冠状病毒刺突蛋白的修饰的S1亚基的制作方法

冠状病毒刺突蛋白的修饰的s1亚基
1.序列表
2.本技术含有依照37 c.f.r.1.821
–
1.825的序列表。本技术随附的序列表在此整体引入作为参考。


背景技术：

3.禽冠状病毒传染性支气管炎病毒(ibv)是网巢病毒目(nidovirales)，冠状病毒科(coronaviridae)的原型丙型冠状病毒。传染性支气管炎病毒主要感染鸡的上呼吸道上皮，引起呼吸系统疾病，通常并发于继发性细菌性病原体(cook等人2012.avian pathol.41:239-250)。一些ibv毒株另外影响肾小管、输卵管和部分胃肠道，导致这些器官系统中的病理损害和临床症状。该病毒具有在商品鸡和散养鸡两者中的世界范围的存在。由于其高基因组变异性，ibv被区分为广泛多样的基因型、血清型和保护型(protectotype)。ibv目前被视为家禽业中经济上最相关的病毒病原体之一。
4.传染性支气管炎病毒是具有27.6kb的正义单链rna基因组的有包膜病毒(cavanagh 2007.vet.res.38:281-297)。病毒基因组的前三分之二包含大编码区(也指定为基因1)，分成两个开放读码框1a和1b，其编码涉及rna复制、编辑和转录的至少15种非结构蛋白。病毒基因组的后三分之一编码结构蛋白：刺突蛋白(s，由基因2编码)、包膜蛋白(e，由基因3c编码)、膜蛋白(m，由基因4编码)、以及核衣壳蛋白(n，由基因6编码)。蛋白s、e和m是病毒包膜的部分，而蛋白n连同病毒rna一起形成核糖核蛋白核心。冠状病毒刺突蛋白决定宿主物种的嗜性(kuo等人2000.j.virol.74:1393-1406)。它是一种二聚体或三聚体跨膜蛋白，其被蛋白酶解切割成两个亚基，s1和s2。糖基化的s1结构域形成刺突蛋白的
‘
头部’，并且含有与宿主细胞表面上的2,3-连接的唾液酸相互作用的受体结合结构域(promkuntod等人2014.virology.448:26-32)。s2结构域含有胞外结构域的剩余部分(
‘
茎部’)、跨膜结构域和定位于细胞质中的胞内结构域。
5.迄今为止广泛使用的减毒活ibv疫苗株h52和h120是通过massachusetts ibv毒株在含胚鸡蛋中的连续传代，于二十世纪六十年代在荷兰开发的(bijlenga等人2004；avian pathol.33:550-557)。所述疫苗株也必须在含胚鸡蛋中培养用于生产。当今，ibv疫苗(灭活疫苗和活疫苗两者)仍然在含胚鸡蛋中繁殖，这是麻烦且昂贵的。
6.迄今为止描述的唯一适应细胞系的ibv是ibv毒株beaudette，其在vero和bhk细胞中有效地复制。casais等人2003(j.virol.77；9084-9089)通过使用beaudette刺突的胞外结构域序列生成重组ibv，显示了beaudette的s蛋白是细胞系嗜性的决定因素，其能够将扩展的细胞系嗜性转移到另一种ibv(m41)。wo 2011/004146公开了来自beaudette的s2亚基负责扩展的组织嗜性。在s2亚基内的序列，来自beaudette的硫酸乙酰肝素结合位点，已被鉴定为负责扩展的细胞系嗜性。此外，bickerton等人2018(journal of virology 92(19))公开了八个氨基酸的beaudette特异性基序。然而，具有beaudette刺突s2亚基的重组ibv不适合作为疫苗。ellis等人2018(j.virol.92(23))描述了具有嵌合刺突的重组beaudette并不赋予针对s1同源攻击的足够保护，所述嵌合刺突具有与beaudette刺突s2亚基组合的来
自m41或qx的异源s1亚基。另外，beaudette野生型不像属于massachusetts血清型的其它获得许可的疫苗那样提供针对同源攻击的保护(hodgson等人2004:j virol 78:13804
–
13811或geilhausen等人1973:archiv f
ü
r die gesamte virusforschung 40:285-290)。
7.fang等人2005(biochemical and biophysical reaearch communication 336；第417至423页)公开了beaudette对于在vero细胞中的繁殖的适应导致49个氨基酸修饰，26个定位于刺突蛋白内。
8.总之，通过将刺突蛋白交换为异源beaudette刺突蛋白，提供具有扩展的细胞嗜性或组织嗜性的ibv疫苗并不导致提供足够功效的ibv疫苗，并且使用beaudette刺突序列将局限于针对massachusetts血清型毒株攻击的保护且缺少针对进一步基因型的交叉保护。此外，在beaudette中鉴定的现有技术基序或位点尚未转移到ibv疫苗内，所述ibv疫苗显示延长的细胞培养或组织嗜性和保护功效(尚未显示扩展的嗜性和疫苗功效之间的干扰)两者。
9.因而，需要单一氨基酸或短基序，其可以转移到ibv或ibv疫苗内而不影响疫苗功效，而是使得能够产生扩展的细胞嗜性或组织嗜性。
具体实施方式
10.在描述本发明的方面之前，必须注意，如本文和所附权利要求中使用的，单数形式“一个”、“一种”和“该/所述”包括复数所指物，除非上下文另有明确说明。因此，例如，提及“一种抗原”包括多种抗原，提及“病毒”是提及一种或多种病毒及其本领域技术人员已知的等价物，等等。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解相同的含义。尽管现在描述了优选的方法、装置和材料，但在本发明的实践或测试中可以使用与本文描述的相似或等价的任何方法和材料。本文提到的所有出版物都引入本文作为参考，目的是描述且公开如出版物中报道的可以与本发明结合使用的细胞系、载体和方法。本文的任何内容均不应被解释为承认本发明无权因在先发明而先于此类公开内容。
11.物质的组成
12.本发明解决了现有技术中固有的问题，并且提供了目前技术水平中的明显进步。
13.一般地，本发明提供了禽冠状病毒刺突蛋白或其片段，其中s1亚基的至少一部分来自具有有限的细胞嗜性或组织嗜性的禽冠状病毒，并且其中在氨基酸位置267处为半胱氨酸。
14.进一步地，本发明提供了包含在氨基酸位置267处向半胱氨酸的突变的重组禽冠状病毒刺突蛋白或其片段。
15.一般地，本发明还提供了ibv刺突蛋白或其片段，其中s1亚基的至少一部分来自具有有限的细胞嗜性或组织嗜性的ibv，并且其中在氨基酸位置267处为半胱氨酸。
16.进一步地，本发明提供了包含在氨基酸位置267处向半胱氨酸的突变的重组ibv刺突蛋白或其片段。
17.有利地，实验数据显示了在将刺突蛋白内的单个位置，位置267修饰成半胱氨酸后，冠状病毒株(毒株例如示例性地h52、qx sp2013-01478和cr88 ibv毒株)具有扩展的细胞嗜性或组织嗜性。
18.术语“冠状病毒”是本领域技术人员众所周知的。一般而言，冠状病毒是网巢病毒目，冠状病毒科中的冠状病毒亚科(coronavirinae)的病毒。冠状病毒是有包膜病毒，并且具有含有螺旋对称的核衣壳的正义单链rna基因组。术语“冠状病毒”包括传染性支气管炎病毒的所有毒株、基因型、保护型和血清型。禽冠状病毒的例子是传染性支气管炎病毒(ibv)；珍珠鸡冠状病毒(gfcov)和火鸡冠状病毒(tcov；火鸡肠炎病毒和蓝冠病病毒)。
19.术语“ibv”指本领域技术人员众所周知的传染性支气管炎病毒。术语“ibv”包括传染性支气管炎病毒的所有毒株、基因型、保护型和血清型。
20.术语“突变”包含病毒rna编码蛋白质中的修饰，其导致所述编码蛋白质的改变。进一步地，术语“突变”包含遗传改造的突变。术语突变涉及但不限于取代(一个或几个核苷酸/碱基对的替换)、缺失(一个、几个或所有核苷酸/碱基对的去除)、和/或插入(一个或几个核苷酸/碱基对的添加)。如本文使用的，突变可以是单个突变或几个突变，因此，经常使用术语“一个或多个突变”，并且涉及单个突变和几个突变两者。然而，术语突变是本领域技术人员众所周知的，并且本领域技术人员可以毫不费力地生成突变。
21.术语“刺突”指由本领域技术人员众所周知的禽冠状病毒或ibv的特异性蛋白质。刺突蛋白是抗体和保护性免疫应答的主要诱导物。进一步地，刺突(s)蛋白通过结合宿主细胞上的细胞受体、以及通过介导与宿主细胞膜的病毒-细胞膜融合，来促进禽冠状病毒或ibv的细胞进入。另外，它还决定了病毒株的组织嗜性和细胞嗜性。
22.术语“蛋白质”、“氨基酸”和“多肽”可互换使用。术语“蛋白质”指由天然存在的氨基酸以及其衍生物组成的氨基酸序列。天然存在的氨基酸是本领域众所周知的，并且在生物化学的标准教科书中进行描述。在氨基酸序列内，氨基酸通过肽键进行连接。进一步地，氨基酸序列的两端被称为羧基末端(c末端)和氨基末端(n末端)。术语“蛋白质”包括基本上纯化的蛋白质或另外包含其它蛋白质的蛋白质制剂。进一步地，该术语还涉及蛋白质片段。此外，它包括化学修饰的蛋白质。此类修饰可以是人工修饰或天然存在的修饰，例如磷酸化、糖基化、十四烷基化等等。
23.突变267
24.在根据本发明的禽冠状病毒或ibv刺突蛋白或其片段的一个方面，通过突变引入在氨基酸位置267处的半胱氨酸。词语“引入”意指突变已通过遗传工程引入(人工地，例如，通过人为干预)。
25.在根据本发明的禽冠状病毒或ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，突变是氨基酸取代、缺失或插入。
26.在根据本发明的禽冠状病毒或ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，在氨基酸位置267处的疏水性氨基酸突变成半胱氨酸；或在氨基酸位置267处的苯丙氨酸或亮氨酸突变成半胱氨酸。
27.扩展的细胞嗜性或组织嗜性
28.在根据本发明的禽冠状病毒或ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，在氨基酸位置267处的半胱氨酸或在氨基酸位置267处向半胱氨酸的所述突变，导致禽冠状病毒或ibv的扩展的细胞嗜性或组织嗜性。
29.术语“细胞或组织”由本领域技术人员已知。术语细胞包括细胞系，例如本文其它地方列出的细胞系以及原代细胞。术语组织包括来自组织例如本文其它地方列出的那些组
织的细胞，示例性地例如来自肺或肝脏的原代鸡胚细胞或者原代鸡成纤维细胞。该术语包括细胞或组织(细胞)在生物外部的培养中的繁殖。术语“培养”涉及在由本领域技术人员已知的限定的培养条件下，在生物外部的细胞(例如细胞系细胞或原代细胞或组织细胞)繁殖。
30.术语“扩展的嗜性”意指本发明的禽冠状病毒或ibv可以在细胞(例如细胞系)或组织细胞(除来自肾脏的原代鸡胚细胞之外)中进行繁殖。相比之下，冠状病毒疫苗(例如ibv疫苗)或者非细胞培养适应的野生型冠状病毒或ibv(描述了细胞系适应的ibv beaudette毒株)，只能在含胚鸡蛋或来自肾脏的原代鸡胚细胞(在适应后)中进行繁殖。相应地，具有扩展的细胞嗜性或组织嗜性的本发明的冠状病毒(例如ibv)，具有在一种或多种细胞系或者除来自肾脏的原代鸡胚细胞外的组织细胞中感染和/或复制的能力。优选地，具有扩展的细胞嗜性或组织嗜性的本发明的冠状病毒(例如ibv)，具有在如本文列出的一种或多种细胞系中感染和/或复制的能力。相应地，例如，具有扩展的细胞嗜性或组织嗜性的冠状病毒或ibv可能具有在pbs-12sf、eb66或hek 293t细胞中感染和/或复制的能力。
31.术语“有限的嗜性”意指禽冠状病毒或ibv在任何情况下只能在来自肾脏的原代鸡胚细胞上生长。相应地，具有有限的细胞嗜性或组织嗜性的冠状病毒或ibv并不具有在例如pbs-12sf、eb66或hek 293t细胞中感染和/或复制的能力。
32.有利地，实验数据显示了在将刺突蛋白内的单个位置，位置267修饰成半胱氨酸后，ibv毒株例如示例性地h52和cr88具有扩展的细胞嗜性或组织嗜性。进一步地，已显示了在位置267处向半胱氨酸的修饰是遗传上稳定的。
33.在根据本发明的禽冠状病毒或ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，禽冠状病毒或ibv在选自以下列表的至少一种细胞系或细胞中感染和/或复制：来自肺或肝脏的原代鸡胚细胞或者原代鸡成纤维细胞、鸡胚成纤维细胞系、鸭胚干细胞系、人胚肾细胞系、幼仓鼠肾细胞系、非洲绿猴肾细胞系、兔肾细胞系、犬肾细胞系、鸡肝细胞系、牛肾细胞系、猪肾细胞系和昆虫细胞系。
34.在根据本发明的禽冠状病毒或ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，禽冠状病毒在选自以下列表的至少一种细胞系中感染和/或复制：df-1(douglas foster)、eb66(鸭胚干细胞系)、pbs-12、pbs-12sf(无血清pbs-12)、bhk21(幼仓鼠肾)、hek 293t(人胚肾)、vero(verda reno)、ma104、rk13(兔肾)、lmh(leghorn雄性肝癌)、mdck(马丁达比(madin-darby)犬肾)、mdbk(马丁达比牛肾)、pk15(猪肾)、pk2a(猪肾)、sf9、sf21和sf+(草地贪夜蛾(spodoptera frugiperda))。
35.在根据本发明的禽冠状病毒或ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，禽冠状病毒或ibv在选自以下列表的至少一种细胞系中感染和/或复制：df-1、eb66、pbs-12、pbs-12sf、bhk、hek 293t、vero、ma104和rk13。
36.优选地，ibv在eb66、pbs-12sf或hek 293t细胞系中感染和/或复制。
37.所有提到的细胞系都是本领域技术人员众所周知的，并且是商购可得和/或可公开获得的。mdck细胞示例性地在登录号atcc ccl-34或atcc crl-2285下，保藏于美国组织培养物保藏中心(american tissue culture collection)。df-1细胞示例性地在登录号atcc crl-12203)下，保藏于美国组织培养物保藏中心。pbs-12sf细胞示例性地在登录号atcc pta-8565下，保藏于美国组织培养物保藏中心，或在cvcl_1k17下保藏于rrid。bhk-21
细胞示例性地在登录号atcc ccl-10下，保藏于美国组织培养物保藏中心。hek 293t细胞示例性地在登录号atcc crl-3216下，保藏于美国组织培养物保藏中心。vero细胞示例性地在登录号atcc ccl-81下，保藏于美国组织培养物保藏中心。ma104细胞示例性地在登录号atcc crl-2378下，保藏于美国组织培养物保藏中心。rk13细胞示例性地在登录号atcc ccl-37下，保藏于美国组织培养物保藏中心。
38.氨基酸位置267的编号
39.在根据本发明的禽冠状病毒或ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，氨基酸位置267的编号指ibv h52、ibv h120或m41的刺突蛋白中的氨基酸位置267。
40.在根据本发明的禽冠状病毒或ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，氨基酸位置267的编号指ibv h52的刺突蛋白中的氨基酸位置267。
41.在根据本发明的禽冠状病毒或ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，氨基酸位置267的编号指如seq id no:1中示例性地给出的刺突蛋白中的氨基酸位置267。
42.在根据本发明的禽冠状病毒或ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，seq id no:1的氨基酸序列用于确定刺突蛋白中的位置编号。
43.在根据本发明的禽冠状病毒或ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，为了确定刺突蛋白中的氨基位置267，将氨基酸序列与seq id no:1的氨基酸序列进行比对。
44.在根据本发明的禽冠状病毒或ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，氨基酸位置267在刺突蛋白的s1亚基内。
45.在根据本发明的禽冠状病毒或ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，氨基酸位置267对应于ibv cr88的刺突序列的氨基酸位置269。
46.在根据本发明的禽冠状病毒或ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，氨基酸位置267对应于ibv qx的刺突序列的氨基酸位置270。
47.在根据本发明的禽冠状病毒或ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，氨基酸位置267对应于ibv q1的刺突序列的氨基酸位置271。
48.在根据本发明的禽冠状病毒或ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，氨基酸位置267对应于ibv var2的刺突序列的氨基酸位置270。
49.在根据本发明的禽冠状病毒或ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，氨基酸位置267对应于ibv brazil的刺突序列的氨基酸位置274。
50.在根据本发明的禽冠状病毒或ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，氨基酸位置267对应于ibv ark99的刺突序列的氨基酸位置274。
51.在根据本发明的禽冠状病毒或ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，刺突蛋白具有选自以下的下述氨基酸中的一种或多种：
[0052]-264是天冬酰胺，和/或
[0053]-265是苏氨酸，和/或
[0054]-269是亮氨酸，和/或
[0055]-271是天冬酰胺，和/或
[0056]-272是苯丙氨酸。
[0057]
所述氨基酸位置的编号指如seq id no:1中示例性地给出的刺突蛋白内的氨基酸位置。
[0058]
刺突
[0059]
本发明还提供了如上所述的刺突蛋白或其片段，其中所述刺突蛋白或其片段选自：传染性支气管炎病毒(ibv)；珍珠鸡冠状病毒(gfcov)、火鸡冠状病毒(tcov；火鸡肠炎病毒和蓝冠病病毒)、猫传染性腹膜炎病毒(fipv)、猫肠道冠状病毒(fecv)；传染性胃肠炎病毒(tgev)、猪呼吸道冠状病毒(prcov)、猪流行性腹泻病毒(pedv)、猪血凝性脑脊髓炎病毒(phev)；严重急性呼吸综合征冠状病毒(sars-cov)、中东呼吸综合征冠状病毒(mers-cov)、人冠状病毒229e(hcov-229e)、人冠状病毒nl63(hcov-nl63)、人冠状病毒hku1(hcov-hku1)、人冠状病毒oc43(hcov-oc43)；犬冠状病毒(ccov)、犬呼吸道冠状病毒(crcov)、小鼠肝炎病毒(mhv)、牛冠状病毒(bcv)。因此，本发明还提供了冠状病毒刺突蛋白或其片段，其中s1亚基的至少一部分来自具有有限的细胞嗜性或组织嗜性的冠状病毒，并且其中在氨基酸位置267处为半胱氨酸，并且其中所述刺突蛋白选自：传染性支气管炎病毒(ibv)；珍珠鸡冠状病毒(gfcov)、火鸡冠状病毒(tcov；火鸡肠炎病毒和蓝冠病病毒)、猫传染性腹膜炎病毒(fipv)、猫肠道冠状病毒(fecv)；传染性胃肠炎病毒(tgev)、猪呼吸道冠状病毒(prcov)、猪流行性腹泻病毒(pedv)、猪血凝性脑脊髓炎病毒(phev)；严重急性呼吸综合征冠状病毒(sars-cov)、中东呼吸综合征冠状病毒(mers-cov)、人冠状病毒229e(hcov-229e)、人冠状病毒nl63(hcov-nl63)、人冠状病毒hku1(hcov-hku1)、人冠状病毒oc43(hcov-oc43)；犬冠状病毒(ccov)、犬呼吸道冠状病毒(crcov)、小鼠肝炎病毒(mhv)、牛冠状病毒(bcv)。进一步地，本发明还提供了重组冠状病毒刺突蛋白或其片段，其包含在氨基酸位置267处向半胱氨酸的突变，其中所述刺突蛋白选自：传染性支气管炎病毒(ibv)；珍珠鸡冠状病毒(gfcov)、火鸡冠状病毒(tcov；火鸡肠炎病毒和蓝冠病病毒)、猫传染性腹膜炎病毒(fipv)、猫肠道冠状病毒(fecv)；传染性胃肠炎病毒(tgev)、猪呼吸道冠状病毒(prcov)、猪流行性腹泻病毒(pedv)、猪血凝性脑脊髓炎病毒(phev)；严重急性呼吸综合征冠状病毒(sars-cov)、中东呼吸综合征冠状病毒(mers-cov)、人冠状病毒229e(hcov-229e)、人冠状病毒nl63(hcov-nl63)、人冠状病毒hku1(hcov-hku1)、人冠状病毒oc43(hcov-oc43)；犬冠状病毒(ccov)、犬呼吸道冠状病毒(crcov)、小鼠肝炎病毒(mhv)、牛冠状病毒(bcv)。
[0060]
在根据本发明的禽冠状病毒刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，禽冠状病毒刺突蛋白或其片段选自：传染性支气管炎病毒(ibv)；珍珠鸡冠状病毒(gfcov)和火鸡冠状病毒(tcov；火鸡肠炎病毒和蓝冠病病毒)。
[0061]
在根据本发明的禽冠状病毒刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，禽冠状病毒是ibv(传染性支气管炎病毒)。
[0062]
ibv毒株可以按血清型和基因型进行分类。血清型分类涉及用中性抗体处理病毒，而基因型分类一般涉及检查s1(刺突)蛋白的序列。然而，不同的ibv毒株是本领域技术人员众所周知的。传染性支气管炎病毒于二十世纪三十年代首次在美国被发现。
[0063]
鉴定的第一种ibv血清型是massachusetts，并且一直是唯一的血清型，直到1956年不同ibv血清型的发现。如今，除最初鉴定的massachusetts类型之外，在美国还已鉴定了几种另外的血清型，包括arkansas和delaware。当今，ibv mass病毒可以在全世界的许多国家中得到鉴定。
[0064]
ibv毒株beaudette是massachusetts类型，并且在鸡胚中至少150次传代之后衍生。ibv毒株beaudette最初由beaudette和hudson(j.am.vet.med.a.90，51-60，1937)分离，
并且在鸡胚中进行传代。除了beaudette之外的其它massachusetts类型的ibv毒株是h120、h52和m41。h120毒株在含胚鸡蛋中传代120次。
[0065]
ibv qx被描述为最初在中国分离的ibv的强毒野外分离株。然而，该病毒已传播到欧洲，并且已在西欧的部分地区，主要在荷兰，以及德国、法国、比利时、丹麦和英国得到鉴定。另外，qx基因型或血清型已在亚洲和非洲的几个国家得到描述。
[0066]
指名为“italien-02”或“italy-02”的毒株于二十世纪九十年代后期在意大利得到分离。这些分离株之一的序列分析于2002年公开(ncbi-blast，编号aj457137)。然而，研究已显示了，这种italian-02毒株在欧洲分布很广，除去ibv变异株4/91，它已成为英国、西班牙、法国和荷兰最主要的基因型之一。
[0067]
自1996年以后，新的传染性支气管炎病毒(ibv)基因型，称为q1，已在中国流行，并且于2011年在意大利首次报道。q1与死亡率、肾脏损害和腺胃炎的增加相关。
[0068]
此外，在欧洲还已鉴定了毒株d274、b1648/d8880、d1466、v1397和arkansas。
[0069]
从何处获得任何ibv毒株在本领域技术人员的一般知识内。ibv毒株可以是商业购买的，从科学研究所获得的，或者基因组可以是作为互补dna合成地合成的，因为ibv毒株已进行测序，并且序列已得到公开并因此是可用的。此外，ibv毒株可以从野外进行分离。分离ibv毒株且表征ibv毒株的方法是本领域技术人员众所周知的。valter leonardo de quadros 2011(dissertation，das bronchitis virus(ibv):molekularbiologische untersuchungen zur diagnostik und zum vorkommen sowie zurdes genotyps ibv qx in spezifisch pathogenfreien(spf)broilern，freieberlin)，worthington等人2009(avian pathology 37(3)，247-257)，liu等人2009(virus genes 38:56-65)，dolz等人2006(avian pathology 35(2):77-85)，farsang等人2002(avian pathology 31:229-236)和feng等人2014(virus genes 49:292-303)描述了如何分离且区分不同的ibv毒株。
[0070]
ibv毒株通常通过刺突蛋白的s1亚基的编码序列进行区分(valastro等人2016.infect genet evol.39:349-364)，但也可以通过其完整的核苷酸序列或特异性蛋白质的序列进行区分，所述特异性蛋白质例如刺突蛋白、核衣壳蛋白、包膜(e)蛋白或膜(m)糖蛋白。因为刺突蛋白决定了ibv的宿主嗜性和抗原性，所以ibv基因型通过刺突蛋白的亚基1的编码序列进行分类。可替代地，ibv毒株可以通过其血清型进行区分。血清型分类涉及病毒的血清学测定，所述血清学测定涉及血清型特异性抗体。
[0071]
在根据本发明的ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，刺突蛋白或其片段来自具有选自以下列表的基因型或血清型或毒株的ibv：arkansas(例如arkansas 99)、brazil(例如br-1、br-2、23/2013、ibv/brasil/351/1984)、california(例如california1734/04、california 99)、connecticut、delaware(例如delaware 98)、dutch(例如d207、d212、d274、d3128、d3896、d8880、d1466)、florida、georgia(例如georgia ga-07、ga-08、ga-12、ga-13)、gray、holte、iowa(例如iowa 97和iowa 69)、italy02)、jmk、ldt3、maine(例如maine 209)、massachusetts(例如m41、h52、h120；排除beaudette)、pennsylvania(例如pennsylvania 1220/98、pennsylvania wolg/98)、pl84084、qu(例如qu-mv)、qx(例如gb341/96)、q1、se 17、变体2(例如is/1494/06、ibv/ck/eg/cu/4/2014、gammacov/ck/poland/g052/2016)和4/91(793b、cr88)。
[0072]
在根据本发明的ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，刺突蛋白或其片段并非来自beaudette毒株。
[0073]
在根据本发明的ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，刺突蛋白或其片段来自选自以下的基因型或血清型或毒株列表的ibv：massachusetts(并非beaudette)、4/91、qx、q1、italy 02、arkansas、conneticut、georgia、ldt3、pl84084、变体2和brazil。
[0074]
措辞“并非beaudette”等价于排除beaudette而使用。因此，措辞“massachusetts(并非beaudette)”意指包含来自massachusetts毒株例如m41、h52和h120的刺突蛋白或其片段，但排除来自beaudette毒株的刺突蛋白或其片段。
[0075]
在根据本发明的ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，刺突蛋白或其片段来自选自以下的基因型或血清型列表的ibv：massachusetts(并非beaudette)、4/91、qx、q1、arkansas、变体2和brazil。
[0076]
在根据本发明的ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，刺突蛋白或其片段来自选自以下的基因型或血清型列表的ibv：massachusetts(并非beaudette)和4/91。
[0077]
在根据本发明的ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，massachusetts毒株选自以下列表：h120、h52、spain/98/308、ibma5-1、sd/97/01、spain/96/334和m41-m21883。
[0078]
在根据本发明的ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，4/91毒株选自以下列表：spain/98/328、spain/92/35、ir-3654-vm、fr-cr88061-88、fr-85131-85、uk-1233-95、uk/3/91、spain/00/336、uk/7/91、致病性4/91、减毒的4/91和ib4-91。
[0079]
在根据本发明的ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，qx毒株选自以下列表：fr-l1450t-05、fr-l1450l-05、nl-l1449t-04、nl-l1449k-04、ibv/ck/sp/170/09、ibv/ck/sp/79/08、ibv/ck/sp/248/09、hbn、ibvqx、lx4、bjq、ck/ch/lgd/03、sp2013-01470、sp2013-014171、sp2013-01478和gb341/96。
[0080]
在根据本发明的ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，q1毒株选自以下列表：ck/ch/ldl/98i、ck/ch/lsd/08-10、j2、q1、ar08er22、ar08ba21、12.185、12.124、12.216和chile-295-10。
[0081]
在根据本发明的ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，italy 02毒株选自以下列表：spain/99/316、italy-02、uk-l633-04、it-497-02、spain/05/866、spain/04/221、spain/00/337、spain/155/09和spain/03/08。
[0082]
在根据本发明的ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，arkansas毒株选自以下列表：ark99、arkga、arkdpi、al/5364/00、arkdpi11、al/0803/01、al/7149/00、arkdpi101、al/1221/01、al/1793/01和al/4614/98。
[0083]
在根据本发明的ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，变体2毒株选自以下列表：is/1494/06、ibv/ck/eg/cu/4/2014、gammacov/ck/poland/g052/2016、eg/clevb-2/ibv/012、d1344/2/4/10_eg、tr8和ib var2-06。
[0084]
在根据本发明的ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，brazil毒株选自以下列表：br-1、br-2、23/2013和ibv/brasil/351/1984。
[0085]
在根据本发明的ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，刺突蛋白或其片段来自massachusetts(并非beaudette)、qx或4/91基因型或血清型的ibv。
[0086]
在根据本发明的ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，刺突蛋白或其片段来
自massachusetts(并非beaudette)基因型或血清型的ibv。
[0087]
在根据本发明的ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，刺突蛋白或其片段来自qx基因型或血清型的ibv。
[0088]
在根据本发明的ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，刺突蛋白或其片段来自4/91基因型或血清型的ibv。
[0089]
在根据本发明的ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，ibv毒株是h52、h120、qx sp2013-01478或cr88。
[0090]
在根据本发明的ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，ibv刺突蛋白或其片段由以下组成或包含以下：如seq id no:2、3、4、5、6、7、8、77中所示的氨基酸序列，或者与其具有至少80％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、99.95％、99.98％或99.99％序列同一性的序列。
[0091]
术语“同一性”或“序列同一性”是本领域已知的，并且指两个或更多个多肽序列或者两个或更多个多核苷酸序列(即参考序列以及待与参考序列比较的给定序列)之间的关系。如通过在此类序列的字符串之间的匹配确定的，在序列已进行最佳比对以产生最高程度的序列相似性后，通过给定序列与参考序列进行比较，来确定序列同一性。在此类比对中，在逐个位置的基础上确定序列同一性，例如，如果在特定位置处，核苷酸或氨基酸残基是等同的，则序列在该位置处是“等同的”。然后将此类位置同一性的总数除以参考序列中的核苷酸或残基的总数，以给出％序列同一性。可以通过已知方法容易地计算序列同一性，所述方法包括但不限于以下中描述的那些方法：computational molecular biology，lesk，a.n.编辑，oxford university press，new york(1988)，biocomputing:informatics and genome projects，smith，d.w.编辑，academic press，new york(1993)；computer analysis of sequence data，part i，griffin，a.m.和griffin，h.g.编辑，humana press，new jersey(1994)；sequence analysis in molecular biology，von heinge，g.，academic press(1987)；sequence analysis primer，gribskov，m.和devereux，j.编辑，m.stockton press，new york(1991)；以及carillo，h.和lipman，d.，siam j.applied math.，48:1073(1988)，其教导引入本文作为参考。确定序列同一性的优选方法设计为给出测试的序列之间的最大匹配。确定序列同一性的方法汇编在可公开获得的计算机程序中，所述计算机程序确定给定序列之间的序列同一性。此类程序的例子包括但不限于gcg程序包(devereux，j.等人，nucleic acids research，12(1):387(1984))、blastp、blastn和fasta(altschul，s.f.等人，j.molec.biol.，215:403-410(1990)。blastx程序可从ncbi和其它来源(blast manual，altschul，s.等人，ncvi nlm nih bethesda，md 20894，altschul，s.f.等人，j.molec.biol.，215:403-410(1990)，其教导引入本文作为参考)公开获得。这些程序使用默认缺口权重最佳地比对序列，以便产生给定序列和参考序列之间的最高序列同一性水平。作为例证，通过具有与参考核苷酸序列具有至少例如85％，优选90％，甚至更优选95％“序列同一性”的核苷酸序列的多核苷酸，预期给定多核苷酸的核苷酸序列与参考序列是等同的，除了给定的多核苷酸序列可能包括参考核苷酸序列的每100个核苷酸至多15个，优选至多10个，甚至更优选至多5个点突变之外。换言之，在具有相对于参考核苷酸序列具有至少85％，优选90％，甚至更优选95％同一性的核苷酸序列的多核苷酸中，参考序列中的至多15％，优选10％，甚至更优选5％的核苷酸可以缺失或由另一种核
苷酸取代，或者参考序列中的总核苷酸的至多15％，优选10％，甚至更优选5％的多个核苷酸可以插入参考序列内。参考序列的这些突变可能在参考核苷酸序列的5'或3'末端位置或者这些末端位置之间的任何位置处发生，个别地散布在参考序列中的核苷酸中或者在参考序列内的一个或多个邻接基团中。类似地，通过具有与参考氨基酸序列具有至少例如85％，优选90％，甚至更优选95％序列同一性的给定氨基酸序列的多肽，预期多肽的给定氨基酸序列与参考序列是等同的，除了给定的多肽序列可能包括参考氨基酸序列的每100个氨基酸至多15个，优选至多10个，甚至更优选至多5个氨基酸改变之外。换言之，为了获得与参考氨基酸序列具有至少85％，优选90％，甚至更优选95％序列同一性的给定多肽序列，参考序列中的至多15％，优选至多10％，甚至更优选至多5％的氨基酸残基可以缺失或由另一种氨基酸取代，或者参考序列中的氨基酸残基总数的至多15％，优选至多10％，甚至更优选至多5％的多个氨基酸可以插入参考序列内。参考序列的这些改变可能在参考氨基酸序列的氨基或羧基末端位置或者这些末端位置之间的任何位置处发生，个别地散布在参考序列中的残基中或者在参考序列内的一个或多个邻接基团中。优选地，并不等同的残基位置因保守氨基酸取代而不同。然而，在确定序列同一性时，保守取代并不作为匹配包括。
[0092]
术语“同一性”、“序列同一性”和“同一性百分比”在本文中可互换使用。出于本发明的目的，在此处定义，为了确定两个氨基酸序列或两个核酸序列的同一性百分比，序列就最佳比较目的进行比对(例如，可以在第一氨基酸序列或核酸序列的序列中引入缺口，用于与第二氨基酸序列或核酸序列的最佳比对)。然后比较在相应的氨基酸或核苷酸位置处的氨基酸或核苷酸残基。当第一序列中的一个位置由与第二序列中的相应位置相同的氨基酸或核苷酸残基占据时，则分子在该位置处是等同的。两个序列之间的同一性百分比是由序列共享的等同位置数目的函数(即，％同一性＝等同位置的数目/位置的总数目(即重叠位置)x100)。优选地，两个序列具有相同的长度。
[0093]
可以在待比较的两个序列的整个长度或两个序列的片段上进行序列比较。通常，比较在待比较的两个序列的全长上进行。然而，序列同一性可以在例如二十、五十、一百个或更多个邻接氨基酸残基的区域上进行。
[0094]
本领域技术人员知道不同的计算机程序可用于确定两个序列之间的同源性的事实。例如，序列的比较和两个序列之间的同一性百分比的确定可以使用数学算法来完成。在一个优选实施方案中，两个氨基酸序列或核酸序列之间的同一性百分比使用needleman和wunsch(j.mol.biol.(48):444-453(1970))算法进行确定，所述算法已掺入accelrys gcg软件包(可在http://www.accelrys.com/products/gcg/处获得)中的gap程序内，使用blosum 62矩阵或pam250矩阵，以及16、14、12、10、8、6或4的缺口权重，以及1、2、3、4、5或6的长度权重。技术人员将了解，所有这些不同的参数将产生略微不同的结果，但当使用不同的算法时，两个序列的整体同一性百分比并不显著地改变。
[0095]
本发明的蛋白质序列或核酸序列可以进一步用作“查询序列”，以针对公共数据库进行搜索，以例如鉴定其它家族成员或有关序列。可以使用altschul等人(1990)j.mol.biol.215:403-10的blastn和blastp程序(版本2.0)进行此类搜索。blast蛋白质搜索可以用blastp程序，评分＝50，字长＝3来进行，以获得与本发明的蛋白质分子同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的缺口比对，如altschul等人(1997)nucleic acids res.25(17):3389-3402中所述的，可以利用gapped blast。当利用blast和gapped blast程
序时，可以使用分别程序(例如，blastp和blastn)的默认参数。参见美国国家生物技术信息中心(national center for biotechnology information)在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/处的主页。
[0096]
如本文使用的，应特别理解术语“与seq id no:x的序列等同”分别等价于术语“在seq id no:x的长度上与seq id no:x的序列等同”、或术语“在seq id no:x的完整长度上与seq id no:x的序列等同”。在此上下文中，“x”是选自1至84的任何整数，使得“seq id no:x”代表本文提到的任何seq id no。
[0097]
在根据本发明的ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，ibv刺突蛋白或其片段由以下组成或包含以下：如seq id no:2中所示的氨基酸序列，或者与其具有至少80％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、99.95％、99.98％或99.99％序列同一性的序列。
[0098]
在根据本发明的ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，ibv刺突蛋白或其片段由以下组成或包含以下：如seq id no:3中所示的氨基酸序列，或者与其具有至少80％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、99.95％、99.98％或99.99％序列同一性的序列。
[0099]
在根据本发明的ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，ibv刺突蛋白或其片段由以下组成或包含以下：如seq id no:4中所示的氨基酸序列，或者与其具有至少80％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、99.95％、99.98％或99.99％序列同一性的序列。
[0100]
在根据本发明的ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，ibv刺突蛋白或其片段由以下组成或包含以下：如seq id no:5中所示的氨基酸序列，或者与其具有至少80％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、99.95％、99.98％或99.99％序列同一性的序列。
[0101]
在根据本发明的ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，ibv刺突蛋白或其片段由以下组成或包含以下：如seq id no:6中所示的氨基酸序列，或者与其具有至少80％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、99.95％、99.98％或99.99％序列同一性的序列。
[0102]
在根据本发明的ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，ibv刺突蛋白或其片段由以下组成或包含以下：如seq id no:7中所示的氨基酸序列，或者与其具有至少80％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、99.95％、99.98％或99.99％序列同一性的序列。
[0103]
在根据本发明的ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，ibv刺突蛋白或其片段由以下组成或包含以下：如seq id no:8或77中所示的氨基酸序列，或者与其具有至少80％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、99.95％、99.98％或99.99％序列同一性的序列。
[0104]
在根据本发明的ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，ibv刺突蛋白或其片段选自以下的基因型列表：gi-2至27、gii-1、giii-1、giv-1、gv-1、gvi-1。
[0105]
valastro等人2016(infection，genetics and evolution 39；349
–
364)描述了与ibv毒株分配的谱系命名法组合的基于系统发育的分类系统。定义了6种基因型(gi至gvi)，
其共同包含32个不同的病毒谱系。
[0106]
在根据本发明的ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，刺突蛋白或其片段并非来自gi-1基因型。gi-1基因型涉及massachusetts基因型/血清型。
[0107]
在根据本发明的禽冠状病毒刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，来自具有有限的细胞嗜性或组织嗜性的禽冠状病毒的所述s1亚基的至少一部分选自：传染性支气管炎病毒(ibv)；珍珠鸡冠状病毒(gfcov)和火鸡冠状病毒(tcov；火鸡肠炎病毒和蓝冠病病毒)。
[0108]
在根据本发明的禽冠状病毒刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，来自具有有限的细胞嗜性或组织嗜性的禽冠状病毒的所述s1亚基的至少一部分来自ibv(传染性支气管炎病毒)。
[0109]
在根据本发明的ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，所述s1亚基的至少一部分来自选自以下的基因型或血清型或毒株列表的ibv：arkansas(例如arkansas 99)、brazil(例如br-1、br-2、23/2013、ibv/brasil/351/1984)、california(例如california1734/04、california 99)、connecticut、delaware(例如delaware 98)、dutch(例如d207、d212、d274、d3128、d3896、d8880、d1466)、florida、georgia(例如georgia ga-07、ga-08、ga-12、ga-13)、gray、holte、iowa(例如iowa 97和iowa 69)、italy02、jmk、ldt3、maine(例如maine 209)、massachusetts(例如m41、h52、h120；排除beaudette)、pennsylvania(例如pennsylvania 1220/98、pennsylvania wolg/98)、pl84084、qu(例如qu-mv)、qx(例如gb341/96)、q1、se 17、变体2(例如is/1494/06、ibv/ck/eg/cu/4/2014、gammacov/ck/poland/g052/2016)和4/91(793b、cr88)。
[0110]
在根据本发明的ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，所述s1亚基的至少一部分来自选自以下的基因型或血清型或毒株列表的ibv：massachusetts(并非beaudette)、4/91、qx、q1、italy 02、arkansas、conneticut、georgia、ldt3、pl84084、变体2和brazil。
[0111]
在根据本发明的ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，所述s1亚基的至少一部分来自选自以下的基因型或血清型或毒株列表的ibv：massachusetts(并非beaudette)、4/91、qx、q1、arkansas、变体2和brazil。
[0112]
在根据本发明的ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，massachusetts毒株选自以下列表：h120、h52、spain/98/308、ibma5-1、sd/97/01、spain/96/334和m41-m21883。
[0113]
在根据本发明的ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，4/91毒株选自以下列表：spain/98/328、spain/92/35、ir-3654-vm、fr-cr88061-88、fr-85131-85、uk-1233-95、uk/3/91、spain/00/336、uk/7/91、致病性4/91、减毒的4/91和ib4-91。
[0114]
在根据本发明的ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，qx毒株选自以下列表：fr-l1450t-05、fr-l1450l-05、nl-l1449t-04、nl-l1449k-04、ibv/ck/sp/170/09、ibv/ck/sp/79/08、ibv/ck/sp/248/09、hbn、ibvqx、lx4、bjq、ck/ch/lgd/03和gb341/96。
[0115]
在根据本发明的ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，q1毒株选自以下列表：ck/ch/ldl/98i、ck/ch/lsd/08-10、j2、q1、ar08er22、ar08ba21和chile-295-10。
[0116]
在根据本发明的ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，italy 02毒株选自以下列表：spain/99/316、italy-02、uk-l633-04、it-497-02、spain/05/866、spain/04/221、spain/00/337、spain/155/09和spain/03/08。
[0117]
在根据本发明的ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，arkansas毒株选自以
下列表：ark99、arkga、arkdpi、al/5364/00、arkdpi11、al/0803/01、al/7149/00、arkdpi101、al/1221/01、al/1793/01和al/4614/98。
[0118]
在根据本发明的ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，变体2毒株选自以下列表：is/1494/06、ibv/ck/eg/cu/4/2014、gammacov/ck/poland/g052/2016、eg/clevb-2/ibv/012、d1344/2/4/10_eg、tr8和ib var2-06。
[0119]
在根据本发明的ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，brazil毒株选自以下列表：br-1、br-2、23/2013和ibv/brasil/351/1984。
[0120]
在根据本发明的ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，所述s1亚基的至少一部分来自选自以下的基因型或血清型列表的ibv：massachusetts(并非beaudette)、qx和4/91。
[0121]
在根据本发明的ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，所述s1亚基的至少一部分来自massachusetts(并非beaudette)ibv基因型或血清型。
[0122]
在根据本发明的ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，所述s1亚基的至少一部分来自qx ibv基因型或血清型。
[0123]
在根据本发明的ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，所述s1亚基的至少一部分来自4/91ibv基因型或血清型。
[0124]
在根据本发明的ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，所述s1亚基的至少一部分来自ibv毒株h120、h52、qx sp2013-01478或cr88。
[0125]
在根据本发明的ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，所述s1亚基的至少一部分来自ibv毒株h120或h52。
[0126]
在根据本发明的禽冠状病毒刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，s1亚基的至少一部分是来自具有有限的细胞嗜性或组织嗜性的禽冠状病毒或ibv的s1亚基序列，或者与其具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列的至少1、5、10、15、20、25、50、100、150、200、250、300、350、400或500个邻接氨基酸。
[0127]
在根据本发明的禽冠状病毒或ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，s1亚基的至少一部分是来自如本文所述的禽冠状病毒或ibv的s1亚基序列，或者与其具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列的至少1、5、10、15、20、25、50、100、150、200、250、300、350、400或500个邻接氨基酸。
[0128]
在根据本发明的ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，来自具有有限的细胞嗜性或组织嗜性的ibv的所述s1亚基的至少一部分具有如seq id no:2、3、4、5、6、7、8、77中所示的氨基酸序列，或者与其具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列的至少1、5、10、15、20、25、50、100、150、200、250、300、350、400或500个邻接氨基酸。
[0129]
在根据本发明的禽冠状病毒或ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，具有有限的细胞嗜性或组织嗜性的冠状病毒或ibv限于在含胚鸡蛋和/或原代鸡肾细胞中的感染和/或复制。
[0130]
在根据本发明的禽冠状病毒或ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，具有有限的细胞嗜性或组织嗜性的冠状病毒或ibv并不在eb66细胞中感染和/或复制。
[0131]
在根据本发明的禽冠状病毒或ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，具有有限的细胞嗜性或组织嗜性的冠状病毒或ibv并不在pbs-12sf和/或hek 293t细胞中感染和/
或复制。
[0132]
片段
[0133]
在根据本发明的禽冠状病毒或ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，禽冠状病毒或ibv刺突蛋白的片段具有至少500、750、1000或1077个氨基酸的长度。
[0134]
在根据本发明的禽冠状病毒或ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，禽冠状病毒或ibv刺突蛋白的片段具有至少1000个氨基酸的长度。
[0135]
在根据本发明的禽冠状病毒或ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，禽冠状病毒或ibv刺突蛋白的片段具有距离n末端至少500、750、1000或1075个氨基酸的长度。
[0136]
术语“n末端”是本领域技术人员众所周知的。n末端也称为氨基末端、nh2末端、n末端端部或胺末端。当蛋白质从信使rna进行翻译时，它是从n末端到c末端产生的。因此，n末端是包含所述胺基(-nh2)的氨基酸链(蛋白质或多肽)的起点。
[0137]
在根据本发明的禽冠状病毒或ibv刺突蛋白或其片段的另一个特定方面，禽冠状病毒或ibv刺突蛋白的片段是刺突蛋白的胞外结构域。
[0138]
术语“胞外结构域”是本领域技术人员众所周知的。刺突蛋白包含不同的功能部分、信号序列、胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域(从n末端到c末端)。因此，在信号序列的切割后，刺突蛋白的n末端以胞外结构域起始。ibv刺突胞外结构域具有约1075个氨基酸的长度，并且取决于ibv毒株，在长度方面相差几个氨基酸。
[0139]
在根据本发明的禽冠状病毒或ibv刺突蛋白的另一个特定方面，在氨基酸位置267处的半胱氨酸或在氨基酸位置267处向半胱氨酸的突变是遗传上稳定的。有利地，实验数据显示了在氨基酸位置267处的半胱氨酸或在氨基酸位置267处向半胱氨酸的突变是遗传上稳定的，并且在一段时间内(经过传代)保持稳定。
[0140]
术语“遗传上稳定的”意指在氨基酸位置267处的半胱氨酸或在氨基酸位置267处向半胱氨酸的突变在一段时间内(经过传代)保持稳定。优选地，所述在氨基酸位置267处的半胱氨酸或在氨基酸位置267处向半胱氨酸的突变在具有根据本发明的所述禽冠状病毒或ibv刺突蛋白的ibv在细胞培养或组织培养中的至少3次传代后，更优选在至少6次传代后，甚至更优选在至少9次传代后，甚至更优选在至少12代后，最优选在15次传代后仍然存在。
[0141]
核苷酸序列和质粒
[0142]
进一步地，本发明提供了编码如本文所述的刺突蛋白或其片段的核苷酸序列。
[0143]
进一步地，本发明提供了包含如本文所述的核苷酸序列的质粒。
[0144]
术语“核酸”或“核酸序列”或“核苷酸序列”指多核苷酸，包括dna分子、rna分子、cdna分子或衍生物。该术语包括单链多核苷酸以及双链多核苷酸。本发明的核酸包括分离的多核苷酸(即从其天然环境中分离的)和遗传修饰的形式。此外，还包括的是化学修饰的多核苷酸，包括天然存在的修饰的多核苷酸例如糖基化或甲基化的多核苷酸、或者人工修饰的多核苷酸例如生物素化的多核苷酸。进一步地，术语“核酸”和“多核苷酸”是可互换的，并且指任何核酸。术语“核酸”和“多核苷酸”具体地还包括由核苷酸组成的核酸，所述核苷酸具有除五种生物学上存在的碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶)外的核碱基。
[0145]
术语“质粒”指在细菌宿主细胞内，不依赖于细菌染色体而复制的细胞质dna。在本发明的一个特定方面，术语“质粒”和/或“转移质粒”和/或“供体质粒”指可用于构建例如重
组病毒或用于插入病毒载体内的表达盒的重组dna技术的元件。在另一个特定方面，术语“质粒”可以用于指定可用于dna疫苗接种目的的质粒。
[0146]
细胞
[0147]
进一步地，本发明提供了包含如本文所述的质粒的细胞。细胞可以是真核细胞或原核细胞。
[0148]
病毒颗粒、禽冠状病毒和ibv
[0149]
进一步地，本发明提供了包含如本文所述的刺突蛋白或其片段的病毒颗粒。
[0150]
进一步地，本发明提供了包含如本文所述的刺突蛋白或其片段的禽冠状病毒。
[0151]
进一步地，本发明提供了包含如本文所述的刺突蛋白的ibv(传染性支气管炎病毒)。
[0152]
在根据本发明的禽冠状病毒或ibv的另一个特定方面，禽冠状病毒或ibv是减毒的。
[0153]
术语“减毒的”指与野生型分离株相比，具有减少的毒力的病原体。在本发明中，减毒的ibv是这样的ibv，其中毒力已这样减少，使得它并不引起ibv感染的临床体征，但能够在靶动物中诱导免疫应答，但也可以意指与由非减毒ibv感染且未接受减毒病毒的动物“对照组”相比，临床体征在由减毒ibv感染的动物中的发病率或严重性方面是减少的。在此上下文中，术语“减少/减少的”意指与如上文定义的由非减毒ibv感染的对照组相比，至少10％，优选25％，甚至更优选50％，还更优选60％，甚至更优选70％，还更优选80％，还更优选90％，甚至更优选95％，且最优选100％的减少。因此，减毒的ibv毒株是适合于掺入包含改良式活ibv的免疫原性组合物内的毒株。
[0154]
在根据本发明的禽冠状病毒或ibv的另一个特定方面，禽冠状病毒或ibv是灭活的。
[0155]
任何常规的灭活方法均可以用于本发明的目的。因此，可以通过本领域技术人员已知的化学处理和/或物理处理进行灭活。优选的灭活方法包括添加环化的二元乙撑亚胺(bei)，包括添加2-溴乙胺氢溴酸盐(bea)的溶液，所述2-溴乙胺氢溴酸盐已环化为二元乙撑亚胺(bei)。优选的进一步的化学灭活剂包括但不限于triton x-100、脱氧胆酸钠、十六烷基三甲基溴化铵、β-丙内酯、硫柳汞、苯酚和甲醛(福尔马林)。然而，灭活还可以包括中和步骤。优选的中和剂包括但不限于硫代硫酸钠、亚硫酸氢钠等等。
[0156]
优选的福尔马林灭活条件包括约0,02％(v/v)
–
2,0％(v/v)，更优选约0,1％(v/v)
–
1,0％(v/v)，还更优选约0,15％(v/v)
–
0,8％(v/v)，甚至更优选约0,16％(v/v)
–
0,6％(v/v)，且最优选约0,2％(v/v)
–
0,4％(v/v)的福尔马林浓度。温育时间取决于ibv的抗性。一般而言，进行灭活过程直到在合适的培养系统中无法检测到ibv的生长。
[0157]
优选地，本发明的灭活ibv是福尔马林灭活的，优选使用如上文所述的浓度。
[0158]
可以使用已知技术将本发明的灭活ibv掺入脂质体内，所述技术例如在nature，1974，252，252-254或journal of immunology，1978，120，1109-13中描述的技术。在本发明的另一个实施方案中，本发明的灭活ibv可以缀合至合适的生物化合物例如多糖、肽、蛋白质等等或其组合。
[0159]
在根据本发明的禽冠状病毒或ibv的另一个特定方面，禽冠状病毒或ibv是遗传改造的。
[0160]
术语“遗传改造的”指已通过使用“反向遗传学”方法进行突变的禽冠状病毒或ibv。优选地，根据本发明的禽冠状病毒或ibv已进行遗传改造。反向遗传学技术涉及合成重组病毒rna的制备。然而，“反向遗传学”技术是本领域技术人员众所周知的。
[0161]
在根据本发明的禽冠状病毒或ibv的另一个特定方面，禽冠状病毒或ibv是重组的。
[0162]
如本文使用的，术语“重组的”指具有任何修饰的rna基因组(或rna序列、cdna序列或蛋白质)，所述修饰并不对相应的rna基因组(或rna序列、cdna序列或蛋白质)天然发生。例如，如果rna基因组(或rna序列、cdna序列或蛋白质)包含例如通过人为干预而人工引入的插入、缺失、倒位、重定位或点突变，则它被视为“重组的”。因此，rna基因组序列(或rna序列、cdna序列或蛋白质)不与它在自然界中与之结合的序列(或rna序列、cdna序列或蛋白质)的全部或一部分结合。当就病毒而言使用时，术语“重组的”意指通过病毒基因组的人工操纵而产生的病毒。术语“重组病毒”包括遗传修饰的病毒。
[0163]
在根据本发明的禽冠状病毒或ibv的另一个特定方面，禽冠状病毒或ibv是嵌合的。
[0164]
术语“嵌合的”指包含来自另一种冠状病毒或ibv的一种或多种核苷酸序列的禽冠状病毒或ibv。优选地，该术语指包含来自另一个ibv毒株的一种或多种核苷酸序列的ibv病毒。
[0165]
在根据本发明的ibv的另一个特定方面，ibv来自具有选自以下列表的基因型或血清型或毒株的ibv：arkansas(例如arkansas 99)、brazil(例如br-1、br-2、23/2013、ibv/brasil/351/1984)、california(例如california 1734/04、california 99)、connecticut、delaware(例如delaware 98)、dutch(例如d207、d212、d274、d3128、d3896、d8880、d1466)、florida、georgia(例如georgia ga-07、ga-08、ga-12、ga-13)、gray、holte、iowa(例如iowa 97和iowa 69)、italy 02、jmk、ldt3、maine(例如maine 209)、massachusetts(m41、h52、h120、beaudette)、pennsylvania(例如pennsylvania 1220/98、pennsylvania wolg/98)、pl84084、qu(例如qu-mv)、qx(例如gb341/96)、q1、se 17、变体2(例如is/1494/06、ibv/ck/eg/cu/4/2014、gammacov/ck/poland/g052/2016)和4/91(793b、cr88)。
[0166]
在根据本发明的ibv的另一个特定方面，ibv选自以下的基因型或血清型或毒株列表：massachusetts、4/91、qx、q1、italy 02、arkansas、conneticut、georgia、ldt3、pl84084、变体2和brazil。
[0167]
在根据本发明的ibv的另一个特定方面，ibv选自以下的基因型或血清型列表：massachusetts、4/91、qx、q1、arkansas、变体2和brazil。
[0168]
在根据本发明的ibv的另一个特定方面，massachusetts毒株选自以下列表：h120、h52、spain/98/308、ibma5-1、sd/97/01、beaudette、spain/96/334和m41-m21883。
[0169]
在根据本发明的ibv的另一个特定方面，4/91毒株选自以下列表：spain/98/328、spain/92/35、ir-3654-vm、fr-cr88061-88、fr-85131-85、uk-1233-95、uk/3/91、spain/00/336、uk/7/91、致病性4/91、减毒的4/91和ib4-91。
[0170]
在根据本发明的ibv的另一个特定方面，qx毒株选自以下列表：fr-l1450t-05、fr-l1450l-05、nl-l1449t-04、nl-l1449k-04、ibv/ck/sp/170/09、ibv/ck/sp/79/08、ibv/ck/
sp/248/09、hbn、ibvqx、lx4、bjq、ck/ch/lgd/03和gb341/96。
[0171]
在根据本发明的ibv的另一个特定方面，q1毒株选自以下列表：ck/ch/ldl/98i、ck/ch/lsd/08-10、j2、q1、ar08er22、ar08ba21和chile-295-10。
[0172]
在根据本发明的ibv的另一个特定方面，italy 02毒株选自以下列表：spain/99/316、italy-02、uk-l633-04、it-497-02、spain/05/866、spain/04/221、spain/00/337、spain/155/09和spain/03/08。
[0173]
在根据本发明的ibv的另一个特定方面，arkansas毒株选自以下列表：ark99、arkga、arkdpi、al/5364/00、arkdpi11、al/0803/01、al/7149/00、arkdpi101、al/1221/01、al/1793/01和al/4614/98。
[0174]
在根据本发明的ibv的另一个特定方面，变体2毒株选自以下列表：is/1494/06、ibv/ck/eg/cu/4/2014、gammacov/ck/poland/g052/2016、eg/clevb-2/ibv/012、d1344/2/4/10_eg、tr8和ib var2-06。
[0175]
在根据本发明的ibv的另一个特定方面，brazil毒株选自以下列表：br-1、br-2、23/2013和ibv/brasil/351/1984。
[0176]
在根据本发明的ibv的另一个特定方面，刺突蛋白或其片段来自massachusetts或4/91基因型或血清型的ibv。
[0177]
在根据本发明的ibv的另一个特定方面，刺突蛋白或其片段来自massachusetts基因型或血清型的ibv。
[0178]
在根据本发明的ibv的另一个特定方面，刺突蛋白或其片段来自4/91基因型或血清型的ibv。
[0179]
在根据本发明的ibv的另一个特定方面，ibv毒株是h120、h52或cr88。
[0180]
在根据本发明的ibv的另一个特定方面，ibv毒株是h120或h52。
[0181]
在根据本发明的ibv的另一个特定方面，ibv具有由以下组成或包含以下的ibv刺突蛋白或其片段：如seq id no:2、3、4、5、6、7、8、77中所示的氨基酸序列，或者与其具有至少80％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、99.95％、99.98％或99.99％序列同一性的序列。
[0182]
在根据本发明的ibv的另一个特定方面，ibv具有扩展的细胞嗜性或组织嗜性。
[0183]
在根据本发明的ibv的另一个特定方面，ibv在如本文所述的至少一种细胞系或细胞中感染和/或复制。优选地，ibv在如本文所述的至少一种细胞系中感染和/或复制。
[0184]
进一步地，本发明提供了细胞，其包含：
[0185]-如本文所述的病毒颗粒，或
[0186]-如本文所述的禽冠状病毒或ibv。
[0187]
在根据本发明的细胞的另一个特定方面，细胞是选自以下列表的细胞系或细胞：原代鸡胚细胞、鸡胚成纤维细胞系、鸭胚干细胞系、人胚肾细胞系、幼仓鼠肾细胞系、非洲绿猴肾细胞系、兔肾细胞系、犬肾细胞系、鸡肝细胞系、牛肾细胞系、猪肾细胞系和昆虫细胞系。
[0188]
在根据本发明的细胞的另一个特定方面，细胞是选自以下列表的细胞系：df-1(douglas foster)、eb66(鸭胚干细胞系)、pbs-12、pbs-12sf(无血清pbs-12)、bhk21(幼仓鼠肾)、hek 293t(人胚肾)、vero(verda reno)、ma104、rk13(兔肾)、lmh(leghorn雄性肝
癌)、mdck(马丁达比犬肾)、mdbk(马丁达比牛肾)、pk15(猪肾)、pk2a(猪肾)、sf9、sf21和sf+(草地贪夜蛾)。
[0189]
在根据本发明的细胞的另一个特定方面，细胞是选自以下列表的细胞系：df-1、eb66、pbs-12、pbs-12sf、bhk、hek 293t、vero、ma104和rk13。
[0190]
在根据本发明的细胞的另一个特定方面，原代鸡胚细胞是成纤维细胞或源自肝脏或肺组织的细胞。
[0191]
进一步地，本发明提供了免疫原性组合物，其包含：
[0192]-如本文所述的刺突蛋白，或
[0193]-如本文所述的病毒颗粒，或
[0194]-如本文所述的禽冠状病毒或ibv。
[0195]
因此，本发明还提供了包含禽冠状病毒或ibv的免疫原性组合物，其包含禽冠状病毒或ibv刺突蛋白或其片段，其中所述s1亚基的至少一部分来自具有有限的细胞嗜性或组织嗜性的禽冠状病毒或ibv，并且其中在氨基酸位置267处为半胱氨酸。进一步地，本发明还提供了包含禽冠状病毒或ibv的免疫原性组合物，其包含重组禽冠状病毒或ibv刺突蛋白或其片段，其包含在氨基酸位置267处向半胱氨酸的突变。进一步地，seq id no:1的氨基酸序列用于确定刺突蛋白中的位置编号。优选地，刺突蛋白的氨基酸序列与seq id no:1的氨基酸序列进行比对。
[0196]
进一步地，本发明提供了疫苗，其包含：
[0197]-如本文所述的刺突蛋白，或
[0198]-如本文所述的病毒颗粒，或
[0199]-如本文所述的冠状病毒或ibv。
[0200]
进一步地，本发明提供了具有扩展的细胞嗜性或组织嗜性的改良式活疫苗，其包含：
[0201]-如本文所述的刺突蛋白，或
[0202]-如本文所述的病毒颗粒，或
[0203]-如本文所述的冠状病毒或ibv。
[0204]
术语“免疫原性组合物”指包含至少一种抗原的组合物，所述至少一种抗原在免疫原性组合物施用于其的宿主中引发免疫应答。此类免疫应答可以是对本发明的免疫原性组合物的细胞和/或抗体介导的免疫应答。优选地，免疫原性组合物诱导免疫应答，且更优选地，赋予针对ibv感染的一种或多种临床体征的保护性免疫。宿主也描述为“对象”。优选地，本文描述或提到的任何宿主或对象是禽类或家禽。
[0205]
通常，“免疫应答”包括但不限于下述效应中的一种或多种：特异性针对本发明的免疫原性组合物中包括的一种或多种抗原的抗体、b细胞、辅助性t细胞、抑制性t细胞和/或细胞毒性t细胞和/或γ-δt细胞的产生或活化。优选地，宿主将展示保护性免疫应答或治疗应答。
[0206]“保护性免疫应答”或“保护性免疫”将通过以下进行证实：由受感染宿主通常展示的临床体征的减少或缺乏、更快的恢复时间和/或受感染宿主的组织或体液或排泄物中的感染性的持续时间降低或病原体滴度降低。
[0207]
在其中宿主展示保护性免疫应答，使得针对新感染的抗性将是增强的和/或疾病
的临床严重性减轻的情况下，免疫原性组合物被描述为“疫苗”。
[0208]
术语“改良式活的”和“减毒的”在本文中可互换使用。
[0209]
在根据本发明的免疫原性组合物或疫苗的另一个特定方面，免疫原性组合物或疫苗包含药学上可接受的载体。
[0210]
术语“药学上可接受的载体”包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂、吸附延迟剂、佐剂、免疫刺激剂及其组合。
[0211]“稀释剂”可以包括水、盐水、右旋糖、乙醇、甘油等等。等渗剂可以尤其包括氯化钠、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇和乳糖。稳定剂尤其包括白蛋白和乙二胺四乙酸的碱金属盐。
[0212]
在根据本发明的免疫原性组合物或疫苗的另一个特定方面，药学上可接受的载体是磷酸盐缓冲盐水。
[0213]
优选地，免疫原性组合物进一步包含蔗糖明胶稳定剂。
[0214]
优选地，药学上可接受的载体是壳聚糖。
[0215]
壳聚糖是甲壳类动物(例如虾、蟹)、昆虫和其它无脊椎动物中，来自甲壳质的天然脱乙酰多糖。最近，rauw等人2009(vet immunol immunop 134:249
–
258)证实了壳聚糖增强了新城疫活疫苗的细胞免疫应答，并且促进其保护效应。进一步地，wang等人，2012(arch virol(2012)157:1451
–
1461)已显示了，揭示壳聚糖作为用于减毒活流感疫苗中的佐剂的潜力的结果。
[0216]
优选地，免疫原性组合物可以进一步包括一种或多种其它免疫调节剂，例如白细胞介素、干扰素或其它细胞因子。通过技术人员可以容易地确定可用于本发明的上下文中的佐剂和添加剂的量和浓度。
[0217]
在一些方面，本发明的免疫原性组合物含有佐剂。如本文使用的，“佐剂”可以包括氢氧化铝和磷酸铝、皂苷例如quila、qs-21(cambridge biotech inc.，cambridge ma)、gpi-0100(galenica pharmaceuticals，inc.，birmingham，al)、油包水型乳状液、水包油型乳状液、水包油包水型乳状液。乳状液可以特别基于轻质液体石蜡油(欧洲药典型)；类异戊二烯油，如角鲨烷或角鲨烯；起因于烯烃，特别是异丁烯或癸烯的低聚反应的油；含有线性烷基的酸或醇的酯，更特别是植物油、油酸乙酯、丙二醇二(辛酸酯/癸酸酯)、甘油三(辛酸酯/癸酸酯)或丙二醇二油酸酯；分支脂肪酸或醇的酯，特别是异硬脂酸酯。油与乳化剂组合使用，以形成乳状液。乳化剂优选是非离子型表面活性剂，特别是脱水山梨糖醇、二缩甘露醇(例如脱水甘露糖醇油酸酯)、乙二醇、聚甘油、丙二醇和油酸、异硬脂酸、蓖麻油酸或羟基硬脂酸的酯，其是任选地乙氧基化的，以及聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚物嵌段，特别是pluronic产品，尤其是l121。参见hunter等人，the theory and practical application of adjuvants(编辑stewart-tull，d.e.s.)，johnwiley and sons，ny，第51-94页(1995)，以及todd等人，vaccine 15:564-570(1997)。示例性佐剂是通过m.powell和m.newman编辑的“vaccine design，the subunit and adjuvant approach”，plenum press，1995的第147页中描述的spt乳状液，以及同一本书的第183页上描述的乳状液mf59。
[0218]
佐剂的一个进一步实例是选自丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物以及马来酸酐和烯基衍生物的共聚物的化合物。有利的佐剂化合物是丙烯酸或甲基丙烯酸的聚合物，其尤其是与糖或多元醇的聚烯基醚交联的。这些化合物通过术语卡波姆(phameuropa第8卷，第2
期，1996年6月)已知。本领域技术人员还可以参考美国专利号2,909,462，其描述了与具有至少3个羟基，优选不多于8个羟基的聚羟基化化合物交联的此类丙烯酸聚合物，所述至少三个羟基的氢原子替换为具有至少2个碳原子的不饱和脂肪族原子团。优选的原子团是含有2至4个碳原子的那些原子团，例如乙烯基、烯丙基和其它烯键式不饱和基团。不饱和原子团本身可以包含其它取代基，例如甲基。以名称卡波姆；(bf goodrich，ohio，usa)销售的产品是特别适当的。它们与烯丙基蔗糖或烯丙基季戊四醇交联。其中，可以提到卡波姆974p、934p和971p。最优选的是卡波姆971p的使用。在马来酸酐和烯基衍生物的共聚物中有共聚物ema(monsanto)，其是马来酸酐和乙烯的共聚物。这些聚合物在水中的溶解导致将优选中和至生理ph的酸溶液，以便给出免疫原性组合物、免疫学组合物或疫苗组合物本身将掺入其内的佐剂溶液。
[0219]
进一步合适的佐剂包括但不限于ribi佐剂系统(ribi inc.)、嵌段共聚物(cytrx，atlanta ga)、saf-m(chiron，emeryville ca)、单磷酰脂质a、阿夫立定脂质-胺佐剂、来自大肠杆菌的不耐热肠毒素(重组的或其它方式)、霍乱毒素、ims 1314或胞壁酰二肽、或者天然存在或重组的细胞因子或其类似物、或内源性细胞因子释放的刺激剂，等等。
[0220]
预计佐剂可以以约100μg至约10mg/剂量的量加入，优选以约100μg至约10mg/剂量的量，更优选以约500μg至约5mg/剂量的量，甚至更优选以约750μg至约2.5mg/剂量的量，且最优选以约1mg/剂量的量。可替代地，佐剂可以为按最终产物的体积计约0.01％至50％的浓度，优选为约2％至30％的浓度，更优选为约5％至25％的浓度，还更优选为约7％至22％的浓度，且最优选为10％至20％的浓度。
[0221]
在根据本发明的免疫原性组合物或疫苗的另一个特定方面，免疫原性组合物或疫苗有效治疗和/或预防有需要的对象中由ibv引起的临床体征。术语“治疗和/或预防”、“临床体征”和“有需要”已在其它地方进行定义。
[0222]
在根据本发明的免疫原性组合物或疫苗的另一个特定方面，所述免疫原性组合物或疫苗配制用于单剂量施用。
[0223]
关于单剂量的体积已在本文其它地方进行定义。
[0224]
此外，已显示了，在此类免疫原性组合物或疫苗的此类单剂量施用后，本发明的免疫原性组合物的一个剂量是有效的。
[0225]
在根据本发明的免疫原性组合物或疫苗的另一个特定方面，免疫原性组合物或疫苗是皮下、肌内、经口、卵内、经由喷雾、经由饮用水或通过滴眼剂施用的。
[0226]
在根据本发明的免疫原性组合物或疫苗的另一个特定方面，免疫原性组合物或疫苗包含1至10log
10 eid50/ibv的剂量。
[0227]
在根据本发明的免疫原性组合物或疫苗的另一个特定方面，免疫原性组合物或疫苗包含2至5log
10 eid50/ibv的剂量。
[0228]
在根据本发明的免疫原性组合物或疫苗的另一个特定方面，免疫原性组合物或疫苗包含2至4log
10 eid50/ibv的剂量。
[0229]
用于制造、培养和修饰的方法
[0230]
进一步地，本发明提供了用于改变禽冠状病毒的细胞嗜性或组织嗜性的方法，其包括使用如本文所述的禽冠状病毒刺突蛋白或其片段。
[0231]
进一步地，本发明提供了用于扩展禽冠状病毒的细胞嗜性或组织嗜性的方法，其
包括使用如本文所述的禽冠状病毒刺突蛋白或其片段。
[0232]
进一步地，本发明提供了用于生产或制造具有扩展的细胞嗜性或组织嗜性的禽冠状病毒的方法，其包括使用如本文所述的禽冠状病毒刺突蛋白或其片段。
[0233]
进一步地，本发明提供了用于在细胞培养或组织培养中培养禽冠状病毒的方法，其包括使用如本文所述的禽冠状病毒刺突蛋白或其片段。
[0234]
进一步地，本发明提供了用于修饰禽冠状病毒的方法，其包括修饰所述禽冠状病毒的刺突蛋白中的氨基酸位置267。
[0235]
进一步地，本发明提供了用于使禽冠状病毒刺突蛋白中的氨基酸位置267突变的方法，其包括：
[0236]
a)提供禽冠状病毒刺突核苷酸或蛋白质序列，
[0237]
b)通过与参考序列比对来鉴定刺突蛋白中的位置267，
[0238]
c)使步骤b)的刺突蛋白的位置267突变成半胱氨酸，
[0239]
d)获得步骤c)的突变的刺突蛋白。
[0240]
进一步地，本发明提供了用于使禽冠状病毒的禽冠状病毒刺突蛋白中的氨基酸位置267突变的方法，其包括：
[0241]
a)提供禽冠状病毒，
[0242]
b)通过与参考序列比对来鉴定刺突蛋白中的位置267,
[0243]
c)使步骤b)的刺突蛋白的位置267突变成半胱氨酸，
[0244]
d)获得步骤c)的突变的禽冠状病毒。
[0245]
术语“获得”包含所述刺突蛋白或其片段的收获、分离、纯化和/或配制(例如精修(finishing)、灭活和/或共混)。术语“收获”指从转染或感染的细胞或细胞系中，收集或回收具有修饰的刺突蛋白的所述禽冠状病毒或ibv。可以使用本领域已知的任何常规方法，例如任何分离方法。本领域众所周知的方法包括离心或过滤，例如使用具有特定孔径的半透性膜。术语“分离”包括具有修饰的刺突蛋白的所述禽冠状病毒或ibv的分离步骤。用于从转染或感染的细胞或细胞系中分离的方法是本领域技术人员已知的。这些方法包括物理方法和/或化学方法，包括但不限于冻融循环、用超声处理等等。用于来自分离株的具有修饰的刺突蛋白的所述禽冠状病毒或ibv的“纯化”方法是本领域技术人员已知的，例如通过protein purification methods-a practical approach(e.l.v.harris和s.angel编辑，irl press at oxford university press)中描述的那些方法。这些方法包括但不限于通过离心和/或过滤分开、沉淀、尺寸排阻(凝胶过滤)层析、亲和层析、金属螯合层析、离子交换层析、共价层析、疏水作用层析等等。载体可以以纯化的纯形式获得，或者不含或基本上不含其它细胞材料或培养基等。在所述分离和/或纯化后，抗原显示出至少80％，优选80％-90％，更优选90％-97％，最优选多于97％的纯度，直至没有任何污染的绝对纯形式。
[0246]
根据一个进一步方面，如本文使用的，“获得”还可以包括作为最终配制过程的部分的进一步精修步骤，如缓冲液的添加、灭活、中和步骤等等。
[0247]
在根据本发明的方法的另一个特定方面，刺突蛋白或其片段在氨基酸位置267处具有半胱氨酸。
[0248]
在根据本发明的方法的另一个特定方面，通过突变引入在氨基酸位置267处的半胱氨酸。
[0249]
在根据本发明的方法的另一个特定方面，突变是氨基酸取代、缺失或插入。
[0250]
在根据本发明的方法的另一个特定方面，在氨基酸位置267处的苯丙氨酸或亮氨酸被修饰或突变成半胱氨酸。
[0251]
在根据本发明的方法的另一个特定方面，禽冠状病毒是如本文所述的ibv。
[0252]
因此，本发明提供了用于改变ibv的细胞嗜性或组织嗜性的方法，其包括使用如本文所述的禽冠状病毒刺突蛋白或其片段。
[0253]
因此，本发明提供了用于扩展ibv的细胞嗜性或组织嗜性的方法，其包括使用如本文所述的ibv刺突蛋白或其片段。
[0254]
因此，本发明提供了用于生产或制造具有扩展的细胞嗜性或组织嗜性的ibv的方法，其包括使用如本文所述的ibv刺突蛋白或其片段。
[0255]
因此，本发明提供了用于在细胞培养或组织培养中培养ibv的方法，其包括使用如本文所述的ibv刺突蛋白或其片段。
[0256]
因此，本发明提供了用于修饰ibv的方法，其包括修饰所述ibv的刺突蛋白中的氨基酸位置267。
[0257]
因此，本发明提供了用于使ibv刺突蛋白中的氨基酸位置267突变的方法，其包括：
[0258]
a)提供ibv刺突核苷酸或蛋白质序列，
[0259]
b)通过与参考序列比对来鉴定刺突蛋白中的位置267，
[0260]
c)使步骤b)的刺突蛋白的位置267突变成半胱氨酸，
[0261]
d)获得步骤c)的突变的刺突蛋白。
[0262]
因此，本发明提供了用于使ibv的ibv刺突蛋白中的氨基酸位置267突变的方法，其包括：
[0263]
a)提供ibv，
[0264]
b)通过与参考序列比对来鉴定刺突蛋白中的位置267，
[0265]
c)使步骤b)的刺突蛋白的位置267突变成半胱氨酸，
[0266]
d)获得步骤c)的突变的ibv。
[0267]
在根据本发明的方法的另一个特定方面，冠状病毒刺突蛋白是如本文所述的ibv(传染性支气管炎病毒)刺突蛋白。
[0268]
在根据本发明的方法的另一个特定方面，在氨基酸位置267处的半胱氨酸或在氨基酸位置267处向半胱氨酸的所述突变，导致扩展的细胞嗜性或组织嗜性。
[0269]
在根据本发明的方法的另一个特定方面，禽冠状病毒或ibv在如本文所述的细胞系或细胞中感染和/或复制。
[0270]
在根据本发明的方法的另一个特定方面，如本文所述的完成氨基酸位置267的编号。
[0271]
试剂盒
[0272]
需要时，组合物可以存在于包装或分配器装置中，其可以含有一种或多种单位剂型，所述单位剂型含有活性成分。包装可以例如包含金属或塑料箔，例如泡罩包装。包装或分配器装置可以附有优选用于施用于对象，尤其是家禽的施用说明书。与此类容器相关联的可以是以由管理药物或生物制品的制造、使用或销售的政府机构规定形式的通知，所述通知反映了通过制造、使用或销售机构批准用于施用。
[0273]
本发明提供了试剂盒，其包含如本文所述的病毒颗粒、禽冠状病毒、ibv、免疫原性组合物或疫苗。
[0274]
在根据本发明的试剂盒的一个特定方面，试剂盒进一步包含用于治疗和/或预防禽类疾病的说明书、或者用于治疗和/或预防家禽疾病的说明书、或者用于治疗和/或预防ib的说明书。
[0275]
在根据本发明的试剂盒的一个特定方面，试剂盒进一步包括能够向所述动物施用疫苗的分配器。
[0276]
治疗方法
[0277]
进一步地，本发明提供了用于使对象免疫的方法，其包括向此类对象施用如本文所述的免疫原性组合物。
[0278]
术语“免疫”涉及通过将免疫原性组合物施用于待免疫的对象，从而引起针对此类免疫原性组合物中包括的抗原的免疫应答的主动免疫。
[0279]
优选地，免疫导致鸟群中的特定禽冠状病毒或ibv感染的发病率降低、或者由特定禽冠状病毒或ibv感染引起或与特定禽冠状病毒或ibv感染相关的临床体征的严重性减轻。
[0280]
进一步地，用如随同提供的免疫原性组合物对有需要的对象进行免疫，导致预防对象受到禽冠状病毒或ibv感染的感染。甚至更优选地，免疫导致针对ibv感染的有效、持久的免疫应答。应理解，所述时间段将持续超过1个月，优选超过2个月，优选超过3个月，更优选超过4个月，更优选超过5个月，更优选超过6个月。应理解，免疫可能并非在免疫的所有对象中都是有效的。然而，该术语要求鸟群中的显著比例的对象得到有效免疫。
[0281]
优选地，在此上下文中设想了一群对象，其通常(即，如果没有免疫)将发展通常由禽冠状病毒或ibv感染引起或者与禽冠状病毒或ibv感染相关的临床体征。通过本领域技术人员可以毫不费力地确定所述群的对象是否得到有效免疫。优选地，如果与未免疫或用在本发明之前可用的免疫原性组合物免疫，但随后被特定禽冠状病毒或ibv感染的对象相比，在给定群的至少33％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、还更优选至少95％且最优选100％的对象中的临床体征，在发病率或严重性方面降低了至少10％，更优选至少20％，还更优选至少30％，甚至更优选至少40％，还更优选至少50％，甚至更优选至少60％，还更优选至少70％，甚至更优选至少80％，还更优选至少90％，还更优选至少95％，且最优选100％，则免疫应该是有效的。
[0282]
进一步地，本发明提供了治疗或预防有需要的对象中由ibv引起的临床体征的方法，该方法包括向对象施用治疗有效量的如本文所述的免疫原性组合物或疫苗。
[0283]
如实施例中所示，如本文提供的免疫原性组合物或疫苗已证明有效治疗或预防对象中由ibv引起的临床体征。因此，实验数据显示了，在氨基酸位置267处的氨基酸修饰成半胱氨酸对疫苗的功效没有任何影响。
[0284]
术语“治疗或预防”指鸟群中的特定ibv感染的发病率降低，或者由特定ibv感染引起或与特定ibv感染相关的临床体征的严重性减轻。因此，术语“治疗或预防”还指与其对象尚未接受此类免疫原性组合物的一组对象相比，在其对象已接受有效量的如本文提供的免疫原性组合物的一组对象中，鸟群中变得由特定ibv感染的对象数目减少(＝特定ibv感染的发病率降低)、或者通常与ibv感染相关或由ibv感染引起的临床体征的严重性减轻、或者在由特定ibv感染后的病毒脱落减少、或者预防或降低在由特定ibv感染后的蛋鸡中的产蛋
下降。
[0285]“治疗或预防”一般涉及将有效量的本发明的免疫原性组合物施用于有需要或可以受益于此类治疗/预防的对象或一群对象。术语“治疗”指一旦对象或群中的至少一些对象已经由此类ibv感染，并且其中此类对象已经显示了由此类ibv感染引起或与此类ibv感染相关的一些临床体征，就施用有效量的免疫原性组合物。术语“预防”指在此类对象由ibv的任何感染之前，或者至少在此类对象或一组对象中的对象无一显示了由此类ibv感染引起或与此类ibv感染相关的任何临床体征的情况下的对象施用。术语“预防(prophylaxis)”和“预防(preventing)”在本技术中可互换使用。
[0286]
如本文使用的，术语“有效量”意指但不限于在对象中引发或能够引发免疫应答的抗原量。此类有效量能够降低鸟群中的特定ibv感染的发病率，或减轻特定ibv感染的临床体征的严重性。
[0287]
优选地，与未治疗或用在本发明之前可用的免疫原性组合物治疗，但随后被特定ibv感染的对象相比，临床体征在发病率或严重性方面降低了至少10％，更优选至少20％，还更优选至少30％，甚至更优选至少40％，还更优选至少50％，甚至更优选至少60％，还更优选至少70％，甚至更优选至少80％，还更优选至少90％，还更优选至少95％，且最优选100％。
[0288]
如本文使用的，术语“临床体征”指来自ibv的对象感染的体征。感染的临床体征取决于所选择的病原体。此类临床体征的例子包括但不限于呼吸窘迫、肾炎、输卵管炎、产蛋异常、羽毛竖起、抑郁、生长速率减慢和食欲减退。呼吸窘迫的体征包括呼吸体征，包括喘气、咳嗽、打喷嚏、气管罗音、鼻和眼分泌物、气管损害和气管中的纤毛停滞。肾炎的体征包括肾脏损害和水样腹泻。异常产蛋的体征包括产蛋下降、较小尺寸的蛋、劣质蛋壳、蛋内部品质降低、具有稀蛋白的蛋和输卵管中的纤毛停滞。然而，临床体征还包括但不限于可直接从活动物中观察到的临床体征。可直接从活动物中观察到的临床体征的例子包括鼻和眼分泌物、咳嗽、喘气、打喷嚏、气管啰音、羽毛竖起、结膜炎、重量减轻、生长速率减慢、食欲减退、脱水、水样腹泻、跛行、嗜睡、消瘦和羸弱等等。
[0289]
优选地，与未治疗或用在本发明之前可用的免疫原性组合物治疗，但随后被特定ibv感染的对象相比，经治疗的对象中的在发病率或严重性方面降低的临床体征指纤毛停滞的减少、罗音减少、产蛋下降的减少、肾脏损害减轻、水样腹泻减轻、体重减轻的减少、病毒载量更少、病毒脱落减少或其组合。
[0290]
如本文使用的，术语“需要”或“有需要”意指施用/治疗与健康或临床体征的加强或改善、或者对于对象的健康的任何其它积极的医学作用相关，所述对象接受依照本发明的免疫原性组合物。
[0291]
进一步地，本发明提供了与同一物种的未免疫的对照组的对象相比，减少有需要的对象中的纤毛停滞的方法，该方法包括向对象施用治疗有效量的如本文所述的免疫原性组合物或疫苗。
[0292]
如实施例中所示，如本文提供的免疫原性组合物或疫苗已证明有效减少纤毛停滞。
[0293]
术语“纤毛停滞”指气管中的纤毛运动减少。因此，纤毛停滞可以通过就纤毛的运动检查气管环的内衬进行确定。如何确定气管中的纤毛运动在本领域技术人员的一般知识
内。
[0294]
优选地，与同一物种的未免疫的对照组的对象相比，从由ibv攻击或感染后的第10天开始，更优选从攻击或感染后的第5天开始，更优选从攻击或感染后的第4天开始，更优选从攻击或感染后的第3天开始，且最优选从攻击或感染后的第1天或第2天开始，纤毛的运动并不减少。
[0295]
术语“纤毛停滞的减少”意指与同一物种的未免疫的对照组的对象相比，纤毛停滞减少了至少10％，优选至少20％，更优选至少30％，甚至更优选至少40％，甚至更优选至少50％，甚至更优选至少60％，甚至更优选至少70％，甚至更优选至少80％，甚至更优选至少90％，甚至更优选至少95％，且最优选100％。如何测量纤毛停滞的减少在本领域技术人员的一般知识内。
[0296]
进一步地，本发明提供了如本文所述的免疫原性组合物或疫苗，其用于使对象免疫的方法中，该方法包括向对象施用治疗有效量的所述免疫原性组合物或疫苗。
[0297]
进一步地，本发明提供了如本文所述的免疫原性组合物或疫苗，其用于治疗或预防有需要的对象中由ibv引起的临床体征的方法中，该方法包括向对象施用治疗有效量的所述免疫原性组合物或疫苗。
[0298]
进一步地，本发明提供了如本文所述的免疫原性组合物或疫苗，其用于与同一物种的未免疫的对照组的对象相比，减少有需要的对象中的纤毛停滞的方法中，该方法包括向对象施用治疗有效量的所述免疫原性组合物或疫苗。
[0299]
在根据本发明的方法或用途的一个特定方面，所述对象是禽类。
[0300]
术语“禽类”是本领域技术人员众所周知的。术语“禽类”包括包含家禽的所有鸟类。
[0301]
在根据本发明的方法或用途的一个特定方面，所述对象是家禽。
[0302]
术语“家禽”是本领域技术人员众所周知的。术语“家禽”包括鸡、火鸡、鹌鹑、雉鸡、珍珠鸡、鹅和鸭。进一步地，术语“鸡”包括肉鸡、蛋鸡和用于两者的繁殖群体，也被称为种鸡。
[0303]
在根据本发明的方法或用途的一个特定方面，所述对象选自鸡、火鸡、鹌鹑或雉鸡。
[0304]
在根据本发明的方法或用途的一个特定方面，所述对象是鸡。
[0305]
在根据本发明的方法或用途的一个特定方面，免疫原性组合物或疫苗施用一次。
[0306]
应理解，单剂量仅施用一次。如实施例中所示，在向有需要的对象施用单剂量后，如本文提供的免疫原性组合物已证明是有效的。
[0307]
剂量体积/家禽取决于疫苗接种的途径和家禽的年龄。
[0308]
通常，滴眼剂疫苗在任何年龄以1至100μl/剂量的体积施用。优选地，用于滴眼剂疫苗的单剂量具有约5μl至70μl，并且更优选约20μl至50μl的总体积，其中单个20μl、25μl、30μl、35μl、40μl、45μl或50μl剂量是优选的。最优选地，用于滴眼剂疫苗的单剂量具有约30μl至50μl的总体积，其中单个30μl、35μl、40μl、45μl或50μl剂量是优选的。
[0309]
对于日龄家禽，喷雾疫苗可以含有以25至1000μl的体积的剂量。优选地，用于喷雾疫苗的单剂量具有约50μl至5000μl，更优选约75μl至2000μl，更优选约100μl至1000μl，甚至更优选约200μl至900μl，甚至更优选约300μl至800μl，且甚至更优选约400μl至700μl的
总体积，其中单个400μl、425μl、450μl、475μl、500μl、525μl、550μl、575μl、600μl、625μl、650μl、675μl或700μl剂量是优选的。最优选地，单剂量具有400μl、450μl、500μl、550μl、600μl、650μl或700μl的总体积。
[0310]
用于卵内疫苗接种的疫苗可以含有以50至100μl，优选50μl的体积的剂量。优选地，用于卵内疫苗的单剂量具有约10μl至250μl，更优选约15μl至200μl，甚至更优选约20μl至150μl，甚至更优选约30μl至100μl，甚至更优选约30μl至75μl的总体积，并且其中单个30μl、35μl、40μl、45μl、50μl、55μl、60μl、65μl、70μl或75μl剂量是优选的。最优选地，单剂量具有40μl、45μl、50μl、55μl或60μl的总体积。
[0311]
用于肌内或皮下疫苗接种的疫苗或者饮用水疫苗的一个剂量可以含有以30μl至1000μl的体积的剂量。优选地，单剂量具有约30μl至1000μl，更优选约50μl至500μl，更优选约75μl至250μl，且甚至更优选约100μl至200μl的总体积，其中单个100μl、110μl、120μl、125μl、130μl、135μl、140μl、145μl、150μl、160μl、170μl、175μl、180μl、190μl、155μl或200μl剂量是最优选的。
[0312]
在根据本发明的方法或用途的一个特定方面，免疫原性组合物或疫苗以两个或更多个剂量施用。
[0313]
然而，免疫原性组合物可以以两个或更多个剂量施用，其中第一剂量在第二(加强)剂量施用之前进行施用。
[0314]
在两次施用方案的一个优选方面，免疫原性组合物的第一剂量和第二剂量以相同的量施用。优选地，每个剂量是上文指定的优选量。除第一剂量和第二剂量方案之外，一个替代实施方案包含进一步的后续剂量。例如，在这些方面可以施用第三剂量、第四剂量或第五剂量。优选地，后续的第三剂量、第四剂量和第五剂量方案以与第一剂量相同的量施用，其中剂量之间的时帧与上文提到的第一剂量和第二剂量之间的时间安排一致。
[0315]
优选地，疫苗的第一次施用通过如下所述的方法在前三周龄内，更优选在前一周龄内，且最优选在一日龄时进行。第二次施用可以在前20周龄内，优选在16-18周龄内，更优选在6-12周龄之间进行。示例性地，初始(第一次)疫苗接种在1-10日龄时进行，而第二次疫苗接种(加强)在6-12或16-18周龄时用活疫苗或灭活疫苗进行。更优选地，初始(第一次)疫苗接种在一日龄时进行，而第二次疫苗接种(加强)在6-12或16-18周龄时用活疫苗或灭活疫苗进行。
[0316]
在使用卵内疫苗接种的情况下，优选地，当胚胎为15至19日龄，优选在17、18或19日龄时，最优选在18日龄时，进行第一次施用。第二次施用可以在前三周龄内，优选在前10日龄内进行。
[0317]
在根据本发明的方法或用途的一个特定方面，所述免疫原性组合物或疫苗是皮下、肌内、经口、卵内、经由喷雾、经由饮用水或通过滴眼剂施用的。
[0318]
免疫原性组合物优选局部或全身施用。常规使用的合适施用途径是经口或肠胃外施用，例如鼻内、静脉内、真皮内、经皮、肌内、腹膜内、皮下，以及吸入、卵内、经由喷雾、经由饮用水或通过滴眼剂。然而，取决于化合物的性质和作用模式，免疫原性组合物也可以通过其它途径进行施用。例如，此类其它途径包括皮内、静脉内、血管内、动脉内、腹膜内、鞘内、气管内、皮内、心内、肺叶内(intralobally)、叶内、髓内、肺内、直肠内和阴道内。然而，最优选地，免疫原性组合物是皮下、肌内、经口、卵内、经由喷雾、经由饮用水或通过滴眼剂施用
的。
[0319]
ibv活疫苗优选个别地通过滴眼剂、鼻内、肌内或皮下进行施用。
[0320]
更优选地，使用大量施加方法，包括饮用水和气雾剂喷雾疫苗接种。还优选的是作为胚胎疫苗(所谓的卵内疫苗)的疫苗的使用，如下文进一步描述的。
[0321]
例如，肉鸡可以在一日龄或1-3周龄时进行疫苗接种，特别是对于具有高水平的mda的肉鸡。产蛋群体或繁殖群体可以最初在1-10日龄时进行疫苗接种，并且在7-12或16-18周龄时用疫苗进行加强。
[0322]
卵内施用
[0323]
如上文概述的，本发明还提供了ibv疫苗，其可以经由卵内途径安全施用，并且同时能够诱导保护性免疫应答。卵内施用是本领域技术人员众所周知的，并且本领域技术人员可以毫不费力地进行卵内施用。疫苗的卵内施用涉及将疫苗施用于包含在蛋中时的禽胚胎(关于卵内疫苗接种的综述，参见：ricks等人，advances in vet.med.495-515，1999)。如本领域所述的(sharma；am.j.vet.res.45 1619-1623,1984)，疫苗可以施用于任何合适的卵区室(例如尿囊液、卵黄囊、羊膜、气室或胚胎内)。优选地，疫苗在壳(气室)膜和尿囊绒膜下方施用。
[0324]
优选地，在胚胎发育的后期阶段过程中，一般在孵化期的最后四分之一过程中，优选在孵出前3-4天，将疫苗注射到含胚卵内。优选地，当胚胎为15至19日龄，优选在17、18或19日龄时，最优选在18日龄时，进行施用。随后，将接种疫苗的含胚卵转移到孵化器用于孵出。可以使用如现有技术中描述的机器人注射过程，使卵内施用的过程自动化。
[0325]
通常，用于家禽孵出后疫苗接种的常规疫苗不能用于卵内疫苗接种，因为晚期胚胎对由检查的大多数疫苗病毒的感染是高度敏感的。然而，国际专利申请wo 01/64244公开了ibv疫苗可以用于卵内施用，条件是它以极低的剂量施用。进一步地，wakenell等人1986(am.j.vet.res.，47 933-938)公开了在组织培养中传代ib疫苗病毒致使该病毒对于胚胎无致病性。
[0326]
在根据本发明的方法或用途的一个特定方面，所述免疫原性组合物或疫苗经由滴眼剂进行施用。
[0327]
通常，用于孵出后施用的活疫苗包含以101至108eid
50
(50％卵感染剂量)/剂量的浓度的减毒ibv，优选以102至105eid
50
/剂量的浓度，且更优选以102至104eid
50
/单位剂量的浓度，且甚至更优选以102至103eid
50
/剂量的浓度。
[0328]
用于卵内施用的活疫苗通常包含在50至100μl、优选50μl的体积中的102至107eid
50
/胚胎，优选102至103eid
50
/胚胎的减毒ibv的量。
[0329]
优选地，本发明的免疫原性组合物包含其量为约1至约10log
10 eid(卵感染剂量)
50
/ml/剂量的本发明的ibv，优选约2至约8log
10 eid
50
/剂量，优选以约2至约7log
10
eid
50
/剂量的量，更优选以约2至约6log
10 eid
50
/剂量的量，甚至更优选以约2至约5log
10
eid
50
/剂量的量，甚至更优选以约2至约4log
10 eid
50
/剂量的量，最优选以约2至约3log
10
eid
50
/剂量的量。更优选地，本发明的免疫原性组合物包含其量为约1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5或log
10 eid
50
/剂量的本发明的ibv。
[0330]
在根据本发明的方法或用途的一个特定方面，免疫原性组合物或疫苗包含1至10log
10 eid
50
/剂量的ibv。
[0331]
在根据本发明的方法或用途的一个特定方面，免疫原性组合物或疫苗包含2至5log
10 eid
50
/剂量的ibv。
[0332]
在根据本发明的方法或用途的一个特定方面，免疫原性组合物或疫苗包含2至4log
10 eid
50
/剂量的ibv。
[0333]
在根据本发明的方法或用途的一个特定方面，将免疫原性组合物或疫苗施用于在前一周龄内、在前三日龄内、在前两日龄内或在前一日龄内的对象。
[0334]
优选地，待免疫的对象是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或21日龄。更优选地，所述待免疫的对象是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14日龄。最优选地，所述待免疫的对象是1、2、3、4、5、6或7日龄。
[0335]
然而，必须理解，在几日龄的对象的接种疫苗后，家禽的免疫系统的确需要几天来建立针对ibv感染的免疫。因此，优选地，对象在年龄的前24小时内进行免疫。
[0336]
在根据本发明的方法或用途的一个特定方面，将免疫原性组合物或疫苗施用于在前一日龄内的对象。如实施例中所示，当施用于1日龄家禽时，如本文提供的免疫原性组合物已证明是安全且有效的。
[0337]
在根据本发明的方法或用途的一个特定方面，所述方法导致选自以下的功效参数的改善：与同一物种的未治疗的对照组的对象相比，纤毛停滞的预防或减少、罗音的预防或减少、产蛋下降的预防或减少、肾脏损害的预防或减少、水样腹泻的预防或减少、体重减轻的预防或减少、更低的病毒载量、减少的病毒脱落或其组合。
[0338]
术语“治疗和/或预防”已在其它地方进行定义，其中术语“预防(prophylaxis)”和“预防(preventing)”或“预防(prevention)”在本技术中可互换使用。进一步地，术语“脱落”也已在其它地方进行定义。
[0339]
术语“减少(reducing)”、“减少(reduced)”、“减少(reduction)”或“降低”意指与同一物种的未免疫的对照组的对象相比，功效参数(纤毛停滞、罗音、产蛋下降、肾脏损害、水样腹泻、体重减轻、病毒载量、病毒脱落)减少了至少10％，优选至少20％，更优选至少30％，甚至更优选至少40％，甚至更优选至少50％，甚至更优选至少60％，甚至更优选至少70％，甚至更优选至少80％，甚至更优选至少90％，甚至更优选至少95％，且最优选100％。如何测量功效参数的改善在本领域技术人员的一般知识内。
[0340]
术语“病毒载量”或“病毒滴度”是活动性病毒感染的严重性的量度，并且可以通过本领域技术人员已知的方法进行确定。术语“病毒滴度”是感染单位/体积的病毒制剂的量度。病毒滴度是生物学程序中的终点，并且定义为平行进行的一定比例的测试在其下显示效应的稀释度(reed和muench，1938)。确定可以基于例如通过与病毒蛋白结合的抗体的病毒蛋白检测，以及通过扩增方法例如rt-pcr的病毒rna检测的进一步检测或替代检测。通过核酸扩增方法监测血浆中的病毒粒子相关病毒rna是广泛使用的参数，以评价逆转录病毒疾病的状态和进展，并且评估预防干预和治疗干预的有效性。示例性地，病毒载量或病毒滴度可以通过估计所涉及的体液中的病毒活量，例如每毫升血浆的rna拷贝数进行计算。
[0341]
术语“纤毛停滞”是本领域技术人员众所周知的。气管的表面覆盖有特化的上皮细胞，其内衬有称为纤毛的众多、能动的毛发状结构。术语“纤毛停滞”包括纤毛的减少或丧失和/或纤毛活性的丧失或部分丧失。通过本领域技术人员可以毫不费力地确定纤毛停滞。
[0342]
术语“罗音”是本领域技术人员众所周知的。然而，术语“罗音”包括气管罗音，并且
指从支气管发出的声音。通过本领域技术人员可以毫不费力地确定罗音。
[0343]
术语“产蛋下降”是本领域技术人员众所周知的。术语“产蛋下降”包括降低的蛋生产。
[0344]
在根据本发明的方法或用途的一个特定方面，与同一物种的未治疗的对照组的对象相比，治疗或预防导致纤毛停滞的预防或减少。
[0345]
在根据本发明的方法或用途的一个特定方面，与同一物种的未治疗的对照组的对象相比，治疗或预防导致肾脏损害的预防或减少。
[0346]
在根据本发明的方法或用途的一个特定方面，与同一物种的未治疗的对照组的对象相比，治疗或预防导致产蛋下降的预防或减少。
[0347]
本发明进一步提供了如本文所述的病毒颗粒、禽冠状病毒、ibv、免疫原性组合物或疫苗，其用于治疗用途。
[0348]
本发明进一步提供了如本文所述的病毒颗粒、禽冠状病毒、ibv、免疫原性组合物或疫苗，其用作免疫原或疫苗。
[0349]
本发明进一步提供了如本文所述的病毒颗粒、禽冠状病毒、ibv、免疫原性组合物或疫苗，其用作药物。
[0350]
本发明进一步提供了如本文所述的病毒颗粒、禽冠状病毒、ibv、免疫原性组合物或疫苗用于制造药物的用途。
[0351]
本发明进一步提供了如本文所述的病毒颗粒、禽冠状病毒、ibv、免疫原性组合物或疫苗用于治疗和/或预防对象中的ibv感染的用途。
[0352]
技术方案
[0353]
本文还描述了下述技术方案：
[0354]
1.一种禽冠状病毒刺突蛋白或其片段，其中所述s1亚基的至少一部分来自具有有限的细胞嗜性或组织嗜性的禽冠状病毒，并且其中在氨基酸位置267处为半胱氨酸。
[0355]
2.一种重组禽冠状病毒刺突蛋白或其片段，其包含在氨基酸位置267处向半胱氨酸的突变。
[0356]
3.一种ibv刺突蛋白或其片段，其中所述s1亚基的至少一部分来自具有有限的细胞嗜性或组织嗜性的ibv，并且其中在氨基酸位置267处为半胱氨酸。
[0357]
4.一种重组ibv刺突蛋白或其片段，其包含在氨基酸位置267处向半胱氨酸的突变。
[0358]
突变267
[0359]
5.技术方案1或3的禽冠状病毒或ibv刺突蛋白或其片段，其中通过突变引入在氨基酸位置267处的半胱氨酸。
[0360]
6.技术方案2、4或5的禽冠状病毒或ibv刺突蛋白或其片段，其中所述突变是氨基酸取代、缺失或插入。
[0361]
7.技术方案2和4至6中任一项的禽冠状病毒或ibv刺突蛋白或其片段，其中在氨基酸位置267处的疏水性氨基酸突变成半胱氨酸；或在氨基酸位置267处的苯丙氨酸或亮氨酸突变成半胱氨酸。
[0362]
扩展的细胞嗜性或组织嗜性
[0363]
8.技术方案1至7中任一项的禽冠状病毒或ibv刺突蛋白或其片段，其中在氨基酸
位置267处的半胱氨酸或在氨基酸位置267处向半胱氨酸的所述突变，导致禽冠状病毒或ibv的扩展的细胞嗜性或组织嗜性。
[0364]
9.技术方案1至8中任一项的禽冠状病毒或ibv刺突蛋白或其片段，其中所述禽冠状病毒或ibv在选自以下列表的至少一种细胞系或细胞中感染和/或复制：来自肺或肝脏的原代鸡胚细胞或者原代鸡成纤维细胞、鸡胚成纤维细胞系、鸭胚干细胞系、人胚肾细胞系、幼仓鼠肾细胞系、非洲绿猴肾细胞系、兔肾细胞系、犬肾细胞系、鸡肝细胞系、牛肾细胞系、猪肾细胞系和昆虫细胞系。
[0365]
10.技术方案1至9中任一项的禽冠状病毒或ibv刺突蛋白或其片段，其中所述禽冠状病毒或ibv在选自以下列表的至少一种细胞系中感染和/或复制：df-1(douglas foster)、eb66(鸭胚干细胞系)、pbs-12、pbs-12sf(无血清pbs-12)、bhk21(幼仓鼠肾)、hek 293t(人胚肾)、vero(verda reno)、ma104、rk13(兔肾)、lmh(leghorn雄性肝癌)、mdck(马丁达比犬肾)、mdbk(马丁达比牛肾)、pk15(猪肾)、pk2a(猪肾)、sf9、sf21和sf+(草地贪夜蛾)。
[0366]
11.技术方案1至10中任一项的禽冠状病毒或ibv刺突蛋白或其片段，其中所述禽冠状病毒或ibv在选自以下列表的至少一种细胞系中感染和/或复制：df-1、eb66、pbs-12、pbs-12sf、bhk、hek 293t、vero、ma104和rk13。
[0367]
氨基酸位置267的编号
[0368]
12.技术方案1至11中任一项的禽冠状病毒或ibv刺突蛋白或其片段，其中所述氨基酸位置267的编号指ibv h52、ibv h120或m41的刺突蛋白中的氨基酸位置267。
[0369]
13.技术方案1至12中任一项的禽冠状病毒或ibv刺突蛋白或其片段，其中所述氨基酸位置267的编号指ibv h52的刺突蛋白中的氨基酸位置267。
[0370]
14.技术方案1至12中任一项的禽冠状病毒或ibv刺突蛋白或其片段，其中所述氨基酸位置267的编号指如seq id no:1中示例性地给出的刺突蛋白中的氨基酸位置267。
[0371]
15.技术方案1至12中任一项的禽冠状病毒或ibv刺突蛋白或其片段，其中所述seq id no:1的氨基酸序列用于确定刺突蛋白中的位置编号。
[0372]
16.技术方案1至12中任一项的禽冠状病毒或ibv刺突蛋白或其片段，其中为了确定刺突蛋白中的氨基位置267，将所述氨基酸序列与seq id no:1的氨基酸序列进行比对。
[0373]
17.技术方案1至16中任一项的禽冠状病毒或ibv刺突蛋白或其片段，其中所述氨基酸位置267在刺突蛋白的s1亚基内。
[0374]
18.技术方案1至17中任一项的禽冠状病毒或ibv刺突蛋白或其片段，其中所述刺突蛋白具有选自以下的下述氨基酸中的一种或多种：
[0375]-264是天冬酰胺，和/或
[0376]-265是苏氨酸，和/或
[0377]-269是亮氨酸，和/或
[0378]-271是天冬酰胺，和/或
[0379]-272是苯丙氨酸。
[0380]
刺突
[0381]
19.技术方案1和2以及5至18中任一项的禽冠状病毒刺突蛋白或其片段，其中所述禽冠状病毒刺突蛋白或其片段选自：传染性支气管炎病毒(ibv)；珍珠鸡冠状病毒(gfcov)和火鸡冠状病毒(tcov；火鸡肠炎病毒和蓝冠病病毒)。
[0382]
20.技术方案1和2以及5至19中任一项的禽冠状病毒刺突蛋白或其片段，其中所述禽冠状病毒是ibv(传染性支气管炎病毒)。
[0383]
21.技术方案3至20中任一项的ibv刺突蛋白或其片段，其中所述刺突蛋白来自具有选自以下列表的基因型或血清型或毒株的ibv：arkansas(例如arkansas 99)、brazil(例如br-1、br-2、23/2013、ibv/brasil/351/1984)、california(例如california 1734/04、california 99)、connecticut、delaware(例如delaware 98)、dutch(例如d207、d212、d274、d3128、d3896、d8880、d1466)、florida、georgia(例如georgia ga-07、ga-08、ga-12、ga-13)、gray、holte、iowa(例如iowa 97和iowa 69)、italy 02、jmk、ldt3、maine(例如maine 209)、massachusetts(例如m41、h52、h120；排除beaudette)、pennsylvania(例如pennsylvania 1220/98、pennsylvania wolg/98)、pl84084、qu(例如qu-mv)、qx(例如gb341/96)、q1、se 17、变体2(例如is/1494/06、ibv/ck/eg/cu/4/2014、gammacov/ck/poland/g052/2016)和4/91(793b、cr88)。
[0384]
22.技术方案3至21中任一项的ibv刺突蛋白或其片段，其中所述刺突蛋白并非来自beaudette毒株。
[0385]
23.技术方案3至22中任一项的ibv刺突蛋白或其片段，其中所述刺突蛋白或其片段来自选自以下的基因型或血清型或毒株列表的ibv：massachusetts(并非beaudette)、4/91、qx、q1、italy 02、arkansas、conneticut、georgia、ldt3、pl84084、变体2和brazil。
[0386]
24.技术方案3至23中任一项的ibv刺突蛋白或其片段，其中所述刺突蛋白或其片段来自选自以下的基因型或血清型列表的ibv：massachusetts(并非beaudette)、4/91、qx、q1、arkansas、变体2和brazil。
[0387]
25.技术方案3至24中任一项的ibv刺突蛋白或其片段，其中所述刺突蛋白或其片段来自选自以下的基因型或血清型列表的ibv：massachusetts(并非beaudette)和4/91。
[0388]
26.技术方案24的ibv刺突蛋白或其片段，其中所述massachusetts毒株选自以下列表：h120、h52、spain/98/308、ibma5-1、sd/97/01、spain/96/334和m41-m21883。
[0389]
27.技术方案24的ibv刺突蛋白或其片段，其中所述4/91毒株选自以下列表：spain/98/328、spain/92/35、ir-3654-vm、fr-cr88061-88、fr-85131-85、uk-1233-95、uk/3/91、spain/00/336、uk/7/91、致病性4/91、减毒的4/91和ib4-91。
[0390]
28.技术方案24的ibv刺突蛋白或其片段，其中所述qx毒株选自以下列表：fr-l1450t-05、fr-l1450l-05、nl-l1449t-04、nl-l1449k-04、ibv/ck/sp/170/09、ibv/ck/sp/79/08、ibv/ck/sp/248/09、hbn、ibvqx、lx4、bjq、ck/ch/lgd/03、sp2013-01470、sp2013-014171、sp2013-01478和gb341/96。
[0391]
29.技术方案24的ibv刺突蛋白或其片段，其中所述q1毒株选自以下列表：ck/ch/ldl/98i、ck/ch/lsd/08-10、j2、q1、ar08er22、ar08ba21、12.185、12.124、12.216和chile-295-10。
[0392]
30.技术方案24的ibv刺突蛋白或其片段，其中所述arkansas毒株选自以下列表：ark99、arkga、arkdpi、al/5364/00、arkdpi11、al/0803/01、al/7149/00、arkdpi101、al/1221/01、al/1793/01和al/4614/98。
[0393]
31.技术方案24的ibv刺突蛋白或其片段，其中所述italy 02毒株选自以下列表：spain/99/316、italy-02、uk-l633-04、it-497-02、spain/05/866、spain/04/221、spain/
00/337、spain/155/09和spain/03/08。
[0394]
32.技术方案24的ibv刺突蛋白或其片段，其中所述变体2毒株选自以下列表：is/1494/06、ibv/ck/eg/cu/4/2014、gammacov/ck/poland/g052/2016、eg/clevb-2/ibv/012、d1344/2/4/10_eg、tr8和ib var2-06。
[0395]
33.技术方案24的ibv刺突蛋白或其片段，其中所述brazil毒株选自以下列表：br-1、br-2、23/2013和ibv/brasil/351/1984。
[0396]
34.技术方案3至24中任一项的ibv刺突蛋白或其片段，其中所述刺突蛋白或其片段来自massachusetts(并非beaudette)、4/91或qx基因型或血清型的ibv。
[0397]
35.技术方案3至24中任一项的ibv刺突蛋白或其片段，其中所述ibv毒株是h52、h120、qx sp2013-01478或cr88。
[0398]
36.技术方案3至35中任一项的ibv刺突蛋白或其片段，其中所述ibv刺突蛋白或其片段由以下组成或包含以下：如seq id no:2、3、4、5、6、7、8、77中所示的氨基酸序列，或者与其具有至少80％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、99.95％、99.98％或99.99％序列同一性的序列。
[0399]
37.技术方案3至36中任一项的ibv刺突蛋白或其片段，其中所述ibv刺突蛋白或其片段选自以下的基因型列表：gi-2至27、gii-1、giii-1、giv-1、gv-1、gvi-1。
[0400]
38.技术方案3至37中任一项的ibv刺突蛋白或其片段，其中所述刺突蛋白或其片段并非来自gi-1基因型。
[0401]
39.技术方案1和5至38中任一项的禽冠状病毒刺突蛋白或其片段，其中来自具有有限的细胞嗜性或组织嗜性的禽冠状病毒的所述s1亚基的至少一部分选自：传染性支气管炎病毒(ibv)；珍珠鸡冠状病毒(gfcov)和火鸡冠状病毒(tcov；火鸡肠炎病毒和蓝冠病病毒)。
[0402]
40.技术方案1和5至38中任一项的禽冠状病毒刺突蛋白或其片段，其中来自具有有限的细胞嗜性或组织嗜性的禽冠状病毒的所述s1亚基的至少一部分来自ibv(传染性支气管炎病毒)。
[0403]
41.技术方案3和5至40中任一项的ibv刺突蛋白或其片段，其中所述s1亚基的至少一部分来自选自以下的基因型或血清型或毒株列表的ibv：arkansas(例如arkansas 99)、brazil(例如br-1、br-2、23/2013、ibv/brasil/351/1984)、california(例如california 1734/04、california 99)、connecticut、delaware(例如delaware 98)、dutch(例如d207、d212、d274、d3128、d3896、d8880、d1466)、florida、georgia(例如georgia ga-07、ga-08、ga-12、ga-13)、gray、holte、iowa(例如iowa 97和iowa 69)、italy 02、jmk、ldt3、maine(例如maine 209)、massachusetts(例如m41、h52、h120；排除beaudette)、pennsylvania(例如pennsylvania 1220/98、pennsylvania wolg/98)、pl84084、qu(例如qu-mv)、qx(例如gb341/96)、q1、se 17、变体2(例如is/1494/06、ibv/ck/eg/cu/4/2014、gammacov/ck/poland/g052/2016)和4/91(793b、cr88)。
[0404]
42.技术方案3和5至41中任一项的ibv刺突蛋白或其片段，其中所述s1亚基的至少一部分来自选自以下的基因型或血清型或毒株列表的ibv：massachusetts(并非beaudette)、4/91、qx、q1、italy 02、arkansas、conneticut、georgia、ldt3、pl84084、变体2和brazil。
[0405]
43.技术方案3和5至41中任一项的ibv刺突蛋白或其片段，其中所述s1亚基的至少一部分来自选自以下的基因型或血清型或毒株列表的ibv：massachusetts、4/91、qx、q1、arkansas、变体2和brazil。
[0406]
44.技术方案43的ibv刺突蛋白或其片段，其中所述massachusetts毒株选自以下列表：h120、h52、spain/98/308、ibma5-1、sd/97/01、spain/96/334和m41-m21883。
[0407]
45.技术方案43的ibv刺突蛋白或其片段，其中所述4/91毒株选自以下列表：spain/98/328、spain/92/35、ir-3654-vm、fr-cr88061-88、fr-85131-85、uk-1233-95、uk/3/91、spain/00/336、uk/7/91、致病性4/91、减毒的4/91和ib4-91。
[0408]
46.技术方案43的ibv刺突蛋白或其片段，其中所述qx毒株选自以下列表：fr-l1450t-05、fr-l1450l-05、nl-l1449t-04、nl-l1449k-04、ibv/ck/sp/170/09、ibv/ck/sp/79/08、ibv/ck/sp/248/09、hbn、ibvqx、lx4、bjq、ck/ch/lgd/03和gb341/96。
[0409]
47.技术方案43的ibv刺突蛋白或其片段，其中所述q1毒株选自以下列表：ck/ch/ldl/98i、ck/ch/lsd/08-10、j2、q1、ar08er22、ar08ba21和chile-295-10。
[0410]
48.技术方案43的ibv刺突蛋白或其片段，其中所述arkansas毒株选自以下列表：ark99、arkga、arkdpi、al/5364/00、arkdpi11、al/0803/01、al/7149/00、arkdpi101、al/1221/01、al/1793/01和al/4614/98。
[0411]
49.技术方案43的ibv刺突蛋白或其片段，其中所述变体2毒株选自以下列表：is/1494/06、ibv/ck/eg/cu/4/2014、gammacov/ck/poland/g052/2016、eg/clevb-2/ibv/012、d1344/2/4/10_eg、tr8和ib var2-06。
[0412]
50.技术方案43的ibv刺突蛋白或其片段，其中所述brazil毒株选自以下列表：br-1、br-2、23/2013和ibv/brasil/351/1984。
[0413]
51.技术方案3和5至43中任一项的ibv刺突蛋白或其片段，其中所述s1亚基的至少一部分来自选自以下的基因型或血清型列表的ibv：massachusetts(并非beaudette)、qx和4/91。
[0414]
52.技术方案3和5至43中任一项的ibv刺突蛋白或其片段，其中所述s1亚基的至少一部分来自ibv毒株h120、h52、qx sp2013-01478或cr88。
[0415]
53.技术方案1和3以及5至52中任一项的禽冠状病毒刺突蛋白或其片段，其中所述s1亚基的至少一部分是来自具有有限的细胞嗜性或组织嗜性的禽冠状病毒或ibv的s1亚基序列，或者与其具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列的至少1、5、10、15、20、25、50、100、150、200、250、300、350、400或500个邻接氨基酸。
[0416]
54.技术方案1和3以及5至52中任一项的禽冠状病毒或ibv刺突蛋白或其片段，其中所述s1亚基的至少一部分是来自技术方案36至50中任一项的禽冠状病毒或ibv的s1亚基序列，或者与其具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列的至少1、5、10、15、20、25、50、100、150、200、250、300、350、400或500个邻接氨基酸。
[0417]
55.技术方案3和5至52中任一项的ibv刺突蛋白或其片段，其中来自具有有限的细胞嗜性或组织嗜性的ibv的所述s1亚基的至少一部分具有如seq id no:2、3、4、5、6、7、8、77中所示的氨基酸序列，或者与其具有至少90％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的序列的至少1、5、10、15、20、25、50、100、150、200、250、300、350、400或500个邻接氨基酸。
[0418]
56.技术方案1和3以及5至55中任一项的禽冠状病毒或ibv刺突蛋白或其片段，其
中具有有限的细胞嗜性或组织嗜性的禽冠状病毒或ibv限于在含胚鸡蛋和/或原代鸡肾细胞中的感染和/或复制。
[0419]
57.技术方案1和3以及5至56中任一项的禽冠状病毒或ibv刺突蛋白或其片段，其中具有有限的细胞嗜性或组织嗜性的禽冠状病毒或ibv并不在eb66细胞中感染和/或复制。
[0420]
58.技术方案1和3以及5至56中任一项的禽冠状病毒或ibv刺突蛋白或其片段，其中具有有限的细胞嗜性或组织嗜性的禽冠状病毒或ibv并不在pbs-12和/或hek293t细胞中感染和/或复制。
[0421]
片段
[0422]
59.技术方案1至58中任一项的禽冠状病毒或ibv刺突蛋白或其片段，其中所述禽冠状病毒或ibv刺突蛋白的片段具有至少500、750、1000或1077个氨基酸的长度。
[0423]
60.技术方案1至59中任一项的禽冠状病毒或ibv刺突蛋白或其片段，其中所述禽冠状病毒或ibv刺突蛋白的片段具有至少1000个氨基酸的长度。
[0424]
61.技术方案1至60中任一项的禽冠状病毒或ibv刺突蛋白，其中在氨基酸位置267处的半胱氨酸或在氨基酸位置267处向半胱氨酸的突变是遗传上稳定的。
[0425]
62.一种核苷酸序列，其编码技术方案1至61中任一项的刺突蛋白或其片段。
[0426]
63.一种质粒，其包含技术方案62的核苷酸序列。
[0427]
64.一种细胞，其包含技术方案63的质粒。
[0428]
65.一种病毒颗粒，其包含技术方案1至61中任一项的刺突蛋白或其片段。
[0429]
66.一种禽冠状病毒，其包含技术方案1至61中任一项的刺突蛋白或其片段。
[0430]
67.一种ibv(传染性支气管炎病毒)，其包含技术方案3至61中任一项的刺突蛋白。
[0431]
68.技术方案66或67的禽冠状病毒或ibv，其中所述禽冠状病毒或ibv是减毒的。
[0432]
69.技术方案66至68中任一项的禽冠状病毒或ibv，其中所述禽冠状病毒或ibv是遗传改造的。
[0433]
70.技术方案66至69中任一项的禽冠状病毒或ibv，其中所述禽冠状病毒或ibv是重组的。
[0434]
71.技术方案66至70中任一项的禽冠状病毒或ibv，其中所述禽冠状病毒或ibv是嵌合的。
[0435]
72.技术方案67至71中任一项的ibv，其中所述ibv来自具有选自以下毒株列表的基因型的ibv：arkansas(例如arkansas 99)、brazil(例如br-1、br-2、23/2013、ibv/brasil/351/1984)、california(例如california 1734/04、california 99)、connecticut、delaware(例如delaware 98)、dutch(例如d207、d212、d274、d3128、d3896、d8880、d1466)、florida、georgia(例如georgia ga-07、ga-08、ga-12、ga-13)、gray、holte、iowa(例如iowa 97和iowa 69)、italy 02、jmk、ldt3、maine(例如maine 209)、massachusetts(m41、h52、h120、beaudette)、pennsylvania(例如pennsylvania 1220/98、pennsylvania wolg/98)、pl84084、qu(例如qu-mv)、qx(例如gb341/96)、q1、se 17、变体2(例如is/1494/06、ibv/ck/eg/cu/4/2014、gammacov/ck/poland/g052/2016)和4/91(793b、cr88)。
[0436]
73.技术方案67至72中任一项的ibv，其中所述ibv选自以下的基因型或血清型列表：massachusetts、4/91、qx、q1、italy 02、arkansas、conneticut、georgia、ldt3、
pl84084、变体2和brazil。
[0437]
74.技术方案67至73中任一项的ibv，其中所述ibv选自以下的基因型或血清型列表：massachusetts、4/91、qx、q1、arkansas、变体2和brazil。
[0438]
75.技术方案74的ibv，其中所述massachusetts毒株选自以下列表：h120、h52、spain/98/308、ibma5-1、sd/97/01、beaudette、spain/96/334和m41-m21883。
[0439]
76.技术方案74的ibv，其中所述4/91毒株选自以下列表：spain/98/328、spain/92/35、ir-3654-vm、fr-cr88061-88、fr-85131-85、uk-1233-95、uk/3/91、spain/00/336、uk/7/91、致病性4/91、减毒的4/91和ib4-91。
[0440]
77.技术方案74的ibv，其中所述qx毒株选自以下列表：fr-l1450t-05、fr-l1450l-05、nl-l1449t-04、nl-l1449k-04、ibv/ck/sp/170/09、ibv/ck/sp/79/08、ibv/ck/sp/248/09、hbn、ibvqx、lx4、bjq、ck/ch/lgd/03和gb341/96。
[0441]
78.技术方案74的ibv，其中所述q1毒株选自以下列表：ck/ch/ldl/98i、ck/ch/lsd/08-10、j2、q1、ar08er22、ar08ba21和chile-295-10。
[0442]
79.技术方案74的ibv，其中所述italy 02毒株选自以下列表：spain/99/316、italy-02、uk-l633-04、it-497-02、spain/05/866、spain/04/221、spain/00/337、spain/155/09和spain/03/08。
[0443]
80.技术方案74的ibv，其中所述arkansas毒株选自以下列表：ark99、arkga、arkdpi、al/5364/00、arkdpi11、al/0803/01、al/7149/00、arkdpi101、al/1221/01、al/1793/01和al/4614/98。
[0444]
81.技术方案74的ibv，其中所述变体2毒株选自以下列表：is/1494/06、ibv/ck/eg/cu/4/2014、gammacov/ck/poland/g052/2016、eg/clevb-2/ibv/012、d1344/2/4/10_eg、tr8和ib var2-06。
[0445]
82.技术方案74的ibv，其中所述brazil毒株选自以下列表：br-1、br-2、23/2013和ibv/brasil/351/1984。
[0446]
83.技术方案67至74中任一项的ibv，其中所述刺突蛋白或其片段来自massachusetts或4/91基因型或血清型的ibv。
[0447]
84.技术方案67至74中任一项的ibv，其中所述ibv毒株是h120、h52或cr88。
[0448]
85.技术方案67至84中任一项的bv，其中所述ibv具有由以下组成或包含以下的ibv刺突蛋白或其片段：如seq id no:2、3、4、5、6、7、8、77中所示的氨基酸序列，或者与其具有至少80％、85％、90％、93％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％、99.95％、99.98％或99.99％序列同一性的序列。
[0449]
86.技术方案67至85中任一项的ibv，其中所述ibv具有扩展的细胞嗜性或组织嗜性。
[0450]
87.技术方案67至86中任一项的ibv，其中所述ibv在技术方案9至11中任一项的至少一种细胞系或细胞中感染和/或复制。
[0451]
88.一种细胞，其包含：
[0452]-技术方案65的病毒颗粒，或
[0453]-技术方案66至87中任一项的禽冠状病毒或ibv。
[0454]
89.技术方案88的细胞，其中所述细胞是选自以下列表的细胞系或细胞：原代鸡胚
细胞、鸡胚成纤维细胞系、鸭胚干细胞系、人胚肾细胞系、幼仓鼠肾细胞系、非洲绿猴肾细胞系、兔肾细胞系、犬肾细胞系、鸡肝细胞系、牛肾细胞系、猪肾细胞系和昆虫细胞系。
[0455]
90.技术方案88或89的细胞，其中所述细胞是选自以下列表的细胞系：df-1(douglas foster)、eb66(鸭胚干细胞系)、pbs-12、pbs-12sf(无血清pbs-12)、bhk21(幼仓鼠肾)、hek 293t(人胚肾)、vero(verda reno)、ma104、rk13(兔肾)、lmh(leghorn雄性肝癌)、mdck(马丁达比犬肾)、mdbk(马丁达比牛肾)、pk15(猪肾)、pk2a(猪肾)、sf9、sf21和sf+(草地贪夜蛾)。
[0456]
91.技术方案88至89中任一项的细胞，其中所述细胞是选自以下列表的细胞系：df-1、eb66、pbs-12、pbs-12sf、bhk、hek 293t、vero、ma104和rk13。
[0457]
92.技术方案89的细胞，其中所述原代鸡胚细胞是成纤维细胞或源自肝脏或肺组织的细胞。
[0458]
93.一种免疫原性组合物，其包含：
[0459]-技术方案1至61中任一项的刺突蛋白，或
[0460]-技术方案65的病毒颗粒，或
[0461]-技术方案66至87中任一项的禽冠状病毒或ibv。
[0462]
94.一种疫苗，其包含：
[0463]-技术方案1至61中任一项的刺突蛋白，或
[0464]-技术方案65的病毒颗粒，或
[0465]-技术方案66至87中任一项的冠状病毒或ibv。
[0466]
95.一种具有扩展的细胞嗜性或组织嗜性的改良式活疫苗，其包含：
[0467]-技术方案1至61中任一项的刺突蛋白，或
[0468]-技术方案65的病毒颗粒，或
[0469]-技术方案66至87中任一项的冠状病毒或ibv。
[0470]
96.技术方案93至95中任一项的免疫原性组合物或疫苗，其中所述免疫原性组合物或疫苗包含药学上可接受的载体。
[0471]
97.技术方案96的免疫原性组合物或疫苗，其中所述药学上可接受的载体是磷酸盐缓冲盐水。
[0472]
98.技术方案93至97中任一项的免疫原性组合物或疫苗，其中所述免疫原性组合物或疫苗有效治疗和/或预防有需要的对象中由ibv引起的临床体征。
[0473]
99.技术方案93至98中任一项的免疫原性组合物或疫苗，其中所述免疫原性组合物或疫苗包含1至10log
10 eid
50
的ibv。
[0474]
100.技术方案93至99中任一项的免疫原性组合物或疫苗，其中所述免疫原性组合物或疫苗包含2至5log
10 eid
50
的ibv。
[0475]
101.技术方案93至100中任一项的免疫原性组合物或疫苗，其中所述免疫原性组合物或疫苗包含2至4log
10 eid
50
的ibv。
[0476]
102.一种用于改变禽冠状病毒的细胞嗜性或组织嗜性的方法，其包括使用技术方案1至61中任一项的禽冠状病毒刺突蛋白或其片段。
[0477]
103.一种用于扩展禽冠状病毒的细胞嗜性或组织嗜性的方法，其包括使用技术方案1至61中任一项的禽冠状病毒刺突蛋白或其片段。
[0478]
104.一种用于生产或制造具有扩展的细胞嗜性或组织嗜性的禽冠状病毒的方法，其包括使用技术方案1至61中任一项的禽冠状病毒刺突蛋白或其片段。
[0479]
105.一种用于在细胞培养或组织培养中培养禽冠状病毒的方法，其包括使用技术方案1至61中任一项的禽冠状病毒刺突蛋白或其片段。
[0480]
106.一种用于修饰禽冠状病毒的方法，其包括修饰所述禽冠状病毒的刺突蛋白中的氨基酸位置267。
[0481]
107.一种用于使禽冠状病毒刺突蛋白中的氨基酸位置267突变的方法，其包括：
[0482]
a)提供禽冠状病毒刺突核苷酸或蛋白质序列，
[0483]
b)通过与参考序列比对来鉴定刺突蛋白中的位置267，
[0484]
c)使步骤b)的刺突蛋白的位置267突变成半胱氨酸，
[0485]
d)获得步骤c)的突变的刺突蛋白。
[0486]
108.技术方案102至106中任一项的方法，其中所述刺突蛋白或其片段在氨基酸位置267处具有半胱氨酸。
[0487]
109.技术方案106至108中任一项的方法，其中通过突变引入在氨基酸位置267处的半胱氨酸。
[0488]
110.技术方案109的方法，其中所述突变是氨基酸取代、缺失或插入。
[0489]
111.技术方案106至111中任一项的方法，其中在氨基酸位置267处的苯丙氨酸或亮氨酸被修饰或突变成半胱氨酸。
[0490]
112.技术方案102至111中任一项的方法，其中所述禽冠状病毒是技术方案67至87中任一项的ibv。
[0491]
113.技术方案102至112任一项的方法，其中所述冠状病毒刺突蛋白是技术方案3至61任一项的ibv(传染性支气管炎病毒)刺突蛋白。
[0492]
114.技术方案102至113中任一项的方法，其中在氨基酸位置267处的半胱氨酸或在氨基酸位置267处向半胱氨酸的所述突变，导致扩展的细胞嗜性或组织嗜性。
[0493]
115.技术方案102至114中任一项的方法，其中所述禽冠状病毒或ibv在技术方案9至11中任一项的至少一种细胞系或细胞中感染和/或复制。
[0494]
116.技术方案106至115中任一项的方法，其中根据技术方案12至18中任一项完成氨基酸位置267的编号。
[0495]
试剂盒技术方案
[0496]
117.一种试剂盒，其包含技术方案65至88和93至101中任一项的病毒颗粒、禽冠状病毒、ibv、免疫原性组合物或疫苗。
[0497]
118.技术方案117的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包含用于治疗和/或预防禽类疾病的说明书、或者用于治疗和/或预防家禽疾病的说明书、或者用于治疗和/或预防ib的说明书。
[0498]
119.技术方案117或118的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包括能够向所述动物施用疫苗的分配器。
[0499]
治疗方法技术方案
[0500]
120.一种用于使对象免疫的方法，其包括向此类对象施用技术方案93至101中任一项的免疫原性组合物或疫苗。
[0501]
121.一种治疗或预防有需要的对象中由ibv引起的临床体征的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的技术方案93至101中任一项的免疫原性组合物或疫苗。
[0502]
122.一种与同一物种的未免疫的对照组的对象相比，减少有需要的对象中的纤毛停滞的方法，所述方法包括向对象施用治疗有效量的技术方案93至101中任一项的免疫原性组合物或疫苗。
[0503]
123.技术方案93至101中任一项的免疫原性组合物或疫苗，其用于使对象免疫的方法中，所述方法包括向对象施用治疗有效量的所述免疫原性组合物或疫苗。
[0504]
124.技术方案93至101中任一项的免疫原性组合物或疫苗，其用于治疗或预防有需要的对象中由ibv引起的临床体征的方法中，所述方法包括向对象施用治疗有效量的所述免疫原性组合物或疫苗。
[0505]
125.技术方案93至101中任一项的免疫原性组合物或疫苗，其用于与同一物种的未免疫的对照组的对象相比，减少有需要的对象中的纤毛停滞的方法中，所述方法包括向对象施用治疗有效量的所述免疫原性组合物或疫苗。
[0506]
126.技术方案120至125中任一项的方法或用途，其中所述对象是禽类。
[0507]
127.技术方案120至126中任一项的方法或用途，其中所述对象是家禽。
[0508]
128.技术方案120至127中任一项的方法或用途，其中所述对象选自鸡、火鸡、鹌鹑或雉鸡。
[0509]
129.技术方案120至128中任一项的方法或用途，其中所述对象是鸡。
[0510]
130.技术方案120至129中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物或疫苗施用一次。
[0511]
131.技术方案120至129中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物或疫苗以两个或更多个剂量施用。
[0512]
132.技术方案120至131中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物或疫苗是皮下、肌内、经口、卵内、经由喷雾、经由饮用水或通过滴眼剂施用的。
[0513]
133.技术方案120至132中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物或疫苗经由滴眼剂进行施用。
[0514]
134.技术方案120至133中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物或疫苗包含1至10log
10 eid
50
/剂量的ibv。
[0515]
135.技术方案120至134中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物或疫苗包含2至5log
10 eid
50
/剂量的ibv。
[0516]
136.技术方案120至135中任一项的方法或用途，其中所述免疫原性组合物或疫苗包含2至4log
10 eid
50
/剂量的ibv。
[0517]
137.技术方案120至136中任一项的方法或用途，其中将所述免疫原性组合物或疫苗施用于在前一周龄内、在前三日龄内、在前两日龄内或在前一日龄内的对象。
[0518]
138.技术方案120至137中任一项的方法或用途，其中将所述免疫原性组合物或疫苗施用于在前一日龄内的对象。
[0519]
139.技术方案120至138中任一项的方法或用途，其中所述方法导致选自以下的功效参数的改善：与同一物种的未治疗的对照组的对象相比，纤毛停滞的预防或减少、罗音的预防或减少、产蛋下降的预防或减少、肾脏损害的预防或减少、水样腹泻的预防或减少、体
重减轻的预防或减少、更低的病毒载量、减少的病毒脱落或其组合。
[0520]
140.技术方案120至139中任一项的方法或用途，其中与同一物种的未治疗的对照组的对象相比，所述治疗或预防导致纤毛停滞的预防或减少。
[0521]
141.技术方案120至140中任一项的方法或用途，其中与同一物种的未治疗的对照组的对象相比，所述治疗或预防导致肾脏损害的预防或减少。
[0522]
142.技术方案120至141中任一项的方法或用途，其中与同一物种的未治疗的对照组的对象相比，所述治疗或预防导致产蛋下降的预防或减少。
[0523]
143.技术方案65至87和93至101中任一项的病毒颗粒、禽冠状病毒、ibv、免疫原性组合物或疫苗，其用于治疗用途。
[0524]
144.技术方案65至87和93至101中任一项的病毒颗粒、禽冠状病毒、ibv、免疫原性组合物或疫苗，其用作免疫原或疫苗。
[0525]
145.技术方案65至87和93至101中任一项的病毒颗粒、禽冠状病毒、ibv、免疫原性组合物或疫苗，其用作药物。
[0526]
146.技术方案65至87和93至101中任一项的病毒颗粒、禽冠状病毒、ibv、免疫原性组合物或疫苗用于制造药物的用途。
[0527]
147.技术方案65至87和93至101中任一项的病毒颗粒、禽冠状病毒、ibv、免疫原性组合物或疫苗用于治疗和/或预防对象中的ibv感染的用途。
附图说明
[0528]
图1.通过经由rt-qpcr检测病毒载量评价的，与h52 ribv野生型病毒相比，关于h52 ribv s f267c的卵内动力学。数据点代表每个时间点5个样品的平均值。误差条指示标准差。
[0529]
图2.h52 ribv s f267c在细胞中的传代。rt-qpcr ct值在每次传代的感染时间点(t＝0)和收获时间点(t＝72)进行确定。p1至p5通过用前一代的病毒原液的1/10稀释物感染而生成。p6和p7通过用前一代的1/1000稀释物接种而生成。对于第一次传代以0.001的moi重复实验，并且获得了类似的结果。
[0530]
图3.h52 ribv s f267c在细胞中的复制动力学。基于来自病毒的第三次繁殖传代的tcid50滴度，以0.001的moi用ribv感染细胞。在0、8、24、48和72hpi时分离核酸，并且经由ibv特异性rt-qpcr进行分析。每个数据点代表三次独立实验的平均ct值。误差条指示平均值(sem)的标准误。
[0531]
图4.h52 ribv s f267c在细胞中的复制动力学。通过tcid50滴定分析时间点0、8、24、48和72hpi的样品。显示了一次实验的结果。
[0532]
图5.针对m41攻击，关于通过h52 ribv s f267c的保护的纤毛停滞评分概括。计算了关于一只动物的10个环的10个个别评分的总和，并且在图中由一个点表示。最大纤毛停滞对应于评分40，而无纤毛停滞由评分0表示。平均值和显著性使用graphpad prism和普通的单因素anova检验进行计算(p《0,0001)。
[0533]
图6.关于h52 ribv s f267c的功效研究，在攻击后7天，肾脏组织的rt-qpcr结果概括。每只个别的鸟由一个点指示。
[0534]
图7.经由免疫荧光分析确定h52 ribv s f267c在pbs-12sf细胞中的复制。显示了
三次独立实验之一。
[0535]
图8：经由来自上清液的核酸提取和后续rt-qpcr分析，确定h52 ribv s f267c在pbs-12sf细胞中的复制。显示了两次独立实验之一。
[0536]
图9.经由免疫荧光分析确定h52 ribv s f267c在hek 293t细胞中的复制。显示了三次独立实验之一。
[0537]
图10.通过经由rt-qpcr检测病毒载量评价的，与cr88 ribv野生型病毒相比，关于cr88 ribv s l269c的卵内动力学。数据点代表每个时间点5个样品的平均值。误差条指示标准差。
[0538]
图11.cr88 ribv s l269c在细胞中的传代。rt-qpcr ct值在分别传代的感染时间点(t＝0)和收获时间点(t＝72)进行确定。包括cr88 ribv野生型作为阴性对照。对于cr88 ribv s l269c，显示了关于p2、p5和p8的数据。在同一传代实验中包括的cr88 ribv具有在初始传代(p1)和末次传代(p7)中缺失的一次传代。每次传代通过用前一代的1/100稀释物感染而生成。
[0539]
图12.cr88 ribv s l269c在细胞中的复制动力学。基于来自病毒的第三次繁殖传代的tcid50滴度，以0.001的moi用ribv感染细胞。在0、8、24、48和72hpi时分离核酸，并且经由ibv特异性rt-qpcr进行分析。每个数据点代表三次独立实验的平均ct值。误差条指示平均值(sem)的标准误。
[0540]
图13.cr88 ribv s l269c在细胞中的复制动力学。通过tcid50滴定分析时间点0、8、24、48和72hpi的样品。显示了一次实验的结果。
[0541]
图14.针对793b攻击，关于通过cr88 ribv s l269c的保护的纤毛停滞评分概括。计算了关于一只动物的10个环的10个个别评分的总和，并且在图中由一个点表示。最大纤毛停滞对应于评分40，而无纤毛停滞由评分0表示。平均值和显著性使用graphpad prism和普通的单因素anova检验进行计算(*p《0.02，**p《0.007)。
[0542]
图15.关于cr88 ribv s l269c的功效研究，在攻击后7天，肾脏组织的rt-qpcr结果概括。每只个别的鸟由一个点指示。
[0543]
图16.通过经由rt-qpcr检测病毒载量评价的，与ibv qx、h52 ribv和cr88ribv相比，关于h52 ribv qx s l270c和cr88 ribv qx s l270c的卵内动力学。数据点代表每个时间点5个样品的平均值。误差条指示标准差。
[0544]
图17.cr88 ribv qx s l270c在细胞中的传代。rt-qpcr ct值在分别传代的感染时间点(t＝0)和收获时间点(t＝72)进行确定。
[0545]
图18.h52 ribv qx s l270c在细胞中的传代。rt-qpcr ct值在分别传代的感染时间点(t＝0)和收获时间点(t＝72)进行确定。
[0546]
图19.h52 ribv qx s l270c和cr88 ribv qx s l270c在细胞中的复制动力学。基于来自病毒的第三次繁殖传代的tcid50滴度，以0.001的moi用ribv感染细胞。在0、8、24和48hpi时分离核酸，并且经由ibv特异性rt-qpcr进行分析。每个数据点代表各自一式三份进行的三次独立实验的平均ct值。误差条指示平均值(sem)的标准误。
[0547]
图20.针对d388 qx攻击，关于通过cr88 ribv qx s l270c和h52 ribv qx s l270c的保护的纤毛停滞评分概括。计算了关于一只动物的10个环的10个个别评分的总和，
并且在图中由一个点表示。最大纤毛停滞对应于评分40，而无纤毛停滞由评分0表示。平均值和显著性使用graphpad prism和普通的单因素anova检验进行计算(***p《0.001，****p《0.0001)。
[0548]
图21.关于cr88 ribv qx s l270c和h52 ribv qx s l270c的功效研究，在攻击后7天，肾脏组织的rt-qpcr结果概括。每只个别的鸟由一个点指示。
[0549]
序列概述
[0550]
seq id no:1ibv h52刺突蛋白
[0551]
seq id no:2具有f267c突变的ibv h52刺突蛋白
[0552]
seq id no:3具有l269c突变的ibv cr88刺突
[0553]
seq id no:4具有l270c突变的ibv qx刺突蛋白
[0554]
seq id no:5具有l271c突变的ibv q1刺突蛋白
[0555]
seq id no:6具有l270c突变的ibv var 2刺突蛋白
[0556]
seq id no:7具有l274c突变的ibv br-i刺突蛋白
[0557]
seq id no:8具有l274c突变的ibv ark刺突蛋白
[0558]
seq id no:9puc57-s h52 ribv供体质粒
[0559]
seq id no:10puc57-s h52 ribv s f267c供体质粒
[0560]
seq id no:11ibv cr88刺突序列
[0561]
seq id no:12puc57-s cr88 mibv供体质粒
[0562]
seq id no:13pgem-t ibv cr88刺突质粒
[0563]
seq id no:14puc57-s cr88 ribv s l269c供体质粒
[0564]
seq id no:15具有l269c突变的pgem-t ibv cr88刺突
[0565]
seq id no:16至64引物
[0566]
seq id no:65ibv qx刺突蛋白
[0567]
seq id no:66pgem-t ibv qx s l270c质粒
[0568]
seq id no:67puc57-s cr88 ribv供体质粒
[0569]
seq id no:68puc57-s cr88 ribv qx s l270c供体质粒
[0570]
seq id no:69puc57-s h52 ribv qx s l270c供体质粒
[0571]
seq id no:70至75引物
[0572]
seq id no:76ibv arkdpi刺突蛋白
[0573]
seq id no:77具有l274c突变的ibv arkdpi刺突蛋白
[0574]
seq id no:78puc57-s ibv arkdpi s l274c
[0575]
seq id no:79puc57-s h52 ribv arkdpi s ecto l274c供体质粒
[0576]
seq id no:80至84引物
[0577]
实施例
[0578]
下文阐述了下述实施例，以说明本发明的具体实施方案。这些实施例仅是说明性的，并且不应理解为限制本发明的范围或基本原理。
[0579]
实施例1：其中刺突蛋白的氨基酸267突变为半胱氨酸的重组ibv h52的生成
[0580]
对于重组ibv的生成，应用如通过van beurden等人(virol j.2017；14(1):109)描述的靶向rna重组的方法。
[0581]
供体质粒构建
[0582]
puc57-s ibv-5-1b-s-sir-3t供体质粒，下文称为puc57-s h52 ribv供体质粒(seq id no:9)，用作用于构建具有h52刺突的h52 ribv供体质粒的模板，其中所述h52刺突(seq id no:1)s1亚基的氨基酸267从苯丙氨酸突变成半胱氨酸(seq id no:2)，其称为puc57-s h52 ribv s f267c(seq id no:10)。通过使用site-directed mutagenesis kit(neb)连同引物po1942和po1943(表1)，并且根据试剂盒方案，使用58℃的退火温度和5分30秒的延伸时间，来实现野生型序列的突变。通过ecorv和xhoi限制性消化，随后为用引物po618和po633(表1)的桑格测序，来鉴定阳性克隆。其后，通过用表1中的引物seq id no:19至seq id no:40测序，来确认刺突和供体区域序列的完整性。
[0583]
表1：用于sdm和测序的引物
[0584][0585][0586]
靶向rna重组和重组ibv的拯救
[0587]
如通过van beurden等人(virol j.2017；14(1):109)所述的，生成h52鼠源化(m)ibv辅助病毒和重组ibv。简言之，对于h52 ribv s f267c的生成，lr7细胞用h52 mibv进行感染，并且用由puc57-s h52 s f267c供体质粒(seq id no:10)生成的体外转录物进行电穿孔，并且随后注射到8日龄的spf含胚鸡蛋(valo biomedia)内。在孵化长达8天后，使用magmax
tm core nucleic acid purification kit(thermofisher)和kingfisher
tm duo prime purification system(thermofisher)，并且通过使用具有platinum
tm taq dna polymerase的superscript
tm iii one-step rt-pcr system(thermofisher)，对于rna分离后的重组ibv的拯救，分开分析所有蛋的尿囊液。在h52 ibv 1ab和h52 ibv s刺突中结合的
引物po1323和po1324(表2)用于区分重组ibv与mibv。使用具有platinum
tm taq dna polymerase的superscript
tm iii one-step rt-pcr system连同引物po618和po633(表2)，随后为qiaquick pcr纯化以及用相同引物的桑格测序，进一步分析阳性样品以确认预期的刺突f267c突变的存在。用最高稀释度的lr7细胞接种的蛋的阳性尿囊液用于8日龄的spf蛋中的终点稀释。如上所述进行核酸分离和样品分析。相同的程序应用于第二个终点稀释。其后，一种检测呈阳性的尿囊液用于在10日龄的spf含胚鸡蛋中的繁殖。尿囊液在1xpbs中进行1:1000稀释，并且注射100μl/蛋，所述蛋随后在37.5℃和60％湿度下孵化。接种后48小时收获尿囊液，合并，清除碎片并贮存于-80℃下。
[0588]
表2用于鉴定所拯救的h52 ribv并确认靶向的s f267c突变的pcr和测序引物。
[0589]
seq id no:名称序列41po1323tcagcatggacgtgtggtta42po1324ccccatgtaaatgccaacca19po618taaatggtgatcttgttt21po633cgctcttagtaacataaac
[0590]
重组ibv的体外表征和卵内表征
[0591]
胚胎感染剂量50％(eid
50
)的确定
[0592]
将病毒原液的等分试样解冻并且在1xpbs中稀释10倍，以通过将100μl接种到每个稀释度5个8日龄的含胚鸡蛋的尿囊腔内，来确定50％胚胎感染剂量(eid
50
)。蛋在36.5℃、60％的湿度下孵化，直到接种后7天。在24小时后具有死亡胚胎的蛋从实验中排除。在接种后7天具有死亡胚胎的所有其它蛋被视为阳性。在接种后7天，具有活胚胎的所有蛋都从底部进行对光检查(candeled)，以鉴定被视为阳性的矮小型(dwarf)。eid
50
/ml用reed和muench(am j epidemiol，1938；27(3):493
–
497)的公式计算。
[0593]
组织培养感染剂量50％(tcid
50
)
[0594]
细胞生存用biorad tc20和台盼蓝进行分析，其中门设定为6-13μm。在接种前1天，在ebx
tm gro-i serum-free media+2.5mm l-谷氨酰胺中，每96孔接种2x106个活细胞/ml，并且在37℃和7.5％co2下温育。在细胞培养基中进行病毒的10倍连续稀释，并且在去除培养基后，将100μl/稀释度(每个稀释度至少4个重复)加入细胞中。如果尿囊液用于感染，则在稀释前使它通过0.45μm孔径的过滤器。使受感染的细胞温育72小时，随后为免疫荧光染色，以鉴定阳性孔。从所有孔中吸出培养基，所述孔随后用1xpbs洗涤，然后加入100μl乙醇/孔，用于在rt下10分钟的细胞固定和细胞的后续风干。使细胞与在1xpbs中1:250稀释的100μl鸡抗ibv mass一级血清(boehringer ingelheim)一起在室温下温育45分钟。在去除一抗后，每个孔用1xpbs洗涤3次。加入100μl alexa fluor 488山羊抗鸡igg二抗(thermofisher scientific，在1xpbs中的1:500稀释度)，并且在室温下在黑暗中温育45分钟。在去除二抗后，每个孔用1xpbs洗涤3次，最后一次洗涤留在细胞上。通过荧光显微镜检查鉴定阳性孔，并且记录以用reed和muench(am j epidemiol,1938；27(3):493
–
497)的公式计算tcid
50
/ml。
[0595]
卵内复制动力学
[0596]
用102eid
50
的ribv和分别的对照接种8日龄的含胚鸡蛋。在孵化0、8、24、34、48和72
小时后，蛋每天进行对光检查，并且记录胚胎死亡率。取出每个样品和时间点的五个预选蛋，并且转移至4℃至少2小时。随后，收获尿囊液并贮存于-80℃下。对于分析，将样品解冻并且在不含ca和mg的1xpbs中进行1:10稀释，并且使用hamilton starlet移液器机器人，伴随载体rna的添加，用qiaamp dna blood mini试剂盒(qiagen)提取核酸。所提取的核酸通过rt-qpcr分析ibv rna的相对量，使用改编自callison等人(j virol methods.2006；138(1-2):60-5)的方案。简言之，使用相同的引物和探针，并且温度曲线适于fast virus 1-step master mix(thermofisher)和abi
tm 7900ht fast real-time pcr system(thermo fisher scientific)的使用。使用ibv h52的10倍稀释系列作为参考，一式三份地分析所有核酸样品。
[0597]
对于h52 ribv野生型和h52 ribv s f267c，观察到相似的卵内复制动力学(图1)。这提示了与野生型ribv相比，对于突变的ribv的卵内复制效率，通过在刺突的位置267处的苯丙氨酸至半胱氨酸的突变并无不利之处。
[0598]
ribv在细胞中的传代
[0599]
细胞在ebx
tm gro-i serum-free media+2.5mm l-谷氨酰胺中，以4x105个细胞/ml的密度接种到总体积为5ml的t25烧瓶内，并且用ribv和对照进行感染。使培养物在37℃和7.5％co2以及以100rpm的振荡下温育72小时。收获培养物并贮存于-80℃下。对于传代1、2、5、6和7，经由rt-qpcr评价病毒复制。为此，在接种后(时间点0小时)以及在收获后(时间点72小时)直接取出250μl悬浮液用于核酸分离。使用magmax
tm core nucleic acid purification kit(thermofisher)和kingfisher
tm duo prime purification system(thermofisher)分离核酸。如上所述进行rt-qpcr。
[0600]
为了分析h52 ribv s f267c是否能够在细胞中复制，用尿囊液原液的1/10稀释物接种细胞。在第一次传代和随后的传代中，在72小时后通过降低的ct值检测到病毒的繁殖。由于用于下一次传代的病毒的稀释，ct值与在接种物收获时测量的ct值相比增加，然后在72小时培养期间由于病毒复制而再次降低。复制在更高的传代6和7中变得甚至更加明显，对于所述传代6和7，接种用前一代的1/1000稀释物进行(图2)。结果明确地显示了h52 ribv f267c在细胞中经过7次传代的复制。因此，显而易见的是在位置267向半胱氨酸的修饰是遗传上稳定的，因为ibv在7次传代后仍然具有扩展的细胞培养/组织嗜性。
[0601]
另外，确定了关于尿囊液原液(10
6.33
tcid
50
/ml、10
7.22
eid
50
/ml)，以及传代p1(10
4.67
tcid
50
/ml)、p5(10
5.33
tcid
50
/ml)和p7(106tcid
50
/ml、10
5.84
eid
50
/ml)的感染滴度。它们确认了h52 ribv s f267c在传代过程期间的有效复制以及在spf蛋中的持续感染性。因此，f267c突变使得能够在细胞系中复制，而不扰乱在卵内复制的能力。
[0602]
细胞复制动力学
[0603]
从细胞中收获的传代3用于在细胞中进行复制动力学。细胞如对于传代所述的进行接种且温育，并且基于tcid
50
滴度以0.001的moi进行感染。在接种后以及8、24、48和72hpi(感染后小时数)直接获取样品。如对于传代实验所述的，分析样品的病毒rna含量(图3)。另外，经由tcid
50
测定分析样品的感染性(图4)。用两种方法均检测到有效的复制，并且早在感染后48小时就达到了复制的平台期。最后，细胞中的复制周期与含胚鸡蛋中同样有效。
[0604]
疫苗功效的确定
[0605]
受精的spf蛋在99.7
°
f和50％湿度下的蛋入孵机(setter)中孵化18天，伴随1次旋转/小时。在孵化的第18天，蛋进行对光检查，并且将受精蛋转移到孵化器中，并且在99
°
f和70％的湿度下孵化直至孵出。没有临床体征或变形的小鸡被随机分配到分别的治疗组内，并且转移到分开的隔离器内。三只小鸡充当严格阴性对照(snc)组，五只小鸡入选攻击对照(cc)组，并且至少10只小鸡入选用适应的重组ibv进行疫苗接种并随后进行攻击的组。动物保持在遵从当地和国家对于动物福利建议的要求的饲养条件下。光照方案调整为16小时光照/天。随意提供饲料和水。在转移到隔离器后，小鸡(1日龄)经由滴眼剂(总体积50μl，每只眼25μl)用103eid
50
/鸡进行疫苗接种，而snc和cc组保持未治疗的。在疫苗接种后21天，cc和疫苗接种组的鸡经由滴眼剂(总体积50μl，每只眼25μl)用103至104eid
50
/鸡的同源攻击毒株进行攻击。在攻击后7天，对所有鸡实施安乐死，取出肾脏并且在4℃下贮存于rnalater stabilization solution(thermofisher)中，用于ibv特异性rt-qpcr分析。另外，取出气管并且转移到具有温细胞培养基的50ml管内。其后，将气管清除掉结缔组织并且用细胞培养基冲洗。使用设定为0.6-0.8mm切片厚度的mcilwain组织切片机，将气管切成气管环。通过光学显微镜检查，就纤毛跳动分析每个气管的上部三个环、中部四个环和下部三个环，并且就纤毛停滞进行评分(参见表3)。如果多于50％的内环显示剧烈的纤毛运动(评分2及更低)，则环被记录为正常的。如果少于50％的纤毛是跳动的(评分3和4)，则环被记录为对于纤毛停滞呈阳性。如果10个环中的不少于9个显示正常的纤毛活性，则动物被视为受保护的。
[0606]
对于ibv特异性rt-qpcr分析，将肾脏组织小片加热至室温，并且转移到分开的2ml precellys管中，所述precellys管分别装满培养基和pbs。肾脏用组织匀浆器(bertin instruments)在6800rpm下匀浆化1x20秒。鼻后孔拭子(choanal wabs)在2ml 1xpbs中进行洗脱。使用magmax
rm core nucleic acid purification kit(thermofisher)和kingfisher
tm duo prime purification system(thermofisher)，分别从200μl洗脱物和组织匀浆中分离核酸。如上文对于卵内动力学所述的进行rt-qpcr，除了使用steponeplus
tm real-time pcr system(thermofisher)之外。
[0607]
表3：气管环中的纤毛停滞评分
[0608]
纤毛活性[％]纤毛停滞评分100075-99150-74225-4930-254
[0609]
该研究的目的是证实在细胞中传代8次的细胞培养适应的h52ribv s f267c，能够赋予针对由强毒m41毒株的攻击的保护。每天观察所有鸡的临床体征，并且在疫苗接种或攻击后没有记录到临床体征。关于在1日龄时用h52 ribv和h52 ribv s f267c进行疫苗接种的反向滴定，分别确定了10
3.2
eid
50
/动物和10
2.87
eid
50
/动物(靶103eid
50
/动物)的滴度，以及对于在疫苗接种后21天用ibv m41的攻击，103eid
50
/动物(靶103eid
50
/动物)的
滴度。纤毛停滞如表3中所述进行评分，并且结果在图5中进行描绘。
[0610]
关于每只动物的10个个别评分总和的平均纤毛停滞值和保护率概括于表4中。严格阴性对照的所有动物都显示了正常的纤毛运动(100％保护)，而攻击对照组的所有动物都对于纤毛停滞呈阳性(0％保护)。相比之下，93％的用h52 ribv进行疫苗接种的动物受到保护，并且用传代的h52 ribv s f267c进行疫苗接种的动物也同样良好地受到保护。
[0611]
表4：关于在疫苗接种后28天和攻击后7天的保护的纤毛停滞评分概括。通过将每组的各个鸡的总评分相加，并且将组总和除以动物数目，来计算平均纤毛停滞评分/组(最高可能评分40，最低可能评分0)。对于不受影响的动物，10个气管外植体中的至少9个显示了正常的纤毛活性。
[0612][0613]
另外，与m41攻击对照相比，用h52 ribv s f267c进行疫苗接种的动物肾脏中的病毒载量与h52 ribv一样有效地减少(图6)。总之，在细胞中繁殖的h52 ribv s f267c与h52 ribv野生型一样有效地保护免于强毒m41的攻击。进一步，位置267半胱氨酸的修饰是遗传上稳定的。
[0614]
用ribv感染pbs-12sf细胞
[0615]
对于h52 ribv s f267c和作为阴性对照的h52 ribv的尿囊液原液，分析了感染pbs-12sf细胞的能力。将pbs-12sf细胞接种到12孔板内的optipro sfm(thermofisher scientific)+10％glutamax(thermofisher scientific)培养基中，以在第二天时达到80％至90％的汇合。使细胞在37℃和5％co2下温育。在感染之前，使尿囊液病毒原液通过0.45μm孔径的过滤器。pbs-12sf细胞用10
5.74
eid
50
的每种病毒/孔在37℃和5％co2下感染4小时，然后取出上清液并加入新鲜培养基用于进一步温育。在72小时后，取出上清液，并且用1xpbs洗涤细胞，并且加入50μl tryple select(thermofisher scientific)，以使细胞解离。将细胞重悬浮于上清液中，并且转移到具有80-90％汇合的pbs-12sf细胞(p2)的t25烧瓶中，使所述pbs-12sf细胞温育72小时。再次，收集上清液和细胞，并且转移到具有80-90％汇合的pbs-12sf细胞的t75烧瓶中，使所述pbs-12sf细胞温育72小时(p3)。收获上清液。细胞通过胰蛋白酶处理进行解离，并且以1/3的比率接种到12孔板内的新鲜培养基中，并且温育直至第二天。吸出培养基，用1xpbs洗涤细胞，用冰冷的100％乙醇固定并风干。随后，将细胞用1xpbs再水化，其后以1:200的稀释度加入鸡抗ibv mass一级血清(boehringer ingelheim)，并且在室温下温育45分钟。在去除抗体后，洗涤细胞，并且加入alexa fluor 488山羊抗鸡igg二抗(thermofisher scientific，在1xpbs中的1:500稀释度)在室温下在黑暗中共45分钟。最后，细胞用1xpbs洗涤3次，并且通过荧光显微镜检查进行分析(图7)。对于h52 ribv s f267c检测到受感染的细胞，而由h52 ribv野生型感染的细胞和未感染的阴性对照如预计的保持阴性。此外，在传代1、2和3各自后，贮存250μl上清液，用于如上所述的
核酸提取和rt-qpcr。在传代过程中，对于h52 ribv s f267c可以观察到ct值的持续下降(对应于病毒的复制和繁殖)，而关于h52 ribv野生型的ct值如预计的增加(图8)。
[0616]
总之，这些数据确认了，在h52刺突的位置267处的苯丙氨酸至半胱氨酸的单突变致使病毒能够在pbs12-sf细胞中复制，而h52野生型病毒缺乏这种能力。
[0617]
用ribv感染hek-293t细胞
[0618]
对于h52 ribv s f267c和作为阴性对照的h52 ribv的尿囊液原液，分析了感染hek 293t细胞的能力。将293t细胞接种到12孔板内的dmem(lonza)+10％fcs(safc)+l-谷氨酰胺(lonza)+1％p/s(gibco)培养基中，以在第二天时达到80％至90％的汇合。使细胞在37℃和5％co2下温育。在感染之前，使尿囊液病毒原液通过0.45μm孔径的过滤器。hek 293t细胞用大致106eid
50
的每种病毒/孔进行感染。在72小时后，取出上清液，并且用1xpbs洗涤细胞，并且加入50μl tryple select(thermofisher scientific)，以使细胞解离。将细胞重悬浮于上清液中，并且转移到具有80-90％汇合的hek 293t细胞和5ml新鲜培养基(p2)的t25烧瓶中，使所述pbs-12sf细胞温育72小时。再次，收集上清液和细胞，并且转移到具有80-90％汇合的hek 293t细胞和10ml新鲜培养基的t75烧瓶中，使所述pbs-12sf细胞温育72小时(p3)。收获上清液。细胞通过胰蛋白酶处理进行解离，并且以1/3的比率接种到12孔板内的新鲜培养基中，并且温育直至第二天。吸出培养基，用1xpbs洗涤细胞，用冰冷的100％乙醇固定并风干。随后，将细胞用1xpbs再水化，其后以1:200的稀释度加入鸡抗ibv mass一级血清(boehringer ingelheim)，并且在室温下温育45分钟。在去除抗体后，洗涤细胞，并且加入alexa fluor 488山羊抗鸡igg二抗(thermofisher scientific，在1xpbs中的1:500稀释度)在室温下在黑暗中共45分钟。最后，细胞用1xpbs洗涤3次，并且通过荧光显微镜检查进行分析(图9)。对于阳性对照以及h52ribv s f267c检测到受感染的细胞，而由h52 ribv野生型感染的细胞和未感染的阴性对照如预计的保持阴性。
[0619]
总之，这些数据确认了，在h52刺突的位置267处的苯丙氨酸至半胱氨酸的单突变致使病毒能够在hek 293t细胞中复制，而h52野生型病毒缺乏这种能力。
[0620]
实施例1的结论：数据显示了，在ibv中的刺突序列(关于编号的参考序列为seq id no:1)的位置267处向半胱氨酸的突变，导致扩展的细胞培养嗜性和组织嗜性。在刺突蛋白中具有f267c突变的h52重组ibv可以在不同的细胞系，例如eb66、pbs-12sf和hek 293t细胞中有效地进行培养。认定所述ibv也可以在其它细胞系中进行培养。进一步地，所述突变对病毒的卵内复制没有影响，并且在卵内和在体外的复制动力学是相似的。最后，即使在细胞系中传代后，疫苗功效也是持续的，对于无需卵内培养，而是使用细胞系的成功的ibv疫苗开发奠定了基础。
[0621]
实施例2：其中刺突蛋白的氨基酸269突变为半胱氨酸的重组ibv cr88的生成
[0622]
为了确定在ibv刺突中的位置267处向半胱氨酸的改变是否也可以应用于其它基因型或血清型，将cr88 ibv毒株的刺突氨基酸序列(seq id no:11)与h52刺突氨基酸序列(seq id no:1)进行比对，以确定对于ibv cr88刺突，等价于h52刺突的氨基酸位置267的位置，其被确定为在cr88刺突的位置269处的亮氨酸。
[0623]
ibv cr88鼠源化供体质粒的构建
[0624]
为了生成cr88鼠源化(m)ibv供体质粒，供体序列由商业供应商合成：cr88基因组的5'utr的497个碱基融合至1ab区域的3'部分(752个碱基)和编码cr88 ibv刺突的前72个
碱基，随后为mhv刺突胞外结构域的3753个碱基，接着是cr88 ibv刺突的末端210个碱基和直到基因组的3'端的随后序列。另外，分别地，将saci限制性位点和t7启动子的序列加入供体区域的5'端，以及100x多聚a序列，随后为在3'端处用于线性化的noti限制性位点。在组装序列的位置5634处引入沉默的a至c突变，以生成xhoi限制性位点。将合成的序列插入puc57-simple内，以产生puc57-scr88 mibv供体质粒(seq id no:12)。
[0625]
cr88 mibv的拯救
[0626]
cr88 mibv与h52 mibv类似地进行拯救(van beurden等人virol j.2017；14(1):109)，伴随一些改变：病毒尿囊液原液经由超速离心进行浓缩，然后分离病毒rna用于电穿孔。将18ml病毒尿囊液通过tne(tris、nacl、edta)缓冲液中的2ml20％蔗糖垫以50,000x g离心2小时。弃去上清液，并且将团块重悬浮于150μl tne缓冲液中，随后为用qiaamp病毒rna微型试剂盒(qiagen)的rna分离。进一步地，使用鸡胚成纤维细胞(cef)代替bhk细胞用于电穿孔(2次脉冲250v/300μf，10秒中断)，并且将1.25％dmso加入电穿孔混合物中。
[0627]
供体质粒构建
[0628]
具有侧翼序列的cr88刺突核酸序列由商业供应商合成，并且克隆到pgem-t(seq id no:13)内。它用作定点诱变的模板，以将在ibv cr88刺突(seq id no:11)的氨基酸位置269处的亮氨酸改变成半胱氨酸(seq id no:3)。为此，使用了根据制造商的方案的quikchangemulti site-directed mutagenesis kit(agilent technologies)、以及通过相应的在线工具设计的引物po1886(表5)。通过限制性消化鉴定阳性克隆，并且通过使用引物po618和po1410(表5)的桑格测序分析所需突变的存在。对于puc57-s cr88 ribv s l269c供体质粒(seq id no:14)的生成，用paci、xhoi和pvui消化含有突变的cr88刺突序列(seq id no:15)的pgem-t cr88 s l269c质粒。从凝胶中切割与刺突相对应的条带，并且用qiaquick凝胶提取试剂盒(qiagen)进行纯化。进一步地，cr88 mibv供体质粒(seq id no:12)用paci、xhoi和kpni进行消化，以获得供体质粒主链。从凝胶中切割具有最高分子量的条带，并且经由qiaquick gel extraction kit(qiagen)进行纯化。使用t4dna连接酶(thermofisher scientific)，将纯化的刺突插入物和cr88供体质粒主链在16℃下连接过夜。通过热休克将连接混合物转化到neb 5-α感受态大肠杆菌(neb)内。在genejet plasmid miniprep kit(thermofisher scientific)后，通过限制性消化鉴定阳性克隆，并且通过使用引物po618、po1014(表5)的桑格测序来表征靶向突变。
[0629]
靶向rna重组和重组ibv的拯救
[0630]
对于cr88 ribv s l269c的拯救，lr7细胞用cr88 mibv进行感染，并且用由noti线性化的puc57-s cr88 s l269c供体质粒生成的体外转录物进行电穿孔，并且随后注射到8日龄的spf含胚鸡蛋(valo biomedia)内。在孵化长达8天后，使用magmax
tm core nucleic acid purification kit(thermofisher)和kingfisher
tm duo prime purification system(thermofisher)，并且通过使用具有platinum
tm taq dna polymerase的superscript
tm iii one-step rt-pcr system(thermofisher)，对于rna分离后的重组ibv的拯救，分开分析所有蛋的尿囊液。在cr88 ibv 1ab和cr88 ibv s刺突中结合的引物po1728和po1729(表5)用于区分重组ibv与mibv。用最高稀释度的lr7细胞接种的蛋的阳性尿囊液用于8日龄的spf含胚蛋中的终点稀释。如上所述进行核酸分离。经由根据改编自callison等人(j virol methods.2006；138(1-2):60-5)的方案进行的rt-qpcr来分析样
品。简言之，使用相同的引物和探针，并且温度曲线适于fast virus 1-step master mix(thermofisher)和steponeplus或abi7900 ht fast real-time pcr systems(thermofisher scientific)的使用。其后，一种检测呈阳性的高稀释度的尿囊液用于在8日龄的spf含胚鸡蛋中的繁殖。尿囊液在1xpbs中进行1:100稀释，并且注射100μl/蛋，所述蛋随后在37.5℃和60％湿度下孵化。在接种后48小时收获尿囊液，清除碎片并贮存于-80℃下。
[0631]
表5获得cr88 s l269c突变的sdm引物、以及用于确认靶向突变和确认cr88ribv拯救的测序引物。
[0632]
seq id no:名称序列43po1886gtatatcgagaaagtagcactaacactacttgtaagttaactaatttcagttttactaatg19po618taaatggtgatcttgttt44po1410tttgtatacgagagccatca45po1728tcagcgtggacatgtggtta46po1729ccccatataggtgccaacct
[0633]
重组ibv的体外表征和卵内表征
[0634]
如对于h52 ribv s f267c所述的，确定关于cr88 ribv s l269c的胚胎感染剂量50％(eid
50
)和组织培养感染剂量50％(tcid
50
)。进一步地，如对于h52 ribv s f267c所述的，进行卵内和体外复制动力学和传代。
[0635]
对于cr88 ribv野生型和cr88 ribv s l269c，观察到相似的卵内复制动力学(图10)。这提示了如h52 ribv s f267c和h52 ribv野生型所示的，与野生型ribv cr88相比，对于突变的ribv的卵内复制效率，在cr88 ribv s l269c的刺突中的半胱氨酸突变并无不利之处。
[0636]
为了分析cr88 ribv s l269c是否能够在细胞中复制，用尿囊液原液的1/100稀释物接种细胞。在第一次传代和随后的传代中，在72小时后通过降低的ct值检测到病毒的繁殖。由于用于下一次传代的病毒的稀释，ct值与在接种物收获时测量的ct值相比增加，然后在72小时培养期间由于病毒复制而再次降低。通过与感染后直接的0小时时间点相比，关于72小时时间点降低的ct值，cr88 ribv s l269c的复制在传代过程中是明确可见的。相比之下，cr88 ribv野生型阴性对照的ct值确认了，在传代过程中任何分析的传代以及初始接种物的稀释中，不存在关于这种病毒的复制(图11)。结果明确地显示了cr88 ribv l269c在细胞中经过7次传代的复制，而野生型病毒不能复制，突出显示了刺突中的l269c突变对于扩展的细胞嗜性或组织嗜性是至关重要的。关于cr88 ribv s l269c的有效复制也在细胞中的复制动力学实验中，经由rt-qpcr(图12)和tcid
50
确定(图13)进行检测。
[0637]
另外，确定了关于尿囊液原液(103tcid
50
/ml、108eid
50
/ml)，以及传代p1(10
3.5
tcid
50
/ml、10
5,84
eid
50
/ml)、p5(10
5.3
tcid
50
/ml)和p8(106tcid
50
/ml、106eid
50
/ml)的感染滴度。它们确认了cr88 ribv s l269c在传代过程期间的有效复制以及在spf蛋中的持续感染性。因此，l269c突变使得能够在细胞系中复制，而不扰乱在卵内复制的能力。
[0638]
疫苗功效的确定
[0639]
如上文对于h52 ribv s f269c所述的，进行关于cr88 ribv s l269c针对用
ibv793b的攻击的功效测试。该研究的目的是证实在细胞中传代一次的细胞培养适应的cr88 ribv s l269c，能够赋予针对由强毒793b毒株的攻击的保护。每天观察所有鸡的临床体征。在疫苗接种或攻击后没有记录到临床体征。关于在1日龄时用cr88ribv s l269c进行疫苗接种的反向滴定，分别确定了10
3.6
eid
50
/动物(靶103eid
50
/动物)的滴度，以及对于在疫苗接种后21天用ibv 793b的攻击，10
4.1
eid
50
/动物(靶104eid
50
/动物)的滴度。纤毛停滞如表3中所述进行评分，并且结果在图14中进行描绘且在表6中进行概括。严格阴性对照的所有动物都显示了正常的纤毛运动，而攻击对照组的5只动物中的4只对于纤毛停滞呈阳性。相比之下，80％的用cr88 ribv s l269c进行疫苗接种的动物受到保护。
[0640]
表6关于在疫苗接种后28天和攻击后7天的保护的纤毛停滞评分概括。通过将每组的各个鸡的总评分相加，并且将组总和除以动物数目，来计算平均纤毛停滞评分/组(最高可能评分40，最低可能评分0)。对于不受影响的动物，10个气管外植体中的至少9个显示了正常的纤毛活性。
[0641][0642]
另外，与攻击对照相比，病毒rna载量在用cr88 ribv s l269c进行疫苗接种的动物肾脏中显著减少(图15)。总之，在细胞中繁殖的cr88ribv s l269c有效地保护免于强毒793b的攻击。刺突突变l269c使病毒适应细胞中的繁殖，同时体内功效得到持续。
[0643]
实施例2的结论：数据显示了，在对应于cr88刺突中的位置269的刺突位置267(关于编号的参考序列为seq id no:1)处向半胱氨酸的突变，也导致重组ibv cr88中扩展的细胞嗜性或组织嗜性。进一步地，所述突变对病毒的卵内复制没有影响。最后，即使在细胞系中繁殖后，疫苗功效也是持续的，对于无需卵内培养，而是使用细胞系的成功的ibv疫苗开发奠定了基础。
[0644]
实施例3：嵌合重组ibv cr88或h52的生成，其中cr88或h52刺突基因替换为qx刺突基因，其中刺突蛋白的氨基酸270突变为半胱氨酸
[0645]
为了进一步详细说明为了实现细胞培养嗜性，在刺突的位置267处向半胱氨酸的改变是否可以转移到另外的ibv基因型，将qx刺突氨基酸(seq id no:65)序列与h52刺突氨基酸序列(seq id no:1)进行比对，以确定对于ibv qx刺突，等价于h52刺突的氨基酸位置267的位置，其被确定为在qx刺突的位置270处的亮氨酸。
[0646]
为了分析在氨基酸位置270处具有向半胱氨酸的突变的qx刺突感染细胞的潜力，生成了重组ibv cr88和重组ibv h52，其中编码cr88刺突或h52刺突的序列分别替换为编码在刺突蛋白的位置270处具有半胱氨酸的qx刺突的序列(seq id no:4)。为此，如实施例1和2中所述的，进行用于构建和拯救h52 mibv和cr88 mibv的步骤。
[0647]
qx刺突基因的克隆和突变
[0648]
qx刺突序列使用引物po1367和po1347(表7)，经由一步rt-pcr(iii one-step rt-pcr，taq)，从ibv qx病毒rna中进行扩增，并且使用pgem-t载体系统(promega)进行克隆。它充当使用由nebasechanger设计的引物po2163和po2164(表7)的
定点诱变的模板，以生成质粒pgem-t ibv qx s l270c(seq id no:66)。为了鉴定具有携带所需突变的质粒的克隆，在阳性限制性消化后，进行使用定位于侧接突变的区域中的引物po1398和po633(表7)的桑格测序。
[0649]
表7：用于qx刺突序列的克隆和定点诱变的引物
[0650]
seq id no名称序列47po1367cgcggatccgccaccatgttggtgaagtcactg48po1347gcggcggccgcttaaacagactttttaggtctg49po2163taatactacttgtgcgttaactaattttacttttagtaatg50po2164acactactttcacgatag51po1398aatttaacagttagcgtatc21po633cgctcttagtaacataaac
[0651]
供体质粒构建
[0652]
使用hifi dna assembly cloning kit(neb)和用于引物设计的在线工具，来构建puc57-s h52 ribv qx s l270c供体质粒(seq id no:69)。为此，使用接近于h52刺突编码序列的限制性位点ecorv、pmli和blpi消化puc57-s h52 ribv供体质粒(seq id no:9)，以使质粒线性化，并且去除h52刺突和侧翼序列。qiaquick凝胶提取试剂盒(qiagen)用于纯化对应于不含h52刺突编码序列的puc57-s ibv h52主链的条带。qx s l270c核酸编码序列以及侧翼的5'和3'ibv h52序列，在使用high-fidelity dna polymerase(neb；关于引物参见表8)的三个分开的pcr反应中进行扩增。pcr产物通过qiaquick凝胶提取(qiagen)进行纯化，并且根据试剂盒方案，用于由hifi dna assembly cloning kit(neb)的gibson组装，以生成puc57-s h52 ribv qx s l270c(seq id no:69)供体质粒。
[0653]
使用hifi dna assembly cloning kit(neb)和用于引物设计的在线工具，来构建puc57-s cr88 ribv qx s l270c供体质粒(seq id no:68)。生成了两种pcr片段：一种用于使用puc57-s cr88 ribv(seq id no:67)作为模板的cr88主链，而一种用于使用pgem-t ibv cr88 s l270c(seq id no:66)作为用于q5 pcr的模板的突变的qx刺突l270，使用表8中的引物。pcr产物用qiaquick凝胶提取试剂盒(qiagen)进行凝胶纯化，然后根据试剂盒方案，将它们用于gibson组装，以生成puc57-s cr88 ribv qx s l270c供体质粒(seq id no:68)。
[0654]
表8：使用nebuilder在线工具设计的引物，用于puc57-s cr88 ribv qx l270c供体质粒(pcr1、2)和puc57-s h52 ribv qx l270c(pcr3、4、5)的gibson组装
[0655][0656]
puc57-s cr88 ribv qx s l270c和puc57-s h52 ribv qx s l270c的成功组装，通过分别用nhei和noti或ecorv、blpi和pmli的质粒限制性消化进行鉴定，并且通过用表9中的引物测序进行表征。
[0657]
表9：用于uc57-s cr88 ribv qx s l270c和puc57-s h52 ribv qx s l270c供体质粒的测序的引物。
[0658]
seq id no引物名称序列56po1565caggattgtgcatggtggac51po1398aatttaacagttagcgtatc57po2090gaagtgaayacaagatcaccattt58po1420tgactgattctgctgctaaa44po1410tttgtatacgagagccatca59po1421tcttgaaacccccaagtag60po1425tatattcagcatcagttggc61po1422ggattttgtggtagtggaag62po1575ccactattgcagtaacattaaca63po1567ctagactgtaagttactattg
[0659]
靶向rna重组和重组ibv的拯救
[0660]
对于cr88 ribv qx s l270c和h52 ribv qx s l270c的拯救，lr7细胞分别用cr88 mibv或h52 mibv进行感染，并且分别用由noti或mssi线性化的puc57-s cr88ribv qx s l270c或puc57-s h52 ribv qx s l270c供体质粒生成的体外转录物进行电穿孔，并且随后注射到8日龄的spf含胚鸡蛋(valo biomedia)内。在孵化长达8天后，使用magmax
tm core nucleic acid purification kit(thermofisher)和kingfisher
tm duo prime purification system(thermofisher)，并且通过使用具有platinum
tm taq dna polymerase的superscript
tm iii one-step rt-pcr system(thermofisher)，对于rna分离后的重组ibv的拯救，分开分析一些蛋的尿囊液。在qx刺突序列中结合的引物po1398和po633(表7)用于鉴定重组病毒的拯救。用最高稀释度的lr7细胞接种的蛋的阳性(通过胚胎死亡或阳性rt-pcr结果定义)尿囊液用于8日龄的spf含胚蛋中的终点稀释。如上所述进行核酸分离。经由根据改编自callison等人(j virol methods.2006；138(1-2):60-5)的方案进行的rt-qpcr来分析样品。简言之，使用相同的引物和探针，并且温度曲线适于
fast virus 1-step master mix(thermofisher)和steponeplus或abi7900 ht fast real-time pcr systems(thermofisher scientific)的使用。其后，一种检测呈阳性的优选高稀释度的尿囊液用于在8日龄的spf含胚鸡蛋中的繁殖。尿囊液在1xpbs中进行1:100稀释，并且注射100μl/蛋，所述蛋随后在37.5℃和60％湿度下孵化。在接种后48小时收获尿囊液，清除碎片并贮存于-80℃下。
[0661]
重组ibv的体外表征和卵内表征
[0662]
如对于h52 ribv s f267c所述的，确定关于cr88 ribv qx s l270c和h52 ribv qx s l270c的胚胎感染剂量50％(eid
50
)和组织培养感染剂量50％(tcid
50
)。进一步地，如对于h52 ribv s f267c所述的，进行卵内和体外复制动力学和传代。
[0663]
对于cr88 ribv qx s l270c和h52 ribv qx s l270c，观察到在48小时后类似的峰值ct值，伴随卵内复制动力学中的轻微不同(图16)。虽然cr88 ribv qc l270c的复制非常类似于cr88 ribv和ibv qx野生型，但h52 ribv qx s l270c的复制与h52 ribv更类似。这提示了与其它ribv或野生型ibv相比，对于突变的ribv的卵内复制效率，在cr88 ribv qx s l270c和h52 ribv qx s l270c的刺突中的半胱氨酸突变并无不利之处。
[0664]
为了分析cr88 ribv qx s l270c和h52 ribv qx s l270c是否能够在细胞中复制，用尿囊液原液的1/100稀释物接种细胞。通过病毒rna的分离和后续rt-qpcr分析来分析病毒的繁殖。通过与感染后直接的0小时时间点相比，关于72小时时间点降低的平均ct值，cr88 ribv qx s l270c和h52 ribv qx s l270c的复制在传代过程中是明确可见的(图17和18)。由于用于下一次传代的病毒的稀释，ct值与在接种物收获时测量的ct值相比增加，然后在72小时培养期间由于病毒复制而再次降低。关于cr88 ribv qx s l270c和h52 ribv qx s l270c的有效复制也在细胞中的复制动力学实验中，经由rt-qpcr(图19)进行检测。两种病毒均展示了相似的复制模式，具有在48小时后的峰值ct值。
[0665]
另外，确定了关于cr88 ribv qx s l270c的尿囊液原液(108eid
50
/ml)，以及传代p2(106tcid
50
/ml、10
8.17
eid
50
/ml)、p6(106tcid
50
/ml、10
7.83
eid
50
/ml)和p9(106tcid
50
/ml、10
8.5
eid
50
/ml)的感染滴度。进一步地，确定了关于h52 ribv qx s l270c的尿囊液原液(108eid
50
/ml)，以及传代p3(10
4.5
tcid
50
/ml、10
8.13
eid
50
/ml)和p6(10
5.5
tcid
50
/ml、10
8.13
eid
50
/ml)的感染滴度。它们确认了cr88 ribv qx s l270c在传代过程期间的有效复制以及在spf蛋中的持续感染性。因此，l270c突变使得能够在细胞系中复制，而不扰乱在卵内复制的能力。
[0666]
疫苗功效的确定
[0667]
如上文对于h52 ribv s f269c所述的，进行关于cr88 ribv qx s l270c和h52ribv qx s l270c针对用ibv d388 qx的攻击的功效测试。该研究的目的是证实在细胞中传代六次的细胞培养适应的cr88 ribv qx s l270c和h52 ribv qx s l270c，能够赋予针对由强毒d388 qx毒株的攻击的保护。每天观察所有鸡的临床体征。在疫苗接种或攻击后没有记录到临床体征。关于在1日龄时用cr88 ribv qx s l270c和h52 ribv qx s l270c进行疫苗接种的反向滴定，分别确定了10
4.2
eid
50
/动物(靶103eid
50
/动物)和10
3.3
eid
50
/动物(靶103eid
50
/动物)的滴度，以及对于在疫苗接种后21天用ibv d388 qx的攻击，10
3.5
eid
50
/动物(靶103eid
50
/动物)的滴度。纤毛停滞如表3中所述进行评分，并且结果在图20中进行描绘且在表10中进行概括。严格阴性对照的所有动物都显示了正常的纤毛运
polymerase(neb；关于引物参见表11)的三个分开的pcr反应中进行扩增。pcr产物通过qiaquick凝胶提取(qiagen)进行纯化，并且根据试剂盒方案，用于由hifi dna assembly cloning kit(neb)的gibson组装，以生成puc57-s h52 ribv arkdpi s ecto l274c(seq id no:79)供体质粒。
[0677]
表11：使用nebuilder在线工具设计的引物，用于puc57-s h52 ribv arkdpi s ecto l274c的gibson组装。
[0678][0679][0680]
puc57-sh52 ribv arkdpisectol274c的成功组装，通过用blpi和xhoi的质粒限制性消化进行鉴定。
[0681]
靶向rna重组和重组ibv的拯救
[0682]
对于h52 ribv arkdpi s ecto l274c的拯救，lr7细胞分别用h52 mibv进行感染，并且用由mssi线性化的puc57-s h52 ribv arkdpi s ecto l274c供体质粒生成的体外转录物进行电穿孔，并且随后注射到8日龄的spf含胚鸡蛋(valo biomedia)内。在孵化长达8天后，使用magmax
tm core nucleic acid purification kit(thermofisher)和kingfisher
tm duo prime purification system(thermofisher)，并且通过使用具有platinum
tm taq dna polymerase的superscript
tm iii one-step rt-pcr system(thermofisher)，对于rna分离后的重组ibv的拯救，分开分析一些蛋的尿囊液。在arkdpi刺突序列中结合的引物po1317和po633(表12)用于鉴定重组病毒的拯救。用最高稀释度的lr7细胞接种的蛋的阳性(通过胚胎死亡或阳性rt-pcr结果定义)尿囊液用于8日龄的spf含胚蛋中的终点稀释。如上所述进行核酸分离。经由根据改编自callison等人(j virol methods.2006；138(1-2):60-5)的方案进行的rt-qpcr来分析样品。简言之，使用相同的引物和探针，并且温度曲线适于fast virus 1-step master mix(thermofisher)和steponeplus或abi7900 ht fast real-time pcr systems(thermofisher scientific)的使用。其后，一种检测呈阳性的优选高稀释度的尿囊液用于在8日龄的spf含胚鸡蛋中的繁殖。尿囊液在1xpbs中进行1:100稀释，并且注射100μl/蛋，所述蛋随后在37.5℃和60％湿度下孵化。在接种后48小时收获尿囊液，清除碎片并贮存于-80℃下。
[0683]
表12：用于检测h52 ribv arkdpi s ecto l274c的引物。
[0684]
seq id no引物名称序列84po1317taatactggyaatttttcaga21po633cgctcttagtaacataaac
[0685]
重组ibv的体外表征
[0686]
如对于h52 ribv s f267c所述的，确定关于h52 ribv arkdpi s ecto l274c的胚
胎感染剂量50％(eid
50
)和组织培养感染剂量50％(tcid
50
)。进一步地，如对于h52ribv s f267c所述的，进行体外复制动力学和传代。
[0687]
为了分析h52 ribv arkdpi s ecto l274c是否能够在细胞中复制，对于第一次传代用尿囊液原液的1/10稀释物，并且对于后续传代用1/10或1/100稀释物来接种细胞。通过病毒rna的分离和后续rt-qpcr分析来分析病毒的繁殖。通过与感染后直接的0小时时间点(21.09)相比，关于72小时时间点(11.59)降低的平均ct值，h52ribv arkdpi s ecto l274c的复制在三次传代后是明确可见的。
[0688]
实施例4的结论：数据显示了，在对应于ibv arkdpi刺突中的位置274的刺突位置267(关于编号的参考序列为seq id no:1)处向半胱氨酸的突变，也导致扩展的细胞嗜性或组织嗜性。另外，具有半胱氨酸突变的刺突的组织培养嗜性并不限于同源遗传背景，因为arkdpi l274c刺突胞外结构域插入h52遗传主链内，并且h52 ribv arkdpi s ecto l274c在细胞中有效地复制。