合物、方法和用途的一些实施方案中，中枢神经系统紊乱或疾病、或与其相关的病症，是与衰老和/或代谢紊乱或疾病无关和/或不是由其引起。
[0130]
代谢紊乱和疾病可能包括代谢综合征，糖尿病，肥胖症，肥胖相关共病症，糖尿病相关共病症，高血糖症，胰岛素抵抗，葡萄糖耐受不良，脂肪肝，酒精性肝病(ald)，非酒精性脂肪肝病(nafld)，非
‑
酒精性脂肪性肝炎(nash)，冠心病(chd)，高脂血症，动脉粥样硬化，内分泌病变，骨少肌性肥胖综合征(oso)，糖尿病肾病，慢性肾病(ckd)，心脏肥大，糖尿病性视网膜病，糖尿病性肾病，糖尿病神经病变，关节炎，败血症，眼部新血管形成，神经变性，痴呆，也可能包括抑郁症，腺瘤，癌。糖尿病可包括前驱糖尿病，高血糖症，1型糖尿病，2型糖尿病，青年成熟期发作糖尿病(mody)，单基因糖尿病，新生儿糖尿病，妊娠糖尿病，脆型糖尿病，特发性糖尿病，药物或化学诱导的糖尿病，僵人综合征，脂肪萎缩性糖尿病，成人潜伏性自身免疫性糖尿病(lada)。肥胖可包括超重，中/上身肥胖，外周/下身肥胖，病态肥胖，骨少肌性肥胖综合症(oso)，小儿肥胖，孟德尔(单基因)综合征，孟德尔非综合征性肥胖，多基因肥胖。优选的代谢紊乱或疾病是肥胖症和/或糖尿病。
[0131]
在根据本发明使用的基因构建体、使用的表达载体、使用的组合物、方法和用途的一些实施方案中，待治疗的受试者是处于患神经炎症、神经变性和/或认知下降，或与其相关的疾病或病症的风险的受试者。
[0132]
在根据本发明使用的基因构建体、使用的表达载体、使用的药物组合物、方法和用途的上下文中，疗法和/或治疗和/或药物可涉及基因构建体在cns中，优选在脑中表达。在一些实施方案中，在除cns和/或脑之外的其他组织中没有可检测的表达。在一些实施方案中，基因构建体在脑中的表达可以意指基因构建体在下丘脑和/或皮质和/或海马和/或小脑和/或嗅球中的表达。因此，基因构建体在脑中的表达可以意指基因构建体在选自由下丘脑、皮质、海马、小脑和嗅球组成的组的至少一个或至少两个或至少三个或所有脑区域中的表达。在一些实施方案中，在cns和/或脑中的表达可以指在cns和/或脑中的特异性表达。在实施方案中，在肝脏、胰腺、脂肪组织、骨骼肌、心脏、肾脏、结肠、造血组织、肺、卵巢、脾脏、胃和/或睾丸中检测不到表达。在优选的实施方案中，在肝脏和/或心脏中检测不到表达。在另一个优选的实施方案中，在骨骼肌中检测不到表达。在一些实施方案中，表达不涉及在选自由肝脏、胰腺、脂肪组织、骨骼肌、心脏、肾脏、结肠、造血组织、肺、卵巢、脾脏、胃、睾丸组成的组的至少一个，至少两个，至少三个，至少四个或所有器官中的表达。在标题为“基本信息”章节提供了cns和/或脑特异性表达的描述。
[0133]
如在标题为“基本信息”章节所述，可以使用诸如qpcr、蛋白质印迹分析或elisa等技术评估表达。在标题为“基本信息”章节提供了“cns”、“脑”、“下丘脑”、“海马”、“小脑”、“皮质”和“嗅球”的描述。
[0134]
在根据本发明使用的基因构建体、使用的表达载体、使用的药物组合物、方法和用途的上下文中，可以通过csf(脑脊液)内施用施用(通过小脑延髓池，鞘内或心室内递送)基因构建体和/或表达载体和/或药物组合物。优选的施用方式，任选地优选的人类施用方式是心室内。
[0135]
在根据本发明使用的基因构建体、使用的表达载体、使用的药物组合物、方法和用途的上下文中，可以通过实质内施用施用基因构建体和/或表达载体和/或药物组合物。
[0136]
在根据本发明使用的基因构建体、使用的表达载体、使用的药物组合物、方法和用途的上下文中，可以通过鼻内施用施用基因构建体和/或表达载体和/或药物组合物和/或药物。
[0137]
如本文所使用的，在本技术的标题“基本信息”部分描述了“csf内施用”、“鼻内施用”、“实质内施用”、“小脑延髓池内施用”、“鞘内施用”和“心室内施用”。
[0138]
在优选的实施方案中，不必重复本文所述药物的治疗或疗法或用途或施用。在一些实施方案中，本文所述的药物的治疗或疗法或用途或施用可以每年或每2、3、4、5、6、7、8、9或10年重复，包括任意两个列出的值之间的间隔。
[0139]
被治疗的受试者可以是高等哺乳动物，例如猫，啮齿动物(优选小鼠，大鼠，沙鼠和豚鼠，更优选小鼠和大鼠)，狗或人。
[0140]
在根据本发明使用的基因构建体、使用的表达载体、使用的药物组合物、方法和用途的上下文中，如本文所述的基因构建体和/或表达载体和/或药物组合物和/或药物优选表现出以下中的至少一种、至少两种、至少三种、至少四种或全部：
[0141]
‑
减少神经炎症；
[0142]
‑
增加神经发生；
[0143]
‑
增加星形胶质细胞的数量；
[0144]
‑
减少神经变性；
[0145]
‑
缓解症状(如本文后面所述)；和
[0146]
‑
改进参数(如本文后面所述)。
[0147]
减少神经炎症可能意味着减少神经组织的炎症。这可以使用本领域技术人员已知的技术来评估，例如(神经)炎症标志物的测量，例如在实验部分中所做的。可以在这方面使用的示例性标志物是il
‑
1b、il
‑
6和nfkb。在这种情况下，“减少”(分别是“改善”)是指使用本领域技术人员已知的测定法，例如在实验部分中进行的测定，至少可检测到的减少(分别是可检测的改善)。减少可以是至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％或至少100％的减少。在使用本发明的基因构建体和/或表达载体和/或组合物进行至少一周、一个月、六个月、一年或更长时间的治疗后，可以看到减少。优选地，在单次施用后观察到减少。在一些实施方案中，在至少一周、一个月、六个月、1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、12年、15年、20年或更长时间的持续时间，优选在单次施用后观察到减少。
[0148]
增加神经发生可意味着神经元是由神经干细胞产生的。这可以使用本领域技术人员已知的技术来评估，例如神经发生标志物的测量，例如在实验部分中所做的。可以在这方面使用的示例性标志物是dcx、ncam和sox2。在这种上下文下，“增加”(分别是“改善”)是指使用本领域技术人员已知的测定法，例如在实验部分中进行的测定，至少可检测到的增加(分别是可检测的改善)。减少可以是至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％或至少100％的减少。在使用本发明的基因构建体和/或表达载体和/或组合物进行至少一周、一个月、六个月、一年或更长时间的治疗后，可以看到增加。优选地，在单次施用后观察到增加。在一些实施方案中，在至少一周、一个月、六个月、1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、12年、15年、20年或更长时间的持续时间，优选在单次施用后观察到增加。
[0149]
增加星形胶质细胞的数量可能意味着星形胶质细胞的数量增加。这可以使用本领域技术人员已知的技术来评估，例如星形胶质细胞标志物的测量，例如在实验部分中所做的。可以在这方面使用的示例性标志物是gfap和s100b。在这种情况下，“增加”(分别是“改善”)是指使用本领域技术人员已知的测定法，例如在实验部分中进行的测定，至少可检测到的增加(分别是可检测的改善)。减少可以是至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％或至少100％的减少。在使用本发明的基因构建体和/或表达载体和/或组合物进行至少一周、一个月、六个月、一年或更长时间的治疗后，可以看到增加。优选地，在单次施用后观察到增加。在一些实施方案中，在至少一周、一个月、六个月、1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、12年、15年、20年或更长时间的持续时间后，优选在单次施用后观察到增加。
[0150]
减少神经变性可能意味着减少神经元结构或功能的丧失，包括减少神经元的死亡。这可以使用本领域技术人员已知的技术例如免疫细胞化学、免疫组织化学、通过医学成像技术例如mri、研究神经元形态学和突触变性(通过测量位于突触中的蛋白质的密度)或通过分析几种衰老和神经变性标志物的表达水平来评估。在这种情况下，“减少”(分别是“改善”)是指使用本领域技术人员已知的测定法，例如在实验部分中进行的测定，至少可检测到的减少(分别是可检测的改善)。减少可以是至少5％，至少10％，至少20％，至少30％，至少40％，至少50％，至少60％，至少70％，至少80％，至少90％或至少100％的减少。在使用
本发明的基因构建体和/或表达载体和/或组合物进行至少一周、一个月、六个月、一年或更长时间的治疗后，可以看到增加。优选地，在单次施用后观察到增加。在一些实施方案中，在至少一周、一个月、六个月、1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、12年、15年、20年或更长时间的持续时间，优选在单次施用后观察到增加。
[0151]
减轻症状可能意味着典型症状(例如神经炎症、神经变性、认知下降、记忆力减退、学习能力下降、突触丧失、tau磷酸化)在由医师评估的个体、所述个体的细胞、组织或器官中的进展已经减慢。典型症状的减轻可能意味着症状发展进展减慢或症状完全消失。可以使用多种方法来评估症状，以及症状的减轻，这些方法在很大程度上与诊断神经炎症、神经变性、认知下降以及与其相关的疾病所使用的方法相同，包括临床检查和常规实验室检查。临床检查可包括行为测试和认知测试。实验室检查包括宏观和微观方法、分子方法、射线照相方法如x射线、生化方法、免疫组织化学方法和其他方法。记忆和学习可以在小鼠中进行评估，例如如实验部分所述，例如通过新的物体识别测试和/或莫里斯水迷宫测试。在使用本发明的基因构建体和/或表达载体和/或组合物进行至少一周、一个月、六个月、一年或更长时间的治疗后，可以看到症状的减轻。优选地，在单次施用后观察到减轻。在一些实施方案中，在至少一周、一个月、六个月、1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、12年、15年、20年或更长时间的持续时间，优选在单次施用后观察到减轻。
[0152]
改善参数可能意味着改善行为测试后的结果，改善血清和csf标志物的表达、改善细胞凋亡/神经发生细胞标志物的表达等。使用本发明的基因构建体和/或表达载体和/或组合物进行至少一周、一个月、六个月、一年或更长时间的治疗后可以看到参数的改善。优选地，在单次施用后观察到改善。在一些实施方案中，在至少一周、一个月、六个月、1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、12年、15年、20年或更长时间的持续时间，优选在单次施用后观察到改善。
[0153]
在根据本发明使用的基因构建体、使用的表达载体、使用的药物组合物、方法和用途的上下文中，本文所述的基因构建体和/或表达载体和/或药物组合物优选减轻个体、所述个体的细胞、组织或器官中神经炎症、神经变性和/或认知障碍、或与其相关的疾病的一种或多种症状，或减轻所述个体的细胞、组织或器官的一种或多种特征或症状。
[0154]
如本文所述，如果使用本发明的基因构建体和/或表达载体和/或组合物进行至少一周、一个月、六个月、一年或更长时间的治疗后，所述症状或特征已减少(例如不再可检测或减慢)，如本文所述的基因构建体和/或表达载体和/或药物组合物优选地能够减轻患者或所述患者的细胞、组织或器官的症状或特征。
[0155]
如本文所述的基因构建体和/或表达载体和/或药物组合物和/或药物可以适合于施用至受神经炎症、神经变性和/或认知障碍、或与其相关的疾病的影响或具有患神经炎症、神经变性和/或认知障碍、或与其相关的疾病的风险的个体体内的细胞、组织和/或器官，并且可以体内、离体或体外施用。可以将所述基因构建体和/或表达载体和/或药物组合物和/或药物直接或间接地施用于受神经炎症、神经变性和/或认知障碍、或与其相关的疾病的影响或具有患神经炎症、神经变性和/或认知障碍、或与其相关的疾病的风险的个体体内的细胞、组织和/或器官，并且可以在体内、离体或体外直接或间接施用。
[0156]
施用方式可以是静脉内，肌内，鞘内，心室内，腹膜内，通过吸入，鼻内，眼内和/或实质内施用。优选的施用方式是鼻内，实质内和csf内(通过小脑延髓池，鞘内或心室内递
送)施用。最优选csf内施用。优选的施用方式，任选地优选的人类施用方式是心室内。
[0157]
本发明的基因构建体和/或表达载体和/或组合物和/或药物可以使用本领域已知的合适方法直接或间接施用。考虑到迄今为止已经实现的进展，可以预期向个体或所述个体的细胞、组织、器官提供本发明的基因构建体和/或表达载体和/或组合物和/或药物的方式的改进。当然，可以结合这种未来的改进以实现本发明的上述效果。基因构建体和/或表达载体和/或组合物和/或药物可以递送至个体，所述个体的细胞、组织或器官。取决于疾病或病症，所述个体的细胞、组织或器官可以如本文先前所述。当施用本发明的基因构建体和/或表达载体和/或组合物和/或药物时，优选这样的基因构建体和/或表达载体和/或组合物和/或药物是溶解在与递送方法兼容的溶液中。
[0158]
如本文所涵盖的，治疗有效剂量的如上所述的基因构建体和/或表达载体和/或组合物优选以单一且独特的剂量施用，从而避免了重复的定期施用。
[0159]
基本信息
[0160]
除非另有说明，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员惯常和通常理解的含义相同的含义，并且鉴于本公开而阅读。
[0161]
序列同一性/相似性
[0162]
在本发明的上下文中，核酸分子例如编码胰岛素的核酸分子由编码蛋白质片段或多肽或肽或衍生肽的核苷酸序列表示。在本发明的上下文中，胰岛素蛋白片段或多肽或肽或衍生肽由氨基酸序列表示。
[0163]
将理解的是，本文中通过给定的序列同一性编号(seq id no:)鉴定的每个核酸分子或蛋白质片段或多肽或肽或衍生的肽或构建体不限于所公开的该特定序列。本文所鉴定的每个编码序列编码给定的蛋白质片段或多肽或肽或衍生的肽或构建体，或者其本身是蛋白质片段或多肽或构建体或肽或衍生的肽。在本技术全文中，每次指代编码给定蛋白质片段或多肽或肽或衍生肽的特定核苷酸序列seq id no(以seq id no:x为例)，都可以用以下代替：
[0164]
i.核苷酸序列，其包含与seq id no:x具有至少60％序列同一性的核苷酸序列；
[0165]
ii.核苷酸序列，其序列由于遗传密码的简并性而与(i)的核酸分子的序列不同；或
[0166]
iii.核苷酸序列，其编码与由核苷酸序列seq id no:x编码的氨基酸序列具有至少60％的氨基酸同一性或相似性的氨基酸序列。
[0167]
另一个优选的序列同一性或相似性水平是70％。另一个优选的序列同一性或相似性水平是80％。另一个优选的序列同一性或相似性水平是90％。另一个优选的序列同一性或相似性水平是95％。另一个优选的序列同一性或相似性水平是99％。
[0168]
在本技术全文中，每次提及特定的氨基酸序列seq id no(以seq idno:y为例)，都可以用以下代替：多肽，其包含与氨基酸序列seq id no:y具有至少60％序列同一性或相似性的氨基酸序列。另一个优选的序列同一性或相似性水平是70％。另一个优选的序列同一性或相似性水平是80％。另一个优选的序列同一性或相似性水平是90％。另一个优选的序列同一性或相似性水平是95％。另一个优选的序列同一性或相似性水平是99％。
[0169]
在进一步优选的实施方式中，借助于其与给定核苷酸序列或氨基酸序列的同一性或相似性百分比，本文描述的每个核苷酸序列或氨基酸序列分别与给定核苷酸或氨基酸序
列具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的同一性或相似性。
[0170]
每个非编码核苷酸序列(即启动子或另一个调控区的)可以被如下核苷酸序列取代，所述核苷酸序列包含与特定核苷酸序列seq id no(取seq id no:a为例)具有至少60％的序列同一性或相似性的核苷酸序列。优选的核苷酸序列与seq id no:a具有至少60％，至少61％，至少62％，至少63％，至少64％，至少65％，至少66％，至少67％，至少68％，至少69％，至少70％，至少71％，至少72％，至少73％，至少74％，至少75％，至少76％，至少77％，至少78％，至少79％，至少80％，至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％的同一性。在优选的实施方案中，如本领域技术人员已知的，此类非编码核苷酸序列例如启动子表现出或发挥至少这种非编码核苷酸序列的活性例如启动子的活性。例如，这种活性是诱导与启动子可操作地连接的核苷酸序列例如胰岛素编码序列的可检测的表达。
[0171]
术语“同源性”，“序列同一性”，“同一性”等在本文可互换使用。序列同一性在本文中描述为通过比较序列确定的两个或更多个氨基酸序列(肽或多肽或蛋白质)或两个或更多个核酸序列(多核苷酸)之间的关系。两个氨基酸序列之间的“相似性”或“序列相似性”是通过将一个多肽的氨基酸序列及其保守氨基酸取代物与第二个多肽的序列进行比较来确定的。可以通过已知方法容易地计算“同一性”和“相似性”，包括但不限于bioinformatics and the cell:modern computational approaches in genomics,proteomics and transcriptomics,xia x.,springer international publishing,new york,2018；和bioinformatics:sequence and genome analysis,mount d.,cold spring harbor laboratory press,new york,2004中描述的那些。
[0172]
可以根据两个给定seq id no的全长或其部分来计算序列同一性或相似性。在一些实施方案中，其部分是指两个seq id no的至少50％，60％，70％，80％，90％，95％或100％。在优选的实施方案中，通过比较本文鉴定的序列的全长来确定序列同一性或相似性。除非本文另外指出，与给定seq id no的同一性或相似性是指基于所述序列的全长(即，在其整个长度或整体上)的同一性或相似性。在本领域中，“同一性”还指氨基酸或核酸序列之间的序列相关性程度，如这通过这种序列的串的之间的匹配确定。
[0173]
取决于两个序列的长度，可以使用全局或局部比对算法通过两个肽或两个核苷酸序列的比对来确定序列同一性或相似性。优选使用全局比对算法(例如，needleman
‑
wunsch)对相似长度的序列进行比对，所述全球比对算法在整个长度上最佳地比对序列，而优选地，使用局部比对算法(例如，smith
‑
waterman)对基本上不同长度的序列进行比对。当序列(例如，使用默认参数通过程序emboss needle或emboss water进行最佳比对)共享至少某最小百分比的序列同一性或相似性(如下面所描述的)时，序列被称为“大体上相同”或“实质上相似”。
[0174]
当两个序列具有相似的长度时，全局比对适合用于确定序列同一性或相似性。当序列的总体长度大体不同时，优选局部比对(例如使用smith
‑
waterman算法的比对)。emboss needle使用needleman
‑
wunsch全局比对算法在两个序列的整个长度(全长)上进行比对，使得匹配数最大且空位数最小。emboss water使用smith
‑
waterman局部比对算法。通常，可以使用emboss needle和emboss water默认参数，空位开放罚分＝10(核苷酸序列)/10(蛋白质)，空位延伸罚分＝0.5(核苷酸序列)/0.5(蛋白质)。对于核苷酸序列，使用的默认评分矩阵是dnafull，而对于蛋白质，默认评分矩阵是blosum62(henikoff&henikoff，1992，pnas 89，915
‑
919)。
[0175]
或者，可以通过搜索公共数据库，使用诸如fasta、blast等算法来确定百分比相似性或同一性。也可以使用同源基因(https://en.wikipedia.org/wiki/homologene)，优选不修改默认参数。因此，本发明的一些实施方案的核苷酸和氨基酸序列可以进一步用作“查询序列”以对公共数据库进行搜索以例如识别其他家族成员或相关序列。可以使用altschul,et al.(1990)j.mol.biol.215:403
‑
10的blastn和blastx程序(2.0版)执行此类搜索。blast核苷酸搜索可以用nblast程序进行，评分＝100，字长＝12，以获得与本发明的核酸分子优选编码胰岛素的核酸分子同源的核苷酸序列。blast蛋白质搜索可以用blastx程序进行，评分＝50，字长＝3，以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的空位比对，可以如altschul等，(1997)nucleicacids res.25(17):3389
‑
3402中所述使用空位blast。当使用blast和gapped blast程序时，可以使用各个程序的默认参数(例如blastx和blastn)。请访问国家生物技术信息中心的主页，该主页可从以下万维网网址访问：www.ncbi.nlm.nih.gov/。
[0176]
任选地，在确定氨基酸相似度时，本领域技术人员还可以考虑所谓的保守氨基酸取代。
[0177]
如本文所使用的，“保守”氨基酸取代是指具有相似侧链的残基的互换性。下文示出了用于保守取代的氨基酸残基类别的实例。
[0178]
[0179]
备选的保守氨基酸残基取代类别如下：
[0180][0181][0182]
氨基酸残基的备选物理和功能分类：
[0183][0184]
例如，具有脂族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；
具有脂肪族羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有酰胺基侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；和具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和甲硫氨酸。优选的保守氨基酸取代基是：缬氨酸
‑
亮氨酸
‑
异亮氨酸，苯丙氨酸
‑
酪氨酸，赖氨酸
‑
精氨酸，丙氨酸
‑
缬氨酸和天冬酰胺
‑
谷氨酰胺。本文公开的氨基酸序列的取代变体是其中公开的序列中的至少一个残基已被去除并且在其位置插入了不同残基的那些。优选地，氨基酸变化是保守的。每个天然存在的氨基酸的优选的保守取代如下：ala取代为ser；arg取代为lys；asn取代为gln或his；asp取代为glu；cys取代为ser或ala；gln取代为asn；glu取代为asp；gly取代为pro；his取代为asn或gln；ile取代为leu或val；leu取代为ile或val；lys取代为arg；gln或glu；met取代为leu或ile；phe取代为met、leu或tyr；ser取代为thr；thr取代为ser；trp取代为tyr；tyr取代为trp或phe；和val取代为ile或leu。
[0185]
基因或编码序列
[0186]“基因”是dna或rna中的核苷酸序列，其编码具有功能的分子。核苷酸序列可以包括“非编码序列”以及“编码序列”。“基因”的编码区，也称为cds(来自编码序列)，是基因dna或rna中编码蛋白质的部分。非编码序列的实例是启动子和microrna靶序列，如本文别处所述。术语“基因”是指包含区域(转录区域)的dna片段，该区域在细胞中被转录成rna分子(例如mrna)，并与合适的调控区域(例如启动子)可操作地连接。基因通常将包含几个可操作地连接的片段，例如启动子，5'前导序列，编码区和3'非翻译序列(3'末端)，例如包含聚腺苷酸化和/或转录终止位点。嵌合或重组基因(例如嵌合或重组胰岛素基因)是通常在自然界中未发现的基因，例如其中启动子本质上不与部分或全部转录的dna区域缔合的基因。“基因的表达”是指这样的过程，其中将与适当的调节区特别是启动子可操作地连接的dna区域转录成具有生物学活性的rna，即能够被翻译成生物活性蛋白质或肽。
[0187]“转基因”在本文中被描述由为新引入细胞中的核苷酸序列表示的基因或编码序列或核酸分子(即编码胰岛素的分子)，即可能存在但通常在细胞中不表达或表达水平不足的基因。在本文中，“不足”是指尽管所述胰岛素在细胞中表达，但仍可发展如本文所述的病症和/或疾病。在这种情况下，本发明允许胰岛素的过表达。转基因可包括细胞的天然的序列，天然不会发生在细胞中的序列，并且它可以包括两者的组合。转基因可以含有编码胰岛素和/或额外的蛋白质的序列，如本文早期所鉴定的，其可以与适当的调控序列可操作地连接，用于在细胞中表达编码胰岛素的序列。优选地，转基因未整合到宿主细胞的基因组中。
[0188]
启动子
[0189]
如本文所使用的，术语“启动子”或“转录调控序列”是指用于控制一个或多个编码序列的转录的核酸片段，并且位于编码序列的转录起始位点的转录方向上游，通过存在dna依赖性rna聚合酶的结合位点、转录起始位点和任何其他dna序列的结构鉴定，包括但不限于转录因子结合位点，阻遏物和活化蛋白结合位点，以及本领域技术人员已知的任何其他核苷酸序列，用于直接或间接地调控启动子的转录量。“组成型”启动子是在大多数生理和发育条件下在大多数组织中有活性的启动子。“诱导型”启动子是一种在生理学或发育学上受调控的启动子，例如，通过应用化学诱导剂。
[0190]“遍在启动子”在基本上生物体的所有组织、器官和细胞中有活性。在一些实施方案中，遍在启动子在至少5、6、7、8、9、10种或更多种不同类型的组织、器官和/或细胞中驱动
表达。
[0191]“器官特异性”或“组织特异性”启动子是分别在特定类型的器官或组织中有活性的启动子。器官特异性和组织特异性启动子主要在一个器官或组织中调节一种或多种基因(或编码序列)的表达，但也可以在其他器官或组织中允许可检测的水平(“泄漏”)表达。如通过本领域技术人员已知的标准测定(例如qpcr，蛋白质印迹分析，elisa)对mrna或蛋白质的水平所评估的，其他器官或组织中的泄漏表达意味着，与器官特异性或组织特异性表达相比，低至少一倍，至少两倍，至少三倍，至少四倍，至少五倍，至少六倍，至少七倍，至少八倍，至少九倍或至少十倍，但仍然是可检测的表达。可以检测到泄漏表达的器官或组织的最大数量是五个，六个，七个或八个。
[0192]“cns和/或脑特异性启动子”是能够在cns和/或脑中启动转录的启动子，同时仍然允许在身体的其它(最多五，六，七或八个)器官和部位中的任何泄漏表达。cns和/或脑中的转录可以在相关区域中检测，例如cns和/或脑和/或下丘脑和/或皮质和/或海马和/或小脑和/或嗅球，以及细胞，例如神经元和/或神经胶质细胞。
[0193]
在本发明的上下文中，cns和/或脑特异性启动子可以是与其他器官或组织相比，能够驱动胰岛素优选或主要(至少高10％，至少高20％，至少高30％，至少高40％，至少高50％，至少高60％，至少高70％，至少高80％，至少高90％，至少高100％，至少高为150％，至少高200％或更高)在cns和/或脑中表达的启动子。其他器官或组织可以是肝脏、胰腺、脂肪组织、骨骼肌、心脏、肾脏、结肠、造血组织、肺、卵巢、脾脏、胃、睾丸等。优选地，其他器官是肝脏和/或心脏。其他器官也可能是骨骼肌。如本文所使用的，cns和/或脑特异性启动子还涵盖引导在cns和/或脑的特定区域或细胞亚群中表达的启动子。因此，cns
‑
和/或脑特异性启动子也可以选自海马特异性启动子、小脑特异性启动子、皮质特异性启动子、下丘脑特异性启动子和/或嗅球特异性启动子，或其任何组合。如在标题为“基本信息”章节所述，可以使用诸如qpcr、蛋白质印迹分析或elisa等技术评估表达。
[0194]
在整个申请中，当在表达的上下文中提到cns和/或脑特异性时，还分别设想了构成cns和/或脑的细胞类型的细胞类型特异性表达。
[0195]
可操作地连接
[0196]
如本文所使用的，术语“可操作地连接”是指多核苷酸元件在功能关系中的连接。当核酸与另一种核酸分子置于功能关系中时，其是“可操作地连接”的。例如，如果转录调控序列影响编码序列的转录，则转录调控序列可操作地连接到编码序列。可操作地连接意味着所连接的dna序列通常是连续的，在必要时连接阅读框中连续的两个蛋白质编码区域。可以通过在方便的限制性位点连接或插入代替的衔接子或接头或通过基因合成或本领域技术人员已知的任何其他方法来实现连接。
[0197]
microrna
[0198]
如本文所使用的，鉴于本公开的内容，“microrna”或“mirna”或“mir”具有本领域技术人员所理解的惯常和普通含义。microrna是在植物、动物和一些病毒中发现的小型非编码rna分子，其可在rna沉默和基因表达的转录后调控中起作用。microrna的靶序列可以表示为“mirt”。例如，microrna
‑
1或mirna
‑
1或mir
‑
1的靶序列可以表示为mirt
‑
1。
[0199]
蛋白质和氨基酸
[0200]
术语“蛋白质”或“多肽”或“氨基酸序列”可互换使用，并指的是由氨基酸链组成的
分子，不参考特定的作用方式、尺寸、三维结构或起源。在如本文所述的氨基酸序列中，氨基酸或“残基”由三个字母的符号表示。这些三字母的符号以及相应的一个字母符号是本领域技术人员所熟知的，并且具有以下含义：a(ala)是丙氨酸，c(cys)是半胱氨酸，d(asp)是天冬氨酸，e(glu)是谷氨酸，f(phe)是苯丙氨酸，g(gly)是甘氨酸，h(his)是组氨酸，i(ile)是异亮氨酸，k(lys)是赖氨酸，l(leu)是亮氨酸，m(met)是甲硫氨酸，n(asn)是天冬酰胺，p(pro)是脯氨酸，q(gln)是谷氨酰胺，r(arg)是精氨酸，s(ser)是丝氨酸，t(thr)是苏氨酸，v(val)是缬氨酸，w(trp)是色氨酸，y(tyr)是酪氨酸。残基可以是任何蛋白氨基酸，也可以是任何非蛋白氨基酸例如d
‑
氨基酸和通过翻译后修饰形成的修饰的氨基酸，以及任何非天然氨基酸。
[0201]
基因构建体
[0202]
如本文所述的基因构建体可以使用本领域技术人员已知的任何克隆和/或重组dna技术制备，其中编码所述胰岛素的核苷酸序列在合适的细胞，例如，培养的细胞或多细胞生物体的细胞中表达，如在ausubel等，"current protocols in molecular biology",greene publishing and wiley
‑
interscience,new york(1987)和sambrook和russell(2001,supra)中所描述的；两者都通过引用整体纳入本文。还参见kunkel(1985)proc.natl.acad.sci.82:488(描述定点诱变)和roberts等(1987)nature 328:731
‑
734或wells,j.a.,et al.(1985)gene 34:315(描述盒式诱变)。
[0203]
表达载体
[0204]
短语“表达载体”或“载体”通常是指能够在与这些序列相容的宿主中实现基因或编码序列的表达的核苷酸序列。表达载体携带能够在细胞中稳定并保持游离的基因组。在本发明的上下文中，细胞可能意味着包括用于制备构建体的细胞或其中将施用构建体的细胞。或者，载体能够整合到细胞的基因组中，例如通过同源重组或其他方式。
[0205]
这些表达载体通常包括至少合适的启动子序列和任选的转录终止信号。如本文所述，也可以使用必要或有助于实现表达的额外因子。编码胰岛素的核酸或dna或核苷酸序列掺入能够导入并在体外细胞培养物中表达的dna构建体中。具体地，dna构建体适用于在原核宿主，例如细菌，例如大肠杆菌中复制，或者可以被引入培养的哺乳动物、植物、昆虫(例如，sf9)、酵母、真菌或其他真核细胞系中。
[0206]
制备用于引入特定宿主的dna构建体可包括由宿主识别的复制系统，编码所需多肽的预期dna段，以及与多肽编码区段可操作地连接的转录和翻译起始和终止调控序列。本文已经描述了术语“可操作地连接”。例如，如果其刺激序列的转录，则启动子或增强子与编码序列可操作地连接。如果其表达为参与多肽分泌的前蛋白质，则信号序列的dna与编码多肽的dna可操作地连接。通常，可操作地连接的dna序列是邻接的，并且在信号序列的情况下，邻接且在阅读框中。然而，增强子不需要与它们控制转录的编码序列邻接。可以通过在方便的限制性位点连接或插入代替的衔接子或接头或通过基因合成或本领域技术人员已知的任何其他方法来实现连接。
[0207]
合适的启动子序列的选择通常取决于选择用于表达dna段的宿主细胞。合适的启动子序列的实例包括本领域熟知的原核以及真核启动子(参见，例如，sambrook和russell，2001，同上)。转录调控序列通常包括由宿主识别的异源增强子或启动子。适当的启动子的选择取决于宿主，但是，诸如trp、lac和噬菌体启动子、trna启动子和糖酵解酶启动子的启
动子是已知的和可用的(参见，例如，sambrook和russell，2001年，同上)。表达载体包括复制系统和转录和翻译调控序列以及用于多肽编码区段的插入部位。在大多数情况下，复制系统仅在用于制备载体的细胞(细菌细胞如大肠杆菌)中起作用。大多数质粒和载体不会在感染载体的细胞中复制。细胞系和表达载体的可行性组合的实例描述于sambrook和russell(2001，同上)和metzger等，(1988)nature 334:3136。例如，合适的表达载体可以在酵母例如酿酒酵母(s.cerevisiae)，昆虫细胞，例如sf9细胞，哺乳动物细胞，例如cho细胞和细菌细胞，例如大肠杆菌中表达。因此，细胞可以是原核或真核宿主细胞。细胞可以是适于在液体或固体培养基上培养的细胞。
[0208]
或者，宿主细胞是一种细胞，其是多细胞生物例如转基因植物或动物的一部分。
[0209]
病毒载体
[0210]
病毒载体或病毒表达载体或病毒基因治疗载体是包含如本文所述的基因构建体的载体。
[0211]
病毒载体或病毒基因治疗载体是适用于基因治疗的载体。适用于基因治疗的载体描述于anderson 1998,nature 392:25
‑
30；walther and stein,2000,drugs 60:249
‑
71；kay et al.,2001,nat.med.7:33
‑
40；russell,2000,j.gen.virol.81:2573
‑
604；amado and chen,1999,science 285:674
‑
6；federico,1999,curr.opin.biotechnol.10:448
‑
53；vigna and naldini,2000,j.gene med.2:308
‑
16；marin et al.,1997,mol.med.today 3:396
‑
403；peng and russell,1999,curr.opin.biotechnol.10:454
‑
7；sommerfelt,1999,j.gen.virol.80:3049
‑
64；reiser,2000,gene ther.7:910
‑
3和其中引用的文献。描述基因治疗载体的其他参考文献是naldini 2015,nature 5526(7573):351
‑
360；wang et al.2019nat rev drug discov 18(5):358
‑
378；dunbar et al.2018science 359(6372)；lukashey et al.2016bioschemistry(mosc)81(7):700
‑
708。
[0212]
特别合适的基因治疗载体包括腺病毒和腺伴随病毒(aav)载体。这些载体感染了大量分裂和非分裂细胞类型，包括滑膜细胞和肝脏细胞。进入细胞后腺病毒和aav载体的游离性质使得这些载体适用于治疗应用(russell,2000,j.gen.virol.81:2573
‑
2604；goncalves,2005,virol j.2(1):43)，如上所述。aav载体是甚至更优选的，因为已知它们导致转基因表达的非常稳定的长期表达(狗中最多9年(niemeyer et al,blood.2009 jan 22；113(4):797
‑
806)和人中约10年(buchlis,g.et al.,blood.2012 mar 29；119(13):3038
‑
41)。优选的腺病毒载体被修饰为减少宿主响应，如russell(2000，同上)所综述的。使用aav载体的基因治疗方法描述于wang et al.,2005,j gene med.march 9(印刷前电子出版),mandel et al.,2004,curr opin mol ther.6(5):482
‑
90,和martin et al.,2004,eye 18(11):1049
‑
55,nathwani et al,n engl j med.2011dec 22；365(25):2357
‑
65,apparailly et al,hum gene ther.2005apr；16(4):426
‑
34。
[0213]
另一个合适的基因治疗载体包括逆转录病毒载体。用于本发明的优选的逆转录病毒载体是基于慢病毒的表达构建体。慢病毒载体有能力感染并稳定地整合到分裂和非分裂细胞的基因组(amado and chen,1999science285:674
‑
6)。基于慢病毒的表达构建体的构建和使用方法描述于美国专利号6,165,782,6,207,455,6,218,181,6,277,633和6,323,031和federico中(1999,curr opin biotechnol 10:448
‑
53)，以及vigna et al.(2000,j gene med 2000；2:308
‑
16)。
[0214]
其他合适的基因治疗载体包括腺病毒载体、疱疹病毒载体、多瘤病毒载体或痘苗病毒载体。
[0215]
腺伴随病毒载体(aav载体)
[0216]
术语“腺伴随病毒”、“aav病毒”、“aav病毒体”，“aav病毒颗粒”和“aav颗粒”，用作本文的同义词，指由aav的至少一个衣壳蛋白(优选地由特定aav血清型的所有衣壳蛋白组成)和aav基因组的包封多核苷酸组成的病毒颗粒。如果颗粒包含侧翼为aav反向末端重复序列的异源多核苷酸(即与野生型aav基因组不同的多核苷酸，例如待递送到哺乳动物细胞的转基因)，则它们通常被称为“aav载体颗粒”或“aav病毒载体”或“aav载体”。aav是指属于细小病毒科(parvoviridae)依赖病毒属(dependovirus)的病毒。aav基因组的长度约为4.7kb，它由单链脱氧核糖核酸(ssdna)组成，单链脱氧核糖核酸可以是阳性或阴性可检测的。本发明还包括使用双链aav，也称为dsaav或scaav。基因组包括在dna链两端的反向末端重复序列(itr)，以及两个开放阅读框(orf)：rep和cap。该框rep由四个重叠基因组成，其编码aav生命周期所需的蛋白质rep。框cap含有与衣壳蛋白：vp1、vp2和vp3重叠的核苷酸序列，其相互作用以形成二十面体对称的衣壳(参见carter and samulski,int j mol med 2000,6(1):17
‑
27和gao et al,2004)。
[0217]
优选的病毒载体或优选的基因治疗载体是aav载体。本文所用的aav载体优选包含重组aav载体(raav载体)。如本文所用的“raav载体”是指包含源自如本文所述的aav血清型的衣壳蛋白的蛋白质壳中包裹的aav基因组部分的重组载体。aav基因组的一部分可含有衍生自腺伴随病毒血清型例如aav1，aav2，aav3，aav4，aav5等的反向末端重复序列(itr)。优选的itr是aav2的itr，其代表序列包含，基本上由，或由seq id no:35(5'itr)和seq id no:36(3'itr)组成。本发明还优选地涵盖了使用与seq id no:35具有至少80％(或至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％)的同一性的序列作为5'itr和与seq id no:36具有至少80％(或至少81％，至少82％，至少83％，至少84％，至少85％，至少86％，至少87％，至少88％，至少89％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％或100％)的同一性的序列作为3'itr。
[0218]
由衣壳蛋白组成的蛋白质壳可以衍生自任意aav血清型。蛋白质壳也可以命名为衣壳蛋白壳。raav载体可以具有一种或优选所有野生型aav基因缺失，但仍包含功能性itr核苷酸序列。功能性itr序列是aav病毒体的复制、拯救和包装所必需的。itr序列可以是野生型序列，或者可以与野生型序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％，至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性或可以例如通过插入、突变、缺失或核苷酸取代来改变，只要它们仍然具有功能。在上下文中，具有功能是指能够引导基因组包装到衣壳壳中，然后允许在待感染宿主细胞或靶细胞中表达。在本发明的上下文中，衣壳蛋白壳可以具有与raav载体基因组itr不同的血清型。
[0219]
由所选择的核苷酸序列，优选编码胰岛素的核苷酸序列表示的核酸分子优选插入raav基因组或itr序列之间，如上面鉴定的，例如表达构建体，其包含与编码序列和3'终止
序列可操作地连接的表达调控元件。所述核酸分子也可以称为转基因。
[0220]“aav辅助功能”通常是指提供给反式raav载体的raav复制和包装所需的相应aav功能。aav辅助功能补充了raav载体缺少的aav功能，但它们缺少aav itr(其由raav载体基因组提供)。aav辅助功能包括aav的两个主要orf，即rep编码区域和cap编码区域或其功能基本相同的序列。rep和cap区域在本领域中是众所周知的，参见例如chiorini等(1999,j.of virology,vol 73(2):1309
‑
1319)或us 5,139,941，通过引用并入本文。aav辅助功能可以在aav辅助构建体上提供。在宿主细胞中引入辅助构建体可以例如通过在引入本文所鉴定的raav载体中存在的raav基因组之前或同时转化、转染或转导发生。因此，可以选择本发明的aav辅助构建体，使得它们在一方面产生raav载体衣壳蛋白壳所需的血清型组合，另一方面产生在所述raav载体复制和包装中存在的raav基因组所需的的血清型组合。
[0221]“aav辅助病毒”提供aav复制和包装所需的额外功能。合适的aav辅助病毒包括腺病毒、单纯疱疹病毒(如hsv 1型和2型)和痘苗病毒。辅助病毒提供的额外功能也可以通过质粒引入宿主细胞中，如us6,531,456中所述，通过引用纳入本文。
[0222]“转导”是指通过病毒载体将胰岛素递送到受体宿主细胞中。例如，通过本发明的raav载体的靶细胞转导导致将载体中含有的raav基因组转移到转导的细胞中。“宿主细胞”或“靶细胞”是指dna递送发生的细胞，例如受试者的肌肉细胞。aav载体能够转导分裂和非分裂细胞。
[0223]
生产aav载体
[0224]
先前已经描述了用于载体化转基因的重组aav(raav)的产生。参见ayuso e,et al.,curr.gene ther.2010；10:423
‑
436,okada t,et al.,hum.gene ther.2009；20:1013
‑
1021,zhang h,et al.,hum.gene ther.2009；20:922
‑
929和virag t,et al.,hum.gene ther.2009；20:807
‑
817。可以使用或修改这些方案以产生本发明的aav。在一个实施方案中，生产细胞系用本发明的多核苷酸(包含侧翼为itr的表达盒)，和编码rep和cap蛋白并提供辅助功能的构建体瞬时转染。在另一个实施方案中，细胞系稳定地供应辅助功能，并且用本发明的多核苷酸(包含侧翼为itr的表达盒)和编码rep和cap蛋白的构建体瞬时转染。在另一个实施方案中，细胞系稳定地供应rep和cap蛋白和辅助功能，并且用本发明的多核苷酸瞬时转染。在另一个实施方案中，细胞系稳定地供应rep和cap蛋白，并且用本发明的多核苷酸和编码辅助功能的多核苷酸瞬时转染。在又一个实施方案中，细胞系稳定地供应本发明的多核苷酸，rep和cap蛋白和辅助功能。本领域已经描述了制造和使用这些和其他aav生产系统的方法。参见muzyczka n,et al.,us 5,139,941,zhou x,et al.,us 5,741,683,samulski r,et al.,us 6,057,152,samulski r,et al.,us 6,204,059,samulski r,et al.,us 6,268,213,rabinowitz j,et al.,us 6,491,907,zolotukhin s,et al.,us 6,660,514,shenk t,et al.,us 6,951,753,snyder r,et al.,us 7,094,604,rabinowitz j,et al.,us 7,172,893,monahan p,et al.,us 7,201,898,samulski r,et al.,us 7,229,823和ferrari f,et al.,us 7,439,065。
[0225]
存在于raav载体中的raav基因组包括至少aav血清型之一(优选在本文前面公开的血清型aav2)的反向末端重复区域(itr)的核苷酸序列，或与其基本上相同的核苷酸序列或与其具有至少60％同一性的核苷酸序列，以及插入两个itr之间的编码胰岛素的核苷酸序列(在适当的调控元件的控制下)。载体基因组需要使用侧翼5'和3'itr序列，以允许载体
基因组有效包装到raav衣壳中。
[0226]
已经测序了几个aav血清型和相应的itr的完整基因组(chiorini et al.1999,j.of virology vol.73,no.2,p1309
‑
1319)。它们可以克隆或通过本领域已知的化学合成制成，使用例如applied biosystems inc.(fosters,ca,usa)提供的寡核苷酸合成仪或标准分子生物学技术。itr可以从aav病毒基因组中克隆或从包含aav itr的载体中切除。itr核苷酸序列可以使用标准分子生物学技术连接在编码一种或多种治疗蛋白的核苷酸序列的任一个末端，或者itr之间的aav序列可以用所需的核苷酸序列代替。
[0227]
优选地，raav载体中存在的raav基因组不包含编码病毒蛋白的任何核苷酸序列，例如aav的rep(复制)或cap(衣壳)基因。该raav基因组可以进一步包含标志物或报告基因，例如本领域已知的编码抗生素抗性基因，荧光蛋白(例如gfp)或编码化学、酶或其他可检测的和/或可选择的产品的基因(例如lacz，aph等)。
[0228]
存在于所述raav载体中的raav基因组还包含与编码胰岛素的核苷酸序列可操作地连接的启动子序列。
[0229]
合适的3'未翻译的序列也可以与编码胰岛素的核苷酸序列可操作地连接。合适的3'未翻译的区域可以是与核苷酸序列天然相关的那些，或者可以衍生自不同的基因，例如sv40聚腺苷酸化信号(seq id no:37)和兔β
‑
珠蛋白聚腺苷酸化信号(seq id no:38)。
[0230]
表达
[0231]
可以通过本领域技术人员已知的任何方法评估表达。例如可以通过本领域技术人员已知的标准测定法，例如qpcr，蛋白质印迹分析或elisa，通过测量mrna或蛋白质水平上肝脏中转基因表达的水平来评估该表达。
[0232]
如本文所述，可以在施用基因构建体、表达载体或组合物后的任意时间评估表达。
[0233]
在本文的一些实施方案中，表达可以在1天、2天、3天、4天、1周、2周、3周、4周、5周、6周、7周、8周、9周或10周后检测。
[0234]
在本文的一些实施方案中，表达可以持续至少4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、14周、16周、18周、20周、22周、24周、28周、32周、36周、40周、44周、48周、1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、12年、15年、20年或以上。换句话说，这意味着在施用后4周、5周、6周、7周、8周、9周、10周、11周、12周、14周、16周、18周、20周、22周、24周、28周、32周、36周、40周、44周、48周、1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、12年、15年、20年或以上仍然可以检测到表达。
[0235]
在一些实施方案中，在单次施用后检测该表达。
[0236]
在本发明的上下文中，cns和/或脑和/或下丘脑和/或皮质和/或海马和/或小脑和/或嗅球特异性表达指与其他器官或组织相比，胰岛素优先或主要(至少高10％，至少高20％，至少高30％，至少高40％，至少高50％，至少高60％，至少高70％，至少高80％，至少高90％，至少高100％，至少高150％，至少高200％或更高)在cns和/或脑和/或下丘脑和/或皮质和/或海马和/或小脑和/或嗅球中表达。其他器官或组织可以是肝脏、胰腺、脂肪组织、骨骼肌、心脏等。在实施方案中，在肝脏、胰腺、脂肪组织、骨骼肌和/或心脏中检测不到表达。在一些实施方案中，在选自由肝脏、胰腺、脂肪组织、骨骼肌和心脏组成的组的至少一个，至少两个，至少三个，至少四个或所有器官中检测不到表达。可以如上所述评估表达。
[0237]
在整个申请中，在表达的上下文中，在提到了cns和/或脑和/或下丘脑和/或皮质
和/或海马和/或小脑和/或嗅球特异性时，还分别设想组成cns和/或脑和/或下丘脑和/或皮质和/或海马和/或小脑和/或嗅球的细胞类型的细胞类型特异性表达。
[0238]
施用
[0239]
如本文所使用的，“csf内施用”是指直接施用至位于围绕脑的脑膜的蛛网膜和软脑膜层之间的蛛网膜下腔空间中的csf。csf内施用可以通过小脑延髓池内、心室内或鞘内施用进行。如本文所使用的，“小脑延髓池内施用”是指施用至小脑延髓池内：位于小脑和延髓背面之间的蛛网膜下腔的开口。如本文所使用的，“心室内施用”意指施用至脑的两侧室中的任意一个中。如本文所使用的，“鞘内施用”涉及直接施用至脊柱的鞘内空间中的csf中。如本文所使用的，“实质内施用”是指直接局部施用至脑实质的任何区域中。如本文所使用的，“鼻内施用”是指通过鼻腔结构的施用。
[0240]
在优选的实施方案中，根据本发明的基因构建体、表达载体和组合物作为单剂量施用。
[0241]
密码子优化
[0242]
如本文所使用的，“密码子优化”是指用于修饰现有的编码序列或设计编码序列的过程，例如，以改善表达宿主细胞或生物体中从编码序列转录的转录本rna分子的翻译，或改善编码序列的转录。密码子优化包括但不限于包括针对编码序列选择密码子以适合表达宿主生物的密码子偏好的过程。例如，为了适合哺乳动物，优选鼠、犬或人表达宿主的密码子偏好。密码子优化还消除了可能负面影响rna稳定性和/或翻译的元件(例如终止序列，tata盒，剪接位点，核糖体进入位点，重复和/或富含gc的序列以及rna二级结构或不稳定性基序)。在一些实施方案中，密码子优化的序列显示出转录、rna稳定性和/或翻译增加至少3％，5％，10％，15％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％，100％或更多。
[0243]
cns和脑
[0244]
如本文所使用的，“中枢神经系统”或“cns”是指包括脑和脊髓的神经系统的一部分，向其传播感觉脉冲和运动脉冲从其通过，并且协调整个神经系统的活性。
[0245]
如本文所使用的，“脑”是指神经系统的中枢器官，由大脑、脑干和小脑组成。它控制了大多数身体的活动，处理，集成以及协调它从感知器官接收的信息，并为发送到身体其余部分的指示做出决定。
[0246]
特别地，如本文所使用的，“下丘脑”是指丘脑下方的前脑区域，其协调自主神经系统和垂体的活动，控制体温、口渴、饥饿和其他稳态系统，以及参与睡眠和情绪活动。如本文所用，“海马”属于边缘系统，在将信息从短期记忆强化到长期记忆中以及在使得能够的空间记忆中发挥重要作用。海马位于大脑皮层(异皮质)下方和灵长类动物的内侧颞叶。如本文所使用的，“皮质”或“大脑皮质”是人类和其他哺乳动物脑的大脑的神经组织的外层。它在记忆、注意力、知觉、意识、思想、语言和意识中起着关键作用。如本文所使用的，“小脑”是指所有脊椎动物后脑中的主要特征。在人类中，它在运动控制中起着重要作用。它还可能涉及一些认知功能，例如注意力和语言以及调节恐惧和愉悦反应。如本文所使用的，“嗅球”是指嗅觉系统(专用于嗅觉的系统)中的重要结构。嗅球发送信息以在扁桃体、眶额叶皮层(ofc)和海马中进行进一步处理，在那里它在情绪、记忆和学习方面发挥作用。
[0247]
记忆
[0248]
记忆通常被理解为脑的能力，数据或信息通过脑被编码、存储，和在需要时检索。
已经描述了不同的类型或记忆。一种可能的区别涉及感觉记忆、短期记忆和长期记忆。感觉记忆在感知到物品后不到一秒钟就保存了感觉信息。短期(也称为工作记忆)记忆允许在几秒到一分钟的时间内回忆，通常无需排练。相反，长期记忆可以在潜在的无限持续时间(长达整个生命周期)内存储更大量的信息。
[0249]
另一个区别涉及程序性记忆(或内隐记忆)和外显记忆(或陈述性记忆)。内隐记忆不是基于对信息的有意识回忆，而是基于内隐学习，即记住如何做某事。外显(或陈述性)记忆是对事实信息、以前的经验和概念的有意识的、有意的回忆。
[0250]
还可以区分回忆记忆和再认记忆。再认是指我们将事件或信息片段“再认”为熟悉的能力，而回忆则是指从记忆中检索相关细节。
[0251]
空间记忆是一种记忆形式，负责记录有关环境和空间方向的信息。
[0252]
在本文件及其权利要求中，动词“包括”及其变化形式以其非限制性意义使用，表示包括该词之后的项目，但不排除未特别提及的项目。另外，动词“由
……
组成”可以由“基本上由
……
组成”代替，表示本文所述的基因构建体、表达载体或组合物可包含除具体鉴定的组分以外的其它组分，所述其它组分不会改变本发明的独特特征。
[0253]
不定冠词“一”或“一个”所指的元件不排除存在一个以上元件的可能性，除非上下文明确要求有一个元件且仅存在一个元件。因此，不定冠词“一”或“一个”通常意指“至少一个”。
[0254]
如本文所使用的，“至少”特定值意指该特定值或更多。例如，“至少2”应理解为与“2或更多”相同，即2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15...，等等。
[0255]
各个数值表示为近似值，就好像这些值之前带有单词“大约”或“近似”。类似地，除非另外明确指出，否则在本技术中指定的各个范围内的数值被表示为近似值，好像在所述范围内的最小值和最大值前面均有单词“大约”或“近似”。如本文所使用的，术语“大约”和“近似”在指数值时应具有与所公开的主题最密切相关或与有争议的范围或元件相关的技术领域的普通技术人员的普通含义。从严格的数值边界扩展的数量取决于许多因素。例如，可以考虑的一些因素包括元件的临界性和/或给定量的变化将对所要求保护的主题的性能产生的影响，以及本领域技术人员已知的其他考虑因素。在没有任何相反的考虑的情况下，单词“大约”或“近似地”当与数值(例如约10)结合使用时，优选地是指该值可以是给定值(10)的或多或少1％的值。
[0256]
如本文所使用的，术语“和/或”表示一种或多种所述情况可单独发生或与至少一种所述情况组合发生，直至与所有所述情况一起发生。
[0257]
除非另有说明，否则本文描述的每个实施方案可以与本文描述的任何其他实施方案组合在一起。
[0258]
本文引用的所有专利申请、专利和印刷出版物，除任何定义，主题放弃或否认外，和所纳入的材料与本文的明确公开内容不符的情况除外，其中以本公开中的语言为准，均通过引用整体纳入本文。
[0259]
本领域技术人员将认识到可以在本发明的实践中使用的许多与本文描述的方法和材料相似或等同的方法和材料。实际上，本发明决不限于所描述的方法和材料。
[0260]
通过以下实施例进一步描述本发明，这些实施例不应解释为限制本发明的范围。
附图说明
[0261]
图1.hins在samp8小鼠脑中的表达。通过rtqpcr在samp8小鼠的下丘脑、皮质、海马和小脑中测量人胰岛素(hins)编码序列的表达水平，并用rplp0值归一化。在csf内施用5x10
10 vg/小鼠aav9
‑
cag
‑
hins
‑
dmirt载体后14周进行分析。结果表示为平均值
±
sem，n＝9只动物/组。nd，未检测的。
[0262]
图2.用aav9
‑
hins载体处理的samp8小鼠的脑部炎症减少。通过rtqpcr在samp8小鼠的下丘脑、海马和小脑中测量炎症分子(nfkb,il1b和il6)的表达水平，并用rplp0值归一化。在csf内施用5x10
10 vg/小鼠aav9
‑
cag
‑
hins
‑
dmirt载体后14周进行分析。结果表示为平均值
±
sem，n＝9只动物/组。*p<0.05，**p<0.01vs未经处理的小鼠。nfkb，核因子κb；il1b，白细胞介素
‑
1β；il6，白细胞介素
‑
6。
[0263]
图3.用aav9
‑
hins载体处理的samp8小鼠脑中星形胶质细胞标志物的表达增加。通过rtqpcr在samp8小鼠的下丘脑、皮质、海马和小脑中测量星形胶质细胞标志物(gfap和s100b)的表达水平，并用rplp0值归一化。在csf内施用5x10
10 vg/小鼠aav9
‑
cag
‑
hins
‑
dmirt载体后14周进行分析。结果表示为平均值
±
sem，n＝9只动物/组。*p<0.05，**p<0.01vs未经处理的小鼠。gfap，胶质细胞原纤维酸性蛋白；s100b，钙结合蛋白b。
[0264]
图4.aav9
‑
hins处理的samp8小鼠脑中的神经发生增加。通过rtqpcr在samp8小鼠的皮质中测量神经发生标志物(dcx,ncam和sox2)的表达水平，并用rplp0值归一化。在csf内施用5x10
10 vg/小鼠aav9
‑
cag
‑
hins
‑
dmirt载体后14周进行分析。结果表示为平均值
±
sem，n＝9只动物/组。*p<0.05vs未经处理的小鼠。dcx，双皮层蛋白；ncam，神经细胞粘附分子；sox2，性别决定区域y盒2。
[0265]
图5.hins在db/db小鼠脑中的表达。通过rtqpcr在db/db小鼠的下丘脑、皮质、海马和小脑中测量人胰岛素(hins)编码序列的表达水平，并用rplp0值归一化。在csf内施用5x10
10 vg/小鼠aav9
‑
cag
‑
hins
‑
dmirt载体后12周进行分析。结果表示为平均值
±
sem，n＝9只动物/组。nd，未检测的。
[0266]
图6.用aav9
‑
hins载体处理的db/db小鼠的脑部炎症减少。通过rtqpcr在db/db小鼠的下丘脑、海马和小脑中测量炎症分子(nfkb,il1b和il6)的表达水平，并用rplp0值归一化。在csf内施用5x10
10 vg/小鼠aav9
‑
cag
‑
hins
‑
dmirt载体后12周进行分析。结果表示为平均值
±
sem，n＝9只动物/组。**p<0.01vs未经处理的小鼠。nfkb，核因子κb；il1b，白细胞介素
‑
1β；il6，白细胞介素
‑
6。
[0267]
图7.用aav9
‑
hins载体处理的db/db小鼠脑中星形胶质细胞标志物的表达增加。通过rtqpcr在db/db小鼠的下丘脑、皮质、海马和小脑中测量星形胶质细胞标志物(gfap和s100b)的表达水平，并用rplp0值归一化。在csf内施用5x10
10 vg/小鼠aav9
‑
cag
‑
hins
‑
dmirt载体后12周进行分析。结果表示为平均值
±
sem，n＝9只动物/组。*p<0.05，**p<0.01vs未经处理的小鼠。gfap，胶质细胞原纤维酸性蛋白；s100b，钙结合蛋白b。
[0268]
图8.aav1
‑
hins、aav2
‑
hins和aav9
‑
hins载体在csf内施用后的脑转导。(a)在csf内施用5x10
10 vg/小鼠的aav1
‑
cag
‑
hins
‑
dmirt、aav2
‑
cag
‑
hins
‑
dmirt或aav9
‑
cag
‑
hins
‑
dmirt载体三周后，通过使用hins特异性引物进行定量pcr，在从野生型小鼠的下丘脑、皮质、海马和小脑分离的dna中测定载体基因组拷贝数。(b)通过rtqpcr在相同动物的下丘脑、皮质、海马和小脑中测量人胰岛素(hins)的表达水平。结果用rplp0值归一化。结果表示为
平均值
±
sem，n＝5只动物/组。nd，未检测的。
[0269]
图9.hins在samp8小鼠脑中的表达。通过rtqpcr在samp8小鼠的下丘脑、皮质、海马、小脑和嗅球中测量人胰岛素(hins)编码序列的表达水平，并用rplp0值归一化。在csf内施用5x10
10 vg/小鼠aav1
‑
cag
‑
hinsasp和aav1
‑
cag
‑
hinswt载体后34周分别进行分析。结果表示为平均值
±
sem，n＝5只动物/组。nd，未检测的。
[0270]
图10.使用aav1
‑
cag
‑
hinswt和aav1
‑
cag
‑
hinsasp载体进行csf基因治疗后，samp8小鼠短期和长期记忆的改善。(a)短期和(b)长期识别指数是在33周龄的samr1未处理的、samp8未处理的、samp8 aav1
‑
cag
‑
hinswt处理的和samp8 aav1
‑
cag
‑
hinsasp处理的小鼠的新物体识别测试中测量的，并按照实施例的一般程序中的解释进行计算。结果表示为平均值
±
sem，n＝5只动物/组。*p<0.05，**p<0.01vssamp8未经处理的小鼠。
[0271]
图11.用aav1
‑
cag
‑
hinswt进行csf内基因治疗后samp8小鼠学习能力的改善。学习能力在39周龄的未经处理的samr1、samp8未经处理的和samp8 aav1
‑
cag
‑
hinswt处理的小鼠的莫里斯水迷宫测试期间测量，并如实施例的一般程序中所解释的进行计算。结果表示为平均值
±
sem，n＝5只动物/组。
实施例
[0272]
通过使用aav载体研究胰岛素在脑中过表达时在脑中的作用。已经执行了三个不同的实验：
[0273]
·
用aav9
‑
ins处理samp8小鼠。使用的剂量：5x10
10 vg/小鼠(实施例1)。
[0274]
·
用aav9
‑
ins处理db/db小鼠。使用的剂量：5x10
10 vg/小鼠(实施例2)。
[0275]
·
用aav1
‑
cag
‑
hinsasp和aav1
‑
cag
‑
hinswt处理samp8小鼠。使用的剂量：5x10
10 vg/小鼠(实施例5)。
[0276]
此外，在野生型小鼠的csf内施用后，我们还检查了通过aav1
‑
hins、aav2
‑
hins和aav9
‑
hins载体的脑转导效率(实施例3)。
[0277]
实施例的一般程序
[0278]
受试者特征
[0279]
使用了雄性samp8/tahsd(samp8)、bks.cg
‑
+lepr
db
/+lepr
db olahsd(db/db)和c57bl/6j(野生型)小鼠。实施例5使用了samr1/tahsd(samr1)。随意给小鼠喂食标准饮食(2018s teklad global,harlan labs.,inc.,madison,wi,us，保持在12小时的明暗循环(上午8:00点光照)，和稳定的温度(22℃
±
2)下。为了进行组织采样，通过吸入麻醉异氟烷(abbott laboratories,abbott park,il,us)麻醉小鼠并断头。切下目标组织并保持在
‑
80℃直到分析。所有实验程序均已获得巴塞罗那自治大学动物与人类实验伦理委员会的批准。
[0280]
重组aav载体
[0281]
根据标准方法(ayuso,e.et al.,2010.curr gene ther.10(6):423
‑
36)通过对hek293细胞的三重转染产生血清型1、2和9的单链aav载体。对于实施例3，将细胞在dmem 10％fbs中于10个滚瓶(850cm2,平的；corning
tm
,sigma
‑
aldrich co.,saint louis,mo,us)中培养至80％汇合度，并通过磷酸钙方法用带有侧翼为aav2 itr(seq id no:40)的表达盒的质粒，分别带有aav2 rep基因和血清型1、2或9cap基因的aav的辅助质粒，以及带有腺病
毒辅助功能的质粒一起共转染。所使用的转基因是由早期增强子/鸡β肌动蛋白(cag)启动子(seq id no:22)驱动，并添加了mirt
‑
122a序列(5'caaacaccattgtcacactcca3',seq id no:7)的四个串联重复序列和克隆在表达盒3'非翻译区中的mirt
‑
1序列(5'ttacatacttctttacattcca3',seq id no:8)的四个串联重复序列的人胰岛素编码序列(seq id no:46)。对于实施例5，细胞用携带侧翼为aav2 itr(seq id no:49或seq id no:50)的表达盒的质粒、携带aav2rep基因和血清型1的aav的辅助质粒和携带腺病毒辅助功能的质粒共转染。所使用的转基因是分别包含弗林蛋白酶切割位点的人胰岛素天冬氨酸编码序列(seq id no:46)或包含弗林蛋白酶切割位点的人胰岛素野生型编码序列(seq id no:45)，由早期增强子/鸡β肌动蛋白(cag)启动子(seqid no:22)驱动。使用基于聚乙二醇沉淀步骤和两个连续氯化铯(cscl)梯度的优化方法纯化aav。该第二代基于cscl的方案显著减少了空aav衣壳以及dna和蛋白质杂质(ayuso,e.et al.,2010.curr gene ther.10(2010):423
‑
36)。纯化的aav载体用pbs透析，过滤并保存在
‑
80℃。根据描述的aav2参考标准物质的方案，使用线性化质粒dna作为标准曲线，通过定量pcr确定病毒基因组的效价(lock m.,et al.,hum.genether.2010；21:1273
‑
1285)。根据本领域众所周知的分子生物学技术构建载体。
[0282]
aav载体的体内csf内施用
[0283]
用氯胺酮(100mg/kg)和甲苯噻嗪(10mg/kg)腹膜内注射麻醉小鼠，从耳朵后面到大约肩胛骨之间头后部的皮肤刮毛并用乙醇漂洗。将小鼠俯卧，头部稍微向下倾斜。在枕骨和c1椎骨之间切成2毫米的头尾切口，以45
‑
55
°
的角度将汉密尔顿注射器引入小脑延髓池，并施用5μl载体稀释液。鉴于cns是载体递送的主要靶标区室，因此不考虑体重，给小鼠服用相同数量的载体基因组(vg)/小鼠(5x10
10 vg/小鼠)。
[0284]
rna分析
[0285]
使用tripure分离试剂(roche diagnostics corp.，indianapolis，in，us)，和rneasy mini kit或对于海马样品使用rneasy micro kit(qiagennv,venlo,nl)从下丘脑、皮质、海马、小脑和嗅球中获得总rna。为了消除残留的病毒基因组，用dnasei(qiagen nv，venlo，nl)处理总rna。为了进行rt
‑
pcr分析，使用transcriptor first strand cdna synthesis kit(04379012001，roche，california，usa)对1μg rna样品进行反转录。使用tb green premix ex taqii(takara bio europe，france)在lightcycler480ii(roche,mannheim,germany)中进行实时定量pcr。用rplp0值对数据进行归一化，并如先前所述进行分析(pfaffl，m.，nucleic acids res.2001；29(9)：e45)。
[0286]
载体生物分布
[0287]
下丘脑、皮质、海马、小脑和嗅球在蛋白酶k(0.2mg/ml)中消化过夜。使用masterpure dna纯化试剂盒(epicenter biotechnologies,madison,wi,us)分离总dna。通过taqman qpcr使用人胰岛素特异性引物和探针在20ng基因组dna中确定载体基因组拷贝数。每个样品的载体基因组是从标准曲线中插值的，该标准曲线是通过线性化质粒的连续稀释液而构建的，这些质粒带有掺入20ng非转导基因组dna的靶序列。
[0288]
新物体识别测试。
[0289]
新物体识别测试是在旷场箱中进行的。使用旷场测试使小鼠适应盒子。第二天，为了进行第一次试验，将两个相同的物体(a和b)放置在箱子的右上和左上象限中，然后将小
鼠放在两个物体的后面。探查10分钟后，将小鼠从盒子中取出，并允许休息10分钟。在第二次试验中，将一个相同的物体(a或b)替换为物体c(新物体)。然后将小鼠放回箱子中进行另外10分钟的探查，以评估短期记忆。第二次试验后24小时，进行第三次试验，用新物体(d)替换物体c。然后将小鼠放回箱子中进行另外10分钟的探查，以评估长期记忆。使用视频追踪系统(smart junior；panlab)记录和评估动物探查新物体所花费的时间。新物体识别测试记忆的评价表示为根据以下公式计算的辨别比的百分比：辨别比(％)＝(n
‑
f)/(n+f)x100％，其中n代表探查新物体所花费的时间，f代表探查同一物体所花费的时间。
[0290]
莫里斯水迷宫。
[0291]
训练小鼠通过游泳和依靠外部可见线索，在水箱(直径1米，温度26
‑
28℃)中定位水下平台(直径10cm)。五天程序：熟悉(第1天)，将小鼠放置在可见平台上，然后自由30秒。然后，在连续两次试验中，将小鼠从两个不同的起点插入迷宫中。如果小鼠在60s内没有到达平台，则将其引导至平台。测量到达可见平台的延迟；训练(第2
‑
4天)，将小鼠随机放置在不同的迷宫象限中。到达隐藏平台(位于“正确”象限)的延迟是通过每天两个时间段(时间段之间间隔1小时)的两次试验测量的，截断值为60s。测试(第5天)，最后一次训练之后是探索试验。移除隐藏平台，将小鼠放置在水池中央，使用视频追踪系统(viewpoint，法国)测量穿越平台所在区域的延迟。
[0292]
在实施例1
‑
4中，使用了具有弗林蛋白酶切割位点的智人胰岛素突变体his
‑
b10
‑
asp的核苷酸序列(hinsasp；seq id no:46)。在实施例5中，使用具有弗林蛋白酶切割位点的智人胰岛素突变体his
‑
b10
‑
asp的核苷酸序列(hinsasp；seq id no:46)和具有弗林蛋白酶切割位点的智人胰岛素野生型的核苷酸序列(hinswt；seq id no:45)。
[0293]
基因工程弗林蛋白酶内切蛋白酶切割位点允许在非胰腺组织中高效生产成熟胰岛素；胰岛素总产量的85
‑
93％是成熟胰岛素(gros et al.,hum gene ther.1997 dec 10；8(18):2249
‑
59；gros et al.hum gene ther.1999 may 1；10(7):1207
‑
17和riu et al.diabetes.2002 mar；51(3):704
‑
11)。已知弗林蛋白酶存在于不同的脑区域(foti et al.gene ther.2009 november；16(11):1314
–
1319)，从而允许从该器官中包含弗林蛋白酶切割位点的序列有效生产成熟胰岛素。
[0294]
实施例1通过csf内施用aav9
‑
cag
‑
hins
‑
dmirt载体，减少samp8小鼠中的神经炎症并增加神经发生
[0295]
我们评估了使用胰岛素的aav介导的脑基因工程对神经炎症和神经发生的治疗潜力。为此，我们使用了衰老加速小鼠易感8(samp8)小鼠，这是一种广泛使用的衰老小鼠模型，具有与年龄相关的脑部病变，如神经炎症(takeda t.,neurochem.res.2009,34(4):639
‑
659；
‑
ferr
éꢀ
c.et al.mol.neurobiol.2016,53(4):2435
‑
2450)。
[0296]
为此，通过小脑延髓池，对七周龄的雄性samp8小鼠进行局部csf内施用，使用在cag遍在启动子的控制下的5x10
10 vg/小鼠的编码人胰岛素的aav9载体，其包括肝脏特异性mir
‑
122和心脏特异性mir1(aav9
‑
cag
‑
hins
‑
dmirt)的靶标位点。作为对照，使用未经处理的samp8动物。在21周龄时对动物实施安乐死并采集组织样本进行分析。
[0297]
aav9
‑
cag
‑
hins
‑
dmirt载体的csf内施用介导了脑中胰岛素的广泛过度表达，如samp8小鼠的脑的不同区域(如下丘脑、皮质、海马和小脑)中人胰岛素表达水平的增加所证明的(图1)。
[0298]
通过促炎性分子nfkb、il1b和il6在脑的不同区域的表达来分析神经炎症。值得注意的是，这些促炎性分子的表达在所有分析的脑区域中都降低了(图2)。
[0299]
分析了星形胶质细胞标志物gfap和s100b的表达。用aav9
‑
cag
‑
hins
‑
dmirt载体csf内处理的samp8小鼠显示下丘脑、皮质、海马和小脑中gfap的表达增加(图3)以及皮质中s100b的表达增加(图3)。星形胶质细胞可以分泌神经递质和atp，它们能够调节附近神经元的活动(cai w.et al.journal of clinical investigation 2018,128(7):2914
‑
2926)。因此，星形胶质细胞数量的增加可以支持神经元活动并具有抗焦虑和抗抑郁作用。此外，伴随星形胶质细胞标志物增加的促炎标志物减少表明，在胰岛素基因治疗处理后增加的星形胶质细胞群体是“有益星形胶质细胞”群体，也称为“a2星形胶质细胞”。
[0300]
为了研究samp8处理小鼠的神经发生，进行了神经发生标志物的实时pcr。在aav9
‑
cag
‑
hins
‑
dmirt处理的小鼠的皮质中，双皮层蛋白(dcx)、神经细胞粘附分子(ncam)和性别决定区y盒2(sox2)表达增加(图4)。
[0301]
实施例2通过csf内施用aav9
‑
cag
‑
hins
‑
dmirt载体，减少db/db小鼠的神经炎症
[0302]
我们在db/db小鼠中评估了胰岛素对与肥胖和/或糖尿病相关的神经炎症的影响。db/db小鼠是一种广泛使用的肥胖和糖尿病遗传小鼠模型，其特征是瘦素信号传导缺陷。此外，这些小鼠不仅在脂肪组织和肝脏等外周组织中出现炎症，而且在脑中也出现炎症(dey et al,j.neuroimmmunol.2014)。
[0303]
为此，7周龄的雄性db/db小鼠通过小脑延髓池，csf内施用5x10
10
vg/小鼠的aav9
‑
cag
‑
hins
‑
dmirt载体。作为对照，使用未经处理的db/db动物。在19周龄时对动物实施安乐死并采集组织样本进行分析。
[0304]
类似于在samp8小鼠中所做的观察，aav9
‑
cag
‑
hins
‑
dmirt载体的csf内施用介导在db/db小鼠的下丘脑、皮质、海马和小脑中胰岛素的稳健过表达(图5)。
[0305]
在用胰岛素编码载体处理的db/db小鼠中，促炎性分子nfkb、il1b和il6的表达在所有分析的脑区域中均降低(图6)。此外，db/db处理的小鼠显示出下丘脑、皮质和海马中星形胶质细胞标志物gfap的表达增加，以及皮质中星形胶质细胞标志物s100b的表达增加(图7)。星形胶质细胞可以分泌神经递质和atp，它们能够调节附近神经元的活动(cai w.et al.journal of clinical investigation 2018,128(7):2914
‑
2926)。因此，星形胶质细胞数量的增加可以支持神经元活动并具有抗焦虑和抗抑郁作用。此外，伴随星形胶质细胞标志物增加的促炎标志物减少表明，在胰岛素基因疗法治疗后增加的星形胶质细胞群体是“有益星形胶质细胞”群体，也称为“a2星形胶质细胞”。
[0306]
实施例3在csf内施用aav1
‑
cag
‑
hins
‑
dmirt、aav2
‑
cag
‑
hins
‑
dmirt和aav9
‑
cag
‑
hins
‑
dmirt载体后的脑转导
[0307]
为了检查不同aav血清型是否能够有效地转导脑，用5x10
10
vg/小鼠的编码在cag遍在启动子的控制下的人胰岛素编码序列的aav1、aav2和aav9载体对野生型小鼠进行了处理，该载体包括肝脏特异性mir
‑
122a和心脏特异性mir
‑
1(aav1
‑
cag
‑
hins
‑
dmirt、aav2
‑
cag
‑
hins
‑
dmirt和aav9
‑
cag
‑
hins
‑
dmirt)的靶标位点。作为对照，使用未经处理的野生型小鼠。
[0308]
在csf内施用aav载体三周后，获得脑样本并确定载体基因组拷贝数和人胰岛素表达。如图8所示，我们发现在csf内施用aav1、aav2和aav9后，下丘脑、皮质、海马和小脑的转
导(图8a)和hins在相同脑区域的表达(图8b)。
[0309]
实施例4在阿尔茨海默氏病小鼠模型中csf内施用aav1
‑
cag
‑
hins载体
[0310]
为了评估使用胰岛素的aav介导的脑基因工程对阿尔茨海默氏病的治疗潜力，使用了3xtg
‑
ad(b6；129tg(appswe,taup301l)1lfa psen1
tm1mpm
)小鼠模型。3xtg
‑
ad是一种广泛使用的阿尔茨海默氏病小鼠模型，所有三个突变等位基因都是纯合的，psen1突变纯合和共注射的appswe和taup301l转基因纯合(belfiore,r.,aging cell.2019,181):e12873)。
[0311]
3xtg
‑
ad小鼠通过小脑延髓池在csf内局部施用5x10
10 vg/小鼠编码在cag遍在启动子控制下的人胰岛素的aav1载体。作为对照，使用未经处理的3xtg
‑
ad动物。在这些小鼠中进行了一些行为测试，如y迷宫、旷场迷宫和莫里斯水迷宫。在12月龄时对动物实施安乐死并采集血清和组织样本进行分析。
[0312]
这些样本的分析包括神经发生的研究(神经元标志物例如sox2、neun和dcx的表达)、神经炎症(gfap、iba1和几种细胞因子水平的表达)、β淀粉样蛋白(可溶性淀粉样蛋白和斑块)水平，突触变性的研究(突触泡蛋白和脊柱密度的蛋白质水平)，tau磷酸化水平。
[0313]
实施例5通过csf内施用aav1
‑
cag
‑
hinsasp和aav1
‑
cag
‑
hinswt载体改善samp8小鼠的短期和长期记忆和学习能力
[0314]
我们评估了使用胰岛素的aav介导的脑基因工程对认知下降的治疗潜力。为此，我们使用了samp8小鼠模型，该模型在8
‑
12个月龄时表现出认知下降(miyamoto,m.,physiol behav.1986；38(3):399
‑
406；markowska,al.,physiol behav.1998；64(1):15
‑
26)。
[0315]
七周龄的雄性samp8小鼠通过小脑延髓池局部csf内施用5x10
10
vg/小鼠的aav1载体(aav1
‑
cag
‑
hinsasp和aav1
‑
cag
‑
hinswt载体)，所述载体分别编码处于cag遍在启动子控制下的人胰岛素天冬氨酸或人胰岛素野生型编码序列。作为对照，使用未经处理的samp8动物和未经处理的sam/抗性1(samr1)动物。
[0316]
aav1
‑
cag
‑
hinsasp和aav1
‑
cag
‑
hinswt载体的csf内施用介导脑中胰岛素的广泛过度表达，这可以通过41周龄的samp8小鼠的脑的不同区域(例如下丘脑、皮质、海马、小脑和嗅球)中人胰岛素的表达水平增加证明(图9)。
[0317]
为了测试用编码胰岛素的病毒载体csf内处理对记忆的影响，在33周龄时进行了新物体识别测试。用aav1
‑
cag
‑
hinsasp或aav1
‑
cag
‑
hinswt编码载体处理的samp8小鼠的表现明显优于未处理的samp8群组(图10)，并且它们的识别指数与未经处理的samr1对照小鼠相似，两者均在第一次试验后10分钟(图10a)和24小时(图10b)，表明基因治疗后短期和长期记忆增加。
[0318]
在39周龄的aav1
‑
cag
‑
hinswt小鼠中使用莫里斯水迷宫测试评估了学习能力，在基因疗法治疗后，经处理的samp8小鼠首次进入平台的延迟降低(图11)，表明aav1
‑
cag
‑
hinswt施用到cns增强了samp8小鼠的学习能力。
[0319]
序列表
[0320]
[0321][0322]
智人胰岛素的核苷酸序列(seq id no:4)
[0323]
atggccctgtggatgcgcctcctgcccctgctggcgctgctggccctctggggacctgacccagccgcagcctttgtgaaccaacacctgtgcggctcacacctggtggaagctctctacctagtgtgcggggaacgaggcttcttctacacacccaagacccgccgggaggcagaggacctgcaggtggggcaggtggagctgggcgggggccctggtgcaggcagcctgcagcccttggccctggaggggtccctgcagaagcgtggcattgtggaacaatgctgtaccagcatctgctccctctaccagctggagaactactgcaactag
[0324]
智人胰岛素的氨基酸序列(seq id no:1)
[0325]
malwmrllpllallalwgpdpaaafvnqhlcgshlvealylvcgergffytpktrreaedlqvgqvelg
ggpgagslqplalegslqkrgiveqcctsicslyqlenycn
[0326]
具有弗林蛋白酶切割位点的智人胰岛素的核苷酸序列cleaving sites(seq id no:45)
[0327]
atggccctgtggatgcgcctcctgcccctgctggcgctgctggccctctggggacctgacccagccgcagcctttgtgaaccaacacctgtgcggctcacacctggtggaagctctctacctagtgtgcggggaacgaggcttcttctacacacccaggaccaagcgggaggcagaggacctgcaggtggggcaggtggagctgggcgggggccctggtgcaggcagcctgcagcccttggccctggaggggtcgcgacagaagcgtggcattgtggaacaatgctgtaccagcatctgctccctctaccagctggagaactactgcaactag
[0328]
具有弗林蛋白酶切割位点的智人胰岛素的氨基酸序列(seq id no:41)
[0329]
malwmrllpllallalwgpdpaaafvnqhlcgshlvealylvcgergffytprtkreaedlqvgqvelgggpgagslqplalegsrqkrgiveqcctsicslyqlenycn
[0330]
具有弗林蛋白酶切割位点的智人胰岛素突变体(his
‑
b10
‑
asp)的核苷酸序列(seq id no:46)
[0331]
atggccctgtggatgcgcctcctgcccctgctggcgctgctggccctctggggacctgacccagccgcagcctttgtgaaccaacacctgtgcggctcagatctggtggaagctctctacctagtgtgcggggaacgaggcttcttctacacacccaggaccaagcgggaggcagaggacctgcaggtggggcaggtggagctgggcgggggccctggtgcaggcagcctgcagcccttggccctggaggggtcgcgacagaagcgtggcattgtggaacaatgctgtaccagcatctgctccctctaccagctggagaactactgcaactag
[0332]
具有弗林蛋白酶切割位点的智人胰岛素突变体(his
‑
b10
‑
asp)的氨基酸序列(seq id no:42)
[0333]
malwmrllpllallalwgpdpaaafvnqhlcgsdlvealylvcgergffytprtkreaedlqvgqvelgggpgagslqplalegsrqkrgiveqcctsicslyqlenycn
[0334]
小家鼠胰岛素的核苷酸序列(seq id no:5)
[0335]
atggccctgtggatgcgcttcctgcccctgctggccctgctcttcctctgggagtcccaccccacccaggcttttgtcaagcagcacctttgtggttcccacctggtggaggctctctacctggtgtgtggggagcgtggcttcttctacacacccatgtcccgccgtgaagtggaggacccacaagtggcacaactggagctgggtggaggcccgggagcaggtgaccttcagaccttggcactggaggtggcccagcagaagcgtggcattgtagatcagtgctgcaccagcatctgctccctctaccagctggagaactactgcaactag
[0336]
小家鼠胰岛素的氨基酸序列(seq id no:2)
[0337]
malwmrflpllallflweshptqafvkqhlcgshlvealylvcgergffytpmsrrevedpqvaqlelgggpgagdlqtlalevaqqkrgivdqcctsicslyqlenycn
[0338]
褐家鼠胰岛素的核苷酸序列(seq id no:47)
[0339]
atggccctgtggatccgcttcctgcccctgctggccctgctcatcctctgggagccccgccctgcccaggcttttgtcaaacagcacctttgtggttctcacttggtggaagctctctacctggtgtgtggggagcgtggattcttctacacacccatgtcccgccgcgaagtggaggacccacaagtggcacaactggagctgggtggaggcccgggggcaggtgaccttcagaccttggcactggaggtggcccggcagaagcgcggcatcgtggatcagtgctgcaccagcatctgctctctctaccaactggagaactactgcaactag
[0340]
褐家鼠胰岛素的氨基酸序列(seq id no:43)malwirflpllallilweprpaqafvkqhlcgshlvealylvcgergffytpmsrrevedpqvaqlelgggpgagdlqtlalevarqkrgivdqcctsicslyqlen
ycn
[0341]
中华田园犬胰岛素的核苷酸序列(seq id no:6)
[0342]
atggccctctggatgcgcctcctgcccctgctggccctgctggccctctgggcgcccgcgcccacccgagccttcgttaaccagcacctgtgtggctcccacctggtagaggctctgtacctggtgtgcggggagcgcggcttcttctacacgcctaaggcccgccgggaggtggaggacctgcaggtgagggacgtggagctggccggggcgcctggcgagggcggcctgcagcccctggccctggagggggccctgcagaagcgaggcatcgtggagcagtgctgcaccagcatctgctccctctaccagctggagaattactgcaactag
[0343]
中华田园犬胰岛素的氨基酸序列(seq id no:3)
[0344]
malwmrllpllallalwapaptrafvnqhlcgshlvealylvcgergffytpkarrevedlqvrdvelagapgegglqplalegalqkrgiveqcctsicslyqlenycn
[0345]
黑猩猩胰岛素的核苷酸序列(seq id no:48)
[0346]
atggccctgtggatgcgcctcctgcccctgctggtgctgctggccctctggggacctgacccagcctcggcctttgtgaaccaacacctgtgcggctcccacctggtggaagctctctacctagtgtgcggggaacgaggcttcttctacacacccaagacccgccgggaggcagaggacctgcaggtggggcaggtggagctgggcgggggccctggtgcaggcagcctgcagcccttggccctggaggggtccctgcagaagcgtggtatcgtggaacaatgctgtaccagcatctgctccctctaccagctggagaactactgcaactag
[0347]
黑猩猩胰岛素的氨基酸序列(seq id no:44)
[0348]
malwmrllpllvllalwgpdpasafvnqhlcgshlvealylvcgergffytpktrreaedlqvgqvelgggpgagslqplalegslqkrgiveqcctsicslyqlenycn
[0349]
cag启动子的核苷酸序列(seq id no:22)
[0350]
gacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtcgaggtgagccccacgttctgcttcactctccccatctcccccccctccccacccccaattttgtatttatttattttttaattattttgtgcagcgatgggggcggggggggggggggggcgcgcgccaggcggggcggggcggggcgaggggcggggcggggcgaggcggagaggtgcggcggcagccaatcagagcggcgcgctccgaaagtttccttttatggcgaggcggcggcggcggcggccctataaaaagcgaagcgcgcggcgggcgggagtcgctgcgttgccttcgccccgtgccccgctccgcgccgcctcgcgccgcccgccccggctctgactgaccgcgttactcccacaggtgagcgggcgggacggcccttctcctccgggctgtaattagcgcttggtttaatgacggcttgtttcttttctgtggctgcgtgaaagccttgaggggctccgggagggccctttgtgcggggggagcggctcggggggtgcgtgcgtgtgtgtgtgcgtggggagcgccgcgtgcggctccgcgctgcccggcggctgtgagcgctgcgggcgcggcgcggggctttgtgcgctccgcagtgtgcgcgaggggagcgcggccgggggcggtgccccgcggtgcggggggctgcgaggggaacaaaggctgcgtgcggggtgtgtgcgtgggggggtgagcagggggtgtgggcgcgtcggtcgggctgcaaccccccctgcacccccctccccgagttgctgagcacggcccggcttcgggtgcggggctccgtacggggcgtggcgcggggctcgccgtgccgggcggggggtggcggcaggtgggggtgccgggcggggcggggccgcctcgggccggggagggctcgggggaggggcgcggcggcccccggagcgccggcggctgtcgaggcgcggcgagccgcagccattgccttttatggtaatcgtgcgagagggcgcagggacttcctttgtcccaaatctgtgcggagccgaaatctgggaggcgccgccgcacccc
ctctagcgggcgcggggcgaagcggtgcggcgccggcaggaaggaaatgggcggggagggccttcgtgcgtcgccgcgccgccgtccccttctccctctccagcctcggggctgtccgcggggggacggctgccttcgggggggacggggcagggcggggttcggcttctggcgtgtgaccggcggctctagagcctctgctaaccatgttcatgccttcttctttttcctacag
[0351]
cmv启动子的核苷酸序列(seq id no:23)
[0352]
gtgatgcggttttggcagtacaccaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactgcgatcgcccgccccgttgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagct
[0353]
cmv增强子的核苷酸序列(seq id no:24)
[0354]
ggcattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtccgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttacgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatg
[0355]
cmv启动子和cmv增强子序列(seq id no:39)
[0356]
ggcattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtccgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttacgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacaccaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactgcgatcgcccgccccgttgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagct
[0357]
截短的aav2 5’itr(seq id no:35)
[0358]
gcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact aggggttcct
[0359]
截短的aav2 3’itr(seq id no:36)
[0360]
aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc gagcgcgc
[0361]
兔β珠蛋白聚腺苷酸化信号(兔β珠蛋白的3'utr和侧翼区域，包括多聚a信号)(seq id no:38)
[0362]
gatctttttccctctgccaaaaattatggggacatcatgaagccccttgagcatctgacttctggctaataaaggaaatttattttcattgcaatagtgtgttggaattttttgtgtctctcactcggaaggacatatgggagggcaaatcatttaaaacatcagaatgagtatttggtttagagtttggcaacatatgcccatatgctggctgccatgaacaaaggttggctataaagaggtcatcagtatatgaaacagccccctgctgtccattccttattccatagaaaagccttgacttgaggttagattttttttatattttgttttgtgttatttttttctttaacatccctaaaattttccttacatgttttactagccagatttttcctcctctcctgactactcccagtcatagctgtccctcttctcttatggagatc
[0363]
mirt序列
[0364]
mirt
‑
122a(seq id no:7):5’caaacaccattgtcacactcca 3’,靶向microrna
‑
122a(mirbase数据库登陆号mi0000442)，其在肝脏中表达
[0365]
mirt
‑
152(seq id no:9):5’ccaagttctgtcatgcactga 3’,靶向microrna
‑
152(mi0000462),其在肝脏中表达。
[0366]
mirt
‑
199a
‑
5p(seq id no:10):5’gaacaggtagtctgaacactggg 3’,靶向microrna 199a(mi0000242)，其在肝脏中表达。
[0367]
mirt
‑
199a
‑
3p(seq id no:11):5’taaccaatgtgcagactactgt 3’,靶向microrna
‑
199a(mi0000242)，其在肝脏中表达。
[0368]
mirt
‑
215(seq id no:12):5’gtctgtcaattcataggtcat 3’,靶向rna
‑
215(mi0000291)，其在肝脏中表达。
[0369]
mirt
‑
192(seq id no:13):5’ggctgtcaattcataggtcag 3’,靶向microrna
‑
192(mi0000234)，其在肝脏中表达。
[0370]
mirt
‑
148a(seq id no:14):5’acaaagttctgtagtgcactga 3’,靶向microrna
‑
148a(mi0000253)，其在肝脏中表达。
[0371]
mirt
‑
194(seq id no:15):5’tccacatggagttgctgttaca 3’,靶向microrna
‑
194(mi0000488)，其在肝脏中表达。
[0372]
mirt
‑
133a(seq id no:16):5’cagctggttgaaggggaccaaa 3’,靶向microrna
‑
133a(mi0000450)，其在心脏中表达。
[0373]
mirt
‑
206(seq id no:17):5’ccacacacttccttacattcca 3’,靶向microrna
‑
206(mi0000490)，其在心脏中表达。
[0374]
mirt
‑
1(seq id no:8):5’ttacatacttctttacattcca 3’,靶向microrna
‑
1(mi0000651)，其在心脏中表达。
[0375]
mirt
‑
208a
‑
5p(seq id no:18):5’gtataacccgggccaaaagctc 3’,靶向microrna
‑
208a(mi0000251)，其在心脏中表达。
[0376]
mirt
‑
208a
‑
3p(seq id no:19):5’acaagctttttgctcgtcttat 3’,靶向microrna
‑
208a(mi0000251)，其在心脏中表达。
[0377]
mirt
‑
499
‑
5p(seq id no:20):5’aaacatcactgcaagtcttaa 3’,靶向microrna
‑
499(mi0003183)，其在心脏中表达。
[0378]
迷你cmv:cmv中间早期启动子(seq id no:25)
[0379]
tatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcagagctctctggctaactagagaacccactgcttaactggcttatcgaaattaatacgactcactatagggagacccaagctt
[0380]
ef1α启动子的核苷酸序列(seq id no:26)
[0381]
ggctccggtgcccgtcagtgggcagagcgcacatcgcccacagtccccgagaagttggggggaggggtcggcaattgaaccggtgcctagagaaggtggcgcggggtaaactgggaaagtgatgtcgtgtactggctccgcctttttcccgagggtgggggagaaccgtatataagtgcagtagtcgccgtgaacgttctttttcgcaacgggtttgccg
ccagaacacaggtaagtgccgtgtgtggttcccgcgggcctggcctctttacgggttatggcccttgcgtgccttgaattacttccactggctgcagtacgtgattcttgatcccgagcttcgggttggaagtgggtgggagagttcgaggccttgcgcttaaggagccccttcgcctcgtgcttgagttgaggcctggcctgggcgctggggccgccgcgtgcgaatctggtggcaccttcgcgcctgtctcgctgctttcgataagtctctagccatttaaaatttttgatgacctgctgcgacgctttttttctggcaagatagtcttgtaaatgcgggccaagatctgcacactggtatttcggtttttggggccgcgggcggcgacggggcccgtgcgtcccagcgcacatgttcggcgaggcggggcctgcgagcgcggccaccgagaatcggacgggggtagtctcaagctggccggcctgctctggtgcctggcctcgcgccgccgtgtatcgccccgccctgggcggcaaggctggcccggtcggcaccagttgcgtgagcggaaagatggccgcttcccggccctgctgcagggagctcaaaatggaggacgcggcgctcgggagagcgggcgggtgagtcacccacacaaaggaaaagggcctttccgtcctcagccgtcgcttcatgtgactccacggagtaccgggcgccgtccaggcacctcgattagttctcgagcttttggagtacgtcgtctttaggttggggggaggggttttatgcgatggagtttccccacactgagtgggtggagactgaagttaggccagcttggcacttgatgtaattctccttggaatttgccctttttgagtttggatcttggttcattctcaagcctcagacagtggttcaaagtttttttcttccatttcaggtgtcgtga
[0382]
rsv启动子的核苷酸序列(seq id no:27)
[0383]
catgtttgacagcttatcatcgcagatccgtatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttggaggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaatttaagctacaacaaggcaaggcttgaccgacaattgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttgcgctgcttcgcgatgtacgggccagatattcgcgtatctgaggggactagggtgtgtttaggcgaaaagcggggcttcggttgtacgcggttaggagtcccctcaggatatagtagtttcgcttttgcatagggagggggaaatgtagtcttatgcaatactcttgtagtcttgcaacatggtaacgatgagttagcaacatgccttacaaggagagaaaaagcaccgtgcatgccgattggtggaagtaaggtggtacgatcgtgccttattaggaaggcaacagacgggtctgacatggattggacgaaccactaaattccgcattgcagagatattgtatttaagtgcctagctcgatacaataaacgccatttgaccattcaccacattggtgtgcacctccaagctgggtaccagct
[0384]
突触蛋白1启动子(seq id no:28)
[0385]
ctgcgctctcaggcacgacacgactcctccgctgcccaccgcagactgaggcagcgctgagtcgccggcgccgcagcgcagatggtcgcgcccgtgcccccctatctcgcgcctcgcgtggtgcggtccggctgggccggcggcggcgcggacgcgaccaaggtggccgggaaggggagtttgcgggggaccggcgagtgacgtcagcgcgccttcagtgctgaggcggcggtggcgcgcgccgccaggcgggggcgaaggcactgtccgcggtgctgaagctggcagtgcgcacgcgcctcgccgcatcctgtttcccctccccctctctgataggggatgcgcaatttggggaatgggggttgggtgcttgtccagtgggtcggggtcggtcgtcaggtaggcacccccaccccgcctcatcctggtcctaaaacccacttgcact
[0386]
钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶ii(camkii)启动子(seq id no:29)
[0387]
taacattatggccttaggtcacttcatctccatggggttcttcttctgattttctagaaaatgagatgggggtgcagagagcttcctcagtgacctgcccagggtcacatcagaaatgtcagagctagaacttgaactcagattactaatcttaaattccatgccttgggggcatgcaagtacgatatacagaaggagtgaactcattagggcagatgaccaatgagtttaggaaagaagagtccagggcagggtacatctacaccacccgcccagccctgggtgagtccagccacgttcacctcattatagttgcctctctccagtcctaccttgacgggaagcacaagcagaaactgggacaggagccccaggagaccaaatcttcatggtccctctgggaggatgggtggggagagctgtggcagaggcctcaggaggggccctgctgctcagtggtgacagataggggtgagaaagcagacagagtcattccgtcagcattctgggtctgtttggtacttcttctcacgctaaggtggcggtgtgatatgcacaatggctaaaaagcagggagagctggaaagaaacaaggacaga
gacagaggccaagtcaaccagaccaattcccagaggaagcaaagaaaccattacagagactacaagggggaagggaaggagagatgaattagcttcccctgtaaaccttagaacccagctgttgccagggcaacggggcaatacctgtctcttcagaggagatgaagttgccagggtaactacatcctgtctttctcaaggaccatcccagaatgtggcacccactagccgttaccatagcaactgcctctttgccccacttaatcccatcccgtctgttaaaagggccctatagttggaggtgggggaggtaggaagagcgatgatcacttgtggactaagtttgttcgcatccccttctccaaccccctcagtacatcaccctgggggaacagggtccacttgctcctgggcccacacagtcctgcagtattgtgtatataaggccagggcaaagaggagcaggttttaaagtgaaaggcaggcaggtgttggggaggcagttaccggggcaacgggaacagggcgtttcggaggtggttgccatggggacctggatgctgacgaaggctcgcgaggctgtgagcagccacagtgccctgctcagaagccccaagctcgtcagtcaagccggttctccgtttgcactcaggagcacgggcaggcgagtggcccctagttctgggggcagcgggg
[0388]
胶质细胞原纤维酸性蛋白(gfap)启动子(seq id no:30)
[0389]
cgcgtgatctaacatatcctggtgtggagtaggggacgctgctctgacagaggctcgggggcctgagctggctctgtgagctggggaggaggcagacagccaggccttgtctgcaagcagacctggcagcattgggctggccgccccccagggcctcctcttcatgcccagtgaatgactcaccttggcacagacacaatgttcggggtgggcacagtgcctgcttcccgccgcaccccagcccccctcaaatgccttccgagaagcccattgagcagggggcttgcattgcaccccagcctgacagcctggcatcttgggataaaagcagcacagccccctaggggctgcccttgctgtgtggcgccaccggcggtggagaacaaggctctattcagcctgtgcccaggaaaggggatcaggggatgcccaggcatggacagtgggtggcagggggggagaggagggctgtctgcttcccagaagtccaaggacacaaatgggtgaggggagagctctccccatagctgggctgcggcccaaccccaccccctcaggctatgccagggggtgttgccaggggcacccgggcatcgccagtctagcccactccttcataaagccctcgcatcccaggagcgagcagagccagagcaggttggagaggagacgcatcacctccgctgctcgcggggtctagagtcga
[0390]
巢蛋白启动子(seq id no:31)
[0391]
gaaggcagcccccggaggtcaaaggctgggcacgcgggaggagaggccagagtcagaggctgcgggtatctcagatatgaaggaaagatgagagaggctcaggaagaggtaagaaaagacacaagagaccagagaagggagaagaattagagagggaggcagaggaccgctgtctctacagacatagctggtagagactgggaggaagggatgaaccctgagcgcatgaagggaaggaggtggctggtggtatatggaggatgtagctgggccagggaaaagatcctgcactaaaaatctgaagctaaaaataacaggacacggggtggagaggcgaaaggagggcagattgaggcagagagactgagaggcctggggatgtgggcattccggtagggcacacagttcacttgtcttctctttttccaggaggccaaagatgctgacctcaagaactcataataccccagtggggaccaccgcattcatagccctgttacaagaagtgggagatgttcctttttgtcccagactggaaatccattacatcccgaggctcaggttctgtggtggtcatctctgtgtggcttgttctgtgggcctacctaaagtcctaagcacagctctcaagcagatccgaggcgactaagatgctagtaggggttgtctggagagaagagccgaggaggtgggctgtgatggatcagttcagctttcaaataaaaaggcgtttttatattctgtgtcgagttcgtgaacccctgtggtgggcttctccatctgtctgggttagtacctgccactatactggaataaggagacgcctgcttccctcgagttggctggacaaggttatgagcatccgtgtacttatggggttgccagcttggtcctggatcgcccgggcccttcccccacccgttcggttccccaccaccacccgcgctcgtacgtgcgtctccgcctgcagctcttgactcatcggggcccccgggtcacatgcgctcgctcggctctataggcgccgccccctgcccaccccccgcccgcgctgggagccgcagccgccgccactcctgctctctctgcgccgccgccgtcaccaccgccaccgccaccggctgagtctgcagtcctccgaaacgggccctct
[0392]
同源框蛋白9启动子(hb9)启动子(seq id no:32)
[0393]
tgaataaatttaagcaggctaattaatatataaactagctcaatttgtcaagttgatttgtattttagttaattgtgaaagtaattaccacatggtcaaattaacagctttctggaaatgaccaagcctgaggttttatttccttcctgggtgaagaaaattcatttttccaagctcttgatgtgatgaataaaagtcataaatctgggtgattggtgcaggcagagtctaaatggcttcatatttcattttaggtttaatagaaatattcatgctctgttttaatgaaattaaattgaagggggatggggctagagtggttagctgatgaattgacaaaaactaatcagctttattgggaaacaggtttaagggcacggacgtgtcaataacgctcagcctgaccccctcttccattagctaggcaggctgattaga
[0394]
酪氨酸羟化酶(th)启动子(seq id no:33)
[0395]
ctgctaggggctgcttcccagctactcctcttggctccgtggcttgccttccagcctgtgtgctgtctggagagcctttaaagcctcacttccaccaactagaagtctctccccaaccctgccctgacctcaagtgcacctcttcaaagtcaggtttagcagctgcagctgggggccctgaatcccacccctgctgtcttccttgaagacagaagtgttgggagctgaggatctgggctagagactggctgtatgatccagagaagtagtgtgcttctgggcctcagatttcccttctgtagaacaggtttgtctgaaatggagaggttggtgctcctctgcagggcctagtgggagtcaccatgagtggttaaaagatccagcttgtcttttggtgagctttgagaggaggtaacagggctgagttctggaagcctgaccaagggcagacttaaggggcctcttggagttgttctcatcaaatggggatgggacacagctaaagtgcccagggcttctctgtgcccacagatgctttagatcttggcacagtgtggtctaccagctgtctctctctgtgtatatatatgtatttcatagacagtgtacagtggcctggtttgtgctatcaggctggatatggacagaggcaagagtttgtggcagcagttatctcccaagagagtccaaagacatcatgttttcaagtttaggccaggtgctacttgagagagctcagacacagacaaaggtctggagagcacatgtcctccacccccacctagcttctgttgcaagcacctccagccgagacaagagaacgaattaaaaagcaatatttgtgtcagtgtaagacatttgccgaaaggttaaatccacattcgtgttgctgcagagcagccccctatgcaggatttgttagatacagctccgtcctaccctgtgccagctgagcaaacgccaggctgggtggggtggaacccagcctgggtttgcctcaccctgcaatccccccagcaccctctaaaggaggaccctgtggtgggcatgcagacctagggactgggcatagataacctttgggtttgggcaacagcccccactcctcaggattgaaggctaaggtgcagccagctctgccttcatggtgggaatgtctccacgtgacccctttctgggctgtggagaacactcagagaagagtcctgggatgccaggcaggccagggatgtgctgggcatgttgagacaggagtgggctaagccagcagagttgctgacccaggaagagttcagaaaggggcatggaacatggggaggggtccatagtgagagagagcaggcagtgcagagtaaatagtccctgagctgggggttatgggatttgcaggagcttgctcagagaaggcagaggagagatgctgcgccaagctgggtatcacagagcctcagactcctggaacaggaactgtgggggtcaggtcagcaggggaggttagggagtgttccctttgtactgacttagcatttatcctgcttctaggggggaaggggggccagtgggggatgcacagcaaggcagtgatgtggcaggcagcctgcgggagctcctggttcctggtgtgaaaaagctgggaaggaagagggctgggtctggtaagtacagcaggcagttggctcctgagagtccaagccctgtctagagggtggagtgagatttcagagggagagctaaacggggtgggggctggggagtccaggcttctggctcctgctaatactcagtgtgctgggtcctcagaacctcagggtggccattttcagggtgagagctctgtcctttggcacttctgcagactccagtatccagaggaataaagatggtactcttcctcagttcccttagtgagaggacacctttctctgaagggcttgggcagttgtcctgaaccattgcctgaaggaaggacttgactccagggacatagaatgggctcagcataagtcccctgtagtagagaaaggtcccctctctggtctccttagagatcctgtttccttggctgaggaagctagggtggatctttgtgtaagtgggtgtggatgctcactggaaatcaaaaggccccttggtgttagaccttggggtgccatgggagagttgatcactgagtgcgcccttacatgggggccagctgagaatggggctgcctctagctcgagaccatgatgcagggagtgagtgggggagttcaggatactcttaactaaagcagaggtctgtccccccagggaggggaggtcagaagaccctagggagatgccaaaggctagggttggcaccatgttgcaggctgtgtcttcaaggagatgataatcagaggaatcgaacctgcaaaagtgggccagtcttagatacactata
gaggaataatcttctgaaacattctgtgtctcataggacctgcctgaggacccagccccagtgccagcacatacactggggcagtgagtagatagtatactttgttacatgggctggggggacatggcctgtgccctggaggggacttgaagacatccaaaaagctagtgagagggctcctagatttatttgtctccaagggctatatatagccttcctaacatgaacccttgggtaatccagcatgggcgctcccatatgccctggtttgattagagagctctagatgtctcctgtcccagaacaccagccagcccctgtcttcatgtcgtgtctagggcggagggtgattcagaggcaggtgcctgcgacagtggatgcaattagatctaatgggacggaggcctctctcgtccgtcgccctcgctctgtgcccacccccgcctccctcaggcacagcaggcgtggagaggatgcgcaggaggtaggaggtgggggacccagaggggctttgacgtcagcctggcctttaagaggccgcctgcctggcaagggccgtggagacagaactcgggaccaccagcttgcact
[0396]
髓磷脂碱性蛋白(mbp)启动子(seq id no:34)
[0397]
caccgtggctttaacacttagagaaaatgcatcccctctaatcaataagtcatcgacagtgggtagatggaggaacggcagtgcgtagtaggatgcgtgcaagcatagtctcgtgcatgggtgcatagatcgctgggcaggtggacaaggtgggggtggataaagaagtgggtagatgattgatgttaggtaaatatcactgggtggacagatgggtggtaggtggatggatggttagaatagtcagaagagggatggattgataaggtgaacagatgataaatgggtgatagactggaagggttgtcaaaagaggataagggaagtgtgagctagccgtatttctaaggtcagtaatagagttgggagaagaggttaagttacatccatttaaacctcacacgaagctgagagggaatggacttgctgccgttggtgaggaaagcgttgcatttcccgtgtgcttggttgtgaagtgctcaggtcccacatgaagcagtcaggttactgcggcttacagaggagccagatccaaatgccccgagtaagcacgtccccgagccagaggcctccagcggaatccgggagagggattgctcagtgccctgcttccctggactgtaagctgcagaaagatgtgggaagtcctgttctccactgagaacactaaaagcaccttttgtcaaacgaccgcttcacatctggggcttgtgcactggtggccttttaaaccagagacaacccacaagatacctaacctgcggggctctctggtacagtgagcaactcaggaaatgctttggcttgattgctgtgggctctcaggccatcgccctctggagtggttcttttaatgagaacctgaagattggcccctgagccatgtataccaagcaagctcaatccaggttagctccctctggttggggcaagctaacgtgctccttgggccccgcgcgtaactgtgcgttttataggagacagctagttcaagaccccaggaagaaagcggctttgtccccctctaggcctcgtacaggcccacattcatatctcattgttgttgcaggggaggcagatgcgatccagaacaatgggacctcggctgaggacacggcggtgacagactccaagcacacagcagacccaaagaataactggcaaggcgcccacccagctgacccagggaaccgcccccacttgatccgcctcttttcccgagatgccccgggaagggaggacaacaccttcaaagacaggccctcagagtccgacgagcttcagaccatccaagaagatcccacagcagcttccgaagaattctgcagtcgacggtaccgcgggcccgggatc
[0398]
sv40多聚a信号(seq id no:37)
[0399]
taagatacat tgatgagttt ggacaaacca caactagaat gcagtgaaaatttgtgaaat ttgtgatgct attgctttat ttgtaaccat tataagctgc aataaacaagtt
[0400]
由来自人β珠蛋白和免疫球蛋白重链基因的内含子组成的嵌合内含子(seq id no:21)
[0401]
gtaagtatca aggttacaag acaggtttaa ggagaccaat agaaactggg cttgtcgagacagagaagac tcttgcgttt ctgataggca cctattggtc ttactgacat ccactttgcctttctctcca cag
[0402]
paav
‑
cag
‑
hins
‑
dmirt(seq id no:40)
[0403]
[0404]
[0405]
[0406][0407]
aav2 5’itr:3612
‑
3742bp
[0408]
cag启动子:3779
‑
5423bp
[0409]
hinsulin(hins):5586
‑
5932bp
[0410]
dmirt(4个拷贝的mirt
‑
122a和4个拷贝的mirt
‑
1):5943
‑
6203bp
[0411]
兔β
‑
珠蛋白多聚a信号(3’兔β
‑
珠蛋白的3'utr和侧翼区域，包括多聚a信号):6293
‑
6811bpaav2 3’itr:6870
‑
7000bp
[0412]
paav
‑
cag
‑
hinsasp(seq id no:49)
[0413]
[0414]
[0415]
[0416]
[0417]
[0418][0419]
aav2 5’itr:3601
‑
3742bp
[0420]
cag启动子:3779
‑
5423bp
[0421]
hinsulin天冬氨酸(hinsasp):5590
‑
5936bp
[0422]
兔β
‑
珠蛋白多聚a信号(兔β
‑
珠蛋白的3'utr和3’侧翼区域，包括多聚a信号):6025
‑
6543bp
[0423]
aav2 3’itr:6602
‑
6743bp
[0424]
paav
‑
cag
‑
hinswt(seq id no:50)
[0425]
[0426]
[0427]
[0428]
[0429][0430]
aav2 5’itr:3601
‑
3742bp
[0431]
cag启动子:3779
‑
5423bp
[0432]
hinsulin野生型(hinswt):5597
‑
5929bp
[0433]
兔β
‑
珠蛋白多聚a信号(兔β
‑
珠蛋白的3'utr和3’侧翼区域，包括多聚a信号):6025
‑
6543bp
[0434]
aav2 3’itr:6602
‑
6743bp。