包含去核类红细胞的缓冲组合物的制作方法

包含去核类红细胞的缓冲组合物
1.对相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2019年4月26日提交的美国临时专利申请序列号62/839,506的优先权；其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
3.本发明一般涉及含有去核类红细胞的组合物。


背景技术：

4.将红细胞输血给已经经历失血的患者。此外，工程化去核类红细胞(包括红细胞)正在开发作为治疗剂，其携带或呈现外源蛋白质给有此需要的患者。


技术实现要素：

5.本发明基于以下发现：如下的组合物与包含去核类红细胞的其他组合物相比具有改善的稳定性(例如，在本文描述的任何示例性温度温育后，溶血减少和/或细胞计数增加)，所述组合物包含(a)去核类红细胞群体和(b)具有约6.5至约8.5的ph和约150mosm/l至约400mosm/l的渗量的药学可接受的水性缓冲溶液，其包含：约5mm至约80mm的缓冲剂、约5mm至约35mm磷酸根离子、约50mm至约160mm钠离子、约5mm至约60mm钾离子、约0.01mm至约10mm钙离子、约1mm至约20mm镁离子和约5mm至约60mm的非离子细胞非渗透剂(non-ionic cell impermeant agent)，并且包括小于0.1mm的葡萄糖，并且任选地，不包括蔗糖、胶体和抗氧化剂的一种或多种。鉴于此发现，本文提供了组合物，其包含(a)去核类红细胞群体；和(b)具有约6.5至约8.5的ph和约150mosm/l至约400mosm/l的渗量的药学可接受的水性缓冲溶液，其包含：约5mm至约80mm的缓冲剂；约5mm至约35mm磷酸根离子，约50mm至约160mm钠离子；约5mm至约60mm钾离子；约0.01mm至约10mm钙离子；约1mm至约20mm镁离子；以及约5mm至约60mm的非离子细胞非渗透剂，其中：药学可接受的水性缓冲溶液包含小于0.1mm的葡萄糖；并且任选地，药学可接受的水性缓冲溶液不包括以下的一种或多种：蔗糖、胶体和抗氧化剂。本文还提供了包括任何这些组合物的试剂盒、制备任何这些组合物的方法和治疗有此需要的受试者的方法，包括施用任何这些组合物。
6.一方面，本文提供了组合物，其包含：(a)去核类红细胞群体；和(b)具有6.5至8.5的ph和150mosm/l至400mosm/l的渗量的药学可接受的水性缓冲溶液，其包含：约5mm至约80mm的缓冲剂；约5mm至约35mm磷酸根离子；约50mm至约160mm钠离子；约5mm至约60mm钾离子；约0.01mm至约10mm钙离子；约1mm至约20mm镁离子；以及约5mm至约60mm的非离子细胞非渗透剂，其中：药学可接受的水性缓冲溶液包含小于5mm的葡萄糖；并且任选地，药学可接受的水性缓冲溶液不包括以下的一种或多种：蔗糖、胶体和抗氧化剂。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液包含约10mm至约40mm的缓冲剂。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液包含约20mm至约30mm的缓冲剂。在一些实施方案中，缓冲剂是good氏缓冲剂。在一些实施方案中，good氏缓冲剂选自下组：hepes、mops、tes、mes、ada、aces、bes、
bicine、caps、capso、ches、pipes、taps和tris。在一些实施方案中，good氏缓冲剂是hepes。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液包含约5mm至约25mm磷酸根离子。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液包含约5mm至约15mm磷酸根离子。在一些实施方案中，磷酸根离子以磷酸一钠和/或磷酸二钠存在于药学可接受的水性缓冲溶液中。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液包含约50mm至约140mm钠离子。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液包含约70mm至约120mm钠离子。在一些实施方案中，钠离子以氯化钠、磷酸一钠和/或磷酸二钠存在于药学可接受的水性缓冲溶液中。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液包含约10mm至约50mm钾离子。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液包含约30mm至约50mm钾离子。在一些实施方案中，钾离子以氯化钾存在于药学可接受的水性缓冲溶液中。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液包含约0.01mm至约5mm钙离子。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液包含约0.01mm至约0.5mm钙离子。在一些实施方案中，钙离子以氯化钙形式存在于药学可接受的水性缓冲溶液中。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液包含约1mm至约10mm镁离子。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液包含约3mm至约7mm镁离子。在一些实施方案中，镁离子以氯化镁存在于药学可接受的水性缓冲溶液中。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液进一步包含约20mm至约120mm的阴离子细胞非渗透剂。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液包含约75mm至约120mm的阴离子细胞非渗透剂。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液包含约90mm至约110mm的阴离子细胞非渗透剂。在一些实施方案中，阴离子细胞非渗透剂选自下组：乳糖酸盐、柠檬酸盐和葡萄糖酸盐。在一些实施方案中，阴离子细胞非渗透剂是乳糖酸盐。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液包含约20mm至约60mm的非离子细胞非渗透剂。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液包含约30mm至约50mm的非离子细胞非渗透剂。在一些实施方案中，非离子细胞非渗透剂选自下组：甘露醇、棉子糖和蔗糖。在一些实施方案中，非离子细胞非渗透剂是甘露醇。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液进一步包含约1mm至约20mm氯离子。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液包含约5mm至约15mm氯离子。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液进一步包括以下的一种或多种：约0.01mm至约5mm的核碱基、约0.01mm至约5mm的核苷和约0.01mm至约5mm的核苷酸。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液进一步包括以下的一种或多种：约0.01mm至约5mm腺嘌呤、约0.01mm至约5mm腺苷、约0.01mm至约5mm单磷酸腺苷、约0.01mm至约5mm二磷酸腺苷和约0.01mm至约5mm三磷酸腺苷。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液进一步包含约3mm至约10mm碳酸氢根离子。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液进一步包含约3mm至约7mm碳酸氢根离子。在一些实施方案中，碳酸氢根离子以碳酸氢钠存在于药学可接受的水性缓冲溶液中。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液进一步包含约0.01mm至约5mm丙酮酸盐。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液进一步包含泊洛沙姆。在一些实施方案中，泊洛沙姆是泊洛沙姆-188。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液包含约0.01％w/v至约2.0％w/v的泊洛沙姆。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液包含约0.01％w/v至约1.0％w/v的泊洛沙姆。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液包含约0.3％w/v至约0.7％w/v的泊洛沙姆。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液进一步包含人血清白蛋白。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液包含约0.01％w/v至约2.0％
w/v人血清白蛋白。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液包含约0.1％w/v至约0.3％w/v的人血清白蛋白。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液具有约7.0至约8.0的ph。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液具有约7.2至约7.6的ph。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液具有约250mosm/l至约400mosm/l的渗量。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液具有约300mosm/l至约400mosm/l的渗量。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液包括小于0.01mm的葡萄糖。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液包括小于约0.001mm的葡萄糖。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液不包括葡萄糖。在一些实施方案中，组合物包含约1.0x109至约7.0x109个去核类红细胞/ml。在一些实施方案中，组合物包含约2.0x109至约4.0x109个去核类红细胞/ml。在一些实施方案中，组合物包含约4.0x109至约6.0x109个去核类红细胞/ml。在一些实施方案中，去核类红细胞是人去核类红细胞。在一些实施方案中，去核类红细胞是供体人去核类红细胞。在一些实施方案中，去核类红细胞是工程化人去核类红细胞。在一些实施方案中，工程化人去核类红细胞包含一种或多种外源蛋白质。在一些实施方案中，工程化人去核类红细胞是点击缀合的人去核类红细胞。在一些实施方案中，工程化人去核类红细胞已经是低渗加载的。在一些实施方案中，工程化的人去核类红细胞已经通过物理操作加载。在一些实施方案中，一种或多种外源蛋白质之一存在于工程化人去核类红细胞的胞质溶胶中。在一些实施方案中，一种或多种外源蛋白质之一是存在于工程化人去核类红细胞的膜上的蛋白质。在一些实施方案中，一种或多种外源蛋白质之一是苯丙氨酸解氨酶，其中苯丙氨酸解氨酶(pal)存在于工程化人去核类红细胞的胞质溶胶中。在一些实施方案中，组合物在约2℃至约10℃贮存30天至约100天导致小于10％的溶血。在一些实施方案中，组合物在约2℃至约10℃贮存30天至约100天导致小于8％的溶血。在一些实施方案中，组合物在约2℃至约10℃贮存30天至约100天导致细胞密度的小于10％降低。在一些实施方案中，组合物在约2℃至约10℃下贮存30天至约100天导致小于8％的溶血。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液不包含抗氧化剂。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液不包含胶体。在一些实施方案中，胶体是葡聚糖。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液不包含抗氧化剂并且不包含胶体。
7.在另一方面，提供了一种治疗受试者的方法，所述方法包括：(i)提供已经在约2℃至约10℃的温度贮存一段时间的上述实施方案中任一项的组合物；并且(ii)向有此需要的受试者施用步骤(i)的组合物。
8.在一些实施方案中，提供了一种治疗患有苯丙酮尿症的受试者的方法，然后所述方法包括(i)提供组合物，其中一种或多种外源蛋白是苯丙氨酸解氨酶(pal)，其中苯丙氨酸解氨酶存在于已经在约2℃至约10℃的温度贮存一段时间的工程化人去核类红细胞的胞质溶胶中；并且(ii)向有此需要的受试者施用步骤(i)的组合物。在一些实施方案中，所述方法进一步包括在步骤(i)和步骤(ii)之间将步骤(i)的组合物温热至约15℃至约30℃的温度的步骤。在一些实施方案中，组合物已在约4℃至约6℃的温度贮存。在一些实施方案中，时间段为约30天至约100天。在一些实施方案中，时间段为约35天至约60天。在一些实施方案中，时间段为约45天至约60天。在一些实施方案中，将组合物温热至约20℃至约30℃的温度。在一些实施方案中，将组合物温热至约23℃至约27℃的温度。在一些实施方案中，与在约2℃至约10℃的温度贮存一段时间之前的组合物相比，在步骤(i)之后发生小于10％的
溶血。在一些实施方案中，与在约2℃至约10℃的温度贮存一段时间之前的组合物相比，在步骤(i)之后发生小于8％的溶血。在一些实施方案中，与在约2℃至约10℃的温度贮存一段时间之前的组合物相比，在步骤(i)之后发生细胞密度的小于10％降低。在一些实施方案中，与在约2℃至约10℃的温度下贮存一段时间之前的组合物相比，在步骤(i)之后发生细胞密度的小于8％降低。在一些实施方案中，步骤(ii)包括向受试者静脉内施用。
9.在另一方面，提供了一种治疗受试者的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用任何上述实施方案的组合物。在一些实施方案中，组合物先前在约2℃至约10℃的温度贮存一段时间。在一些实施方案中，组合物先前在约4℃至约6℃的温度贮存。在一些实施方案中，时间段为约30天至约100天。在一些实施方案中，时间段为约35天至约60天。在一些实施方案中，时间段为约45天至约60天。在一些实施方案中，方法进一步包括在施用步骤之前将组合物温热至约15℃至约30℃的温度的步骤。在一些实施方案中，将组合物温热至约20℃至约30℃的温度。在一些实施方案中，将组合物温热至约23℃至约27℃的温度。在一些实施方案中，在施用之前，组合物已经在约2℃至约10℃的温度贮存一段时间，并且与在约2℃至约10℃的温度贮存一段时间之前的组合物相比，在约2℃至约10℃的温度贮存一段时间后发生小于10％的溶血。在一些实施方案中，与在约2℃至约10℃的温度贮存一段时间前的组合物相比，在约2℃至约10℃的温度下贮存一段时间后发生小于8％的溶血。在一些实施方案中，在施用之前，组合物已在约2℃至约10℃的温度贮存一段时间，并且其中与在约2℃至约10℃的温度贮存一段时间前的组合物相比，在约2℃至约10℃的温度贮存一段时间后发生细胞密度的小于10％降低。在一些实施方案中，与在约2℃至约10℃的温度贮存一段时间前的组合物相比，在约2℃至约10℃的温度贮存一段时间后发生细胞密度的小于8％降低。在一些实施方案中，施用步骤包括向受试者静脉内施用。
10.在另一方面，提供了一种制备组合物的方法，所述方法包括：(i)提供去核类红细胞群体；并且(ii)将去核类红细胞群体重悬于具有6.5至8.5的ph和150mosm/l至400mosm/l的渗量的药学可接受的水性缓冲溶液中，所述药学可接受的水性缓冲溶液包含：约5mm至约80mm的缓冲剂；约5mm至约35mm磷酸根离子；约50mm至约160mm钠离子；约5mm至约60mm钾离子；约0.01mm至约10mm钙离子；约1mm至约20mm镁离子；和约5mm至约60mm的非离子细胞非渗透剂，其中：药学可接受的水性缓冲溶液包含小于5mm的葡萄糖；并且任选地，药学可接受的水性缓冲溶液不包括以下的一种或多种：蔗糖、胶体和抗氧化剂。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液包含约10mm至约40mm的缓冲剂。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液包含约20mm至约30mm的缓冲剂。在一些实施方案中，缓冲剂是good氏缓冲剂。在一些实施方案中，good氏缓冲剂选自下组：hepes、mops、tes、mes、ada、aces、bes、bicine、caps、capso、ches、pipes、taps和tris。在一些实施方案中，good氏缓冲剂是hepes。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液包含约5mm至约25mm磷酸根离子。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液包含约5mm至约15mm磷酸根离子。在一些实施方案中，磷酸根离子以磷酸一钠和/或磷酸二钠存在于药学可接受的水性缓冲溶液中。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液包含约50mm至约140mm钠离子。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液包含约70mm至约120mm钠离子。在一些实施方案中，钠离子以氯化钠、磷酸一钠和/或磷酸二钠存在于药学可接受的水性缓冲溶液中。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液包含约10mm至约50mm钾离子。在一些实施方案中，药学可接受的水性
缓冲溶液包含约30mm至约50mm钾离子。在一些实施方案中，钾离子以氯化钾存在于药学可接受的水性缓冲溶液中。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液包含约0.01mm至约5mm钙离子。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液包含约0.01mm至约0.5mm钙离子。在一些实施方案中，钙离子以氯化钙形式存在于药学可接受的水性缓冲溶液中。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液包含约1mm至约10mm镁离子。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液包含约3mm至约7mm镁离子。在一些实施方案中，镁离子以氯化镁存在于药学可接受的水性缓冲溶液中。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液进一步包含约20mm至约120mm的阴离子细胞非渗透剂。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液包含约75mm至约120mm的阴离子细胞非渗透剂。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液包含约90mm至约110mm的阴离子细胞非渗透剂。在一些实施方案中，阴离子细胞非渗透剂选自下组：乳糖酸盐、柠檬酸盐和葡萄糖酸盐。在一些实施方案中，阴离子细胞非渗透剂是乳糖酸盐。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液包含约20mm至约60mm的非离子细胞非渗透剂。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液包含约30mm至约50mm的非离子细胞非渗透剂。在一些实施方案中，非离子细胞非渗透剂选自下组：甘露醇、棉子糖和蔗糖。在一些实施方案中，非离子细胞非渗透剂是甘露醇。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液进一步包含约1mm至约20mm氯离子。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液包含约5mm至约15mm氯离子。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液还包括以下中的一种或多种：约0.01mm至约5mm的核碱基、约0.01mm至约5mm的核苷和约0.01mm至约5mm的核苷酸。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液进一步包括以下的一种或多种：约0.01mm至约5mm腺嘌呤、约0.01mm至约5mm腺苷、约0.01mm至约5mm单磷酸腺苷、约0.01mm至约5mm二磷酸腺苷和约0.01mm至约5mm三磷酸腺苷。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液进一步包含约3mm至约10mm碳酸氢根离子。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液进一步包含约3mm至约7mm碳酸氢根离子。在一些实施方案中，碳酸氢根离子以碳酸氢钠存在于药学可接受的水性缓冲溶液中。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液进一步包含约0.01mm至约5mm丙酮酸盐。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液进一步包括泊洛沙姆。在一些实施方案中，泊洛沙姆是泊洛沙姆-188。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液包含约0.01％w/v至约2.0％w/v的泊洛沙姆。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液包含约0.01％w/v至约1.0％w/v的泊洛沙姆。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液包含约0.3％w/v至约0.7％w/v的泊洛沙姆。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液进一步包括人血清白蛋白。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液包含约0.01％w/v至约2.0％w/v人血清白蛋白。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液包含约0.1％w/v至约0.3％w/v人血清白蛋白。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液具有约7.0至约8.0的ph。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液具有约7.2至约7.6的ph。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液具有约250mosm/l至约400mosm/l的渗量。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液具有约300mosm/l至约400mosm/l的渗量。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液包括小于0.01mm的葡萄糖。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液包括小于约0.001mm的葡萄糖。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液不包括葡萄糖。在一些实施方案中，组合物包含约1.0x109至约7.0x109个去核类红细
胞/ml。在一些实施方案中，组合物包含约2.0x109至约4.0x109个去核类红细胞/ml。在一些实施方案中，组合物包含约4.0x109至约6.0x109个去核类红细胞/ml。在一些实施方案中，去核类红细胞是人去核类红细胞。在一些实施方案中，去核类红细胞是供体人去核类红细胞。在一些实施方案中，去核类红细胞是工程化人去核类红细胞。在一些实施方案中，工程化人去核类红细胞包括一种或多种外源蛋白质。在一些实施方案中，工程化人去核类红细胞是点击缀合的人去核类红细胞。
11.在一些实施方案中，工程化人去核类红细胞已经是低渗加载的。在一些实施方案中，工程化的人去核类红细胞已通过物理操作加载。在一些实施方案中，一种或多种外源蛋白质之一存在于工程化人去核类红细胞的胞质溶胶中。在一些实施方案中，一种或多种外源蛋白质之一是存在于工程化人去核类红细胞的膜上的蛋白质。在一些实施方案中，一种或多种外源蛋白质之一是苯丙氨酸解氨酶，其中苯丙氨酸解氨酶存在于工程化人去核类红细胞的胞质溶胶中。在一些实施方案中，组合物在约2℃至约10℃贮存30天至约100天导致小于10％的溶血。在一些实施方案中，组合物在约2℃至约10℃贮存30天至约100天导致小于8％的溶血。在一些实施方案中，组合物在约2℃至约10℃贮存30天至约100天导致细胞密度的小于8％降低。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液不包括抗氧化剂。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液不包括胶体。在一些实施方案中，胶体是葡聚糖。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液不包括抗氧化剂并且不包括胶体。在一些实施方案中，所述方法进一步包括培养类红祖细胞以提供去核类红细胞群体。在另一方面，提供了通过任何上述实施方案中描述的方法提供的组合物。
12.术语“非离子细胞非渗透剂”是指(i)在生理ph(例如，约7.4的ph)不具有任何阳离子且不具有任何阴离子，(ii)基本上不穿过完整且物理和化学上未改变的哺乳动物细胞的质膜，并且(iii)通过被动生物物理渗透效应阻止水移入完整且物理和化学上未改变的哺乳动物细胞的分子。非离子细胞非渗透剂的非限制性实例包括甘露醇、棉子糖、蔗糖、山梨糖醇、海藻糖、葡萄糖酸盐和聚乙二醇(peg)(例如，具有大于1kda、大于5kda、大于10kda，大于15kda的分子量的peg，例如peg 20kda)。非离子细胞非渗透剂的其他实例是本领域已知的。
13.术语“阴离子细胞非渗透剂”是指(i)在生理ph(例如，约7.4的ph)下具有一个或多个阴离子，(ii)基本上不穿过完整且物理和化学上未改变的哺乳动物细胞的质膜，和(iii)通过被动生物物理渗透效应阻止水移入完整且物理和化学上未改变的哺乳动物细胞的分子。阴离子细胞渗透剂的非限制性实例包括乳糖酸盐、柠檬酸盐和葡萄糖酸盐。阴离子细胞非渗透剂的其他实例是本领域已知的。
14.术语“群体”是指给定物品中的两个或更多个(例如，本文描述的任何示例性去核类红细胞)。
15.术语“工程化去核类红细胞”是指包含一种或多种(例如，两种、三种、四种、五种或六种)外源蛋白质(例如，任何本文所述或本领域已知的示例性外源蛋白质的组合)的去核类红细胞(例如人去核类红细胞)。例如，工程化去核类红细胞可以具有其胞质溶胶中存在的一种或多种外源蛋白质。在一些实例中，工程化去核类红细胞可具有其质膜上存在的一种或多种外源蛋白质。在一些实例中，工程化去核类红细胞可具有(i)一种或多种存在于其胞质溶胶中的外源蛋白质和(ii)存在于其质膜上的一种或多种外源蛋白质。工程化去核类
红细胞的非限制性实例包括点击缀合的去核类红细胞、已低渗加载的去核类红细胞和已通过物理操作(例如，本文所述或本领域已知的的任何示例性类型的物理操作)加载的去核类红细胞。本文描述了工程化去核类红细胞的其他非限制性方面。
16.术语“点击缀合的去核类红细胞”是指一种工程化的去核类红细胞，其具有通过酶和/或肽序列的催化活性和/或化学反应与存在于工程化去核类红细胞的质膜上的另一种蛋白质(例如去核红细胞的内源蛋白质或不同外源蛋白质)缀合的至少一种外源蛋白质。
17.术语“低渗加载的去核类红细胞”是指至少部分通过将去核类红细胞或类红细胞祖细胞暴露于包含一种或多种外源蛋白质的低离子强度缓冲剂(例如，本文中描述的任何示例性低离子强度缓冲剂)产生的工程化去核类红细胞。本文描述了可用于产生低渗加载的去核类红细胞的方法的非限制性实例。用于产生低渗加载的去核类红细胞的其他方法是本领域已知的。
18.术语“通过物理操作加载的去核类红细胞”是指至少部分通过以导致对类红祖细胞引入编码一种或多种外源蛋白质(例如，本文描述的或本领域已知的任何示例性外源蛋白质)的核酸的方式物理操作类红祖细胞产生的去核类红细胞。可用于将编码一种或多种外源蛋白质的核酸引入类红祖细胞的物理操作的非限制性实例包括电穿孔和颗粒介导的转染。可用于将编码一种或多种外源蛋白质的核酸引入类红祖先的物理操作的其他实例是本领域已知的。
19.术语“外源蛋白质”是指引入细胞中或细胞上，或通过将编码蛋白质的外源核酸引入细胞或细胞祖先中而引起细胞表达的蛋白质。在一些实施方案中，外源蛋白质是由引入细胞或细胞祖先中的外源核酸编码的蛋白质，该核酸任选不被细胞保留。在一些实施方案中，外源蛋白质是通过化学或酶促手段与细胞表面缀合的蛋白质。外源蛋白的非限制性类别包括酶、白介素、细胞因子受体、fc结合分子、t细胞激活配体、t细胞受体、免疫抑制分子、mhc分子、apc结合分子、自身抗原、变应原、毒素、靶向剂、受体配体(例如受体激动剂或受体拮抗剂)和抗体或抗体片段。在本文中描述了可存在于工程化去核类红细胞中的外源蛋白质的其他实例(参见例如表a-d)。可存在于工程化去核类红细胞中的外源蛋白质的其他实例是本领域已知的。
20.术语“存在于膜上的蛋白质”是指(1)物理附着于或至少部分嵌入去核类红细胞膜中的蛋白质(例如跨膜蛋白、外周膜蛋白、脂质锚定的蛋白(例如gpi锚、n-肉豆蔻酰化蛋白或s-棕榈酰化蛋白))或(2)与其关联受体稳定结合的蛋白质，其中关联受体物理附着到去核类红细胞的膜(例如，与其关联受体结合的配体，其中关联受体物理附着到去核类红细胞的膜)。用于确定哺乳动物细胞膜上蛋白质存在的非限制性方法包括荧光激活细胞分选(facs)、免疫组织化学、细胞分级测定法和蛋白质印迹法。
21.术语“类红祖细胞”是指能够最终分化/发育成去核类红细胞的哺乳动物细胞。在一些实施方案中，类红祖细胞是脐带血干细胞、cd34
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细胞、造血干/祖细胞(hsc、hspc)、脾集落形成(cfu-s)细胞、髓系共同祖细胞(cmp)、胚细胞集落形成细胞、爆发形成单位-类红细胞/红细胞(bfu-e)、巨核细胞-类红祖(mep)细胞、类红集落形成单位或集落形成单位红细胞(cfu-e)、诱导多能干细胞(ipsc)、间充质干细胞(msc)或它们的组合。
22.术语“抗氧化剂”是指防止通过暴露于氧和/或自由基氧种类引起的化学变化的试剂，并且包括酶促剂和非酶促剂。酶促抗氧化剂的非限制性实例包括超氧化物歧化酶、谷胱
甘肽过氧化物酶和过氧化氢酶。非酶抗氧化剂的非限制性实例包括抗坏血酸(维生素c)、α-生育酚(维生素e)、谷胱甘肽、n-乙酰半胱氨酸和β-胡萝卜素(类胡萝卜素)。抗氧化剂的其他实例是本领域已知的。
23.术语“受试者”是指任何哺乳动物。在一些实施方案中，受试者或“需要治疗的受试者”可以是灵长类(例如人、猿(例如猴(例如狨猴或狒狒)或猿(例如大猩猩、黑猩猩、猩猩或长臂猿))、啮齿类(例如，小鼠、豚鼠、仓鼠或大鼠)、兔、狗、猫、马、棉羊、牛、猪或山羊。在一些实施方案中，受试者或“适合治疗的受试者”可以是非人哺乳动物，尤其是常规用作证明对人的治疗功效的模型的哺乳动物(例如，小鼠、猪、大鼠或非人灵长类)。在一些实例中，受试者可以预先诊断或鉴定为需要由医学专业人员(例如，内科医师、实验室技术员、内科医师助理、护士或临床实验室技术员)的治疗。
24.如本文所用，“治疗”是指受试者(例如，本文描述的任何示例性受试者)中医学疾病或病况的一种或多种症状的数量、严重性、频率和/或持续时间的减少。
25.除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同。本文描述了用于本发明的方法和材料；也可以使用本领域已知的其他合适的方法和材料。材料、方法和实例仅是说明性的而不是限制性的。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目和其他参考文献均通过引用整体并入。如有冲突，以本说明书(包括定义)为准。
26.本发明的其他特征和优点从以下详细描述和附图以及权利要求书中将是明显的。
附图说明
27.图1a和1b显示了与贮存在(hts；sigma-aldrich产品目录编号h4416)中的去核类红细胞相比，贮存在t1系列制剂中的去核类红细胞的溶血百分比和细胞计数变化百分比。图1a显示分别在34、40和68天后与贮存在hts中的那些相比，贮存在t1系列制剂中的去核类红细胞的溶血百分比。图1b显示了与在hts中贮存68天的那些相比，在t1系列制剂中贮存68天的去核类红细胞的细胞计数变化百分比。
28.图2显示了分别在hts或t1-1中贮存32天或45天后的去核红细胞浓度。
29.图3a和3b显示了与贮存在hts中的那些相比，贮存在t1-1制剂中的去核类红细胞的渗透扫描(osmoscan)曲线。图3a显示分别在34天、40天和68天后贮存在t1-1制剂或hts中的去核类红细胞的渗透扫描曲线。图3b显示分别在32天或45天后贮存在t1-1制剂或hts中的去核类红细胞的渗透扫描曲线。
30.图4a显示了在2-8℃贮存在t1-1(6个批次)或进一步补充有0.2％w/v人血清白蛋白的t1-1(2个批次)中时，工程化去核类红细胞的随时间的细胞浓度，所述工程化去核类红细胞在其细胞表面上包含含有4-1bbl的第一外源蛋白和第二外源蛋白，所述第二外源蛋白包含与il-15受体alpha(il-15rα)的细胞外部分连接的il-15。
31.图4b显示了在2-8℃贮存在t1-1(6个批次)或进一步补充有0.2％w/v人血清白蛋白的t1-1(2个批次)中时，工程化去核类红细胞的随时间的溶血百分比，所述工程化去核类红细胞在其细胞表面上包含含有4-1bbl的第一外源蛋白和第二外源蛋白，所述第二外源蛋白包含与il-15rα的细胞外部分连接的il-15。
具体实施方式
32.本文中提供了组合物，其包含(a)去核类红细胞群体；和(b)具有约6.5至约8.5(例如，本文描述的该范围的任何子范围)的ph和约150mosm/l至约400mosm/l(例如，本文描述的该范围的任何子范围)的药学可接受的水性缓冲溶液，其包含：约5mm至约80mm(例如，本文描述的该范围的任何子范围)的缓冲剂(例如，本文描述的或本领域已知的任何示例性缓冲剂)；约5mm至约35mm(例如，本文描述的该范围的任何子范围)磷酸根离子；约50mm至约160mm(例如，本文描述的该范围的任何子范围)钠离子；约5mm至约60mm钾离子；约0.01mm至约10mm钙离子；约1mm至约20mm(例如，本文描述的该范围的任何子范围)镁离子；和约5mm至约60mm(例如，本文描述的该范围的任何子范围)的非离子细胞非渗透剂(例如，本文所述或本领域已知的任何示例性非离子细胞非渗透剂)，其中：药学可接受的水性缓冲溶液包含小于0.1mm的葡萄糖(例如，不含可检测到的葡萄糖)；并且任选地，药学可接受的水性缓冲溶液不包含以下的一种或多种：蔗糖、胶体和抗氧化剂。这些组合物的一些实施方案包括小于0.005mm葡萄糖、小于0.001mm葡萄糖、无葡萄糖或无可检测的葡萄糖。这些组合物的一些实施方案不包含蔗糖、胶体(例如葡聚糖)和抗氧化剂中的一种或多种(例如，一种、两种、三种或四种)。
33.在一些实施方案中，本文描述的任何组合物在约2℃至约10℃(例如约2℃至约9℃、约2℃至约8℃、约2℃至约7℃、约2℃至约6℃、约2℃至约5℃、约2℃至约4℃、约3℃至约10℃、约3℃至约9℃、约3℃至约8℃、约3℃至约7℃、约3℃至约6℃、约3℃至约5℃、约4℃至约10℃、约4℃至约9℃、约4℃至约8℃、约4℃至约7℃、约4
°
至约6℃、约5℃至约10℃、约5℃至约9℃、约5℃至约8℃、约5℃至约7℃、约6℃至约10℃、约6℃至约9℃、约6℃至约8℃、约7℃至约10℃、约7℃至约9℃或约8℃至约10℃)贮存30天至约100天(例如约30天至约95天、约30天至约90天、约30天至约85天、约30天至约80天、约30天至约75天、约30天至约70天、约30天至约65天、约30天至约60天、约30天至约55天、约30天至约50天、约30天至约45天、约30天至约40天、约30天至约35天、约35天至约100天、约35天至约95天、约35天至约90天、约35天至约85天、约35天至约80天、约35天至约75天、约35天至约70天、约35天约至65天、约35天至约60天、约35天至约55天、约35天至约50天、约35天至约45天、约35天至约40天、约40天至约100天、约40天至约95天、约40天至约90天、约40天至约85天、约40天至约80天、约40天至约75天、约40天至约70天、约40天约至65天、约40天至约60天、约40天至约55天、约40天至约50天、约40天至约45天、约45天至约100天、约45天至约95天、约45天至约90天、约45天至约85天、约45天至约80天、约45天至约75天、约45天至约70天、约45天约至65天、约45天至约60天、约45天至约55天、约45天至约50天、约50天至约100天、约50天至约95天、约50天至约90天、约50天至约85天、约50天至约80天、约50天至约75天、约50天至约70天、约50天约至65天、约50天至约60天、约50天至约55天、约55天至约100天、约55天至约95天、约55天至约90天、约55天至约85天、约55天至约80天、约55天至约75天、约55天至约70天、约55天约至65天、约55天至约60天、约60天至约100天、约60天至约95天、约60天至约90天、约60天至约85天、约60天至约80天、约60天至约75天、约60天至约70天、约60天约至65天、约65天至约100天、约65天至约95天、约65天至约90天、约65天至约85天、约65天至约80天、约65天至约75天、约65天至约70天、约70天至约100天、约70天至约95天、约70天至约90天、约70天至约85天、约70天至约80天、约70天至约75天、约75天至约100天、约75天至约95天、约75天至约90
天、约75天至约85天、约75天至约80天、约80天至约100天、约80天至约95天、约80天至约90天、约80天至约85天、约85天至约100天、约85天至约95天、约85天至约90天、约90天至约100天、约90天至约95天、约95天至约100天)导致小于12％溶血、小于10.0％溶血、小于9.5％溶血、小于9.0％溶血、小于8.5％溶血、小于8.0％溶血、小于7.5％溶血、小于7.0％溶血、小于6.5％溶血、小于6.0％溶血、小于5.5％溶血、小于5.0％溶血、小于4.5％溶血、小于4.0％溶血、小于3.5％溶血、小于3.0％溶血、小于2.5％溶血、小于2.0％溶血、小于1.5％溶血、小于1.0％溶血、小于0.5％溶血或小于0.1％溶血(例如与贮存前相比)。
34.本文还提供了治疗受试者(例如本文描述的任何受试者)的方法，其包括(i)提供已在约2℃至约10℃的温度(例如本文描述的此范围的任何子范围)贮存一段时间(例如，本文描述的任何示例性时间段，例如，约30天至约100天，或本文描述的该范围的任何子范围)的本文描述的任何组合物；并且(ii)向有此需要的受试者施用步骤(i)的组合物。在这些方法的一些实施方案中，与约2℃至约10℃(例如约2℃至约9℃、约2℃至约8℃、约2℃至约7℃、约2℃至约6℃、约2℃至约5℃、约2℃至约4℃、约3℃至约10℃、约3℃至约9℃、约3℃至约8℃、约3℃至约7℃、约3℃至约6℃、约3℃至约5℃、约4℃至约10℃、约4℃至约9℃、约4℃至约8℃、约4℃至约7℃、约4
°
至约6℃、约5℃至约10℃、约5℃至约9℃、约5℃至约8℃、约5℃至约7℃、约6℃至约10℃、约6℃至约9℃、约6℃至约8℃、约7℃至约10℃、约7℃至约9℃或约8℃至约10℃)的温度贮存一段时间(例如本文描述的任何示例性时间段，例如约30天至约100天或本文描述的此范围的任何子范围)前的组合物相比，在步骤(i)后发生小于12％的溶血(例如小于10％溶血、小于9.5％溶血、小于9.0％溶血、小于8.5％溶血、小于8.0％溶血、小于7.5％溶血、小于7.0％溶血、小于6.5％溶血、小于6.0％溶血、小于5.5％溶血、小于5.0％溶血、小于4.5％溶血、小于4.0％溶血、小于3.5％溶血、小于3.0％溶血、小于2.5％溶血、小于2.0％溶血、小于1.5％溶血、小于1.0％溶血、小于0.5％溶血或小于0.1％溶血)。在这些方法的一些实施方案中，与约2℃至约10℃(例如约2℃至约9℃、约2℃至约8℃、约2℃至约7℃、约2℃至约6℃、约2℃至约5℃、约2℃至约4℃、约3℃至约10℃、约3℃至约9℃、约3℃至约8℃、约3℃至约7℃、约3℃至约6℃、约3℃至约5℃、约4℃至约10℃、约4℃至约9℃、约4℃至约8℃、约4℃至约7℃、约4
°
至约6℃、约5℃至约10℃、约5℃至约9℃、约5℃至约8℃、约5℃至约7℃、约6℃至约10℃、约6℃至约9℃、约6℃至约8℃、约7℃至约10℃、约7℃至约9℃或约8℃至约10℃)的温度贮存一段时间(例如本文描述的任何示例性时间段，例如约30天至约100天或本文描述的此范围的任何子范围)前的组合物相比，在步骤(i)后发生细胞密度的小于12％降低(例如小于10％降低、小于9.5％降低、小于9.0％降低、小于8.5.％降低、小于8.0％降低、小于7.5％降低、小于7.0％降低、小于6.5％降低、小于6.0％降低、小于5.5％降低、小于5.0％降低、小于4.5％降低、小于4.0％降低、小于3.5％降低、小于3.0％降低、小于2.5％降低、小于2.0％降低、小于1.5％降低、小于1.0％降低、小于0.5％降低、或小于0.1％降低)。
35.本文中还提供了治疗受试者(例如本文中描述的任何受试者)的方法，其包括向有此需要的受试者施用本文中描述的任何组合物。在这些方法的一些实施方案中，在施用前，组合物已经在约2℃至约10℃(例如约2℃至约9℃、约2℃至约8℃、约2℃至约7℃、约2℃至约6℃、约2℃至约5℃、约2℃至约4℃、约3℃至约10℃、约3℃至约9℃、约3℃至约8℃、约3℃至约7℃、约3℃至约6℃、约3℃至约5℃、约4℃至约10℃、约4℃至约9℃、约4℃至约8℃、约4
℃至约7℃、约4
°
至约6℃、约5℃至约10℃、约5℃至约9℃、约5℃至约8℃、约5℃至约7℃、约6℃至约10℃、约6℃至约9℃、约6℃至约8℃、约7℃至约10℃、约7℃至约9℃或约8℃至约10℃)的温度贮存一段时间(例如本文中描述的任何示例性时间段，例如约30天至约100天或本文中描述的此范围的任何子范围)，并且与约2℃至约10℃的温度贮存一段时间前的组合物相比，在约2℃至约10℃的温度贮存一段时间后发生小于12％溶血(例如小于约10％溶血、小于约9.5％溶血、小于9.0％溶血、小于8.5％溶血、小于8.0％溶血、小于7.5％溶血、小于7.0％溶血、小于6.5％溶血、小于6.0％溶血、小于5.5％溶血、小于5.0％溶血、小于4.5％溶血、小于4.0％溶血、小于3.5％溶血、小于3.0％溶血、小于2.5％溶血、小于2.0％溶血、小于1.5％溶血、小于1.0％溶血、小于0.5％溶血或小于0.1％溶血)。在这些方法的一些实施方案中，在施用前，组合物已经在约2℃至约10℃(例如约2℃至约9℃、约2℃至约8℃、约2℃至约7℃、约2℃至约6℃、约2℃至约5℃、约2℃至约4℃、约3℃至约10℃、约3℃至约9℃、约3℃至约8℃、约3℃至约7℃、约3℃至约6℃、约3℃至约5℃、约4℃至约10℃、约4℃至约9℃、约4℃至约8℃、约4℃至约7℃、约4
°
至约6℃、约5℃至约10℃、约5℃至约9℃、约5℃至约8℃、约5℃至约7℃、约6℃至约10℃、约6℃至约9℃、约6℃至约8℃、约7℃至约10℃、约7℃至约9℃或约8℃至约10℃)的温度贮存一段时间(例如本文中描述的任何示例性时间段，例如约30天至约100天，或本文中描述的此范围的任何子范围)，并且与约2℃至约10℃的温度贮存一段时间前的组合物相比，在约2℃至约10℃的温度贮存一段时间后发生细胞密度的小于12％降低(例如小于10％降低、小于9.5％降低、小于9.0％降低、小于8.5.％降低、小于8.0％降低、小于7.5％降低、小于7.0％降低、小于6.5％降低、小于6.0％降低、小于5.5％降低、小于5.0％降低、小于4.5％降低、小于4.0％降低、小于3.5％降低、小于3.0％降低、小于2.5％降低、小于2.0％降低、小于1.5％降低、小于1.0％降低、小于0.5％降低、或小于0.1％降低)。
36.还提供了制备组合物的方法，所述方法包括：(i)提供去核类红细胞群体；并且(ii)将去核类红细胞群体重悬于具有约6.5至约8.5(例如，本文描述的范围的任何子范围)和约150mosm/l至约400mosm/l(例如，本文描述的该范围的任何子范围)的渗量的药学可接受的水性缓冲溶液，其包含：约5mm至约80mm(例如，本文描述的该范围的任何子范围)的缓冲剂(例如，本文描述的或本领域已知的任何示例性缓冲剂)；约5mm至约35mm(例如，本文描述的该范围的任何子范围)磷酸根离子；约50mm至约160mm(例如，本文描述的该范围的任何子范围)钠离子；约5mm至约60mm(例如，本文描述的该范围的任何子范围)钾离子；约0.01mm至约10mm(例如，本文描述的该范围的任何子范围)钙离子；约1mm至约20mm(例如，本文描述的该范围的任何子范围)镁离子；和约5mm至约60mm(例如，本文描述的该范围的任何子范围)的非离子细胞非渗透剂(例如，本文所述或本领域已知的任何示例性非离子细胞非渗透剂)，其中：药学可接受的水性缓冲溶液包含小于0.1mm的葡萄糖(例如，无可检测的葡萄糖)；并且任选地，药学可接受的水性缓冲溶液不包括以下的一种或多种：蔗糖、胶体和抗氧化剂。在这些方法的一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液包含小于0.005mm葡萄糖、小于0.001mm葡萄糖、无葡萄糖或无可检测的葡萄糖。在这些方法的一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液不包括蔗糖、胶体(例如葡聚糖)和抗氧化剂中的一种或多种(例如，一种、两种、三种或四种)。在这些方法的一些实施方案中，例如与组合物在约2℃至约10℃贮存约30天至约100天之前相比，组合物在约2℃至约10℃(例如约2℃至约9℃、约2℃至
约8℃、约2℃至约7℃、约2℃至约6℃、约2℃至约5℃、约2℃至约4℃、约3℃至约10℃、约3℃至约9℃、约3℃至约8℃、约3℃至约7℃、约3℃至约6℃、约3℃至约5℃、约4℃至约10℃、约4℃至约9℃、约4℃至约8℃、约4℃至约7℃、约4
°
至约6℃、约5℃至约10℃、约5℃至约9℃、约5℃至约8℃、约5℃至约7℃、约6℃至约10℃、约6℃至约9℃、约6℃至约8℃、约7℃至约10℃、约7℃至约9℃或约8℃至约10℃)贮存约30天至约100天(例如本文描述的此范围的任何子范围)导致小于12％溶血(例如小于约10％溶血、小于约9.5％溶血、小于约9.0％溶血、小于约8.5％溶血、小于约8.0％溶血、小于约7.5％溶血、小于约7.0％溶血、小于约6.5％溶血、小于约5.0％溶血、小于约4.5％溶血、小于约4.0％溶血、小于约3.5％溶血、小于约3.0％溶血、小于约2.5％溶血、小于约2.0％溶血、小于约1.5％溶血、小于约1.0％溶血、小于0.5％溶血或小于0.1％溶血)。在这些方法的一些实施方案中，组合物在约2℃至约10℃(例如约2℃至约9℃、约2℃至约8℃、约2℃至约7℃、约2℃至约6℃、约2℃至约5℃、约2℃至约4℃、约3℃至约10℃、约3℃至约9℃、约3℃至约8℃、约3℃至约7℃、约3℃至约6℃、约3℃至约5℃、约4℃至约10℃、约4℃至约9℃、约4℃至约8℃、约4℃至约7℃、约4
°
至约6℃、约5℃至约10℃、约5℃至约9℃、约5℃至约8℃、约5℃至约7℃、约6℃至约10℃、约6℃至约9℃、约6℃至约8℃、约7℃至约10℃、约7℃至约9℃或约8℃至约10℃)贮存约30天至约100天(例如本文描述的此范围的任何子范围)导致细胞密度的小于12％(例如小于10％降低、小于9.5％降低、小于9.0％溶血、小于8.5％溶血、小于8.0％溶血、小于7.5％溶血、小于7.0％溶血、小于6.5％溶血、小于6.0％溶血、小于5.5％溶血、小于5.0％溶血、小于4.5％溶血、小于4.0％溶血、小于3.5％溶血、小于3.0％溶血、小于2.5％溶血、小于2.0％溶血、小于1.5％溶血、小于1.0％溶血、小于0.5％溶血或小于0.1％溶血)。这些方法的一些实施方案进一步包括培养类红祖细胞(例如，本文描述的任何类红祖细胞)以提供去核类红细胞群体。本文描述了用于测量溶血的示例性测定法。还提供了通过本文描述的任何方法产生的组合物。
37.下文描述了这些组合物和方法的非限制性方面。本领域技术人员可以理解，下面列出的示例性方面可以任意组合使用，并且可以与本领域已知的其他方面组合。
38.去核类红细胞
39.在本文描述的任何组合物的一些实施方案中，该组合物包含约0.5x108至约7.0x109个去核类红细胞/ml、例如约0.5x108至约6.0x109、约0.5x108至约5.0x109、约0.5x108至约4.0x109、约0.5x108至约3.0x109、约0.5x108至约2.0x109、约0.5x108至约1.0x109、约0.5x108至约0.5x109、约0.5x108至约1.0x108、约1.0x108至约7.0x109、约1.0x108至约6.0x109、约1.0x108至约5.0x109、约1.0x108至约4.0x109、约1.0x108至约3.0x109、约1.0x108至约2.0x109、约1.0x108至约1.0x109、约1.0x108至约0.5x109、约0.5x109至约7.0x109、约0.5x109至约6.0x109、约0.5x109至约5.0x109、约0.5x109至约4.0x109、约0.5x109至约3.0x109、约0.5x109至约2.0x109、约0.5x109至约1.0x109、约1.0x109至约7.0x109、约1.0x109至约6.0x109、约1.0x109至约5.0x109、约1.0x109至约4.0x109、约1.0x109至约3.0x109、约1.0x109至约2.0x109、约2.0x109至约7.0x109、约2.0x109至约6.0x109、约2.0x109至约5.0x109、约2.0x109至约4.0x109、约2.0x109至约3.0x109、约3.0x109至约7.0x109、约3.0x109至约6.0x109、约3.0x109至约5.0x109、约3.0x109至约4.0x109、约4.0x109至约7.0x109、约4.0x109至约6.0x109、约4.0x109至约5.0x109、约5.0x109至约7.0x109、约5.0x109至约6.0x109或约6.0x109至约7.0x109个去核类红细胞/ml。
40.在一些实施方案中，本文描述的去核类红细胞(例如，人去核类红细胞)对一种或多种次要血型抗原呈阴性(即不包括一种或多种次要血型抗原)，例如le(a-b-)(对于lewis抗原系统)、fy(a-b-)(对于duffy系统)、jk(a-b-)(对于kidd系统)、m-n-(对于mns系统)、k-k-(对于kell系统)、lu(a-b-)(对于lutheran系统)和h-抗原阴性(bombay表型)或其任何组合。在一些实施方案中，去核类红细胞也是o型和/或rh-型。例如，次要血型记载于agarwal et al.,“blood group phenotype frequencies in blood donors from a tertiary care hospital in north india,”blood res.48(1):51
–
54,2013,以及mitra et al.,“blood groups systems,”indian j.anaesth.58(5):524
–
528,2014，其描述通过引用并入本文。
41.在一些实施方案中，本文描述的去核类红细胞(例如，人去核类红细胞)表现出与不包含外源蛋白质(例如，本文描述或本领域已知的的任何外源蛋白)的分离的、未培养的去核类红细胞基本相同的渗透膜脆性。在一些实施方案中，去核类红细胞群体在0.3％、0.35％、0.4％、0.45％或0.5％nacl下具有小于50％的细胞裂解的渗透脆性。在一些实施方案中，使用wo2015/073587的实施例59中描述的方法(其描述通过引用并入本文)测定渗透脆性。
42.在一些实施方案中，去核类红细胞(例如，人去核类红细胞)具有与野生型、未处理的去核类红细胞大致相同的直径或体积。在一些实施方案中，去核类红细胞群(例如，人去核类红细胞)的平均直径约为4、5、6、7、8、9、10、11或12微米、或约4.0至约12.0微米、约4.0至约11.5微米、约4.0至约11.0微米、约4.0至约10.5微米、约4.0至约10微米、约4.0至约9.5微米、约4.0至约9.0微米、约4.0至约8.5微米、约4.0至约8.0微米、约4.0至约7.5微米、约4.0至约7.0微米、约4.0至约6.5微米、约4.0至约6.0微米、约4.0至约5.5微米、约4.0至约5.0微米、约4.0至约4.5微米、约4.5至约12.0微米、约4.5至约11.5微米、约4.5至约11.0微米、约4.5至约10.5微米、约4.5至约10.0微米、约4.5至约9.5微米、约4.5至约9.0微米、约4.5至约8.5微米、约4.5至约8.0微米、约4.5至约7.5微米、约4.5至约7.0微米、约4.5至约6.5微米、约4.5至约6.0微米、约4.5至约5.5微米、约4.5至约5.0微米、约5.0至约12.0微米、约5.0至约11.5微米、约5.0至约11.0微米、约5.0至约10.5微米、约5.0至约10.0微米、约5.0至约9.5微米、约5.0至约9.0微米、约5.0至约8.5微米、约5.0至约8.0微米、约5.0至约7.5微米、约5.0至约7.0微米、约5.0至约6.5微米、约5.0至约6.0微米、约5.0至约5.5微米、约5.5至约12.0微米、约5.5至约11.5微米、约5.5至约11.0微米、约5.5至约10.5微米、约5.5至约10.0微米、约5.5至约9.5微米、约5.5至约9.0微米、约5.5至约8.5微米、约5.5至约8.0微米、约5.5至约7.5微米、约5.5至约7.0微米、约5.5至约6.5微米、约5.5至约6.0微米、约6.0至约12.0微米、约6.0至约11.5微米、约6.0至约11.0微米、约6.0至约10.5微米、约6.0至约10.0微米、约6.0至约9.5微米、约6.0至约9.0微米、约6.0至约8.5微米、约6.0至约8.0微米、约6.0至约7.5微米、约6.0至约7.0微米、约6.0至约6.5微米、约6.5至约12.0微米、约6.5至约11.5微米、约6.5至约11.0微米、约6.5至约10.5微米、约6.5至约10.0微米、约6.5至约9.5微米、约6.5至约9.0微米、约6.5至约8.5微米、约6.5至约8.0微米、约6.5至约7.5微米、约6.5至约7.0微米、约7.0至约12.0微米、约7.0至约11.5微米、约7.0至约11.0微米、约7.0至约10.5微米、约7.0至约10.0微米、约7.0至约9.5微米、约7.0至约9.0微米、约7.0至约8.5微米、约7.0至约8.0微米、约7.0至约7.5微米、约7.5至约12.0微米、约7.5至约11.5微米、约7.5至约11.0微米、约7.5至约10.5微米、约7.5至约10.0微米、约7.5至约9.5微米、约7.5至
约9.0微米、约7.5至约8.5微米、约7.5至约8.0微米、约8.0至约12.0微米、约8.0至约11.5微米、约8.0至约11.0微米、约8.0至约10.5微米、约8.0至约10.0微米、约8.0至约9.5微米、约8.0至约9.0微米、约8.0至约8.5微米、约8.5至约12.0微米、约8.5至约11.5微米、约8.5至约11.0微米、约8.5至约10.5微米、约8.5至约10.0微米、约8.5至约9.5微米、约8.5至约9.0微米、约9.0至约12.0微米、约9.0至约11.5微米、约9.0至约11.0微米、约9.0至约10.5微米、约9.0至约10.0微米、约9.0至约9.5微米、约9.5至约12.0微米、约9.5至约11.5微米、约9.5至约11.0微米、约9.5至约10.5微米、约9.5至约10.0微米、约10.0至约12.0微米、约10.0至约11.5微米、约10.0至约11.0微米、约10.0至约10.5微米、约10.5至约12.0微米、约10.5至约11.5微米、约10.5至约11.0微米、约11.0至约12.0微米、约11.0至约11.5微米或约11.5至约12.0微米，并且任选地群体的标准差小于1、2或3微米。可以测量去核类红细胞直径，例如使用advia 120血液学系统，或者moxi z细胞计数器(orflo)。
43.在一些实施方案中，去核类红细胞的平均红细胞体积的体积是约10fl至约175fl、约10fl至约160fl、约10fl至约140fl、约10fl至约120fl、约10fl至约100fl、约10fl至约95fl、约10fl至约90fl、约10fl至约85fl、约10fl至约80fl、约10fl至约75fl、约10fl至约70fl、约10fl至约65fl、约10fl至约60fl、约10fl至约55fl、约10fl至约50fl、约10fl至约45fl、约10fl至约40fl、约10fl至约35fl、约10fl至约30fl、约10fl至约25fl、约10fl至约20fl、约10fl至约15fl、约15fl至约175fl、约15fl至约160fl、约15fl至约140fl、约15fl至约120fl、约15fl至约100fl、约15fl至约95fl、约15fl至约90fl、约15fl至约85fl、约15fl至约80fl、约15fl至约75fl、约15fl至约70fl、约15fl至约65fl、约15fl至约60fl、约15fl至约55fl、约15fl至约50fl、约15fl至约45fl、约15fl至约40fl、约15fl至约35fl、约15fl至约30fl、约15fl至约25fl、约15fl至约20fl、约20fl至约175fl、约20fl至约160fl、约20fl至约140fl、约20fl至约120fl、约20fl至约100fl、约20fl至约95fl、约20fl至约90fl、约20fl至约85fl、约20fl至约80fl、约20fl至约75fl、约20fl至约70fl、约20fl至约65fl、约20fl至约60fl、约20fl至约55fl、约20fl至约50fl、约20fl至约45fl、约20fl至约40fl、约20fl至约35fl、约20fl至约30fl、约20fl至约25fl、约25fl至约175fl、约25fl至约160fl、约25fl至约140fl、约25fl至约120fl、约25fl至约100fl、约25fl至约95fl、约25fl至约90fl、约25fl至约85fl、约25fl至约80fl、约25fl至约75fl、约25fl至约70fl、约25fl至约65fl、约25fl至约60fl、约25fl至约55fl、约25fl至约50fl、约25fl至约45fl、约25fl至约40fl、约25fl至约35fl、约25fl至约30fl、约30fl至约175fl、约30fl至约160fl、约30fl至约140fl、约30fl至约120fl、约30fl至约100fl、约30fl至约95fl、约30fl至约90fl、约30fl至约85fl、约30fl至约80fl、约30fl至约75fl、约30fl至约70fl、约30fl至约65fl、约30fl至约60fl、约30fl至约55fl、约30fl至约50fl、约30fl至约45fl、约30fl至约40fl、约30fl至约35fl、约35fl至约175fl、约35fl至约160fl、约35fl至约140fl、约35fl至约120fl、约35fl至约100fl、约35fl至约95fl、约35fl至约90fl、约35fl至约85fl、约35fl至约80fl、约35fl至约75fl、约35fl至约70fl、约35fl至约65fl、约35fl至约60fl、约35fl至约55fl、约35fl至约50fl、约35fl至约45fl、约35fl至约40fl、约40fl至约175fl、约40fl至约160fl、约40fl至约140fl、约40fl至约120fl、约40fl至约100fl、约40fl至约95fl、约40fl至约90fl、约40fl至约85fl、约40fl至约80fl、约40fl至约75fl、约40fl至约70fl、约40fl至约65fl、约40fl至约60fl、约40fl至约55fl、约40fl至约50fl、约40fl至约45fl、约45fl至约175fl、约45fl至约160fl、约45fl至约
140fl、约45fl至约120fl、约45fl至约100fl、约45fl至约95fl、约45fl至约90fl、约45fl至约85fl、约45fl至约80fl、约45fl至约75fl、约45fl至约70fl、约45fl至约65fl、约45fl至约60fl、约45fl至约55fl、约45fl至约50fl、约50fl至约175fl、约50fl至约160fl、约50fl至约140fl、约50fl至约120fl、约50fl至约100fl、约50fl至约95fl、约50fl至约90fl、约50fl至约85fl、约50fl至约80fl、约50fl至约75fl、约50fl至约70fl、约50fl至约65fl、约50fl至约60fl、约50fl至约55fl、约60fl至约175fl、约60fl至约160fl、约60fl至约140fl、约60fl至约120fl、约60fl至约100fl、约60fl至约95fl、约60fl至约90fl、约60fl至约85fl、约60fl至约80fl、约60fl至约75fl、约60fl至约70fl、约60fl至约65fl、约70fl至约175fl、约70fl至约160fl、约70fl至约140fl、约70fl至约120fl、约70fl至约100fl、约70fl至约95fl、约70fl至约90fl、约70fl至约85fl、约70fl至约80fl、约70fl至约75fl、约80fl至约175fl、约80fl至约160fl、约80fl至约140fl、约80fl至约120fl、约80fl至约100fl、约80fl至约95fl、约80fl至约90fl、约80fl至约85fl、约100fl至约175fl、约100fl至约160fl、约100fl至约140fl、约100fl至约120fl、约120fl至约175fl、约120fl至约160fl、约120fl至约140fl、约140fl至约175fl、约140fl至约160fl或约160fl至约175fl，并且任选地群体的标准差是小于50、40、30、20、10、5或2fl。可以测量平均红细胞体积，例如使用血液学分析仪器，例如coulter计数器、moxi z细胞计数器(orflo)或sysmex血液学分析仪。
44.在本文描述的任何组合物的一些实施方案中，去核类红细胞是人的(例如，源自人供体的类红祖细胞)去核类红细胞。
45.在本文描述的任何组合物的一些实施方案中，去核类红细胞是工程化人去核类红细胞。在一些实例中，工程化去核类红细胞包含单一外源蛋白质(例如，存在于细胞溶胶中或存在于工程化去核类红细胞的膜上的外源蛋白质)(例如，本文描述的或本领域已知的任何示例性外源蛋白质)。
46.在其他实例中，工程化去核类红细胞包含两种或更多种外源蛋白质(例如，本文描述的任何示例性外源蛋白质)。在一些实例中，两种或更多种外源蛋白中的至少一种可存在于工程化去核类红细胞的胞质溶胶中(例如，酶，例如苯丙氨酸解氨酶)。在一些实例中，两种或更多种外源蛋白质中的至少一种可以存在于工程化去核类红细胞的膜上(例如，fc结合分子、细胞因子受体、t细胞活化配体、t细胞受体、免疫抑制分子、mhc分子、apc结合分子、自身抗原、变应原、毒素、靶向剂、受体配体(例如受体激动剂或受体拮抗剂)或抗体或抗体片段)。
47.除了包含外源蛋白质的工程化类红细胞可用于治疗的相应疾病或病况之外，本文描述的任何工程化类红细胞可包含的一种或多种外源蛋白质的非限制性实例列于下表a-d中。本文描述的任何类红细胞可以包含的外源蛋白质的其他实例是本领域已知的。
48.表a：示例性外源蛋白质
[0049][0050][0051]
表b.示例性外源蛋白
[0052][0053]
表c.示例性外源蛋白
[0054][0055][0056]
表d.示例性外源蛋白
[0057][0058]
在一些实施方案中，工程化去核类红细胞膜上存在的外源蛋白质可以是点击化学反应的产物(例如，可以使用本文描述的任何方法将外源蛋白质与细胞膜上存在的蛋白质(例如，第二外源蛋白质或内源蛋白质)缀合)。在一些实施方案中，工程化去核类红细胞膜上存在的外源蛋白质可以是使用分选酶(sortase)的缀合反应的产物(例如，可以使用本文描述的任何方法将外源蛋白质与细胞膜上存在的蛋白质(例如，第二外源蛋白质或内源蛋白质)缀合)。使用分选酶的缀合反应的非限制性实例可以参见美国专利no.10,260,038和美国专利公开文本no.2016/0082046a1。在一些实施方案中，工程化去核类红细胞的膜上存在的外源蛋白质可以是脂质锚定蛋白，例如gpi锚、n-肉豆蔻酰化蛋白或s-棕榈酰化蛋白。在一些实施方案中，工程化去核类红细胞的膜上存在的外源蛋白质可以是跨膜蛋白(例如，单次通过或多次通过跨膜蛋白)或外周膜蛋白。在一些实施方案中，工程化去核类红细胞膜上存在的外源蛋白质可以是包含跨膜域的融合蛋白(例如，包含小整合膜蛋白1(smim1)或血型糖蛋白a(gpa)的跨膜域的融合蛋白))。在一些实施方案中，工程化去核类红细胞膜上存在的外源蛋白质不具有任何伸入细胞外空间中的氨基酸。在一些实施方案中，工程化去核类红细胞膜上存在的外源蛋白质不具有任何伸入工程化去核类红细胞的胞质溶胶中的氨基酸。在一些实施方案中，工程化去核类红细胞膜上存在的外源蛋白质具有伸入细胞外空间中的氨基酸和伸入工程化去核类红细胞的胞质溶胶中的氨基酸。
[0059]
可以通过将编码一种或多种外源蛋白质(例如，本文描述的或本领域已知的任何外源蛋白质)的一种或多种核酸(例如，dna表达载体或mrna)引入类红祖细胞(例如，本文描述的或本领域已知的任何类红祖细胞)来产生工程化去核类红细胞。将dna表达载体引入类红祖细胞的示例性方法包括但不限于脂质体介导的转移、转化、基因枪、转染和转导，例如病毒介导的基因转移(例如，使用病毒载体进行，包括腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体、疱疹病毒载体和基于逆转录病毒的载体)。将dna表达载体引入类红祖细胞的其他示例性方法包括使用例如裸dna、capo4沉淀、deae葡聚糖、电穿孔、原生质体融合、脂质转染和细胞显微注射。
[0060]
可以任选地在例如引入一种或多种编码一种或多种外源蛋白质的核酸之前和/或之后，在允许分化成工程化去核类红细胞的合适条件下培养类红祖细胞。在一些实施方案中，所得的工程化去核类红细胞包含与成熟红细胞相关的蛋白质，例如血红蛋白(例如，成人血红蛋白和/或胎儿血红蛋白)、血型糖蛋白a和可以通过标准方法(例如western印迹法或facs分析)验证和量化的外源蛋白质。
[0061]
在一些实例中，去核类红细胞或类红祖细胞可以用编码外源蛋白质的mrna转染以产生工程化的去核类红细胞。信使rna可以从cdna质粒构建体的体外转录衍生，所述构建体含有编码外源蛋白质的序列。例如，可以将编码外源蛋白质的cdna序列插入到含有与特定rna聚合酶相容的启动子序列的克隆载体中。例如，克隆载体zappbk-cmv(stratagene,la jolla,ca,usa)含有分别与t3和t7 rna聚合酶相容的t3和t7启动子序列。对于有义mrna的体外转录，质粒在对应于编码外源蛋白质的序列末端的终止密码子下游的限制性位点处线性化。使用商品化的试剂盒诸如例如高产率转录试剂盒(来自stratagene,la jolla,calif.,usa)从线性dna模板转录mrna。在某些情况下，可以期望生成5'-m7gpppg加帽的mrna。因此，可以使用例如来自ambion(austin,tex.,usa)的mmessage mmachine高产率加帽rna转录试剂盒进行线性化cdna模板的转录。转录可以在20-100μl的反应体积中在37℃下进行30分钟至4小时。通过用dnase i短暂处理以消除线性化dna模板，然后在氯化锂、乙酸钠或乙酸铵存在下在70％乙醇中沉淀，从反应混合物中纯化转录的mrna。可以使用琼脂糖-甲醛凝胶或商品化的novex预制tbe凝胶(novex,invitrogen,carlsbad,ca,usa)使用电泳评估转录的mrna的完整性。
[0062]
可以使用多种方法，包括例如脂质转染和电穿孔，将编码外源蛋白质的信使rna引入去核类红细胞或类红祖细胞中(van tandeloo et al.,blood98:49-56,2001)。例如，对于脂质转染，将opti-mem(invitrogen,carlsbad,calif.,usa)中5μg体外转录的mrna与阳离子脂质dmrie-c(invitrogen)以1:4比率温育5-15分钟。
[0063]
或者，多种其他阳离子脂质或阳离子聚合物可用于用mrna转染类红祖细胞，包括例如dotap、各种形式的聚乙烯亚胺和聚l-赖氨酸(sigma-aldrich,saint louis,mo.,usa)和superfect(qiagen,inc.,valencia,calif.,usa；参见例如bettinger et al.,nucleic acids res.29:3882-3891,2001)。将所得的mrna/脂质复合物与细胞(1
–
2x106个细胞/ml)在37℃温育2小时，清洗并返回培养。例如，对于电穿孔，将500μl opti-mem(invitrogen,carlsbad,calif.,usa)中的约5-20x106个细胞与约20μg体外转录的mrna混合，并在0.4cm皿中使用例如easyject plus装置(equibio,kent,united kingdom)电穿孔。在某些情况下，测试各种电压、电容和电穿孔体积以确定将特定mrna转染到类红祖细胞中的有用条件
可能是必要的。一般而言，用mrna有效转染细胞所需要的电穿孔参数似乎比dna电穿孔所需要的电穿孔参数对细胞的危害小(van tandeloo et al.,blood 98:49-56,2001)。
[0064]
或者，可以使用肽介导的rna递送策略将mrna转染到去核类红细胞或类红祖细胞中(参见例如bettinger et al.,nucleic acids res.29:3882-3891,2001)。例如，阳离子脂质聚乙烯亚胺2kda(sigma-aldrich,saint louis,mo.,usa)可以与蜂毒肽(alta biosciences,birmingham,uk)组合以提高mrna转染的效率，特别是在有丝分裂后的原代细胞中。蜂毒肽可以使用二硫化物交联剂，例如杂双功能交联剂琥珀酰亚胺基3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯与pei缀合。将体外转录的mrna与蜂毒肽-pei预温育5-15分钟，以形成rna/肽/脂质复合物。然后，将此复合物添加到无血清培养基中的细胞中，在37℃在5％co2加湿环境中持续2至4小时，然后除去，并进一步培养转染的细胞。
[0065]
在一些实施方案中，通过将编码一种或多种外源蛋白质(例如，本文描述的任何外源蛋白质或外源蛋白质的任何组合)的核酸(例如，本文描述的任何示例性核酸)引入类红祖细胞产生工程化去核类红细胞。在一些实施方案中，外源蛋白质由引入类红祖细胞的dna编码。在一些实施方案中，外源蛋白质由引入类红祖细胞的rna编码。
[0066]
编码一种或多种外源蛋白质的核酸可在终末分化为去核类红细胞之前使用多种dna技术引入类红祖细胞中，所述技术包括例如瞬时或稳定转染和基因疗法方法。
[0067]
病毒基因转移可用于用编码一种或多种外源蛋白质的核酸转染细胞。许多病毒可用作基因转移媒介物，包括莫洛尼鼠白血病病毒(moloney murine leukemia virus，mmlv)、腺病毒、腺相关病毒(aav)、单纯疱疹病毒(hsv)、慢病毒如人类免疫缺陷病毒1(hiv1)和泡沫病毒属如泡沫病毒(参见例如osten et al.,hep 178:177-202,2007)。例如，逆转录病毒有效地转导哺乳动物细胞(包括人类细胞)并整合到染色体中，从而赋予稳定的基因转移。
[0068]
可以将编码一种或多种外源蛋白质的核酸转染到类红祖细胞中。合适的载体是莫洛尼鼠白血病病毒(mmlv)载体(malik et al.,blood 91:2664-2671,1998)。基于mmlv(一种致癌逆转录病毒)的载体目前用于基因疗法临床试验(hassle et al.,news physiol.sci.17:87-92,2002)。例如，可以使用标准分子生物学技术在mmlv载体骨架中生成包含编码外源蛋白质的cdna的dna构建体。将构建体转染到包装细胞系中，诸如例如pa317细胞，并且使用病毒上清液转染生产者细胞，例如pg13细胞。将pg13病毒上清液与类红祖细胞一起温育。外源蛋白质的表达可以使用facs分析(荧光激活细胞分选)进行监测，例如，如果它存在于工程化人去核类红细胞的膜上，则使用针对外源蛋白质的荧光标记抗体。可以使用类似的方法，使得外源蛋白质存在于工程化人去核类红细胞的胞质溶胶中。
[0069]
任选地，可以使用基于病毒的方法将编码荧光追踪分子诸如例如绿色荧光蛋白(gfp)的核酸转染到类红祖细胞中(tao et al.,stem cells 25:670-678,2007)。使用包装细胞，诸如例如phoenix-eco细胞系(由orbigen,san diego,calif.销售)包装含有编码增强型绿色荧光蛋白(egfp)或红色荧光蛋白(例如dsred-express)的dna的生态型逆转录病毒载体。包装细胞系稳定表达适当病毒包装所需要的病毒蛋白，包括例如gag、pol和env。使用来自phoenix-eco细胞的上清液转导类红祖细胞，所述上清液中已脱落有病毒颗粒。在一些情况下，转导可以在特殊包被的表面，诸如例如重组纤连蛋白的片段上进行以改善逆转录病毒介导的基因转移的效率(例如，retronectin,takara bio usa,madison,wis.)。在
retronectin包被的板中将细胞与逆转录病毒phoenix-eco上清液以及合适的辅因子一起温育。次日，可以重复转导。在此种情况下，可以通过facs评估表达egfp或dsred-express的类红祖细胞的百分比。可用于评估转导效率的其他报告基因包括例如β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶和萤光素酶，以及低亲和力神经生长因子受体(lngfr)和人类细胞表面cd24抗原(bierhuizen et al.,leukemia 13:605-613,1999)。
[0070]
非病毒载体可用于将编码一种或多种外源蛋白质的核酸引入类红祖细胞以产生工程化的去核类红细胞。许多递送方法可用于将非病毒载体引入类红祖细胞，包括化学和物理方法。
[0071]
可以使用合成大分子，例如阳离子脂质和聚合物，将编码外源蛋白质的非病毒载体引入类红祖细胞中(papapetrou et al.,gene therapy 12:s118-s130,2005)。例如，阳离子脂质体通过电荷相互作用与dna形成复合物。带正电荷的dna/脂质复合物与负细胞表面结合，并通过内吞被细胞吸收。该方法可用于例如转染造血细胞(参见例如keller et al.,gene therapy 6:931-938,1999)。对于类红祖细胞，将质粒dna(在无血清培养基中，诸如例如optimem(invitrogen,carlsbad,ca))与阳离子脂质体(在无血清培养基中)，例如商品化的转染试剂lipofectamine
tm
(invitrogen,carlsbad,ca)混合，并且允许温育至少20分钟以形成复合物。将dna/脂质体复合物添加到类红祖细胞中，并温育5-24小时，然后可以测定外源蛋白质的转基因表达。或者，可以使用其他商品化的脂质体转染剂(例如in vivo geneshuttle
tm
,qbiogene,carlsbad,calif.)。
[0072]
任选地，阳离子聚合物诸如例如聚乙烯亚胺(pei)可用于有效转染类红祖细胞，例如造血和脐带血衍生的cd34
+
细胞(参见例如shin et al.,biochim.biophys.acta 1725:377-384,2005)。从人脐带血中分离出人cd34
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细胞，并在补充有200ng/ml干细胞因子和20％热灭活血清的iscove改良dulbecco培养基中培养。将编码外源蛋白质的质粒dna与大小从0.8k至750k的分支或线性pei(sigma aldrich,saint louis,mo.,usa；fermetas,hanover,md.,usa)一起温育。pei制备为4.2mg/ml蒸馏水的储备溶液，并使用hcl轻微酸化至ph5.0。根据1μg dna含有3nmol磷酸盐和1μl pei储备溶液含有10nmol胺氮的计算，dna可以在室温下以各种氮/磷酸盐比率与pei组合30分钟。分离的cd34
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细胞用dna/阳离子复合物接种，以280xg离心5分钟，并在培养基中温育4小时以上，直到评估外源蛋白质的表达。
[0073]
可以使用物理方法将质粒载体引入合适的类红祖细胞，例如颗粒介导的转染、“基因枪”、生物射弹或颗粒轰击技术(papapetrou,et al.,gene therapy12:s118-s130,2005)。在此种情况下，将编码外源蛋白质的dna吸附到金颗粒上，并通过颗粒枪施用到细胞。例如，此方法可用于转染类红祖细胞，例如源自脐带血的造血干细胞(参见例如verma et al.,gene therapy 5:692-699,1998)。因此，将脐带血分离并在磷酸盐缓冲盐水中稀释三倍。与用二抗包被的磁微珠和磁分离系统(例如miltenyi minimac system,auburn,calif.,usa)组合，使用抗cd34单克隆抗体纯化cd34
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细胞。cd34
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富集的细胞可以如本文所述进行培养。对于转染，通过用氯化钙和亚精胺处理，将编码外源蛋白质的质粒dna沉淀到颗粒(例如金珠)上。在用乙醇清洗dna包被的珠之后，可以使用例如生物射弹biolistic pds-1000/he系统(bio-rad,hercules,calif.,usa)将珠递送到培养的细胞中。报告基因诸如例如β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、萤光素酶或绿色荧光蛋白可用于评估转染效率。
[0074]
任选地，可以使用电穿孔方法将质粒载体引入到类红祖细胞中。电穿孔在细胞膜
上产生瞬时孔，允许将各种分子引入细胞，所述分子包括例如dna和rna。因此，如本文所述分离和培养cd34
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细胞。在电穿孔之前立即，通过在室温下以250xg离心10分钟来分离细胞，并以0.2-10x106个活细胞/ml重悬于电穿孔缓冲剂，诸如例如补充有1.0％人血清白蛋白(hsa)的x-vivo 10中。将质粒dna(1-50μg)与500μl细胞悬液一起加入合适的电穿孔皿中。
[0075]
可以使用例如具有范围为200v至280v的电压和范围为25至70msec的脉冲长度的ecm 600电穿孔仪(genetronics,san diego,calif.,usa)进行电穿孔。许多替代的电穿孔仪器是商品化的并且可用于该目的(例如，gene pulser xcell
tm
,biorad,hercules,calif.；cellject duo,thermo science,milford,mass.)。或者，可以使用以下参数对分离的cd34
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细胞进行有效的电穿孔：4mm皿、1600μl、550v/cm和10μg dna/500μl细胞，以1x105个细胞/ml(oldak et al.,acta biochim.polonica 49:625-632,2002)。
[0076]
核转染(一种电穿孔形式)也可用于转染类红祖细胞。在这种情况下，在细胞类型特异性溶液中使用电参数进行转染，所述细胞类型特异性溶液使dna(或其他试剂)能够直接运输到核，从而降低细胞质中可能降解的风险。例如，人cd34细胞nucleofector
tm
试剂盒(来自amaxa inc.)可用于转染类红祖细胞。在这种情况下，将人cd34细胞nucleofector
tm
溶液中的1-5x106个细胞与1-5μg dna混合，并使用预编程设置在nucleofector
tm
仪器中进行转染，如制造商确定。
[0077]
类红祖细胞可以用常规表达载体以非病毒转染，所述常规表达载体不能在哺乳动物细胞中自我复制，除非它被整合到基因组中。或者，可以用附加型载体转染类红祖细胞，该载体可以作为自主复制的遗传单位持续存在于宿主细胞核中而不整合到染色体中(papapetrou et al.,gene therapy12:s118-s130,2005)。这些载体利用源自病毒的遗传元件，所述病毒通常在潜伏感染后在细胞中进行染色体外复制，例如ebv、人多瘤病毒bk、牛乳头瘤病毒-1(bpv-1)、单纯疱疹病毒-1(hsv)和猿病毒40(sv40)。哺乳动物人工染色体也可用于非病毒基因转移(vanderbyl et al.,exp.hematol.33:1470-1476,2005)。
[0078]
编码一种或多种外源蛋白质的外源核酸可以通过本领域已知的标准分子生物学方法，例如限制性消化、重叠-延伸pcr和gibson组装来组装到表达载体中。
[0079]
外源核酸可包含编码通常不存在于细胞表面，例如去核类红细胞的表面上的外源蛋白质的基因，该外源蛋白质与编码内源或天然膜蛋白质的基因融合，使得外源蛋白质在细胞表面上表达。例如，编码外源蛋白质的外源基因可以克隆在1型膜蛋白的前导序列后的n端、2型膜蛋白的c端或gpi连接的膜蛋白的gpi附着位点上游。
[0080]
标准克隆方法可用于在两个融合基因之间引入柔性氨基酸接头。例如，柔性接头是聚甘氨酸聚丝氨酸接头，例如通常用于从全长抗体生成单链抗体片段的[gly4ser]3(seq id no:1)(antibody engineering:methods&protocols,b.lo,ed.,humana press,2004,576pp.)，或ala-gly-ser-thr多肽，例如用于产生单链arc阻遏物的多肽(antibody engineering:methods&protocols,b.lo,编,humana press,2004,576pp.)。在一些实施方案中，与没有柔性接头的等效构建体相比，柔性接头为外源蛋白质提供了更大的柔性和空间自由度。这种增加的柔性可用于需要结合靶标，例如抗体或蛋白质，或蛋白质(对于所述蛋白质，活性位点必须可接近底物(例如靶标))的酶促反应的应用。
[0081]
在一些实施方案中，所提供的方法包括通过使类红祖细胞与核酸接触并在有效递送所述核酸到细胞中的条件，例如本文描述的那些条件下通过电穿孔引入核酸，将大核酸
(特别是rna，例如mrna)递送到类红祖细胞中。合适的电穿孔仪包括但不限于bio-rad gene pulser和gene pulser ii；life technologies neon；btx gemini系统；和maxcyte电穿孔仪。这些方法不需要病毒递送或使用病毒载体。合适的核酸包括rna，例如mrna。合适的核酸还包括dna，包括可转座元件、稳定附加体、质粒dna或线性dna。
[0082]
细胞系的电穿孔的条件已在文献中描述，例如van tendeloo et al.,blood98(l):49-56,2001。适用于本文所述方法的电穿孔条件对于life technologies neon转染系统包括：范围为约500至约2000v，约800至约1800v，或约850至约1700v的脉冲电压；范围为约5至约50msec，或约10至约40msec的脉冲宽度；范围1至2次脉冲、1-3次脉冲、1-4次脉冲或1-5次脉冲的脉冲数。
[0083]
用于类红祖细胞的电穿孔的特别合适的条件包括例如，持续4天：a)脉冲电压1300-1400，脉冲宽度：10-20msec，脉冲数：1-3；b)脉冲电压1400，脉冲宽度：10msec，脉冲数：3；c)脉冲电压1400，脉冲宽度：20msec，脉冲数：1；以及d)脉冲电压1300，脉冲宽度：10msec，脉冲数：3。
[0084]
用于类红祖细胞的电穿孔的特别合适的条件包括，例如，持续8-9天：a)脉冲电压：1400-1600，脉冲宽度：20，脉冲数：1；b)脉冲电压：1100-1300，脉冲宽度：30，脉冲数：1；c)脉冲电压：1000-1200，脉冲宽度：40，脉冲数：1；d)脉冲电压：1100-1400，脉冲宽度：20，脉冲数：2；e)脉冲电压：950-1150，脉冲宽度：30，脉冲数：2；f)脉冲电压：1300-1600，脉冲宽度：10，脉冲数：3。这些条件通常导致至少约60％或更多(例如至少约65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少约97％或更多)的转染效率，以及至少约70％或更高(例如至少约75％、80％、85％、90％、95％或至少约97％或更多)的细胞存活力。
[0085]
在分化条件下培养中的类红祖细胞电穿孔的特别合适的条件包括例如，持续12-13天：a)脉冲电压：1500-1700，脉冲宽度：20，脉冲数：1；以及b)脉冲电压：1500-1600，脉冲宽度：10，脉冲数：3。这些条件通常导致至少约50％或更多(例如至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少约97％或更多)的转染效率和至少约70％或更多(例如至少约75％、80％、85％、90％、95％或至少约97％或更多)的细胞存活力。
[0086]
本领域普通技术人员可以容易地调整本文中关于life technologies neon系统公开的条件，以仅通过常规实验适应不同的电穿孔仪和/或不同的电穿孔设置，并且本文描述的特定电穿孔仪对于公开的方法不是限制性的。
[0087]
在一些实施方案中，使用本文描述的电穿孔条件，对培养的类红祖细胞进行第一次电穿孔，然后培养期望的时间段(任选地在分化条件下)，然后再电穿孔第二次。在一些实施方案中，第一次电穿孔培养的类红祖细胞，然后培养期望的时间段(任选地在分化条件下)，然后再电穿孔第二次、第三次、第四次、第五次或第六次。任选地，可以改变第一次和第二次、第二次和第三次等电穿孔之间的培养期。例如，可以根据需要调整电穿孔之间的时段，例如时段可以是30分钟、1小时、6小时、12小时、18小时、24小时、30小时、36小时、48小时、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天、12天、13天、14天或21天。例如，类红祖细胞可以在第1和2、1和3、1和4、1和5、1和6、1和7、1和8、1和9、1和10、1和11、1和12、1和13、1和14、1和15、或1和16天进行电穿孔。在另一个实例中，细胞可以在第2和3、2和4、2和5、2和6、2和7、2和8、2和9、2和10、2和11、2和12、2和13、2和14、2和15、或2和16天进行电穿孔。在又一个实例中，可以在第3和4、3和5、3和6、3和7、3和8、3和9、3和10、3和11、3和12、3和13、3和14、
3和15或3和16天对类红祖细胞进行电穿孔。在又一个实例中，可以在第4和5、4和6、4和7、4和8、4和9、4和10、4和11、4和12、4和13、4和14、4和15或4和16天对细胞进行电穿孔。在又一个实例中，可以在第5和6、5和7、5和8、5和9、5和10、5和11、5和12、5和13、5和14、5和15，或5和16天对细胞进行电穿孔。可以在第6和7、6和8、6和9、6和10、6和11、6和12、6和13、6和14、6和15或6和16天对细胞进行电穿孔。在另一个实例中，可以在第7和8、7和9、7和10、7和11、7和12、7和13、7和14、7和15或7和16天对类红祖细胞进行电穿孔。在另一个实例中，可以在第8和9、8和10、8和11、8和12、8和13、8和14、8和15或8和16天对类红祖细胞进行电穿孔。在又一个实例中，可以在第9、10、9和11、9和12、9和13、9和14、9和15，或9和16天对类红祖细胞进行电穿孔。在又一个实例中，可以在第10和11、10和12、10和13、10和14、10和15或10和16天对类红祖细胞进行电穿孔。在又一个实例中，可以在第11和12、11和13、11和14、11和15，或11和16天对类红祖细胞进行电穿孔。在又一个实例中，可以在第12天和13、12和14、12和15，或12和16天对类红祖细胞进行电穿孔。在又一个实例中，可以在第13和14、13和15或13和16天对类红祖细胞进行电穿孔。在又一个实例中，可以在第14和15天，或第14和16天对类红祖细胞进行电穿孔。可选地，可以将类红祖细胞电穿孔超过两次，例如，3次、4次、5次或6次，并且可以根据需要在细胞的分化过程的任何点时选择间隔。
[0088]
在一些实施方案中，使用本文描述的电穿孔条件，培养的类红祖细胞在分化的第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16天电穿孔。
[0089]
在一些实施方案中，工程化去核类红细胞可以是点击缀合的工程化去核类红细胞。形成催化键的多肽域可以在例如类红祖细胞之上或之中表达，存在于胞质溶胶中或存在于膜上。存在许多催化键形成多肽，包括转肽酶、分选酶和异肽酶，包括源自spy0128的那些，从酿脓链球菌(streptococcus pyogenes)分离的蛋白质。已经证明了分开spy0128的自催化异肽键形成亚基(cnab2域)产生两种不同的多肽，它们保留了彼此特异性的催化活性。此系统中的多肽称为spytag和spycatcher。混合后，spytag和spycatcher在spytag上的aspl 17和spycatcher上的lys31之间经历异肽键(zakeri and howarth,jacs 132:4526,2010)。该反应与细胞环境相容并且对蛋白质/肽缀合具有高度特异性(zakeri et al.,proc.natl.acad.sci.u.s.a.109:e690-e697,2012)。已经显示了spytag和spycatcher指导弹性蛋白样蛋白的翻译后拓扑修饰。例如，将spytag放置于n端以及将spycatcher放置于c端可指导环状弹性蛋白样蛋白的形成(zhang et al,j.am.chem.soc.2013)。
[0090]
spytag和spycatcher的组分可以互换，使得分子a与spytag融合且分子b与spycatcher融合的系统在功能上等同于分子a与spycatcher融合且分子b与spytag融合的系统。就本公开而言，当使用spytag和spycatcher时，应理解互补分子可以在其适当位置中替换。
[0091]
催化键形成多肽，例如spytag/spycatcher系统，可用于将外源蛋白质附着到例如类红祖细胞或去核类红细胞的表面。spytag多肽序列可以在类红组细胞或去核类红细胞的细胞外表面上表达。spytag多肽可以例如与1型或3型跨膜蛋白(例如血型糖蛋白a)的n端融合，与2型跨膜蛋白(例如kell)的c端融合，以符合读码框方式插入多次通过跨膜蛋白(例如band 3)的胞外末端或胞外环中，与gpi受体多肽(例如cd55或cd59)融合，与脂链锚定多肽融合，或与外周膜蛋白融合。外源蛋白质可以与spycatcher融合。可以表达编码spycatcher融合物的核酸，并且从表达spytag融合物的同一类红祖细胞或去核类红细胞分泌。或者，编
码spycatcher融合物的核酸序列可以外源产生，例如在细菌、真菌、昆虫、哺乳动物或无细胞生产系统中。在spytag和spycatcher多肽反应后，将形成共价键，其将外源蛋白质附着到类红祖细胞或去核类红细胞的表面。
[0092]
在一个实施方案中，spytag多肽可以在类红细胞中在gatal启动子的控制下以与血型糖蛋白a的n端的融合物表达。与spycatcher多肽序列融合的外源蛋白质可以在同一类红细胞中在gatal启动子的控制下表达。在两种融合多肽表达后，spytag和spycatcher多肽之间将形成异肽键，从而在类红细胞表面和外源蛋白之间形成共价键。
[0093]
在另一个实施方案中，spytag多肽可以在类红祖细胞或去核红系细胞中在gatal启动子的控制下以与血型糖蛋白a的n端的融合物表达。与spycatcher多肽序列融合的外源蛋白可以在合适的哺乳动物细胞表达系统，例如hek293细胞中表达。在类红细胞祖细胞或去核类红细胞上表达spytag融合多肽后，可以使spycatcher融合多肽与细胞接触。在合适的反应条件下，spytag和spycatcher多肽之间会形成异肽键，从而在类红祖细胞表面或去核类红细胞表面与外源蛋白之间形成共价键。
[0094]
催化键形成多肽，例如spytag/spycatcher系统，可用于将外源蛋白质锚定到类红祖细胞或去核类红细胞的细胞内空间。spytag多肽序列可以通过多种方法在类红祖细胞或去核类红细胞的细胞内空间中表达，所述方法包括转基因的直接表达、与内源性细胞内蛋白质诸如例如血红蛋白的融合、与内源性细胞表面蛋白(例如band 3、血型糖蛋白a、kell)的胞内域融合，或与细胞骨架的结构组分融合。spytag序列不限于多肽末端，并且可以整合在内源多肽的内部序列内，使得多肽翻译和定位不受干扰。外源蛋白质可以与spycatcher融合。编码spycatcher融合物的核酸序列可以在表达spytag融合物的同一类红祖细胞或去核类红细胞内表达。在spytag和spycatcher多肽反应后，将形成共价键，其作用为将外源蛋白质锚定在类红祖细胞或去核类红细胞的细胞内空间中。
[0095]
在一个实施方案中，类红祖细胞或去核类红细胞可以在细胞内表达与血红蛋白β融合的spytag。类红祖细胞或去核类红细胞可以用包括血红蛋白启动子、β珠蛋白基因和spytag序列的基因序列进行遗传修饰，使得在翻译时，细胞内β珠蛋白在其c末端与spytag融合。此外，类红祖细胞或去核类红细胞表达gatal启动子引导的基因，该基因编码驱动蛋白表达(例如苯丙氨酸羟化酶(pah)表达)的spycatcher，使得在翻译时，细胞内蛋白(例如，pah)在其n端与spycatcher融合。在表达这两种融合蛋白后，spytag结合的β珠蛋白通过异肽键连接到细胞内空间中的spycatcher结合蛋白(例如pah)，使蛋白质(例如，pah)锚定到β珠蛋白并在成熟过程中得到保留。
[0096]
在另一个实施方案中，spytag多肽可以在类红祖细胞或去核类红细胞内表达为与外源蛋白的融合物。spycatcher多肽可以在同一类红祖细胞或去核类红细胞内表达为与血型糖蛋白a的c端(细胞内)的融合物。在两种融合多肽表达后，spytag和spycatcher多肽之间将形成异肽键，从而在膜锚定的内源性类红多肽和外源蛋白之间形成共价键。
[0097]
多肽之间可以形成其他分子融合物，并且包括直接或间接缀合。多肽可以彼此直接缀合或通过接头间接缀合。接头可以是肽、聚合物、适体或核酸。聚合物可以是例如天然的、合成的、线性的或支化的。外源蛋白质可以包括包含第一多肽和第二多肽的异源融合蛋白，该融合蛋白包含彼此直接连接或在一端或两端用居间的接头序列和/或其他序列连接的多肽。与接头的缀合可以通过共价键或离子键进行。
[0098]
在一些实施方案中，工程化的去核类红细胞是已经低渗加载的人去核类红细胞。对于低渗加载/裂解，将类红祖细胞或去核类红细胞暴露于低离子强度缓冲剂中，导致它们破裂。外源蛋白质分布在细胞内。去核类红细胞或类红祖细胞可通过向分离的去核类红细胞团粒加入30-50倍体积过量的5mm磷酸盐缓冲剂(ph 8)进行低渗裂解。通过离心分离所得裂解的细胞膜。重悬裂解的细胞膜团粒，并且在外源蛋白质存在的情况下在低离子强度缓冲剂中温育，例如，温育30分钟。或者，裂解的细胞膜可以与外源蛋白质一起温育短至一分钟或长至几天，这取决于确定有效装载去核类红细胞或类红祖细胞的最佳条件。为了低渗加载编码一种或多种外源蛋白质(例如，本文描述的或本领域已知的任何示例性外源蛋白质)的核酸，可以将核酸悬浮在低渗tris-hcl溶液(ph 7.0)中并注射到类红祖细胞中。tris-hcl的浓度可以为约20mmol/l至约150mmol/l，这取决于确定有效装载去核类红细胞的最佳条件。
[0099]
或者，可以使用针对低渗溶液的受控透析使细胞膨胀并在细胞膜中产生孔，用外源蛋白质加载类红祖细胞或去核的类红细胞(参见，例如，美国专利号4,327,710；5,753,221；6,495,351,和10,046,009)。例如，将细胞团粒重悬在10mm hepes、140mm nacl、5mm葡萄糖ph 7.4中，并在含有10mm nah2p04,10mm nahco3,20mm葡萄糖和4mm mgcl2,ph 7.4的低离子强度缓冲剂中透析。30-60分钟后，将细胞针对含有外源蛋白质的16mm nah2p04,ph 7.4溶液再透析30-60分钟。所有这些程序都可以有利地在4℃的温度下进行。在一些情况下，通过透析方法加载大量类红祖细胞或去核类红细胞可能是有益的，并且可以使用为此目的设计的特定装置(参见，例如美国专利号4,327,710,6,139,836和6,495,351)。
[0100]
缓冲剂
[0101]
本文描述的制剂包括缓冲剂(例如，一种或多种缓冲剂)(例如，本文描述的或本领域已知的任何示例性缓冲剂)。
[0102]
可存在于本文描述的任何制剂中的缓冲剂(例如，一种或多种缓冲剂)的非限制性实例可为good氏缓冲剂。good氏缓冲剂的非限制性实例包括：4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸(hepes)、3-(n-吗啉代)丙磺酸(mops)、2-[[1,3-二羟基-2-(羟甲基)丙-2-基]氨基]乙磺酸(tes)、2-(n-吗啉代)乙磺酸(mes)、2-[(2-氨基-2-氧乙基)-(羧甲基)氨基]乙酸(ada)、n-(2-乙酰胺基)-2-氨基乙磺酸(aces)、n,n-双(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸(bes)、2-(双(2-羟乙基)氨基)乙酸(bicine)、n-环己基-3-氨基丙磺酸(caps)、n-环己基-2-羟基-3-氨基丙磺酸(capso)、n-环己基-2-氨基乙磺酸(ches)、哌嗪-n,n
’‑
双(2-乙磺酸)(pipes)、[三(羟甲基)甲基氨基]丙磺酸(taps)和2-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二醇(tris)。可存在于本文描述的任何制剂中的缓冲剂的其他实例是本领域已知的。
[0103]
本文中描述的任何药学可接受的水性缓冲溶液中的缓冲剂的终浓度(或一种或多种缓冲剂的最终总浓度)可以是例如约0.1mm至约100mm、约0.1mm至约95mm、约0.1mm至约90mm、约0.1mm至约85mm、约0.1mm至约80mm、约0.1mm至约75mm、约0.1mm至约70mm、约0.1mm至约65mm、约0.1mm至约60mm、0.1mm至约55mm、约0.1mm至约50mm、约0.1mm至约45mm、约0.1mm至约40mm、约0.1mm至约35mm、约0.1mm至约30mm、约0.1mm至约25mm、约0.1mm至约20mm、约0.1mm至约15mm、约0.1mm至约10mm、约0.1mm至约5.0mm、约0.1mm至约2.0mm、约0.1mm至约1.0mm、约1.0mm至约100mm、约1.0mm至约95mm、约1.0mm至约90mm、约1.0mm至约85mm、约1.0mm至约80mm、约1.0mm至约75mm、约1.0mm至约70mm、约1.0mm至约65mm、约1.0mm
至约60mm、1.0mm至约55mm、约1.0mm至约50mm、约1.0mm至约45mm、约1.0mm至约40mm、约1.0mm至约35mm、约1.0mm至约30mm、约1.0mm至约25mm、约1.0mm至约20mm、约1.0mm至约15mm、约1.0mm至约10mm、约1.0mm至约5.0mm、约1.0mm至约2.0mm、约5.0mm至约100mm、约5.0mm至约95mm、约5.0mm至约90mm、约5.0mm至约85mm、约5.0mm至约80mm、约5.0mm至约75mm、约5.0mm至约70mm、约5.0mm至约65mm、约5.0mm至约60mm、约5.0mm至约55mm、约5.0mm至约50mm、约5.0mm至约45mm、约5.0mm至约40mm、约5.0mm至约35mm、约5.0mm至约30mm、约5.0mm至约25mm、约5.0mm至约20mm、约5.0mm至约15mm、约5.0mm至约10mm、约10mm至约100mm、约10mm至约95mm、约10mm至约90mm、约10mm至约85mm、约10mm至约80mm、约10mm至约75mm、约10mm至约70mm、约10mm至约65mm、约10mm至约60mm、约10mm至约55mm、约10mm至约50mm、约10mm至约45mm、约10mm至约40mm、约10mm至约35mm、约10mm至约30mm、约10mm至约25mm、约10mm至约20mm、约10mm至约15mm、约15mm至约100mm、约15mm至约95mm、约15mm至约90mm、约15mm至约85mm、约15mm至约80mm、约15mm至约75mm、约15mm至约70mm、约15mm至约65mm、约15mm至约60mm、约15mm至约55mm、约15mm至约50mm、约15mm至约45mm、约15mm至约40mm、约15mm至约35mm、约15mm至约30mm、约15mm至约25mm、约15mm至约20mm、约20mm至约100mm、约20mm至约95mm、约20mm至约90mm、约20mm至约85mm、约20mm至约80mm、约20mm至约75mm、约20mm至约70mm、约20mm至约65mm、约20mm至约60mm、约20mm至约55mm、约20mm至约50mm、约20mm至约45mm、约20mm至约40mm、约20mm至约35mm、约20mm至约30mm或约20mm至约25mm。
[0104]
磷酸根离子
[0105]
本文中描述的任何药学可接受的水性缓冲溶液中的磷酸根离子的终浓度可以是例如约0.1mm至约50mm、约0.1mm至约45mm、约0.1mm至约40mm、约0.1mm至约35mm、约0.1mm至约30mm、约0.1mm至约25mm、约0.1mm至约20mm、约0.1mm至约15mm、约0.1mm至约10mm、约0.1mm至约5.0mm、约0.1mm至约2.0mm、约0.1mm至约1.0mm、约1.0mm至约50mm、约1.0mm至约45mm、约1.0mm至约40mm、约1.0mm至约35mm、约1.0mm至约30mm、约1.0mm至约25mm、约1.0mm至约20mm、约1.0mm至约15mm、约1.0mm至约10mm、约1.0mm至约5.0mm、约1.0mm至约2.0mm、约5.0mm至约50mm、约5.0mm至约45mm、约5.0mm至约40mm、约5.0mm至约35mm、约5.0mm至约30mm、约5.0mm至约25mm、约5.0mm至约20mm、约5.0mm至约15mm、约5.0mm至约10mm、约10mm至约50mm、约10mm至约45mm、约10mm至约40mm、约10mm至约35mm、约10mm至约30mm、约10mm至约25mm、约10mm至约20mm、约10mm至约15mm、约15mm至约50mm、约15mm至约45mm、约15mm至约40mm、约15mm至约35mm、约15mm至约30mm、约15mm至约25mm、约15mm至约20mm、约20mm至约50mm、约20mm至约45mm、约20mm至约40mm、约20mm至约35mm、约20mm至约30mm、约20mm至约25mm、约25mm至约50mm、约25mm至约45mm、约25mm至约40mm、约25mm至约35mm、约25mm至约30mm、约30mm至约50mm、约30mm至约45mm、约30mm至约40mm、约30mm至约35mm、约35mm至约50mm、约35mm至约45mm、约35mm至约40mm、约40mm至约50mm、约40mm至约45mm、或约45mm至约50mm。
[0106]
在一些实施方案中，磷酸根离子以磷酸一钠、磷酸二钠、磷酸一钙、磷酸二钙、三磷酸五钾、三磷酸五钠、磷酸镁、磷酸钾或磷酸铵存在于药学可接受的水性缓冲溶液中。磷酸根离子的另外的药学可接受的来源是本领域已知的。
[0107]
钠离子
[0108]
本文中描述的任何药学可接受的水性缓冲溶液中的钠离子的终浓度可以是例如约20mm至约200mm、约20mm至约190mm、约20mm至约180mm、约20mm至约170mm、约20mm至约160mm、约20mm至约150mm、约20mm至约140mm、约20mm至约130mm、约20mm至约120mm、约20mm至约110mm、约20mm至约100mm、约20mm至约90mm、约20mm至约80mm、约20mm至约70mm、约20mm至约60mm、约20mm至约50mm、约20mm至约40mm、约20mm至约30mm、约30mm至约200mm、约30mm至约190mm、约30mm至约180mm、约30mm至约170mm、约30mm至约160mm、约30mm至约150mm、约30mm至约140mm、约30mm至约130mm、约30mm至约120mm、约30mm至约110mm、约30mm至约100mm、约30mm至约90mm、约30mm至约80mm、约30mm至约70mm、约30mm至约60mm、约30mm至约50mm、约30mm至约40mm、约40mm至约200mm、约40mm至约190mm、约40mm至约180mm、约40mm至约170mm、约40mm至约160mm、约40mm至约150mm、约40mm至约140mm、约40mm至约130mm、约40mm至约120mm、约40mm至约110mm、约40mm至约100mm、约40mm至约90mm、约40mm至约80mm、约40mm至约70mm、约40mm至约60mm、约40mm至约50mm、约50mm至约200mm、约50mm至约190mm、约50mm至约180mm、约50mm至约170mm、约50mm至约160mm、约50mm至约150mm、约50mm至约140mm、约50mm至约130mm、约50mm至约120mm、约50mm至约110mm、约50mm至约100mm、约50mm至约90mm、约50mm至约80mm、约50mm至约70mm、约50mm至约60mm、约60mm至约200mm、约60mm至约190mm、约60mm至约180mm、约60mm至约170mm、约60mm至约160mm、约60mm至约150mm、约60mm至约140mm、约60mm至约130mm、约60mm至约120mm、约60mm至约110mm、约60mm至约100mm、约60mm至约90mm、约60mm至约80mm、约60mm至约70mm、约70mm至约200mm、约70mm至约190mm、约70mm至约180mm、约70mm至约170mm、约70mm至约160mm、约70mm至约150mm、约70mm至约140mm、约70mm至约130mm、约70mm至约120mm、约70mm至约110mm、约70mm至约100mm、约70mm至约90mm、约70mm至约80mm、约80mm至约200mm、约80mm至约190mm、约80mm至约180mm、约80mm至约170mm、约80mm至约160mm、约80mm至约150mm、约80mm至约140mm、约80mm至约130mm、约80mm至约120mm、约80mm至约110mm、约80mm至约100mm、约80mm至约90mm、约90mm至约200mm、约90mm至约190mm、约90mm至约180mm、约90mm至约170mm、约90mm至约160mm、约90mm至约150mm、约90mm至约140mm、约90mm至约130mm、约90mm至约120mm、约90mm至约110mm、约90mm至约100mm、约100mm至约200mm、约100mm至约190mm、约100mm至约180mm、约100mm至约170mm、约100mm至约160mm、约100mm至约150mm、约100mm至约140mm、约100mm至约130mm、约100mm至约120mm、约100mm至约110mm、约110mm至约200mm、约110mm至约190mm、约110mm至约180mm、约110mm至约170mm、约110mm至约160mm、约110mm至约150mm、约110mm至约140mm、约110mm至约130mm、约110mm至约120mm、约120mm至约200mm、约120mm至约190mm、约120mm至约180mm、约120mm至约170mm、约120mm至约160mm、约120mm至约150mm、约120mm至约140mm、约120mm至约130mm、约130mm至约200mm、约130mm至约190mm、约130mm至约180mm、约130mm至约170mm、约130mm至约160mm、约130mm至约150mm、约130mm至约140mm、约140mm至约200mm、约140mm至约190mm、约140mm至约180mm、约140mm至约170mm、约140mm至约160mm、约140mm至约150mm、约150mm至约200mm、约150mm至约190mm、约150mm至约180mm、约150mm至约170mm、约150mm至约160mm、约160mm至约200mm、约160mm至约190mm、约160mm至约180mm、约160mm至约170mm、约170mm至约200mm、约170mm至约190mm、约170mm至约180mm、约180mm至约200mm、约180mm至约190mm、或约190mm至约200mm。
[0109]
在一些实施方案中，钠离子以氯化钠、磷酸一钠、磷酸二钠、氟化钠、溴化钠、碘化
钠、硫酸钠、碳酸氢钠、碳酸钠或氨基钠存在于本文描述的药学可接受的水性缓冲溶液中。钠离子的其他药学可接受的来源是本领域已知的。在一些实施方案中，可以提供钠离子作为组合物中存在的一种或多种阴离子的抗衡离子。
[0110]
钾离子
[0111]
本文描述的任何药学可接受的水性缓冲溶液中的钾离子的终浓度可以是例如约0.1mm至约100mm、约0.1mm至约95mm、约0.1mm至约90mm、约0.1mm至约85mm、约0.1mm至约80mm、约0.1mm至约75mm、约0.1mm至约70mm、约0.1mm至约65mm、约0.1mm至约60mm、约0.1mm至约55mm、约0.1mm至约50mm、约0.1mm至约45mm、约0.1mm至约40mm、约0.1mm至约35mm、约0.1mm至约30mm、约0.1mm至约25mm、约0.1mm至约20mm、约0.1mm至约15mm、约0.1mm至约10mm、约0.1mm至约5mm、约5mm至约100mm、约5mm至约95mm、约5mm至约90mm、约5mm至约85mm、约5mm至约80mm、约5mm至约75mm、约5mm至约70mm、约5mm至约65mm、约5mm至约60mm、约5mm至约55mm、约5mm至约50mm、约5mm至约45mm、约5mm至约40mm、约5mm至约35mm、约5mm至约30mm、约5mm至约25mm、约5mm至约20mm、约5mm至约15mm、约5mm至约10mm、约10mm至约100mm、约10mm至约95mm、约10mm至约90mm、约10mm至约85mm、约10mm至约80mm、约10mm至约75mm、约10mm至约70mm、约10mm至约65mm、约10mm至约60mm、约10mm至约55mm、约10mm至约50mm、约10mm至约45mm、约10mm至约40mm、约10mm至约35mm、约10mm至约30mm、约10mm至约25mm、约10mm至约20mm、约10mm至约15mm、约15mm至约100mm、约15mm至约95mm、约15mm至约90mm、约15mm至约85mm、约15mm至约80mm、约15mm至约75mm、约15mm至约70mm、约15mm至约65mm、约15mm至约60mm、约15mm至约55mm、约15mm至约50mm、约15mm至约45mm、约15mm至约40mm、约15mm至约35mm、约15mm至约30mm、约15mm至约25mm、约15mm至约20mm、约20mm至约100mm、约20mm至约95mm、约20mm至约90mm、约20mm至约85mm、约20mm至约80mm、约20mm至约75mm、约20mm至约70mm、约20mm至约65mm、约20mm至约60mm、约20mm至约55mm、约20mm至约50mm、约20mm至约45mm、约20mm至约40mm、约20mm至约35mm、约20mm至约30mm、约20mm至约25mm、约30mm至约100mm、约30mm至约95mm、约30mm至约90mm、约30mm至约85mm、约30mm至约80mm、约30mm至约75mm、约30mm至约70mm、约30mm至约65mm、约30mm至约60mm、约30mm至约55mm、约30mm至约50mm、约30mm至约45mm、约30mm至约40mm、约30mm至约35mm、约40mm至约100mm、约40mm至约95mm、约40mm至约90mm、约40mm至约85mm、约40mm至约80mm、约40mm至约75mm、约40mm至约70mm、约40mm至约65mm、约40mm至约60mm、约40mm至约55mm、约40mm至约50mm、约40mm至约45mm、约50mm至约100mm、约50mm至约95mm、约50mm至约90mm、约50mm至约85mm、约50mm至约80mm、约50mm至约75mm、约50mm至约70mm、约50mm至约65mm、约50mm至约60mm、约50mm至约55mm、约60mm至约100mm、约60mm至约95mm、约60mm至约90mm、约60mm至约85mm、约60mm至约80mm、约60mm至约75mm、约60mm至约70mm、约60mm至约65mm、约70mm至约100mm、约70mm至约95mm、约70mm至约90mm、约70mm至约85mm、约70mm至约80mm、约70mm至约75mm、约80mm至约100mm、约80mm至约95mm、约80mm至约90mm、约80mm至约85mm、约90mm至约100mm或约90mm至约95mm。
[0112]
在一些实施方案中，钾离子以氯化钾、硫酸氢钾、碳酸钾、氟化钾、碘化钾、硝酸钾、磷酸钾或硫酸钾存在于本文描述的药学可接受的溶液中。其他药学可接受的钾离子来源是本领域已知的。
[0113]
钙离子
[0114]
本文描述的任何药学可接受的水性缓冲溶液中钙离子的终浓度可以是例如约0.01mm至约20mm、约0.01mm至约19mm、约0.01mm至约18mm、约0.01mm至约17mm、约0.01mm至约16mm、约0.01mm至约15mm、约0.01mm至约14mm、约0.01mm至约13mm、约0.01mm至约12mm、约0.01mm至约11mm、约0.01mm至约10mm、约0.01mm至约9mm、约0.01mm至约8mm、约0.01mm至约7mm、约0.01mm至约6mm、约0.01mm至约5mm、约0.01mm至约4mm、约0.01mm至约3mm、约0.01mm至约2mm、约0.01mm至约1mm、约0.01mm至约0.1mm、约0.01mm至约0.05mm、约0.05mm至约20mm、约0.05mm至约19mm、约0.05mm至约18mm、约0.05mm至约17mm、约0.05mm至约16mm、约0.05mm至约15mm、约0.05mm至约14mm、约0.05mm至约13mm、约0.05mm至约12mm、约0.05mm至约11mm、约0.05mm至约10mm、约0.05mm至约9mm、约0.05mm至约8mm、约0.05mm至约7mm、约0.05mm至约6mm、约0.05mm至约5mm、约0.05mm至约4mm、约0.05mm至约3mm、约0.05mm至约2mm、约0.05mm至约1mm、约0.05mm至约0.5mm、约0.05mm至约0.1mm、约0.1mm至约20mm、约0.1mm至约19mm、约0.1mm至约18mm、约0.1mm至约17mm、约0.1mm至约16mm、约0.1mm至约15mm、约0.1mm至约14mm、约0.1mm至约13mm、约0.1mm至约12mm、约0.1mm至约11mm、约0.1mm至约10mm、约0.1mm至约9mm、约0.1mm至约8mm、约0.1mm至约7mm、约0.1mm至约6mm、约0.1mm至约5mm、约0.1mm至约4mm、约0.1mm至约3mm、约0.1mm至约2mm、约0.1mm至约1mm、约0.1mm至约0.5mm、约0.5mm至约20mm、约0.5mm至约19mm、约0.5mm至约18mm、约0.5mm至约17mm、约0.5mm至约16mm、约0.5mm至约15mm、约0.5mm至约14mm、约0.5mm至约13mm、约0.5mm至约12mm、约0.5mm至约11mm、约0.5mm至约10mm、约0.5mm至约9mm、约0.5mm至约8mm、约0.5mm至约7mm、约0.5mm至约6mm、约0.5mm至约5mm、约0.5mm至约4mm、约0.5mm至约3mm、约0.5mm至约2mm、约0.5mm至约1.0mm、约1mm至约20mm、约1mm至约19mm、约1mm至约18mm、约1mm至约17mm、约1mm至约16mm、约1mm至约15mm、约1mm至约14mm、约1mm至约13mm、约1mm至约12mm、约1mm至约11mm、约1mm至约10mm、约1mm至约9mm、约1mm至约8mm、约1mm至约7mm、约1mm至约6mm、约1mm至约5mm、约1mm至约4mm、约1mm至约3mm、约1mm至约2mm、约2mm至约20mm、约2mm至约19mm、约2mm至约18mm、约2mm至约17mm、约2mm至约16mm、约2mm至约15mm、约2mm至约14mm、约2mm至约13mm、约2mm至约12mm、约2mm至约11mm、约2mm至约10mm、约2mm至约9mm、约2mm至约8mm、约2mm至约7mm、约2mm至约6mm、约2mm至约5mm、约2mm至约4mm、约2mm至约3mm、约3mm至约20mm、约3mm至约19mm、约3mm至约18mm、约3mm至约17mm、约3mm至约16mm、约3mm至约15mm、约3mm至约14mm、约3mm至约13mm、约3mm至约12mm、约3mm至约11mm、约3mm至约10mm、约3mm至约9mm、约3mm至约8mm、约3mm至约7mm、约3mm至约6mm、约3mm至约5mm、约3mm至约4mm、约4mm至约20mm、约4mm至约19mm、约4mm至约18mm、约4mm至约17mm、约4mm至约16mm、约4mm至约15mm、约4mm至约14mm、约4mm至约13mm、约4mm至约12mm、约4mm至约11mm、约4mm至约10mm、约4mm至约9mm、约4mm至约8mm、约4mm至约7mm、约4mm至约6mm、约4mm至约5mm、约5mm至约20mm、约5mm至约19mm、约5mm至约18mm、约5mm至约17mm、约5mm至约16mm、约5mm至约15mm、约5mm至约14mm、约5mm至约13mm、约5mm至约12mm、约5mm至约11mm、约5mm至约10mm、约5mm至约9mm、约5mm至约8mm、约5mm至约7mm、约5mm至约6mm、约6mm至约20mm、约6mm至约19mm、约6mm至约18mm、约6mm至约17mm、约6mm至约16mm、约6mm至约15mm、约6mm至约14mm、约6mm至约13mm、约6mm至约12mm、约6mm至约11mm、约6mm至约10mm、约6mm至约9mm、约6mm至约8mm、约6mm至约7mm、约7mm至约20mm、约7mm至约19mm、约7mm至约18mm、约7mm至约17mm、约7mm至约16mm、约7mm至约15mm、约7mm至约14mm、约7mm至约13mm、约7mm至约12mm、约7mm至约11mm、约7mm至约
10mm、约7mm至约9mm、约7mm至约8mm、约8mm至约20mm、约8mm至约19mm、约8mm至约18mm、约8mm至约18mm、约8mm至约16mm、约8mm至约15mm、约8mm至约14mm、约8mm至约13mm、约8mm至约12mm、约8mm至约11mm、约8mm至约10mm、约8mm至约9mm、约9mm至约20mm、约9mm至约19mm、约9mm至约19mm、约9mm至约19mm、约9mm至约16mm、约9mm至约15mm、约9mm至约14mm、约9mm至约13mm、约9mm至约12mm、约9mm至约11mm、约9mm至约10mm、约10mm至约20mm、约10mm至约19mm、约10mm至约18mm、约10mm至约17mm、约10mm至约16mm、约10mm至约15mm、约10mm至约14mm、约10mm至约13mm、约10mm至约12mm、约10mm至约11mm、约11mm至约20mm、约11mm至约19mm、约11mm至约18mm、约11mm至约17mm、约11mm至约16mm、约11mm至约15mm、约11mm至约14mm、约11mm至约13mm、约11mm至约12mm、约12mm至约20mm、约12mm至约19mm、约12mm至约18mm、约12mm至约17mm、约12mm至约16mm、约12mm至约15mm、约12mm至约14mm、约12mm至约13mm、约13mm至约20mm、约13mm至约19mm、约13mm至约18mm、约13mm至约17mm、约13mm至约16mm、约13mm至约15mm、约13mm至约14mm、约14mm至约20mm、约14mm至约19mm、约14mm至约18mm、约14mm至约17mm、约14mm至约16mm、约14mm至约15mm、约15mm至约20mm、约15mm至约19mm、约15mm至约18mm、约15mm至约17mm、约15mm至约16mm、约16mm至约20mm、约16mm至约19mm、约16mm至约18mm、约16mm至约17mm、约17mm至约20mm、约17mm至约19mm、约17mm至约18mm、约18mm至约20mm、约18mm至约19mm或约19mm至约20mm。
[0115]
在一些实施方案中，钙离子以氯化钙、碳酸钙、碘化钙、硫酸钙、磷酸钙或亚硝酸钙存在于本文描述的药学可接受的溶液中。钙离子的其他药学可接受的来源是本领域已知的。
[0116]
镁离子
[0117]
本文描述的任何药学可接受的水性缓冲溶液中镁离子的终浓度可以是例如约0.1mm至约50mm、约0.1mm至约45mm、约0.1mm至约40mm、约0.1mm至约35mm、约0.1mm至约30mm、约0.1mm至约25mm、约0.1mm至约20mm、约0.1mm至约15mm、约0.1mm至约10mm、约0.1mm至约5mm、约0.1mm至约1mm、约0.1mm至约0.5mm、约0.5mm至约50mm、约0.5mm至约45mm、约0.5mm至约40mm、约0.5mm至约35mm、约0.5mm至约30mm、约0.5mm至约25mm、约0.5mm至约20mm、约0.5mm至约15mm、约0.5mm至约10mm、约0.5mm至约5mm、约0.5mm至约1mm、约1mm至约50mm、约1mm至约45mm、约1mm至约40mm、约1mm至约35mm、约1mm至约30mm、约1mm至约25mm、约1mm至约20mm、约1mm至约15mm、约1mm至约10mm、约1mm至约5mm、约5mm至约50mm、约5mm至约45mm、约5mm至约40mm、约5mm至约35mm、约5mm至约30mm、约5mm至约25mm、约5mm至约20mm、约5mm至约15mm、约5mm至约10mm、约10mm至约50mm、约10mm至约45mm、约10mm至约40mm、约10mm至约35mm、约10mm至约30mm、约10mm至约25mm、约10mm至约20mm、约10mm至约15mm、约15mm至约50mm、约15mm至约45mm、约15mm至约40mm、约15mm至约35mm、约15mm至约30mm、约15mm至约25mm、约15mm至约20mm、约20mm至约50mm、约20mm至约45mm、约20mm至约40mm、约20mm至约35mm、约20mm至约30mm、约20mm至约25mm、约25mm至约50mm、约25mm至约45mm、约25mm至约40mm、约25mm至约35mm、约25mm至约30mm、约30mm至约50mm、约30mm至约45mm、约30mm至约40mm、约30mm至约35mm、约35mm至约50mm、约35mm至约45mm、约35mm至约40mm、约40mm至约50mm、约40mm至约45mm或约45mm至约50mm。
[0118]
在一些实施方案中，镁离子以氯化镁、溴化镁、氟化镁、碘化镁或硫酸镁存在于本文描述的药学可接受的溶液中。镁离子的药学可接受的来源的其他实例是本领域已知的。
[0119]
非离子细胞非渗透剂
[0120]
本文描述的任何药学可接受的水性缓冲溶液中的非离子细胞非渗透剂的终浓度可以是例如约5mm至约100mm、约5mm至约90mm、约5mm至约80mm、约5mm至约70mm、约5mm至约60mm、约5mm至约50mm、约5mm至约40mm、约5mm至约30mm、约5mm至约20mm、约5mm至约10mm、约10mm至约100mm、约10mm至约90mm、约10mm至约80mm、约10mm至约70mm、约10mm至约60mm、约10mm至约50mm、约10mm至约40mm、约10mm至约30mm、约10mm至约20mm、约20mm至约100mm、约20mm至约90mm、约20mm至约80mm、约20mm至约70mm、约20mm至约60mm、约20mm至约50mm、约20mm至约40mm、约20mm至约30mm、约30mm至约100mm、约30mm至约90mm、约30mm至约80mm、约30mm至约70mm、约30mm至约60mm、约30mm至约50mm、约30mm至约40mm、约40mm至约100mm、约40mm至约90mm、约40mm至约80mm、约40mm至约70mm、约40mm至约60mm、约40mm至约50mm、约50mm至约100mm、约50mm至约90mm、约50mm至约80mm、约50mm至约70mm、约50mm至约60mm、约60mm至约100mm、约60mm至约90mm、约60mm至约80mm、约60mm至约70mm、约70mm至约100mm、约70mm至约90mm、约70mm至约80mm、约80mm至约100mm、约80mm至约90mm或约90mm至约100mm。
[0121]
非离子细胞非渗透剂的非限制性实例包括甘露糖醇、棉子糖、蔗糖、山梨糖醇、海藻糖、葡萄糖酸盐和peg(例如具有大于1kda、大于5kda或大于15kda的分子量的peg，例如peg 20kda)。非离子细胞非渗透剂的其他实例是本领域已知的。
[0122]
葡萄糖
[0123]
在一些实施方案中，本文中描述的药学可接受的水性缓冲溶液包含小于0.1mm葡萄糖，例如小于0.09mm、小于0.08mm、小于0.07mm、小于0.06mm、小于0.05mm、小于0.04mm、小于0.03mm、小于0.02mm、小于0.01mm、小于0.009mm、小于0.008mm、小于0.007mm、小于0.006mm、小于0.005mm、小于0.004mm、小于0.003mm、小于0.002mm或小于0.001mm。在一些实施方案中，本文中描述的药学可接受的水性缓冲溶液不包含葡萄糖。在一些实施方案中，本文中描述的药学可接受的水性缓冲溶液不包含可检测的葡萄糖。
[0124]
阴离子细胞非渗透剂
[0125]
在一些实施方案中，本文中描述的药学可接受的水性缓冲溶液可以进一步包含阴离子细胞非渗透剂。本文中描述的任何药学可接受的水性缓冲溶液中的阴离子细胞非渗透剂的终浓度可以是例如约1mm至约150mm、约1mm至约140mm、约1mm至约130mm、约1mm至约120mm、约1mm至约110mm、约1mm至约100mm、约1mm至约90mm、约1mm至约80mm、约1mm至约70mm、约1mm至约60mm、约1mm至约50mm、约1mm至约40mm、约1mm至约30mm、约1mm至约20mm、约1mm至约10mm、约1mm至约5mm、约5mm至约150mm、约5mm至约140mm、约5mm至约130mm、约5mm至约120mm、约5mm至约110mm、约5mm至约100mm、约5mm至约90mm、约5mm至约80mm、约5mm至约70mm、约5mm至约60mm、约5mm至约50mm、约5mm至约40mm、约5mm至约30mm、约5mm至约20mm、约5mm至约10mm、约10mm至约150mm、约10mm至约140mm、约10mm至约130mm、约10mm至约120mm、约10mm至约110mm、约10mm至约100mm、约10mm至约90mm、约10mm至约80mm、约10mm至约70mm、约10mm至约60mm、约10mm至约50mm、约10mm至约40mm、约10mm至约30mm、约10mm至约20mm、约20mm至约150mm、约20mm至约140mm、约20mm至约130mm、约20mm至约120mm、约20mm至约110mm、约20mm至约100mm、约20mm至约90mm、约20mm至约80mm、约20mm至约70mm、约20mm至约60mm、约20mm至约50mm、约20mm至约40mm、约20mm至约30mm、约30mm至约150mm、约30mm至约140mm、约30mm至约130mm、约30mm至约120mm、约30mm至约110mm、约30mm至约100mm、约30mm
至约90mm、约30mm至约80mm、约30mm至约70mm、约30mm至约60mm、约30mm至约50mm、约30mm至约40mm、约40mm至约150mm、约40mm至约140mm、约40mm至约130mm、约40mm至约120mm、约40mm至约110mm、约40mm至约100mm、约40mm至约90mm、约40mm至约80mm、约40mm至约70mm、约40mm至约60mm、约40mm至约50mm、约50mm至约150mm、约50mm至约140mm、约50mm至约130mm、约50mm至约120mm、约50mm至约110mm、约50mm至约100mm、约50mm至约90mm、约50mm至约80mm、约50mm至约70mm、约50mm至约60mm、约60mm至约150mm、约60mm至约140mm、约60mm至约130mm、约60mm至约120mm、约60mm至约110mm、约60mm至约100mm、约60mm至约90mm、约60mm至约80mm、约60mm至约70mm、约70mm至约150mm、约70mm至约140mm、约70mm至约130mm、约70mm至约120mm、约70mm至约110mm、约70mm至约100mm、约70mm至约90mm、约70mm至约80mm、约80mm至约150mm、约80mm至约140mm、约80mm至约130mm、约80mm至约120mm、约80mm至约110mm、约80mm至约100mm、约80mm至约90mm、约90mm至约150mm、约90mm至约140mm、约90mm至约130mm、约90mm至约120mm、约90mm至约110mm、约90mm至约100mm、约100mm至约150mm、约100mm至约140mm、约100mm至约130mm、约100mm至约120mm、约100mm至约110mm、约110mm至约150mm、约110mm至约140mm、约110mm至约130mm、约110mm至约120mm、约120mm至约150mm、约120mm至约140mm、约120mm至约130mm、约130mm至约150mm、约130mm至约140mm或约140mm至约150mm。
[0126]
阴离子细胞非渗透剂的非限制性实例包括乳糖酸盐、柠檬酸盐和葡萄糖酸盐。阴离子细胞不渗透剂的其他实例是本领域已知的。
[0127]
氯离子
[0128]
本文中描述的任何药学可接受的水性缓冲溶液中的氯离子的终浓度可以是例如约0.5mm至约60mm、约0.5mm至约55mm、约0.5mm至约50mm、约0.5mm至约45mm、约0.5mm至约40mm、约0.5mm至约35mm、约0.5mm至约30mm、约0.5mm至约25mm、约0.5mm至约20mm、约0.5mm至约15mm、约0.5mm至约10mm、约0.5mm至约5mm、约0.5mm至约1mm、约1mm至约60mm、约1mm至约55mm、约1mm至约50mm、约1mm至约45mm、约1mm至约40mm、约1mm至约35mm、约1mm至约30mm、约1mm至约25mm、约1mm至约20mm、约1mm至约15mm、约1mm至约10mm、约1mm至约5mm、约5mm至约60mm、约5mm至约55mm、约5mm至约50mm、约5mm至约45mm、约5mm至约40mm、约5mm至约35mm、约5mm至约30mm、约5mm至约25mm、约5mm至约20mm、约5mm至约15mm、约5mm至约10mm、约10mm至约60mm、约10mm至约55mm、约10mm至约50mm、约10mm至约45mm、约10mm至约40mm、约10mm至约35mm、约10mm至约30mm、约10mm至约25mm、约10mm至约20mm、约10mm至约15mm、约15mm至约60mm、约15mm至约55mm、约15mm至约50mm、约15mm至约45mm、约15mm至约40mm、约15mm至约35mm、约15mm至约30mm、约15mm至约25mm、约15mm至约20mm、约20mm至约60mm、约20mm至约55mm、约20mm至约50mm、约20mm至约45mm、约20mm至约40mm、约20mm至约35mm、约20mm至约30mm、约20mm至约25mm、约25mm至约60mm、约25mm至约55mm、约25mm至约50mm、约25mm至约45mm、约25mm至约40mm、约25mm至约35mm、约25mm至约30mm、约30mm至约60mm、约30mm至约55mm、约30mm至约50mm、约30mm至约45mm、约30mm至约40mm、约30mm至约35mm、约35mm至约60mm、约35mm至约55mm、约35mm至约50mm、约35mm至约45mm、约35mm至约40mm、约40mm至约60mm、约40mm至约55mm、约40mm至约50mm、约40mm至约45mm、约45mm至约60mm、约45mm至约55mm、约45mm至约50mm、约50mm至约60mm、约50mm至约55mm或约55mm至约60mm。钠离子的非限制性来源包括不同的钠盐，例如氯化钠、氯化钾、氯化钙和氯化镁。钠离子的其他药学上
可接受的来源是本领域已知的。在一些实例中，钠离子可以作为组合物中存在的一种或多种其他阴离子的抗衡离子存在于组合物中。
[0129]
核碱基
[0130]
在一些实施方案中，本文中描述的药学可接受的水性缓冲溶液可以进一步包含约0.01mm至约10mm(例如约0.01mm至约9mm、约0.01mm至约8mm、约0.01mm至约7mm、约0.01mm至约6mm、约0.01mm至约5mm、约0.01mm至约4mm、约0.01mm至约3mm、约0.01mm至约2mm、约0.01mm至约1mm、约0.01mm至约0.1mm、约0.1mm至约10mm、约0.1mm至约9mm、约0.1mm至约8mm、约0.1mm至约7mm、约0.1mm至约6mm、约0.1mm至约5mm、约0.1mm至约4mm、约0.1mm至约3mm、约0.1mm至约2mm、约0.1mm至约1mm、约1mm至约10mm、约1mm至约9mm、约1mm至约8mm、约1mm至约7mm、约1mm至约6mm、约1mm至约5mm、约1mm至约4mm、约1mm至约3mm、约1mm至约2mm、约2mm至约10mm、约2mm至约9mm、约2mm至约8mm、约2mm至约7mm、约2mm至约6mm、约2mm至约5mm、约2mm至约4mm、约2mm至约3mm、约3mm至约10mm、约3mm至约9mm、约3mm至约8mm、约3mm至约7mm、约3mm至约6mm、约3mm至约5mm、约3mm至约4mm、约4mm至约10mm、约4mm至约9mm、约4mm至约8mm、约4mm至约7mm、约4mm至约6mm、约4mm至约5mm、约5mm至约10mm、约5mm至约9mm、约5mm至约8mm、约5mm至约7mm、约5mm至约6mm、约6mm至约10mm、约6mm至约9mm、约6mm至约8mm、约6mm至约7mm、约7mm至约10mm、约7mm至约9mm、约7mm至约8mm、约8mm至约10mm、约8mm至约9mm或约9mm至约10mm)的核碱基。核碱基的非限制性实例包括腺嘌呤、胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、次黄嘌呤和尿嘧啶。
[0131]
核苷
[0132]
在一些实施方案中，本文中描述的药学可接受的水性缓冲溶液可以进一步包含约0.01mm至约10mm(例如约0.01mm至约9mm、约0.01mm至约8mm、约0.01mm至约7mm、约0.01mm至约6mm、约0.01mm至约5mm、约0.01mm至约4mm、约0.01mm至约3mm、约0.01mm至约2mm、约0.01mm至约1mm、约0.01mm至约0.1mm、约0.1mm至约10mm、约0.1mm至约9mm、约0.1mm至约8mm、约0.1mm至约7mm、约0.1mm至约6mm、约0.1mm至约5mm、约0.1mm至约4mm、约0.1mm至约3mm、约0.1mm至约2mm、约0.1mm至约1mm、约1mm至约10mm、约1mm至约9mm、约1mm至约8mm、约1mm至约7mm、约1mm至约6mm、约1mm至约5mm、约1mm至约4mm、约1mm至约3mm、约1mm至约2mm、约2mm至约10mm、约2mm至约9mm、约2mm至约8mm、约2mm至约7mm、约2mm至约6mm、约2mm至约5mm、约2mm至约4mm、约2mm至约3mm、约3mm至约10mm、约3mm至约9mm、约3mm至约8mm、约3mm至约7mm、约3mm至约6mm、约3mm至约5mm、约3mm至约4mm、约4mm至约10mm、约4mm至约9mm、约4mm至约8mm、约4mm至约7mm、约4mm至约6mm、约4mm至约5mm、约5mm至约10mm、约5mm至约9mm、约5mm至约8mm、约5mm至约7mm、约5mm至约6mm、约6mm至约10mm、约6mm至约9mm、约6mm至约8mm、约6mm至约7mm、约7mm至约10mm、约7mm至约9mm、约7mm至约8mm、约8mm至约10mm、约8mm至约9mm或约9mm至约10mm)的核苷。核苷的非限制性实例包括腺苷、肌苷、胞苷、尿苷、鸟苷和胸苷。
[0133]
核苷酸
[0134]
在一些实施方案中，本文中描述的药学可接受的水性缓冲溶液可以进一步包含约0.01mm至约10mm(例如约0.01mm至约9mm、约0.01mm至约8mm、约0.01mm至约7mm、约0.01mm至约6mm、约0.01mm至约5mm、约0.01mm至约4mm、约0.01mm至约3mm、约0.01mm至约2mm、约0.01mm至约1mm、约0.01mm至约0.1mm、约0.1mm至约10mm、约0.1mm至约9mm、约0.1mm至约
8mm、约0.1mm至约7mm、约0.1mm至约6mm、约0.1mm至约5mm、约0.1mm至约4mm、约0.1mm至约3mm、约0.1mm至约2mm、约0.1mm至约1mm、约1mm至约10mm、约1mm至约9mm、约1mm至约8mm、约1mm至约7mm、约1mm至约6mm、约1mm至约5mm、约1mm至约4mm、约1mm至约3mm、约1mm至约2mm、约2mm至约10mm、约2mm至约9mm、约2mm至约8mm、约2mm至约7mm、约2mm至约6mm、约2mm至约5mm、约2mm至约4mm、约2mm至约3mm、约3mm至约10mm、约3mm至约9mm、约3mm至约8mm、约3mm至约7mm、约3mm至约6mm、约3mm至约5mm、约3mm至约4mm、约4mm至约10mm、约4mm至约9mm、约4mm至约8mm、约4mm至约7mm、约4mm至约6mm、约4mm至约5mm、约5mm至约10mm、约5mm至约9mm、约5mm至约8mm、约5mm至约7mm、约5mm至约6mm、约6mm至约10mm、约6mm至约9mm、约6mm至约8mm、约6mm至约7mm、约7mm至约10mm、约7mm至约9mm、约7mm至约8mm、约8mm至约10mm、约8mm至约9mm或约9mm至约10mm)的核苷酸。核苷酸的非限制性实例包括单磷酸腺苷、二磷酸腺苷、三磷酸腺苷、单磷酸鸟苷、二磷酸鸟苷、三磷酸鸟苷、单磷酸胞苷、二磷酸胞苷、三磷酸胞苷、单磷酸胸苷、二磷酸胸苷、三磷酸胸苷、单磷酸尿苷、二磷酸尿苷和三磷酸尿苷。
[0135]
碳酸氢根离子
[0136]
在一些实施方案中，本文中描述的药学可接受的水性缓冲溶液可以进一步包含约0.01mm至约20mm(例如约0.01mm至约18mm、约0.01mm至约16mm、约0.01mm至约14mm、约0.01mm至约12mm、约0.01mm至约10mm、约0.01mm至约9mm、约0.01mm至约8mm、约0.01mm至约7mm、约0.01mm至约6mm、约0.01mm至约5mm、约0.01mm至约4mm、约0.01mm至约3mm、约0.01mm至约2mm、约0.01mm至约1mm、约1mm至约20mm、约1mm至约18mm、约1mm至约16mm、约1mm至约14mm、约1mm至约12mm、约1mm至约10mm、约1mm至约9mm、约1mm至约8mm、约1mm至约7mm、约1mm至约6mm、约1mm至约5mm、约1mm至约4mm、约1mm至约3mm、约1mm至约2mm、约2mm至约20mm、约2mm至约18mm、约2mm至约16mm、约2mm至约14mm、约2mm至约12mm、约2mm至约10mm、约2mm至约9mm、约2mm至约8mm、约2mm至约7mm、约2mm至约6mm、约2mm至约5mm、约2mm至约4mm、约2mm至约3mm、约3mm至约20mm、约3mm至约18mm、约3mm至约16mm、约3mm至约14mm、约3mm至约12mm、约3mm至约10mm、约3mm至约9mm、约3mm至约8mm、约3mm至约7mm、约3mm至约6mm、约3mm至约5mm、约3mm至约4mm、约4mm至约20mm、约4mm至约18mm、约4mm至约16mm、约4mm至约14mm、约4mm至约12mm、约4mm至约10mm、约4mm至约9mm、约4mm至约8mm、约4mm至约7mm、约4mm至约6mm、约4mm至约5mm、约5mm至约20mm、约5mm至约18mm、约5mm至约16mm、约5mm至约14mm、约5mm至约12mm、约5mm至约10mm、约5mm至约9mm、约5mm至约8mm、约5mm至约7mm、约5mm至约6mm、约6mm至约20mm、约6mm至约18mm、约6mm至约16mm、约6mm至约14mm、约6mm至约12mm、约6mm至约10mm、约6mm至约9mm、约6mm至约8mm、约6mm至约7mm、约7mm至约20mm、约7mm至约18mm、约7mm至约16mm、约7mm至约14mm、约7mm至约12mm、约7mm至约10mm、约7mm至约9mm、约7mm至约8mm、约8mm至约20mm、约8mm至约18mm、约8mm至约16mm、约8mm至约14mm、约8mm至约12mm、约8mm至约10mm、约8mm至约9mm、约9mm至约20mm、约9mm至约18mm、约9mm至约16mm、约9mm至约14mm、约9mm至约12mm、约9mm至约10mm、约10mm至约20mm、约10mm至约18mm、约10mm至约16mm、约10mm至约14mm、约10mm至约12mm、约12mm至约20mm、约12mm至约18mm、约12mm至约16mm、约12mm至约14mm、约14mm至约20mm、约14mm至约18mm、约14mm至约16mm、约16mm至约20mm、约16mm至约18mm或约18mm至约20mm)碳酸氢根离子。
[0137]
在一些实施方案中，碳酸氢根离子以碳酸氢钠存在于药学可接受的水性缓冲溶液中。另外的药学可接受的碳酸氢根离子来源是本领域中已知的。
[0138]
丙酮酸盐
[0139]
在一些实施方案中，本文中描述的药学可接受的水性缓冲溶液可以进一步包含约0.01mm至约10mm(例如约0.01mm至约9mm、约0.01mm至约8mm、约0.01mm至约7mm、约0.01mm至约6mm、约0.01mm至约5mm、约0.01mm至约4mm、约0.01mm至约3mm、约0.01mm至约2mm、约0.01mm至约1mm、约0.01mm至约0.1mm、约0.1mm至约10mm、约0.1mm至约9mm、约0.1mm至约8mm、约0.1mm至约7mm、约0.1mm至约6mm、约0.1mm至约5mm、约0.1mm至约4mm、约0.1mm至约3mm、约0.1mm至约2mm、约0.1mm至约1mm、约1mm至约10mm、约1mm至约9mm、约1mm至约8mm、约1mm至约7mm、约1mm至约6mm、约1mm至约5mm、约1mm至约4mm、约1mm至约3mm、约1mm至约2mm、约2mm至约10mm、约2mm至约9mm、约2mm至约8mm、约2mm至约7mm、约2mm至约6mm、约2mm至约5mm、约2mm至约4mm、约2mm至约3mm、约3mm至约10mm、约3mm至约9mm、约3mm至约8mm、约3mm至约7mm、约3mm至约6mm、约3mm至约5mm、约3mm至约4mm、约4mm至约10mm、约4mm至约9mm、约4mm至约8mm、约4mm至约7mm、约4mm至约6mm、约4mm至约5mm、约5mm至约10mm、约5mm至约9mm、约5mm至约8mm、约5mm至约7mm、约5mm至约6mm、约6mm至约10mm、约6mm至约9mm、约6mm至约8mm、约6mm至约7mm、约7mm至约10mm、约7mm至约9mm、约7mm至约8mm、约8mm至约10mm、约8mm至约9mm、或约9mm至约10mm)丙酮酸盐。
[0140]
泊洛沙姆
[0141]
在一些实施方案中，本文中描述的药学可接受的水性缓冲溶液可以进一步包含泊洛沙姆(例如泊洛沙姆-188)。本文中描述的任何药学可接受的水性缓冲溶液中的泊洛沙姆(例如泊洛沙姆-124、泊洛沙姆-182、泊洛沙姆-188、泊洛沙姆-331和/或泊洛沙姆-407)的终浓度可以是约0.01％w/v至约2.0％w/v(例如约0.01％w/v至约1.9％w/v、约0.01％w/v至约1.8％w/v、约0.01％w/v至约1.7％w/v、约0.01％w/v至约1.6％w/v、约0.01％w/v至约1.5％w/v、约0.01％w/v至约1.4％w/v、约0.01％w/v至约1.3％w/v、约0.01％w/v至约1.2％w/v、约0.01％w/v至约1.1％w/v、约0.01％w/v至约1.0％w/v、约0.01％w/v至约0.90％w/v、约0.01％w/v至约0.80％w/v、约0.01％w/v至约0.75％w/v、约0.01％w/v至约0.70％w/v、约0.01％w/v至约0.65％w/v、约0.01％w/v至约0.60％w/v、约0.01％w/v至约0.55％w/v、约0.01％w/v至约0.50％w/v、约0.01％w/v至约0.45％w/v、约0.01％w/v至约0.40％w/v、约0.01％w/v至约0.35％w/v、约0.01％w/v至约0.30％w/v、约0.01％w/v至约0.25％w/v、约0.01％w/v至约0.20％w/v、约0.01％w/v至约0.15％w/v、约0.01％w/v至约0.10％w/v、约0.01％至约0.05％w/v、约0.05％w/v至约2.0％w/v、约0.05％w/v至约1.9％w/v、约0.05％w/v至约1.8％w/v、约0.05％w/v至约1.7％w/v、约0.05％w/v至约1.6％w/v、约0.05％w/v至约1.5％w/v、约0.05％w/v至约1.4％w/v、约0.05％w/v至约1.3％w/v、约0.05％w/v至约1.2％w/v、约0.05％w/v至约1.1％w/v、约0.05％w/v至约1.0％w/v、约0.05％w/v至约0.90％w/v、约0.05％w/v至约0.80％w/v、约0.05％w/v至约0.75％w/v、约0.05％w/v至约0.70％w/v、约0.05％w/v至约0.65％w/v、约0.05％w/v至约0.60％w/v、约0.05％w/v至约0.55％w/v、约0.05％w/v至约0.50％w/v、约0.05％w/v至约0.45％w/v、约0.05％w/v至约0.40％w/v、约0.05％w/v至约0.35％w/v、约0.05％w/v至约0.30％w/v、约0.05％w/v至约0.25％w/v、约0.05％w/v至约0.20％w/v、约0.05％w/v至约0.15％w/v、约0.05％w/v至约0.10％w/v、约0.10％w/v至约2.0％w/v、约0.10％w/v至约1.9％w/v、约0.10％w/v至约1.8％w/v、约0.10％w/v至约1.7％w/v、约0.10％w/v至约1.6％w/v、约0.10％w/v至约1.5％
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0.35％w/v至约1.7％w/v、约0.35％w/v至约1.6％w/v、约0.35％w/v至约1.5％w/v、约0.35％w/v至约1.4％w/v、约0.35％w/v至约1.3％w/v、约0.35％w/v至约1.2％w/v、约0.35％w/v至约1.1％w/v、约0.35％w/v至约1.0％w/v、约0.35％w/v至约0.90％w/v、约0.35％w/v至约0.80％w/v、约0.35％w/v至约0.75％w/v、约0.35％w/v至约0.70％w/v、约0.35％w/v至约0.65％w/v、约0.35％w/v至约0.60％w/v、约0.35％w/v至约0.55％w/v、约0.35％w/v至约0.50％w/v、约0.35％w/v至约0.45％w/v、约0.35％w/v至约0.40％w/v、约0.40％w/v至约2.0％w/v、约0.40％w/v至约1.9％w/v、约0.40％w/v至约1.8％w/v、约0.40％w/v至约1.7％w/v、约0.40％w/v至约1.6％w/v、约0.40％w/v至约1.5％w/v、约0.40％w/v至约1.4％w/v、约0.40％w/v至约1.3％w/v、约0.40％w/v至约1.2％w/v、约0.40％w/v至约1.1％w/v、约0.40％w/v至约1.0％w/v、约0.40％w/v至约0.90％w/v、约0.40％w/v至约0.80％w/v、约0.40％w/v至约0.75％w/v、约0.40％w/v至约0.70％w/v、约0.40％w/v至约0.65％w/v、约0.40％w/v至约0.60％w/v、约0.40％w/v至约0.55％w/v、约0.40％w/v至约0.50％w/v、约0.40％w/v至约0.45％w/v、约0.45％w/v至约2.0％w/v、约0.45％w/v至约1.9％w/v、约0.45％w/v至约1.8％w/v、约0.45％w/v至约1.7％w/v、约0.45％w/v至约1.6％w/v、约0.45％w/v至约1.5％w/v、约0.45％w/v至约1.4％w/v、约0.45％w/v至约1.3％w/v、约0.45％w/v至约1.2％w/v、约0.45％w/v至约1.1％w/v、约0.45％w/v至约1.0％w/v、约0.45％w/v至约0.90％w/v、约0.45％w/v至约0.80％w/v、约0.45％w/v至约0.75％w/v、约0.45％w/v至约0.70％w/v、约0.45％w/v至约0.65％w/v、约0.45％w/v至约0.60％w/v、约0.45％w/v至约0.55％w/v、约0.45％w/v至约0.50％w/v、约0.50％w/v至约2.0％w/v、约0.50％w/v至约1.9％w/v、约0.50％w/v至约1.8％w/v、约0.50％w/v至约1.7％w/v、约0.50％w/v至约1.6％w/v、约0.50％w/v至约1.5％w/v、约0.50％w/v至约1.4％w/v、约0.50％w/v至约1.3％w/v、约0.50％w/v至约1.2％w/v、约0.50％w/v至约1.1％w/v、约0.50％w/v至约1.0％w/v、约0.50％w/v至约0.90％w/v、约0.50％w/v至约0.80％w/v、约0.50％w/v至约0.75％w/v、约0.50％w/v至约0.70％w/v、约0.50％w/v至约0.65％w/v、约0.50％w/v至约0.60％w/v、约0.50％w/v至约0.55％w/v、约0.55％w/v至约2.0％w/v、约0.55％w/v至约1.9％w/v、约0.55％w/v至约1.8％w/v、约0.55％w/v至约1.7％w/v、约0.55％w/v至约1.6％w/v、约0.55％w/v至约1.5％w/v、约0.55％w/v至约1.4％w/v、约0.55％w/v至约1.3％w/v、约0.55％w/v至约1.2％w/v、约0.55％w/v至约1.1％w/v、约0.55％w/v至约1.0％w/v、约0.55％w/v至约0.90％w/v、约0.55％w/v至约0.80％w/v、约0.55％w/v至约0.75％w/v、约0.55％w/v至约0.70％w/v、约0.55％w/v至约0.65％w/v、约0.55％w/v至约0.60％w/v、约0.60％w/v至约2.0％w/v、约0.60％w/v至约1.9％w/v、约0.60％w/v至约1.8％w/v、约0.60％w/v至约1.7％w/v、约0.60％w/v至约1.6％w/v、约0.60％w/v至约1.5％w/v、约0.60％w/v至约1.4％w/v、约0.60％w/v至约1.3％w/v、约0.60％w/v至约1.2％w/v、约0.60％w/v至约1.1％w/v、约0.60％w/v至约1.0％w/v、约0.60％w/v至约0.90％w/v、约0.60％w/v至约0.80％w/v、约0.60％w/v至约0.75％w/v、约0.60％w/v至约0.70％w/v、约0.60％w/v至约0.65％w/v、约0.65％w/v至约2.0％w/v、约0.65％w/v至约1.9％w/v、约0.65％w/v至约1.8％w/v、约0.65％w/v至约1.7％w/v、约0.65％w/v至约1.6％w/v、约0.65％w/v至约1.5％w/v、约0.65％w/v至约1.4％w/v、约0.65％w/v至约1.3％w/v、约0.65％w/v至约1.2％w/v、约
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[0142]
血清白蛋白
[0143]
在一些实施方案中，本文中描述的药学可接受的水性缓冲溶液可以进一步包含血清白蛋白(例如人血清白蛋白或hsa)。本文中描述的任何药学可接受的水性缓冲溶液中的
血清白蛋白(例如人血清白蛋白或hsa)的终浓度可以是约0.01％w/v至约2.0％w/v(例如约0.01％w/v至约1.9％w/v、约0.01％w/v至约1.8％w/v、约0.01％w/v至约1.7％w/v、约0.01％w/v至约1.6％w/v、约0.01％w/v至约1.5％w/v、约0.01％w/v至约1.4％w/v、约0.01％w/v至约1.3％w/v、约0.01％w/v至约1.2％w/v、约0.01％w/v至约1.1％w/v、约0.01％w/v至约1.0％w/v、约0.01％w/v至约0.90％w/v、约0.01％w/v至约0.80％w/v、约0.01％w/v至约0.75％w/v、约0.01％w/v至约0.70％w/v、约0.01％w/v至约0.65％w/v、约0.01％w/v至约0.60％w/v、约0.01％w/v至约0.55％w/v、约0.01％w/v至约0.50％w/v、约0.01％w/v至约0.45％w/v、约0.01％w/v至约0.40％w/v、约0.01％w/v至约0.35％w/v、约0.01％w/v至约0.30％w/v、约0.01％w/v至约0.25％w/v、约0.01％w/v至约0.20％w/v、约0.01％w/v至约0.15％w/v、约0.01％w/v至约0.10％w/v、约0.01％至约0.05％w/v、约0.05％w/v至约2.0％w/v、约0.05％w/v至约1.9％w/v、约0.05％w/v至约1.8％w/v、约0.05％w/v至约1.7％w/v、约0.05％w/v至约1.6％w/v、约0.05％w/v至约1.5％w/v、约0.05％w/v至约1.4％w/v、约0.05％w/v至约1.3％w/v、约0.05％w/v至约1.2％w/v、约0.05％w/v至约1.1％w/v、约0.05％w/v至约1.0％w/v、约0.05％w/v至约0.90％w/v、约0.05％w/v至约0.80％w/v、约0.05％w/v至约0.75％w/v、约0.05％w/v至约0.70％w/v、约0.05％w/v至约0.65％w/v、约0.05％w/v至约0.60％w/v、约0.05％w/v至约0.55％w/v、约0.05％w/v至约0.50％w/v、约0.05％w/v至约0.45％w/v、约0.05％w/v至约0.40％w/v、约0.05％w/v至约0.35％w/v、约0.05％w/v至约0.30％w/v、约0.05％w/v至约0.25％w/v、约0.05％w/v至约0.20％w/v、约0.05％w/v至约0.15％w/v、约0.05％w/v至约0.10％w/v、约0.10％w/v至约2.0％w/v、约0.10％w/v至约1.9％w/v、约0.10％w/v至约1.8％w/v、约0.10％w/v至约1.7％w/v、约0.10％w/v至约1.6％w/v、约0.10％w/v至约1.5％w/v、约0.10％w/v至约1.4％w/v、约0.10％w/v至约1.3％w/v、约0.10％w/v至约1.2％w/v、约0.10％w/v至约1.1％w/v、约0.10％w/v至约1.0％w/v、约0.10％w/v至约0.90％w/v、约0.10％w/v至约0.80％w/v、约0.10％w/v至约0.75％w/v、约0.10％w/v至约0.70％w/v、约0.10％w/v至约0.65％w/v、约0.10％w/v至约0.60％w/v、约0.10％w/v至约0.55％w/v、约0.10％w/v至约0.50％w/v、约0.10％w/v至约0.45％w/v、约0.10％w/v至约0.40％w/v、约0.10％w/v至约0.35％w/v、约0.10％w/v至约0.30％w/v、约0.10％w/v至约0.25％w/v、约0.10％w/v至约0.20％w/v、约0.10％w/v至约0.15％w/v、约0.15％w/v至约2.0％w/v、约0.15％w/v至约1.9％w/v、约0.15％w/v至约1.8％w/v、约0.15％w/v至约1.7％w/v、约0.15％w/v至约1.6％w/v、约0.15％w/v至约1.5％w/v、约0.15％w/v至约1.4％w/v、约0.15％w/v至约1.3％w/v、约0.15％w/v至约1.2％w/v、约0.15％w/v至约1.1％w/v、约0.15％w/v至约1.0％w/v、约0.15％w/v至约0.90％w/v、约0.15％w/v至约0.80％w/v、约0.15％w/v至约0.75％w/v、约0.15％w/v至约0.70％w/v、约0.15％w/v至约0.65％w/v、约0.15％w/v至约0.60％w/v、约0.15％w/v至约0.55％w/v、约0.15％w/v至约0.50％w/v、约0.15％w/v至约0.45％w/v、约0.15％w/v至约0.40％w/v、约0.15％w/v至约0.35％w/v、约0.15％w/v至约0.30％w/v、约0.15％w/v至约0.25％w/v、约0.15％w/v至约0.20％w/v、约0.20％w/v至约2.0％w/v、约0.20％w/v至约1.9％w/v、约0.20％w/v至约1.8％w/v、约0.20％w/v至约1.7％w/v、约0.20％w/v至约1.6％w/v、约0.20％w/v至约1.5％w/v、约0.20％w/v至约1.4％w/v、约0.20％w/v至约1.3％w/v、约0.20％w/v至约1.2％w/v、约
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ph
[0145]
在一些实施方案中，本文中描述的药学可接受的水性缓冲溶液具有例如约6.0至约9.0、约6.0至约8.8、约6.0至约8.6、约6.0至约8.4、约6.0至约8.2、约6.0至约8.0、约6.0至约7.8、约6.0至约7.6、约6.0至约7.4、约6.0至约7.4、约6.0至约7.2、约6.0至约7.0、约6.0至约6.8、约6.0至约6.6、约6.0至约6.4、约6.0至约6.2、约6.2至约9.0、约6.2至约8.8、约6.2至约8.6、约6.2至约8.4、约6.2至约8.2、约6.2至约8.0、约6.2至约7.8、约6.2至约7.6、约6.2至约7.4、约6.2至约7.4、约6.2至约7.2、约6.2至约7.0、约6.2至约6.8、约6.2至约6.6、约6.2至约6.4、约6.4至约9.0、约6.4至约8.8、约6.4至约8.6、约6.4至约8.4、约6.4至约8.2、约6.4至约8.0、约6.4至约7.8、约6.4至约7.6、约6.4至约7.4、约6.4至约7.4、约6.4至约7.2、约6.4至约7.0、约6.4至约6.8、约6.4至约6.6、约6.6至约9.0、约6.6至约8.8、约6.6至约8.6、约6.6至约8.4、约6.6至约8.2、约6.6至约8.0、约6.6至约7.8、约6.6至约7.6、约6.6至约7.4、约6.6至约7.4、约6.6至约7.2、约6.6至约7.0、约6.6至约6.8、约6.8至约9.0、约6.8至约8.8、约6.8至约8.6、约6.8至约8.4、约6.8至约8.2、约6.8至约8.0、约6.8至约7.8、约6.8至约7.6、约6.8至约7.4、约6.8至约7.4、约6.8至约7.2、约6.8至约7.0、约7.0至约9.0、约7.0至约8.8、约7.0至约8.6、约7.0至约8.4、约7.0至约8.2、约7.0至约8.0、约7.0至约7.8、约7.0至约7.6、约7.0至约7.4、约7.0至约7.4、约7.0至约7.2、约7.2至约9.0、约7.2至约8.8、约7.2至约8.6、约7.2至约8.4、约7.2至约8.2、约7.2至约8.0、约7.2至约7.8、约7.2至约7.6、约7.2至约7.4、约7.4至约9.0、约7.4至约8.8、约7.4至约8.6、约7.4至约8.4、约7.4至约8.2、约7.4至约8.0、约7.4至约7.8、约7.4至约7.6、约7.6至约9.0、约7.6至约8.8、约7.6至约8.6、约7.6至约8.4、约7.6至约8.2、约7.6至约8.0、约7.6至约7.8、约7.8至约9.0、约7.8至约8.8、约7.8至约8.6、约7.8至约8.4、约7.8至约8.2、约7.8至约
8.0、约8.0至约9.0、约8.0至约8.8、约8.0至约8.6、约8.0至约8.4、约8.0至约8.2、约8.2至约9.0、约8.2至约8.8、约8.2至约8.6、约8.2至约8.4、约8.4至约9.0、约8.4至约8.8、约8.4至约8.6、约8.6至约9.0、约8.6至约8.8或约8.8至约9.0的ph。
[0146]
渗量
[0147]
在一些实施方案中，本文中描述的药学可接受的水性缓冲溶液具有约100mosm/l至约400mosm/l(例如约100mosm/l至约380mosm/l、约100mosm/l至约360mosm/l、约100mosm/l至约340mosm/l、约100mosm/l至约320mosm/l、约100mosm/l至约300mosm/l、约100mosm/l至约280mosm/l、约100mosm/l至约260mosm/l、约100mosm/l至约250mosm/l、约100mosm/l至约200mosm/l、约100mosm/l至约150mosm/l、约150mosm/l至约400mosm/l、约150mosm/l至约380mosm/l、约150mosm/l至约360mosm/l、约150mosm/l至约340mosm/l、约150mosm/l至约320mosm/l、约150mosm/l至约300mosm/l、约150mosm/l至约280mosm/l、约150mosm/l至约260mosm/l、约150mosm/l至约250mosm/l、约150mosm/l至约200mosm/l、约200mosm/l至约400mosm/l、约200mosm/l至约380mosm/l、约200mosm/l至约360mosm/l、约200mosm/l至约340mosm/l、约200mosm/l至约320mosm/l、约200mosm/l至约300mosm/l、约200mosm/l至约280mosm/l、约200mosm/l至约260mosm/l、约200mosm/l至约250mosm/l、约250mosm/l至约400mosm/l、约250mosm/l至约380mosm/l、约250mosm/l至约360mosm/l、约250mosm/l至约340mosm/l、约250mosm/l至约320mosm/l、约250mosm/l至约300mosm/l、约250mosm/l至约280mosm/l、约250mosm/l至约260mosm/l、约260mosm/l至约400mosm/l、约260mosm/l至约380mosm/l、约260mosm/l至约360mosm/l、约260mosm/l至约340mosm/l、约260mosm/l至约320mosm/l、约260mosm/l至约300mosm/l、约260mosm/l至约280mosm/l、约280mosm/l至约400mosm/l、约280mosm/l至约380mosm/l、约280mosm/l至约360mosm/l、约280mosm/l至约340mosm/l、约280mosm/l至约320mosm/l、约280mosm/l至约300mosm/l、约300mosm/l至约400mosm/l、约300mosm/l至约380mosm/l、约300mosm/l至约360mosm/l、约300mosm/l至约340mosm/l、约300mosm/l至约320mosm/l、约320mosm/l至约400mosm/l、约320mosm/l至约380mosm/l、约320mosm/l至约360mosm/l、约320mosm/l至约340mosm/l、约340mosm/l至约400mosm/l、约340mosm/l至约380mosm/l、约340mosm/l至约360mosm/l、约360mosm/l至约400mosm/l、约360mosm/l至约380mosm/l或约380mosm/l至约400mosm/l)的渗量。
[0148]
示例性实施方案
[0149]
在一些实施方案中，本文中提供的组合物包含药学可接受的水性缓冲溶液，其包含：约70mm至约90mm(例如约75mm至约85mm或约80mm)钠离子、约30mm至约50mm(例如约37mm至约47mm或约42mm)钾离子；约0.01mm至约0.15mm(例如约0.01mm至约0.10mm或约0.05mm)钙离子；约1mm至约10mm(例如约4mm至约6mm或约5mm)镁离子；约5mm至约10mm(例如约8mm至约10mm或约10.1mm)氯离子；约5mm至约15mm(例如约8mm至约12mm或约10mm)磷酸根离子；约1mm至约10mm(例如约3mm至约7mm或约5mm)碳酸氢根离子；约15mm至约35mm(例如约20mm至约30mm或约25mm)缓冲剂(例如hepes)；约80mm至约120mm(例如约90mm至约110mm或约100mm)乳糖酸盐；约30mm至约50mm(例如约35mm至约45mm或约40mm)甘露醇；约0.1mm至约3mm(例如约1.5mm至约2.5mm或约2.0mm)腺苷；和约0.1mm至约2mm(例如约0.5mm至约1.5mm或约1.0mm)腺嘌呤；并且具有约7.4至约7.8(例如约7.5至约7.6或约7.57)的ph。
[0150]
在一些实施方案中，本文中提供的组合物可以包含工程化去核类红细胞(或其群体)和药学可接受的水性缓冲溶液，所述工程化去核类红细胞包含其膜上存在的一种或多种外源蛋白质(例如以下的组合：包含连接到跨膜蛋白(例如gpa或其跨膜片段)的4-1bbl或其片段的第一外源蛋白；和第二外源蛋白，其包含il-15或其片段，其连接到il-15受体alpha(il-15rα)的胞外部分或其片段(例如il-15rαsushi结合域)，连接到跨膜蛋白(例如gpa或其跨膜部分)，例如如记载于美国专利申请公开no.2019/0298769，其通过引用并入本文)，所述药学可接受的水性缓冲溶液包含：约70mm至约90mm(例如约75mm至约85mm或约80mm)钠离子，约30mm至约50mm(例如约37mm至约47mm或约42mm)钾离子；约0.01mm至约0.15mm(例如约0.01mm至约0.10mm或约0.05mm)钙离子；约1mm至约10mm(例如约4mm至约6mm或约5mm)镁离子；约5mm至约10mm(例如约8mm至约10mm或约10.1mm)氯离子；约5mm至约15mm(例如约8mm至约12mm或约10mm)磷酸根离子；约1mm至约10mm(例如约3mm至约7mm或约5mm)碳酸氢根离子；约15mm至约35mm(例如约20mm至约30mm或约25mm)缓冲剂(例如hepes)；约80mm至约120mm(例如约90mm至约110mm或约100mm)乳糖酸盐；约30mm至约50mm(例如约35mm至约45mm或约40mm)甘露醇；约0.1mm至约3mm(例如约1.5mm至约2.5mm或约2.0mm)腺苷；和约0.1mm至约2mm(例如约0.5mm至约1.5mm或约1.0mm)腺嘌呤；并且具有约7.4至约7.8(例如约7.5至约7.6或约7.57)的ph。
[0151]
在一些实施方案中，本文中提供的组合物可以包含工程化去核类红细胞(或其群体)和药学可接受的水性缓冲溶液，所述工程化去核类红细胞包含其膜上存在的一种或多种外源蛋白质(例如以下的组合：包含连接到跨膜蛋白(例如gpa或其跨膜片段)的4-1bbl或其片段的第一外源蛋白；和第二外源蛋白，其包含il-12p40或其片段，其连接到il-12p35或其片段，连接到跨膜域(例如gpa或其跨膜片段或smim1或其跨膜片段)，例如如记载于美国专利申请公开no.2019/0298769，其通过引用并入本文)，所述药学可接受的水性缓冲溶液包含：约70mm至约90mm(例如约75mm至约85mm或约80mm)钠离子，约30mm至约50mm(例如约37mm至约47mm或约42mm)钾离子；约0.01mm至约0.15mm(例如约0.01mm至约0.10mm或约0.05mm)钙离子；约1mm至约10mm(例如约4mm至约6mm或约5mm)镁离子；约5mm至约10mm(例如约8mm至约10mm或约10.1mm)氯离子；约5mm至约15mm(例如约8mm至约12mm或约10mm)磷酸根离子；约1mm至约10mm(例如约3mm至约7mm或约5mm)碳酸氢根离子；约15mm至约35mm(例如约20mm至约30mm或约25mm)缓冲剂(例如hepes)；约80mm至约120mm(例如约90mm至约110mm或约100mm)乳糖酸盐；约30mm至约50mm(例如约35mm至约45mm或约40mm)甘露醇；约0.1mm至约3mm(例如约1.5mm至约2.5mm或约2.0mm)腺苷；和约0.1mm至约2mm(例如约0.5mm至约1.5mm或约1.0mm)腺嘌呤；并且具有约7.4至约7.8(例如约7.5至约7.6或约7.57)的ph。
[0152]
在一些实施方案中，本文中提供的组合物可以包含工程化去核类红细胞(或其群体)和药学可接受的水性缓冲溶液，所述工程化去核类红细胞包含其膜上存在的一种或多种外源蛋白质(例如以下的组合：第一外源蛋白，所述第一外源蛋白包含抗原性肽(例如hpv抗原，诸如hpv16 e7
11-19
)，其连接到beta 2微球蛋白(b2m)或其片段，连接到mhc i类蛋白(例如hla*02:01)的alpha1、alpha2和alpha 3域中的一种或多种或其片段或变体，连接到跨膜蛋白(例如gpa或其跨膜片段)；第二外源蛋白，所述第二外源蛋白包含4-1bbl或其片段，连接到跨膜蛋白(例如gpa或其跨膜片段)；和第二外源蛋白，其包含il-12p40或其片段，连接到il-12p35或其片段，连接到跨膜蛋白(例如gpa或其跨膜片段或smim1或其跨膜片
段)，例如如记载于美国专利申请公开no.2019/0298769，其通过引用并入本文)，所述药学可接受的水性缓冲溶液包含：约70mm至约90mm(例如约75mm至约85mm或约80mm)钠离子，约30mm至约50mm(例如约37mm至约47mm或约42mm)钾离子；约0.01mm至约0.15mm(例如约0.01mm至约0.10mm或约0.05mm)钙离子；约1mm至约10mm(例如约4mm至约6mm或约5mm)镁离子；约5mm至约10mm(例如约8mm至约10mm或约10.1mm)氯离子；约5mm至约15mm(例如约8mm至约12mm或约10mm)磷酸根离子；约1mm至约10mm(例如约3mm至约7mm或约5mm)碳酸氢根离子；约15mm至约35mm(例如约20mm至约30mm或约25mm)缓冲剂(例如hepes)；约80mm至约120mm(例如约90mm至约110mm或约100mm)乳糖酸盐；约30mm至约50mm(例如约35mm至约45mm或约40mm)甘露醇；约0.1mm至约3mm(例如约1.5mm至约2.5mm或约2.0mm)腺苷；和约0.1mm至约2mm(例如约0.5mm至约1.5mm或约1.0mm)腺嘌呤；并且具有约7.4至约7.8(例如约7.5至约7.6或约7.57)的ph。
[0153]
在一些实施方案中，本文中提供的组合物包含药学可接受的水性缓冲溶液，其包含：约70mm至约90mm(例如约75mm至约85mm或约80mm)钠离子，约30mm至约50mm(例如约37mm至约47mm或约42mm)钾离子；约0.01mm至约0.15mm(例如约0.01mm至约0.10mm或约0.05mm)钙离子；约1mm至约10mm(例如约4mm至约6mm或约5mm)镁离子；约5mm至约10mm(例如约8mm至约10mm或约10.1mm)氯离子；约5mm至约15mm(例如约8mm至约12mm或约10mm)磷酸根离子；约1mm至约10mm(例如约3mm至约7mm或约5mm)碳酸氢根离子；约15mm至约35mm(例如约20mm至约30mm或约25mm)缓冲剂(例如hepes)；约80mm至约120mm(例如约90mm至约110mm或约100mm)乳糖酸盐；约30mm至约50mm(例如约35mm至约45mm或约40mm)甘露醇；约0.1mm至约3mm(例如约1.5mm至约2.5mm或约2.0mm)腺苷；约0.1mm至约2mm(例如约0.5mm至约1.5mm或约1.0mm)腺嘌呤；和约0.1％w/v至约0.9％w/v(例如约0.3％w/v至约0.7％w/v或约0.5％w/v)泊洛沙姆(例如泊洛沙姆-188)并且具有约7.4至约7.8(例如约7.5至约7.6或约7.57)的ph。
[0154]
在一些实施方案中，本文中提供的组合物包含工程化去核类红细胞(或其群体)和药学可接受的水性缓冲溶液，所述工程化去核类红细胞包含其膜上存在的一种或多种外源蛋白质(例如以下的组合：第一外源蛋白，其包含4-1bbl或其片段，连接到跨膜蛋白(例如，gpa，或其跨膜片段)；和第二外源蛋白，其包含il-15或其片段，连接到il-15受体alpha(il-15rα)的细胞外部分或其片段(例如，il-15rαsushi结合域)，连接到跨膜蛋白(例如，gpa或其跨膜片段)，例如如记载于美国专利申请公开no.2019/0298769，其通过引用并入本文)，所述药学可接受的水性缓冲溶液包含：约70mm至约90mm(例如约75mm至约85mm或约80mm)钠离子，约30mm至约50mm(例如约37mm至约47mm或约42mm)钾离子；约0.01mm至约0.15mm(例如约0.01mm至约0.10mm或约0.05mm)钙离子；约1mm至约10mm(例如约4mm至约6mm或约5mm)镁离子；约5mm至约10mm(例如约8mm至约10mm或约10.1mm)氯离子；约5mm至约15mm(例如约8mm至约12mm或约10mm)磷酸根离子；约1mm至约10mm(例如约3mm至约7mm或约5mm)碳酸氢根离子；约15mm至约35mm(例如约20mm至约30mm或约25mm)缓冲剂(例如hepes)；约80mm至约120mm(例如约90mm至约110mm或约100mm)乳糖酸盐；约30mm至约50mm(例如约35mm至约45mm或约40mm)甘露醇；约0.1mm至约3mm(例如约1.5mm至约2.5mm或约2.0mm)腺苷；约0.1mm至约2mm(例如约0.5mm至约1.5mm或约1.0mm)腺嘌呤；和约0.1％w/v至约0.9％w/v(例如约0.3％w/v至约0.7％w/v或约0.5％w/v)泊洛沙姆(例如泊洛沙姆-188)，并且具有约7.4至约7.8
(例如约7.5至约7.6或约7.57)的ph。
[0155]
在一些实施方案中，本文中提供的组合物包含工程化去核类红细胞(或其群体)和药学可接受的水性缓冲溶液，所述工程化去核类红细胞包含其膜上存在的一种或多种外源蛋白质(例如以下的组合：第一外源蛋白，其包含4-1bbl或其片段，连接到跨膜蛋白(例如，gpa，或其跨膜片段)；和第二外源蛋白，其包含il-12p40或其片段，连接到il-12p35或其片段，连接到跨膜蛋白(例如，gpa或其跨膜片段，或smim1或其跨膜片段)，例如如记载于美国专利申请公开no.2019/0298769，其通过引用并入本文)，所述药学可接受的水性缓冲溶液包含：约70mm至约90mm(例如约75mm至约85mm或约80mm)钠离子，约30mm至约50mm(例如约37mm至约47mm或约42mm)钾离子；约0.01mm至约0.15mm(例如约0.01mm至约0.10mm或约0.05mm)钙离子；约1mm至约10mm(例如约4mm至约6mm或约5mm)镁离子；约5mm至约10mm(例如约8mm至约10mm或约10.1mm)氯离子；约5mm至约15mm(例如约8mm至约12mm或约10mm)磷酸根离子；约1mm至约10mm(例如约3mm至约7mm或约5mm)碳酸氢根离子；约15mm至约35mm(例如约20mm至约30mm或约25mm)缓冲剂(例如hepes)；约80mm至约120mm(例如约90mm至约110mm或约100mm)乳糖酸盐；约30mm至约50mm(例如约35mm至约45mm或约40mm)甘露醇；约0.1mm至约3mm(例如约1.5mm至约2.5mm或约2.0mm)腺苷；约0.1mm至约2mm(例如约0.5mm至约1.5mm或约1.0mm)腺嘌呤；和约0.1％w/v至约0.9％w/v(例如约0.3％w/v至约0.7％w/v或约0.5％w/v)泊洛沙姆(例如泊洛沙姆-188)并且具有约7.4至约7.8(例如约7.5至约7.6或约7.57)的ph。
[0156]
在一些实施方案中，本文中提供的组合物包含工程化去核类红细胞(或其群体)和药学可接受的水性缓冲溶液，所述工程化去核类红细胞包含其膜上存在的一种或多种外源蛋白质(例如以下的组合：第一外源蛋白，所述第一外源蛋白包含抗原性肽(例如hpv抗原，诸如hpv16 e7
11-19
)，其连接到b2m或其片段，连接到mhc i类蛋白(例如hla*02:01)的alpha1、alpha2和alpha 3域中的一种或多种或其片段或变体，连接到跨膜蛋白(例如gpa或其跨膜片段)；第二外源蛋白，所述第二外源蛋白包含4-1bbl或其片段，连接到跨膜蛋白(例如gpa或其跨膜片段)；和第二外源蛋白，其包含il-12p40或其片段，连接到il-12p35或其片段，连接到跨膜蛋白(例如gpa或其跨膜片段或smim1或其跨膜片段)，例如如记载于美国专利申请公开no.2019/0298769，其通过引用并入本文)，所述药学可接受的水性缓冲溶液包含：约70mm至约90mm(例如约75mm至约85mm或约80mm)钠离子，约30mm至约50mm(例如约37mm至约47mm或约42mm)钾离子；约0.01mm至约0.15mm(例如约0.01mm至约0.10mm或约0.05mm)钙离子；约1mm至约10mm(例如约4mm至约6mm或约5mm)镁离子；约5mm至约10mm(例如约8mm至约10mm或约10.1mm)氯离子；约5mm至约15mm(例如约8mm至约12mm或约10mm)磷酸根离子；约1mm至约10mm(例如约3mm至约7mm或约5mm)碳酸氢根离子；约15mm至约35mm(例如约20mm至约30mm或约25mm)缓冲剂(例如hepes)；约80mm至约120mm(例如约90mm至约110mm或约100mm)乳糖酸盐；约30mm至约50mm(例如约35mm至约45mm或约40mm)甘露醇；约0.1mm至约3mm(例如约1.5mm至约2.5mm或约2.0mm)腺苷；约0.1mm至约2mm(例如约0.5mm至约1.5mm或约1.0mm)腺嘌呤；和约0.1％w/v至约0.9％w/v(例如约0.3％w/v至约0.7％w/v或约0.5％w/v)泊洛沙姆(例如泊洛沙姆-188)并且具有约7.4至约7.8(例如约7.5至约7.6或约7.57)的ph。
[0157]
在一些实施方案中，本文中提供的组合物包含药学可接受的水性缓冲溶液，其包
含：约70mm至约90mm(例如约75mm至约85mm或约79.4mm)钠离子，约30mm至约50mm(例如约37mm至约47mm或约41.7mm)钾离子；约0.01mm至约0.15mm(例如约0.01mm至约0.10mm或约0.05mm)钙离子；约1mm至约10mm(例如约4mm至约6mm或约5mm)镁离子；约5mm至约10mm(例如约8mm至约10mm或约10.0mm)氯离子；约5mm至约15mm(例如约8mm至约12mm或约9.9mm)磷酸根离子；约1mm至约10mm(例如约3mm至约7mm或约5mm)碳酸氢根离子；约15mm至约35mm(例如约20mm至约30mm或约24.8mm)缓冲剂(例如hepes)；约80mm至约120mm(例如约90mm至约110mm或约99.2mm)乳糖酸盐；约30mm至约50mm(例如约35mm至约45mm或约39.7mm)甘露醇；约0.1mm至约3mm(例如约1.5mm至约2.5mm或约2.0mm)腺苷；约0.1mm至约2mm(例如约0.5mm至约1.5mm或约1.0mm)腺嘌呤；和约0.1％w/v至约0.3％w/v(例如约0.15％w/v至约0.25％w/v或约0.20％w/v)血清白蛋白(例如人血清白蛋白)，并且具有约7.4至约7.8(例如约7.5至约7.6或约7.57)的ph。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液进一步包含约0.1％w/v至约0.9％w/v(例如约0.3％w/v至约0.7％w/v或约0.5％w/v)泊洛沙姆(例如泊洛沙姆-188)。
[0158]
在一些实施方案中，本文中提供的组合物包含工程化去核类红细胞(或其群体)和药学可接受的水性缓冲溶液，所述工程化去核类红细胞包含其膜上存在的一种或多种外源蛋白质(例如以下的组合：第一外源蛋白，其包含4-1bbl或其片段，连接到跨膜蛋白(例如，gpa，或其跨膜片段)；和第二外源蛋白，其包含il-15或其片段，连接到il-15rα的细胞外部分或其片段(例如，il-15rαsushi结合域)，连接到跨膜蛋白(例如，gpa或其跨膜片段)，例如如记载于美国专利申请公开no.2019/0298769，其通过引用并入本文)，所述药学可接受的水性缓冲溶液包含：约70mm至约90mm(例如约75mm至约85mm或约79.4mm)钠离子，约30mm至约50mm(例如约37mm至约47mm或约41.7mm)钾离子；约0.01mm至约0.15mm(例如约0.01mm至约0.10mm或约0.05mm)钙离子；约1mm至约10mm(例如约4mm至约6mm或约5mm)镁离子；约5mm至约10mm(例如约8mm至约10mm或约10.0mm)氯离子；约5mm至约15mm(例如约8mm至约12mm或约9.9mm)磷酸根离子；约1mm至约10mm(例如约3mm至约7mm或约5mm)碳酸氢根离子；约15mm至约35mm(例如约20mm至约30mm或约24.8mm)缓冲剂(例如hepes)；约80mm至约120mm(例如约90mm至约110mm或约99.2mm)乳糖酸盐；约30mm至约50mm(例如约35mm至约45mm或约39.7mm)甘露醇；约0.1mm至约3mm(例如约1.5mm至约2.5mm或约2.0mm)腺苷；约0.1mm至约2mm(例如约0.5mm至约1.5mm或约1.0mm)腺嘌呤；和约0.1％w/v至约0.3％w/v(例如约0.15％w/v至约0.25％w/v或约0.20％w/v)血清白蛋白(例如人血清白蛋白)并且具有约7.4至约7.8(例如约7.5至约7.6或约7.57)的ph。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液进一步包含约0.1％w/v至约0.9％w/v(例如约0.3％w/v至约0.7％w/v或约0.5％w/v)泊洛沙姆(例如泊洛沙姆-188)。
[0159]
在一些实施方案中，本文中提供的组合物包含工程化去核类红细胞(或其群体)和药学可接受的水性缓冲溶液，所述工程化去核类红细胞包含其膜上存在的一种或多种外源蛋白质(例如以下的组合：第一外源蛋白，其包含4-1bbl或其片段，连接到跨膜蛋白(例如，gpa，或其跨膜片段)；和第二外源蛋白，其包含il-12p40或其片段，连接到il-12p35或其片段，连接到跨膜蛋白(例如，gpa或其跨膜片段，或smim1或其跨膜片段)，例如如记载于美国专利申请公开no.2019/0298769，其通过引用并入本文)，所述药学可接受的水性缓冲溶液包含：约70mm至约90mm(例如约75mm至约85mm或约79.4mm)钠离子，约30mm至约50mm(例如约
37mm至约47mm或约41.7mm)钾离子；约0.01mm至约0.15mm(例如约0.01mm至约0.10mm或约0.05mm)钙离子；约1mm至约10mm(例如约4mm至约6mm或约5mm)镁离子；约5mm至约10mm(例如约8mm至约10mm或约10.0mm)氯离子；约5mm至约15mm(例如约8mm至约12mm或约9.9mm)磷酸根离子；约1mm至约10mm(例如约3mm至约7mm或约5mm)碳酸氢根离子；约15mm至约35mm(例如约20mm至约30mm或约24.8mm)缓冲剂(例如hepes)；约80mm至约120mm(例如约90mm至约110mm或约99.2mm)乳糖酸盐；约30mm至约50mm(例如约35mm至约45mm或约39.7mm)甘露醇；约0.1mm至约3mm(例如约1.5mm至约2.5mm或约2.0mm)腺苷；约0.1mm至约2mm(例如约0.5mm至约1.5mm或约1.0mm)腺嘌呤；和约0.1％w/v至约0.3％w/v(例如约0.15％w/v至约0.25％w/v或约0.20％w/v)血清白蛋白(例如人血清白蛋白)并且具有约7.4至约7.8(例如约7.5至约7.6或约7.57)的ph。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液进一步包含约0.1％w/v至约0.9％w/v(例如约0.3％w/v至约0.7％w/v或约0.5％w/v)泊洛沙姆(例如泊洛沙姆-188)。
[0160]
在一些实施方案中，本文中提供的组合物包含工程化去核类红细胞(或其群体)和药学可接受的水性缓冲溶液，所述工程化去核类红细胞包含其膜上存在的一种或多种外源蛋白质(例如以下的组合：第一外源蛋白，所述第一外源蛋白包含抗原性肽(例如hpv抗原，诸如hpv16 e7
11-19
)，其连接到b2m或其片段，连接到mhc i类蛋白(例如hla*02:01)的alpha1、alpha2和alpha 3域中的一种或多种或其片段或变体，连接到跨膜蛋白(例如gpa或其跨膜片段)；第二外源蛋白，所述第二外源蛋白包含4-1bbl或其片段，连接到跨膜蛋白(例如gpa或其跨膜片段)；和第二外源蛋白，其包含il-12p40或其片段，连接到il-12p35或其片段，连接到跨膜蛋白(例如gpa或其跨膜片段或smim1或其跨膜片段)，例如如记载于美国专利申请公开no.2019/0298769，其通过引用并入本文)，所述药学可接受的水性缓冲溶液包含：约70mm至约90mm(例如约75mm至约85mm或约79.4mm)钠离子，约30mm至约50mm(例如约37mm至约47mm或约41.7mm)钾离子；约0.01mm至约0.15mm(例如约0.01mm至约0.10mm或约0.05mm)钙离子；约1mm至约10mm(例如约4mm至约6mm或约5mm)镁离子；约5mm至约10mm(例如约8mm至约10mm或约10.0mm)氯离子；约5mm至约15mm(例如约8mm至约12mm或约9.9mm)磷酸根离子；约1mm至约10mm(例如约3mm至约7mm或约5mm)碳酸氢根离子；约15mm至约35mm(例如约20mm至约30mm或约24.8mm)缓冲剂(例如hepes)；约80mm至约120mm(例如约90mm至约110mm或约99.2mm)乳糖酸盐；约30mm至约50mm(例如约35mm至约45mm或约39.7mm)甘露醇；约0.1mm至约3mm(例如约1.5mm至约2.5mm或约2.0mm)腺苷；约0.1mm至约2mm(例如约0.5mm至约1.5mm或约1.0mm)腺嘌呤；和约0.1％w/v至约0.3％w/v(例如约0.15％w/v至约0.25％w/v或约0.20％w/v)血清白蛋白(例如人血清白蛋白)并且具有约7.4至约7.8(例如约7.5至约7.6或约7.57)的ph。在一些实施方案中，药学可接受的水性缓冲溶液进一步包含约0.1％w/v至约0.9％w/v(例如约0.3％w/v至约0.7％w/v或约0.5％w/v)泊洛沙姆(例如泊洛沙姆-188)。
[0161]
试剂盒
[0162]
本文还提供了包含本文提供的任何组合物的试剂盒。本文还提供了试剂盒，其包含一个或多个含有本文描述的任何组合物的无菌容器(例如，无菌锥形管、无菌培养皿、无菌小瓶(例如硼硅酸盐玻璃小瓶)和无菌塑料袋(邻苯二甲酸二-2-乙基己酯(dehp)-增塑聚氯乙烯(pvc)袋或正丁酰基-三(正己基)-柠檬酸酯(bthc)-增塑pvc袋)。在一些实施方案
中，本文提供的任何试剂盒还可包含将任何组合物施用于有此需要的受试者的用法说明。
[0163]
本文描述的试剂盒的一些实施方案包括本文描述的任何组合物的合适的单一剂型。例如，本文描述的任何组合物的单一剂型可以具有例如约0.5ml至约2l、约0.5ml至约1800ml、约0.5ml至约1500ml、约0.5ml至约1200ml、约0.5ml至约1000ml、约0.5ml至约800ml、约0.5ml至约600ml、约0.5ml至约500ml、约0.5ml至约450ml、约0.5ml至约400ml、约0.5ml至约350ml、约0.5ml至约300ml、约0.5ml至约250ml、约0.5ml至约200ml、约0.5ml至约180ml、约0.5ml至约160ml、约0.5ml至约140ml、约0.5ml至约120ml、约0.5ml至约100ml、约0.5ml至约80ml、约0.5ml至约60ml、约0.5ml至约40ml、约0.5ml至约20ml、约0.5ml至约10ml、约0.5ml至约5ml、约0.5ml至约1.0ml、约1.0ml至约2l、约1.0ml至约1800ml、约1.0ml至约1500ml、约1.0ml至约1200ml、约1.0ml至约1000ml、约1.0ml至约800ml、约1.0ml至约600ml、约1.0ml至约500ml、约1.0ml至约450ml、约1.0ml至约400ml、约1.0ml至约350ml、约1.0ml至约300ml、约1.0ml至约250ml、约1.0ml至约200ml、约1.0ml至约180ml、约1.0ml至约160ml、约1.0ml至约140ml、约1.0ml至约120ml、约1.0ml至约100ml、约1.0ml至约80ml、约1.0ml至约60ml、约1.0ml至约40ml、约1.0ml至约20ml、约1.0ml至约10ml、约1.0ml至约5ml、约5ml至约2l、约5ml至约1800ml、约5ml至约1500ml、约5ml至约1200ml、约5ml至约1000ml、约5ml至约800ml、约5ml至约600ml、约5ml至约1800ml、约5ml至约500ml、约5ml至约450ml、约5ml至约400ml、约5ml至约350ml、约5ml至约300ml、约5ml至约250ml、约5ml至约200ml、约5ml至约180ml、约5ml至约160ml、约5ml至约140ml、约5ml至约120ml、约5ml至约100ml、约5ml至约80ml、约5ml至约60ml、约5ml至约40ml、约5ml至约20ml、约5ml至约10ml、约10ml至约2l、约10ml至约1800ml、约10ml至约1500ml、约10ml至约1200ml、约10ml至约1000ml、约10ml至约800ml、约10ml至约600ml、约10ml至约500ml、约10ml至约450ml、约10ml至约400ml、约10ml至约350ml、约10ml至约300ml、约10ml至约250ml、约10ml至约200ml、约10ml至约180ml、约10ml至约160ml、约10ml至约140ml、约10ml至约120ml、约10ml至约100ml、约10ml至约80ml、约10ml至约60ml、约10ml至约40ml、约10ml至约20ml、约20ml至约2l、约20ml至约1800ml、约20ml至约1500ml、约20ml至约1200ml、约20ml至约1000ml、约20ml至约800ml、约20ml至约600ml、约20ml至约500ml、约20ml至约450ml、约20ml至约400ml、约20ml至约350ml、约20ml至约300ml、约20ml至约250ml、约20ml至约200ml、约20ml至约180ml、约20ml至约160ml、约20ml至约140ml、约20ml至约120ml、约20ml至约100ml、约20ml至约80ml、约20ml至约60ml、约20ml至约40ml、约40ml至约2l、约40ml至约1800ml、约40ml至约1500ml、约40ml至约1200ml、约40ml至约1000ml、约40ml至约800ml、约40ml至约600ml、约40ml至约500ml、约40ml至约450ml、约40ml至约400ml、约40ml至约350ml、约40ml至约300ml、约40ml至约250ml、约40ml至约200ml、约40ml至约180ml、约40ml至约160ml、约40ml至约140ml、约40ml至约120ml、约40ml至约100ml、约40ml至约80ml、约40ml至约60ml、约60ml至约2l、约60ml至约1800ml、约60ml至约1500ml、约60ml至约1200ml、约60ml至约1000ml、约60ml至约800ml、约60ml至约600ml,约60ml至约500ml、约60ml至约450ml、约60ml至约400ml、约60ml至约350ml、约60ml至约300ml、约60ml至约250ml、约60ml至约200ml、约60ml至约180ml、约60ml至约160ml、约60ml至约140ml、约60ml至约120ml、约60ml至约100ml、约60ml至约80ml、约80ml至约2l、约80ml至约1800ml、约80ml至约1500ml、约80ml至约1200ml、约80ml至约1000ml、约80ml至约800ml、约80ml至约600ml、约80ml至约500ml、约80ml至约450ml、约80ml
至约400ml、约80ml至约350ml、约80ml至约300ml、约80ml至约250ml、约80ml至约200ml、约80ml至约180ml、约80ml至约160ml、约80ml至约140ml、约80ml至约120ml、约80ml至约100ml、约100ml至约2l、约100ml至约1800ml、约100ml至约1500ml、约100ml至约1200ml、约100ml至约1000ml、约100ml至约800ml、约100ml至约600ml、约100ml至约500ml、约100ml至约450ml、约100ml至约400ml、约100ml至约350ml、约100ml至约300ml、约100ml至约250ml、约100ml至约200ml、约100ml至约180ml、约100ml至约160ml、约100ml至约140ml、约100ml至约120ml、约120ml至约2l、约120ml至约1800ml、约120ml至约1500ml、约120ml至约1200ml、约120ml至约1000ml、约120ml至约800ml、约120ml至约600ml、约120ml至约500ml、约120ml至约450ml、约120ml至约400ml、约120ml至约350ml、约120ml至约300ml、约120ml至约250ml、约120ml至约200ml、约120ml至约180ml、约120ml至约160ml、约120ml至约140ml、约140ml至约2l、约140ml至约1800ml、约140ml至约1500ml、约140ml至约1200ml、约140ml至约1000ml、约140ml至约800ml、约140ml至约600ml、约140ml至约500ml、约140ml至约450ml、约140ml至约400ml、约140ml至约350ml、约140ml至约300ml、约140ml至约250ml、约140ml至约200ml、约140ml至约180ml、约140ml至约160ml、约160ml至约500ml、约160ml至约450ml、约160ml至约400ml、约160ml至约350ml、约160ml至约300ml、约160ml至约250ml、约160ml至约200ml、约160ml至约180ml、约180ml至约2l、约180ml至约1800ml、约180ml至约1500ml、约180ml至约1200ml、约180ml至约1000ml、约180ml至约800ml、约180ml至约600ml、约180ml至约500ml、约180ml至约450ml、约180ml至约400ml、约180ml至约350ml、约180ml至约300ml、约180ml至约250ml、约180ml至约200ml、约200ml至约2l、约200ml至约1800ml、约200ml至约1500ml、约200ml至约1200ml、约200ml至约1000ml、约200ml至约800ml、约200ml至约600ml、约200ml至约500ml、约200ml至约450ml、约200ml至约400ml、约200ml至约350ml、约200ml至约300ml、约200ml至约250ml、约250ml至约2l、约250ml至约1800ml、约250ml至约1500ml、约250ml至约1200ml、约250ml至约1000ml、约250ml至约800ml、约250ml至约600ml、约250ml至约500ml、约250ml至约450ml、约250ml至约400ml、约250ml至约350ml、约250ml至约300ml、约300ml至约2l、约300ml至约1800ml、约300ml至约1500ml、约300ml至约1200ml、约300ml至约1000ml、约300ml至约800ml、约300ml至约600ml、约300ml至约500ml、约300ml至约450ml、约300ml至约400ml、约300ml至约350ml、约350ml至约2l、约350ml至约1800ml、约350ml至约1500ml、约350ml至约1200ml、约350ml至约1000ml、约350ml至约800ml、约350ml至约600ml、约350ml至约500ml、约350ml至约450ml、约350ml至约400ml、约400ml至约2l、约400ml至约1800ml、约400ml至约1500ml、约400ml至约1200ml、约400ml至约1000ml、约400ml至约800ml、约400ml至约600ml、约400ml至约500ml、约400ml至约450ml、约450ml至约2l、约450ml至约1800ml、约450ml至约1500ml、约450ml至约1200ml、约450ml至约1000ml、约450ml至约800ml、约450ml至约600ml、约450ml至约500ml、约500ml至约2l、约500ml至约1800ml、约500ml至约1500ml、约500ml至约1200ml、约500ml至约1000ml、约500ml至约800ml、约500ml至约600ml、约600ml至约2l、约600ml至约1800ml、约600ml至约1500ml、约600ml至约1200ml、约600ml至约1000ml、约600ml至约800ml、约800ml至约2l、约800ml至约1800ml、约800ml至约1500ml、约800ml至约1200ml、约800ml至约1000ml、约1000ml至约2l、约1000ml至约1800ml、约1000ml至约1500ml、约1000ml至约1200ml、约1200ml至约2l、约1200ml至约1800ml、约1200ml至约1500ml、约1500ml至约2l、约1500ml至约1800ml或约1800ml至约2l的
体积。
[0164]
配制方法
[0165]
本文还提供了制备组合物的方法，其包括：(i)提供去核类红细胞群体；并且(ii)在药学可接受的水性缓冲溶液(例如，本文描述的任何示例性药学可接受的水性缓冲溶液)中重悬去核类红细胞群体。在一些实施方案中，去核类红细胞可以是本文描述的任何去核类红细胞。在一些实施方案中，组合物可包含约0.5x108至约7.0x109个去核类红细胞/ml，例如约0.5x108至约6.0x109、约0.5x108至约5.0x109、约0.5x108至约4.0x109、约0.5x108至约3.0x109、约0.5x108至约2.0x109、约0.5x108至约1.0x109、约0.5x108至约0.5x109、约0.5x108至约1.0x108、约1.0x108至约7.0x109、约1.0x108至约6.0x109、约1.0x108至约5.0x109、约1.0x108至约4.0x109、约1.0x108至约3.0x109、约1.0x108至约2.0x109、约1.0x108至约1.0x109、约1.0x108至约0.5x109、约0.5x109至约7.0x109、约0.5x109至约6.0x109、约0.5x109至约5.0x109、约0.5x109至约4.0x109、约0.5x109至约3.0x109、约0.5x109至约2.0x109、约0.5x109至约1.0x109、约1.0x109至约7.0x109、约1.0x109至约6.0x109、约1.0x109至约5.0x109、约1.0x109至约4.0x109、约1.0x109至约3.0x109、约1.0x109至约2.0x109、约2.0x109至约7.0x109、约2.0x109至约6.0x109、约2.0x109至约5.0x109、约2.0x109至约4.0x109、约2.0x109至约3.0x109、约3.0x109至约7.0x109、约3.0x109至约6.0x109、约3.0x109至约5.0x109、约3.0x109至约4.0x109、约4.0x109至约7.0x109、约4.0x109至约6.0x109、约4.0x109至约5.0x109、约5.0x109至约7.0x109、约5.0x109至约6.0x109或约6.0x109至约7.0x109个去核类红细胞/ml(例如本文中描述的任何示例性去核类红细胞)。
[0166]
在一些实施方案中，该方法可包括在步骤(i)中将去核类红细胞群体离心，之后将其重悬。可通过渗滤或超滤/渗滤的组合在步骤(ii)中将去核类红细胞重悬于药学可接受的水性缓冲溶液中。在一些实施方案中，去核类红细胞群体可以从供体获得(还有供体去核类红细胞，例如压实红细胞)。
[0167]
在一些实施方案中，去核类红细胞群体可以是清洗的红细胞(rbc)。清洗的红细胞可以从供体获得并随后清洗。从供体获得的红细胞的清洗通常在开放或封闭系统中使用生理盐水(0.9％)进行。例如，清洗过程去除约95％-99％的rbc上清液，其除添加溶液外含有血浆蛋白、电解质、一些白细胞(wbc)、血小板、微粒和细胞碎片。由于理论上细菌污染的风险增加以及生理盐水中的rbc存活力，在开放系统中清洗的rbc通常在清洗后24小时内使用。在封闭系统中清洗的rbc的有效期(expiration time)为14天。rbc清洗经常用于经历心脏手术的新生儿和婴儿。清洗rbc降低细胞外钾，但增加rbc膜渗透脆性，这导致在新生儿体外膜式氧合(ecmo)的前三天内清洗的红细胞的溶血增加。rbc清洗也可增加rbc渗透脆性，导致输血后溶血增加。rbc清洗装置的非限制性实例包括cobe 2991(terumo bct,lakewood,co,usa)和haemonetics cell saver elite(haemonetics,braintree,ma,usa)。schmidt et al.(int.j.clin.transfusion med.4:79-88,2016)描述了rbc清洗的其他非限制性方面。
[0168]
在一些实施方案中，去核类红细胞是工程化去核类红细胞(例如，本文描述的任何示例性工程化去核类红细胞)。
[0169]
任何这些方法的一些实施方案还包括培养类红祖细胞以提供去核类红细胞群体。
[0170]
在一些实施方案中，在工程化类红细胞是工程化去核类红细胞的情况下，方法可
以进一步包括将一种或多种编码一种或多种外源蛋白质(例如，本文描述的任何示例性外源蛋白)的核酸(例如，本文描述的任何示例性核酸)引入类红祖细胞中(例如，使用本文描述的将核酸引入类红祖细胞的任何方法)。在这些实例中，方法还可包括在将核酸引入类红祖细胞之前和/或之后培养类红祖细胞。
[0171]
类红祖细胞可以是患者衍生的类红祖细胞、永生化类红细胞系，或者可以源自诱导的多能干细胞。例如，在一些实施方案中，类红祖细胞是永生化的类红细胞系，例如包含至少一种编码人乳头瘤病毒(hpv)e6和/或hpv e7的外源核酸的细胞系。在一些实施方案中，类红祖细胞包含至少一种编码oct4、sox2、klf4和cmyc中的一种或多种的外源核酸，并且任选地包含遗传修饰以抑制、降低或消除tp53的表达(参见例如huang et al.,(2014)mol.ther.22(2):451-63)。在一些实施方案中，类红祖细胞是bel-a细胞系细胞(参见trakarnasanga et al.(2017)nat.commun.8:14750)。在美国专利号9,951,350和8,975,072中描述了额外的永生化类红祖细胞。在一些实施方案中，类红祖细胞包含至少一种编码bmi-1的外源核酸。使用细胞培养技术产生去核类红细胞的示例性方法是本领域中公知的，例如giarratana et al.,blood 118:5071,2011；kurita et al.,plos one 8:e59890,2013；fibach et al.,blood 73:100,1989；giarratana et al.,blood 118:5071,2011)。可以通过培养造血祖细胞来产生去核类红细胞，所述造血祖细胞包括例如cd34
+
造血祖细胞(giarratana et al.,blood 118:5071,2011)、诱导多能干细胞(kurita et al.,plos 8:e59890,2013)和胚胎干细胞(hirose et al.,stem cell reports 1:499,2013)。适合于将类红祖细胞扩增和分化为去核类红细胞的生长和分化因子混合物是本领域已知的。合适的扩增和分化因子的实例包括但不限于干细胞因子(scf)，白介素(il)，例如il-1,il-2,il-3,il-4,il-5,il-6,il-7,il-8,il-9,il-11,il-12,csf,g-csf，血小板生成素(tpo)，gm-csf，促红细胞生成素(epo)，flt3,flt2,pixy 321和白血病抑制因子(lif)。
[0172]
可以通过在多步培养过程中使类红祖细胞与限定的因子接触，从类红祖细胞(例如，本文描述的任何示例性类红祖细胞)，例如cd34
+
细胞培养类红细胞。例如，可以在三步培养过程中从类红祖细胞产生去核类红细胞。
[0173]
第一步可以包括在液体培养基中培养类红祖细胞，所述液体培养基包含1-1000ng/ml的干细胞因子(scf)、1-100u/ml的促红细胞生成素(epo)和0.1-100ng/ml的白介素-3(il-3)。在第一步中，液体培养基还可包含结合并激活核激素受体，诸如例如糖皮质激素受体、雌激素受体、孕酮受体、雄激素受体或孕烷x受体的配体。这些受体的配体包括例如皮质类固醇，诸如例如10nm-100μm的地塞米松或10nm-100μm的氢化可的松；雌激素，例如10nm-100μm的β-雌二醇；孕激素，诸如例如10nm-100μm的孕酮、10nm-100μm的羟基孕酮、10nm-100μm的5a-二氢孕酮、10nm-100μm的11-去氧皮质酮，或合成孕酮，诸如例如，10nm-100μm的醋酸氯地孕酮；雄激素，诸如例如10nm-100μm的睾酮、10nm-100μm的二氢睾酮或10nm-100μm的雄烯二酮；或孕烷x受体配体，诸如例如10nm-100μm的利福平、10nm-100μm的贯叶金丝桃素(hyperforin)、10nm-100μm的圣约翰草(st.john's wort)(金丝桃素(hypericin))或维生素e样分子，诸如例如10nm-100μm的生育酚。第一步中的液体培养基还可包含胰岛素样分子，诸如例如1-50μg/ml的胰岛素、1-50μg/ml的胰岛素样生长因子1(igf-1)、1-50μg/ml的胰岛素样生长因子2(igf-2)，或1-50μg/ml的机械生长因子(mechano-growth factor)。第一步中的液体培养基还可以包含0.1-5mg/ml的转铁蛋白。
[0174]
第一步中使用的液体培养基可任选地包括一种或多种白介素(il)或生长因子，例如，il-1,il-2,il-4,il-5,il-6,il-7,il-8,il-9,il-11,il-12，粒细胞集落刺激因子(g-csf),巨噬细胞集落刺激因子(m-csf),粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf),血小板生成素、成纤维细胞生长因子(fgf)、血小板衍生生长因子(pdgf)、转化生长因子β(tgf-b)、肿瘤坏死因子α(tnf-a)、巨核细胞生长和发育因子(mgdf)、白血病抑制因子(lif)和flt3配体。每种白介素或生长因子可以以0.1-100ng/ml的浓度包含在第一步中使用的液体培养基中。第一步中使用的液体培养基还可任选地包括血清蛋白或非蛋白分子，例如人血清(1-20％)、人血浆(1-20％)、plasmanate(1-20％)、人血清(1-20％)、人白蛋白(0.1-100mg/ml)或肝素(0.1-10u/ml)。
[0175]
三步培养过程的第二步包括在液体培养基中培养祖细胞，所述液体培养基包含1-1000ng/ml的干细胞因子(scf)和1-100u/ml的促红细胞生成素(epo)。第二步中使用的液体培养基还可任选地包括胰岛素样分子，诸如例如1-50μg/ml的胰岛素、1-50μg/ml的胰岛素样生长因子1(igf-1)、1-50μg/ml的胰岛素样生长因子2(igf-2)、或1-50μg/ml的机械生长因子。第二步中使用的液体培养基可以任选地进一步包括0.1-5mg/ml的转铁蛋白。第二步中使用的液体培养基可任选地进一步包括血清蛋白或非蛋白分子，诸如例如人血浆(1-20％)、plasmanate(1-20％)、人血清(1-20％)、人白蛋白(0.1-100mg/ml)或肝素(0.1-10u/ml)。
[0176]
三步培养过程的第三步包括在含有1-100u/ml促红细胞生成素(epo)的液体培养基中培养类红祖细胞。第三步中使用的液体培养基可以任选地进一步1-1000ng/ml的干细胞因子(scf)。第三步骤中使用的液体培养基可任选地进一步包含胰岛素样分子，诸如例如1-50μg/ml的胰岛素、1-50μg/ml的胰岛素样生长因子1(igf-1)、1-50μg/ml的胰岛素样生长因子2(igf-2)、或1-50μg/ml的机械生长因子。第三步中使用的液体培养基还可任选地包含0.1-5mg/ml的转铁蛋白和/或血清蛋白或非蛋白分子，诸如例如人血清(1-20％)、人血浆(1-20％)、plasmanate(1-20％)、人血清(1-20％)、人白蛋白(0.1-100mg/ml)或肝素(0.1-10u/ml)。
[0177]
在一些实施方案中，方法进一步包括将组合物置于无菌容器中。无菌容器的非限制性实例包括无菌锥形管、无菌培养皿、无菌小瓶(例如硼硅酸盐玻璃小瓶)和无菌塑料袋(邻苯二甲酸二-2-乙基己酯(dehp)-增塑聚氯乙烯(pvc)袋，或正丁酰基-三(正己基)-柠檬酸酯(bthc)-增塑pvc袋)。
[0178]
治疗受试者的方法
[0179]
本文还提供了治疗有此需要的受试者(例如，本文描述的或本领域已知的任何受试者)的方法，包括：(i)提供已经于约2℃至约10℃(例如约2℃至约9℃、约2℃至约8℃、约2℃至约7℃、约2℃至约6℃、约2℃至约5℃、约2℃至约4℃、约3℃至约10℃、约3℃至约9℃、约3℃至约8℃、约3℃至约7℃、约3℃至约6℃、约3℃至约5℃、约4℃至约10℃、约4℃至约9℃、约4℃至约8℃、约4℃至约7℃、约4
°
至约6℃、约5℃至约10℃、约5℃至约9℃、约5℃至约8℃、约5℃至约7℃、约6℃至约10℃、约6℃至约9℃、约6℃至约8℃、约7℃至约10℃、约7℃至约9℃或约8℃至约10℃)的温度贮存一段时间的组合物(例如本文中描述的任何组合物)；(ii)向有此需要的受试者施用步骤(ii)的组合物。在这些方法的一些实施方案中，先前已经将受试者鉴定或诊断为需要存在于施用的工程化去核类红细胞中的外源蛋白质中
的一种或多种。在一些实施方案中，先前已经将受试者鉴定或诊断为需要输血和/或红细胞增加。
[0180]
在一些实施方案中，本文提供治疗患有苯丙酮尿症的受试者的方法，其包括：(i)提供组合物，其中工程化的人去核类红细胞包含外源蛋白苯丙氨酸解氨酶(pal)，所述组合物已经于约2℃至约10℃(例如约2℃至约9℃、约2℃至约8℃、约2℃至约7℃、约2℃至约6℃、约2℃至约5℃、约2℃至约4℃、约3℃至约10℃、约3℃至约9℃、约3℃至约8℃、约3℃至约7℃、约3℃至约6℃、约3℃至约5℃、约4℃至约10℃、约4℃至约9℃、约4℃至约8℃、约4℃至约7℃、约4
°
至约6℃、约5℃至约10℃、约5℃至约9℃、约5℃至约8℃、约5℃至约7℃、约6℃至约10℃、约6℃至约9℃、约6℃至约8℃、约7℃至约10℃、约7℃至约9℃或约8℃至约10℃)的温度一段时间；并且(ii)向受试者施用步骤(i)的组合物。在这些方法的一些实施方案中，先前已经将受试者鉴定或诊断为患有苯丙酮尿症。
[0181]
在一些实施方案中，本文提供了治疗患有癌症的受试者的方法，其包括：(i)提供组合物，其中工程化的人去核类红细胞包含以下的组合：第一外源蛋白，所述第一外源蛋白包含抗原性肽(例如hpv抗原，诸如hpv16 e7
11-19
)，其连接到beta 2微球蛋白(b2m)或其片段，连接到mhc i类蛋白(例如hla*02:01)的alpha1、alpha2和alpha 3域中的一种或多种或其片段或变体，连接到跨膜蛋白(例如gpa或其跨膜片段)；所述第二外源蛋白，其包含4-1bbl或其片段，连接到跨膜蛋白(例如gpa或其跨膜片段)；和第二外源蛋白，其包含il-12p40或其片段，连接到il-12p35或其片段，连接到跨膜蛋白(例如gpa或其跨膜片段或smim1或其跨膜片段)(例如，如美国专利申请公开no.2019/0290686中描述，通过引用并入本文)，所述组合物已经在约2℃至约10℃(例如约2℃至约9℃、约2℃至约8℃、约2℃至约7℃、约2℃至约6℃、约2℃至约5℃、约2℃至约4℃、约3℃至约10℃、约3℃至约9℃、约3℃至约8℃、约3℃至约7℃、约3℃至约6℃、约3℃至约5℃、约4℃至约10℃、约4℃至约9℃、约4℃至约8℃、约4℃至约7℃、约4
°
至约6℃、约5℃至约10℃、约5℃至约9℃、约5℃至约8℃、约5℃至约7℃、约6℃至约10℃、约6℃至约9℃、约6℃至约8℃、约7℃至约10℃、约7℃至约9℃或约8℃至约10℃)的温度贮存一段时间；并且(ii)向受试者施用步骤(i)的组合物。在这些方法的一些实施方案中，先前已经将受试者鉴定或诊断为患有癌症。
[0182]
在一些实施方案中，本文提供治疗患有癌症的受试者的方法，其包括：(i)提供组合物，其中工程化人去核类红细胞包含以下的组合：第一外源蛋白，其包含4-1bbl或其片段，连接到跨膜蛋白(例如，gpa或其跨膜片段)；和第二外源蛋白，其包含il-15或其片段，连接至il-15受体α(il-15rα)的胞外部分或其片段(例如il-15rαsushi结合域)，连接到跨膜蛋白(例如gpa或其跨膜片段)(例如，如美国专利申请公开no.2019/0298769中所述，通过引用并入本文)，所述组合物已经在约2℃至约10℃(例如约2℃至约9℃、约2℃至约8℃、约2℃至约7℃、约2℃至约6℃、约2℃至约5℃、约2℃至约4℃、约3℃至约10℃、约3℃至约9℃、约3℃至约8℃、约3℃至约7℃、约3℃至约6℃、约3℃至约5℃、约4℃至约10℃、约4℃至约9℃、约4℃至约8℃、约4℃至约7℃、约4
°
至约6℃、约5℃至约10℃、约5℃至约9℃、约5℃至约8℃、约5℃至约7℃、约6℃至约10℃、约6℃至约9℃、约6℃至约8℃、约7℃至约10℃、约7℃至约9℃或约8℃至约10℃)的温度贮存一段时间；并且(ii)向受试者施用步骤(i)的组合物。在这些方法的一些实施方案中，先前已经将受试者鉴定或诊断为患有癌症。
[0183]
在一些实施方案中，本文提供了治疗患有表a至d中所列的任何疾病或病况的受试
者的方法，其包括：(i)提供组合物，其中工程化人去核类红细胞包含外源蛋白质(例如，表a到d中列出的示例性外源蛋白中的一种或多种，用于治疗表a到d中列出的相应疾病或病况)，所述组合物已经在约2℃至约10℃(例如约2℃至约9℃、约2℃至约8℃、约2℃至约7℃、约2℃至约6℃、约2℃至约5℃、约2℃至约4℃、约3℃至约10℃、约3℃至约9℃、约3℃至约8℃、约3℃至约7℃、约3℃至约6℃、约3℃至约5℃、约4℃至约10℃、约4℃至约9℃、约4℃至约8℃、约4℃至约7℃、约4
°
至约6℃、约5℃至约10℃、约5℃至约9℃、约5℃至约8℃、约5℃至约7℃、约6℃至约10℃、约6℃至约9℃、约6℃至约8℃、约7℃至约10℃、约7℃至约9℃或约8℃至约10℃)的温度贮存一段时间；并且(ii)向有此需要的受试者施用步骤(i)的组合物。在这些方法的一些实施方案中，先前已经将受试者鉴定或诊断为患有表a至d中列出的疾病或病况。
[0184]
这些方法的一些实施方案进一步包括在步骤(i)和步骤(ii)之间将步骤(i)的组合物温热到约15℃至约30℃(例如约15℃至约29℃、约15℃至约28℃、约15℃至约27℃、约15℃至约26℃、约15℃至约25℃、约15℃至约24℃、约15℃至约23℃、约15℃至约22℃、约15℃至约21℃、约15℃至约20℃、约15℃至约19℃、约15℃至约18℃、约15℃至约17℃、约15℃至约16℃、约16℃至约30℃、约16℃至约29℃、约16℃至约28℃、约16℃至约27℃、约16℃至约26℃、约16℃至约25℃、约16℃至约24℃、约16℃至约23℃、约16℃至约22℃、约16℃至约21℃、约16℃至约20℃、约16℃至约19℃、约16℃至约18℃、约16℃至约17℃、约17℃至约30℃、约17℃至约29℃、约17℃至约28℃、约17℃至约27℃、约17℃至约26℃、约17℃至约25℃、约17℃至约24℃、约17℃至约23℃、约17℃至约22℃、约17℃至约21℃、约17℃至约20℃、约17℃至约19℃、约17℃至约18℃、约18℃至约30℃、约18℃至约29℃、约18℃至约28℃、约18℃至约27℃、约18℃至约26℃、约18℃至约25℃、约18℃至约24℃、约18℃至约23℃、约18℃至约22℃、约18℃至约21℃、约18℃至约20℃、约18℃至约19℃、约19℃至约30℃、约19℃至约29℃、约19℃至约28℃、约19℃至约27℃、约19℃至约26℃、约19℃至约25℃、约19℃至约24℃、约19℃至约23℃、约19℃至约22℃、约19℃至约21℃、约19℃至约20℃、约20℃至约30℃、约20℃至约29℃、约20℃至约28℃、约20℃至约27℃、约20℃至约26℃、约20℃至约25℃、约20℃至约24℃、约20℃至约23℃、约20℃至约22℃、约20℃至约21℃、约21℃至约30℃、约21℃至约29℃、约21℃至约28℃、约21℃至约27℃、约21℃至约26℃、约21℃至约25℃、约21℃至约24℃、约21℃至约23℃、约21℃至约22℃、约22℃至约30℃、约22℃至约29℃、约22℃至约28℃、约22℃至约27℃、约22℃至约26℃、约22℃至约25℃、约22℃至约24℃、约22℃至约23℃、约23℃至约30℃、约23℃至约29℃、约23℃至约28℃、约23℃至约27℃、约23℃至约26℃、约23℃至约25℃、约23℃至约24℃、约24℃至约30℃、约24℃至约29℃、约24℃至约28℃、约24℃至约27℃、约24℃至约26℃、约24℃至约25℃、约25℃至约30℃、约25℃至约29℃、约25℃至约28℃、约25℃至约27℃、约25℃至约26℃、约26℃至约30℃、约26℃至约29℃、约26℃至约28℃、约26℃至约27℃、约27℃至约30℃、约27℃至约29℃、约27℃至约28℃、约28℃至约30℃、约28℃至约29℃或约29℃至约30℃)的温度的步骤。
[0185]
在这些方法的一些实施方案中，时间段是约30天至约100天(例如约30天至约95天、约30天至约90天、约30天至约85天、约30天至约80天、约30天至约75天、约30天至约70天、约30天至约65天、约30天至约60天、约30天至约55天、约30天至约50天、约30天至约45
天、约30天至约40天、约30天至约35天、约35天至约100天、约35天至约95天、约35天至约90天、约35天至约85天、约35天至约80天、约35天至约75天、约35天至约70天、约35天约至65天、约35天至约60天、约35天至约55天、约35天至约50天、约35天至约45天、约35天至约40天、约40天至约100天、约40天至约95天、约40天至约90天、约40天至约85天、约40天至约80天、约40天至约75天、约40天至约70天、约40天约至65天、约40天至约60天、约40天至约55天、约40天至约50天、约40天至约45天、约45天至约100天、约45天至约95天、约45天至约90天、约45天至约85天、约45天至约80天、约45天至约75天、约45天至约70天、约45天约至65天、约45天至约60天、约45天至约55天、约45天至约50天、约50天至约100天、约50天至约95天、约50天至约90天、约50天至约85天、约50天至约80天、约50天至约75天、约50天至约70天、约50天约至65天、约50天至约60天、约50天至约55天、约55天至约100天、约55天至约95天、约55天至约90天、约55天至约85天、约55天至约80天、约55天至约75天、约55天至约70天、约55天约至65天、约55天至约60天、约60天至约100天、约60天至约95天、约60天至约90天、约60天至约85天、约60天至约80天、约60天至约75天、约60天至约70天、约60天约至65天、约65天至约100天、约65天至约95天、约65天至约90天、约65天至约85天、约65天至约80天、约65天至约75天、约65天至约70天、约70天至约100天、约70天至约95天、约70天至约90天、约70天至约85天、约70天至约80天、约70天至约75天、约75天至约100天、约75天至约95天、约75天至约90天、约75天至约85天、约75天至约80天、约80天至约100天、约80天至约95天、约80天至约90天、约80天至约85天、约85天至约100天、约85天至约95天、约85天至约90天、约90天至约100天、约90天至约95天、约95天至约100天)。
[0186]
在这些方法的一些实施方案中，步骤(ii)包括向受试者静脉内施用。
[0187]
本文还提供了治疗受试者的方法，其包括向有此需要的受试者(例如，先前鉴定或诊断为需要工程化去核类红细胞中存在的一种或多种外源蛋白质的受试者或鉴定为需要输血和/或红细胞增加的受试者)施用本文描述的任何组合物。在这些方法的一些实施方案中，先前将组合物于约2℃至约10℃(例如约2℃至约9℃、约2℃至约8℃、约2℃至约7℃、约2℃至约6℃、约2℃至约5℃、约2℃至约4℃、约3℃至约10℃、约3℃至约9℃、约3℃至约8℃、约3℃至约7℃、约3℃至约6℃、约3℃至约5℃、约4℃至约10℃、约4℃至约9℃、约4℃至约8℃、约4℃至约7℃、约4
°
至约6℃、约5℃至约10℃、约5℃至约9℃、约5℃至约8℃、约5℃至约7℃、约6℃至约10℃、约6℃至约9℃、约6℃至约8℃、约7℃至约10℃、约7℃至约9℃或约8℃至约10℃)贮存一段时间。在一些实施方案中，时间段是约30天至约100天(例如本文中描述的此范围的任何子范围)。
[0188]
这些方法的一些实施方案进一步包括在施用步骤之前将组合物温热至约15℃至约30℃的温度(例如，本文描述的该范围的任何子范围)的步骤。在这些方法的一些实施方案中，施用步骤包括向受试者静脉内施用。
[0189]
本文描述的任何方法的一些实施方案还包括向受试者施用一种或多种另外的治疗剂。在一些实施方案中，可以与本文提供的任何组合物基本上同时向受试者施用一种或多种另外的治疗剂。在一些实施方案中，可以在向受试者施用本文描述的任何组合物之前或之后向受试者施用一种或多种另外的治疗剂。
[0190]
实施例
[0191]
以下实施例中进一步描述了本发明，所述实施例不限制权利要求书中所述的本发
明的范围。
[0192]
实施例1：制剂开发
[0193]
使用实验设计(doe)方法进行去核类红细胞的制剂开发。开发了t1和t2制剂系列(见表1和2)。发现t1制剂系列优于(hts；sigma-aldrich目录号h4416)，其是为细胞的低温贮存而开发的已知制剂，其包含5mm葡萄糖并且包含胶体。根据贮存后的细胞计数、溶血和细胞变形性所确定，称为t1-1的制剂鉴定为最优越的。令人惊讶的是，t1-1是不含葡萄糖的制剂，其是出乎意料的，因为认为葡萄糖对于贮存期间去核类红细胞的稳定性至关重要。
[0194]
[0195][0196]
实施例2：细胞贮存制剂的稳定性分析
[0197]
材料和方法
[0198]
溶血测定法
[0199]
为了计算溶血百分比(％)，使用以下函数：
[0200]
溶血百分比(％)＝上清液血红蛋白/总血红蛋白
[0201]
其中血红蛋白根据harboe直接分光光度法(han et al.,vox sang98(2):116-23,2010)测量。
[0202]
血红蛋白＝1.539x[1.672x(a
415
)
–
0.836x(a
380
)
–
0.836x(a
450
)]，
[0203]
其中a
415
、a
380
和a
450
分别是415nm、380nm和450nm处的吸光度，其使用biotek gen5
读板仪测量。
[0204]
结果
[0205]
在68天的过程内分析包含苯丙氨酸解氨酶(pal)的示例性工程化去核类红细胞群体的溶血百分比和细胞计数的变化，所述去核类红细胞群体贮存在各种制剂中，包括hts和t1系列中的制剂。测试的t1系列中的制剂包括t1-1、t1-2、t1-3、t1-4、t1-5、t1-6、t1-6a5、t1-6a0、t1-6m、t1-6c、t1-7、t1-8和t1-9。与包括hts在内的剩余制剂相比，t1-7、t1-8和t1-9制剂含有更高水平的葡萄糖。如图1a中所示，在贮存34、40和68天后，与hts相比，各种t1系列制剂表现出减少的去核类红细胞溶血。特别地，与hts相比，在t1-1中贮存68天导致较低的溶血。接下来，对已经贮存68天的去核类红细胞进行细胞计数分析。如图1b中所示，与在hts溶液中的贮存相比，在t1-1中的贮存也导致细胞计数的较低的减少。令人惊讶的是，与其他制剂相比在含有更高水平的葡萄糖的t1-7、t1-8和t1-9中的贮存导致细胞计数的最大减少。
[0206]
还分析了在hts或t1-1中贮存32和45天后的去核类红细胞浓度。细胞浓度以贮存32或45天后细胞计数与贮存前细胞计数的比率测量。如图2中所示，与hts相比，t1-1在32天和45天都导致细胞浓度的降低较少。
[0207]
接下来，使用激光辅助旋转红细胞分析仪(maxsis)通过激光衍射法(ektacytometry)分析在hts或t1-1中贮存34、40和68天的去核类红细胞的渗量扫描特性。如图3a中所示，在研究的所有三个时间点，与贮存在hts中的去核类红细胞相比，贮存在t1-1中的去核类红细胞维持显著更高的eimax(峰值伸长指数)和曲线下面积(auc)。具体地，在t1-1中贮存68天的细胞显示出与在hts中贮存40天的细胞相似的渗量扫描特性。
[0208]
还分析了在hts或t1-1中贮存32或45天的去核类红细胞的渗量扫描特性。如图3b中所示，与贮存在hts中的去核类红细胞相比，贮存在t1-1中的去核类红细胞维持显著更好的渗透扫描特性。具体地，与在hts中贮存32天的去核类红细胞相比，在t1-1中贮存45天的去核类红细胞显示出更好的渗透扫描特性。
[0209]
这些结果出人意料地证明，本文提供的组合物有利于维持细胞完整性、防止溶血和在去核类红细胞贮存延长的时间段时提供改进的变形性。
[0210]
实施例3：细胞贮存制剂的稳定性分析
[0211]
材料和方法
[0212]
溶血测定法
[0213]
在这些实验中使用与实施例2中描述的相同的溶血测定法。
[0214]
细胞浓度测定法
[0215]
使用流式细胞术(bd facslyric
tm
系统；bd biosciences)使用bd trucount
tm
管(bd biosciences)确定细胞浓度，并根据检测到的细胞数目、bd trucount
tm
管中预定义的珠和稀释因子，使用等式(每ml细胞浓度＝(细胞事件数目/珠数目)x(批次特异性珠数目/样品体积(ml))x稀释因子计算。
[0216]
测试组合物
[0217]
在这些实验中使用t1-1和补充有0.2％w/v人血清白蛋白(hsa)的t1-1中的六个不同批次的示例性工程化去核类红细胞，其包含其表面上的含有4-1bbl的第一外源蛋白和含有与il-15rα的细胞外部分连接的il-15的第二外源蛋白。补充有0.2％w/v hsa的t1-1包含
药学可接受的水性缓冲溶液，其包含：79.4mm钠离子、41.7mm钾离子、0.05mm钙离子、5.0mm镁离子、10.0mm氯离子、9.9mm磷酸盐离子、5.0mm碳酸氢根离子、24.8mm hepes、99.2mm乳糖酸盐、39.7mm甘露醇、2.0mm腺苷、1.0mm腺嘌呤和0.20％w/v hsa，ph～7.57。
[0218]
结果
[0219]
在这些稳定性研究中使用工程化的去核类红细胞，其包含其表面上的含有4-1bbl的第一外源蛋白和含有与il-15rα的细胞外部分连接的il-15的第二外源蛋白。在50升规模的生物反应器中生产细胞，过滤，并以1.5-3
×
109个细胞/ml的浓度加工到t1-1或补充有0.2％hsa的t1-1中，并装入玻璃小瓶封闭系统中。将小瓶避光贮存在2-8℃。在指定的贮存时间点(天)，将新鲜的小瓶转移到室温并通过流式细胞术进行细胞浓度的稳定性测试，并通过分光光度法进行溶血测试。结果(图4a和4b)显示工程化的去核类红细胞在t1-1中是稳定的，将细胞数量和溶血维持在安全水平内达45天以上。添加hsa不影响稳定性结果。这些数据表明，t1-1是将工程化去核类红细胞稳定化的合适制剂，所述工程化去核类红细胞包含其表面上的外源蛋白质。
[0220]
其他实施方案
[0221]
应当理解，虽然已经结合其详细描述描述了本发明，但前述描述旨在说明而非限制本发明的范围，本发明的范围由所附权利要求书的范围限定。其他方面、优点和修改在所附权利要求书的范围内。