1.本发明涉及一种对严重发热伴血小板减少综合征病毒的疫苗组合物。
背景技术：
2.发热伴血小板减少综合征(severe fever with thrombocytopenia syndrome，sfts)是一种因为感染发热伴血小板减少综合征病毒(sfts virus，sftsv)而导致的感染性疾病。自从于2009年在中国第一次报道以来，在中国、韩国、日本以及越南等亚洲国家陆续有相关的病例报告。stfsv作为基因组包括三个分段核糖核酸(rna)，分别对rna聚合酶(rdrp)、两个包膜糖蛋白(gn、gc)、核衣壳(np)以及非结构蛋白(ns)进行编码。在感染所述病毒时，会伴有发热、胃肠道并发症、白细胞减少症以及血小板减少症症状，其致死率达到5～20％(lancet infect dis 2018,18,1127-1137,doi:10.1016/s1473-3099(18)30293-7)。目前为止还没有治疗药剂，正在进行疫苗开发。
3.stfs疫苗开发目前还处于初期研究阶段，最近已经有报告指出了利用重组病毒载体的疫苗或脱氧核糖核酸(dna)疫苗可以在感染动物模型中提供保护免疫的事实(npj vaccines 2019,4,5,doi:10.1038/s41541-018-0096-y；nat commun 2019,10,3836,doi:10.1038/s41467-019-11815-4)。已经确认了利用ns的疫苗可以诱导抗体的形成，但是在小鼠感染模型中没有能够提供保护免疫(viral immunol 2015,28,113-122,doi:10.1089/vim.2014.0100)。已经有报告指出在利用显微操作针对用于对np以及ns基因进行编码的dna进行免疫时，可以诱导所述抗原的特异性t细胞反应，但是目前还没有能够确定在动物感染模型中是否可以提供保护免疫(colloids surf b biointerfaces 2017,159,54-61,doi:10.1016/j.colsurfb.2017.07.059)。最近，有论文报告称在对表达gn以及gc蛋白的重组病毒(live attenuated recombinant vesicular stomatitis virus，rvsv)进行一次免疫时可以诱导中和抗体的形成，而且在被达到致死量的stfsv感染的第一型干扰素受体基因敲除(knock-out，ko)小鼠中可以诱导完美的保护免疫(npj vaccines 2019,4,5,doi:10.1038/s41541-018-0096-y)。此外，有报告指出在对分别表达sftsv的五个基因的dna同时进行免疫时、对用于对gn以及gc进行编码的两种dna同时进行免疫时、以及对用于对np、ns以及rdrp进行编码的三种dna同时进行免疫时，可以对易感染sftsv的老龄黄鼠狼(四岁以上)的致死感染提供免疫保护(nat commun 2019,10,3836,doi:10.1038/s41467-019-11815-4)。但是，目前为止并没有报告指出在对各个结构蛋白(gn、gc、np)分别进行免疫时可以提供哪种程度的保护免疫，而且也没有发表与利用所述蛋白的亚单位蛋白疫苗的功效相关的研究成果。
4.本发明公开一种gn蛋白、gc蛋白以及np蛋白的疫苗功效。
5.发明详述
6.技术问题
7.本发明的目的在于提供一种利用gn蛋白、gc蛋白以及np蛋白的对sfts病毒的疫苗组合物。
8.本发明的其他目的或具体的目的将在后续的内容中进行说明。
9.解决问题的手段
10.如下述实施例所示，本发明人比较验证了将gn或gc蛋白的胞外结构域(extracellular domain)融合到人类抗体fc部位的重组单位(gn-fc以及gc-fc)以及np蛋白(全长序列蛋白)是否可以单独免疫第一型干扰素受体ko小鼠并提供免疫保护。其结果，利用gc-fc蛋白免疫的小鼠全部死亡，但是与对照组(仅利用fc免疫的组)相比其生存时间呈现出了具有统计学意义的增加，而且利用gn-fc蛋白免疫的小鼠有50％生存，利用np蛋白免疫的小鼠有60％生存，借此可以确认分别具有显著的保护免疫提供效果。此外，在对gn-fc以及gc-fc与np进行混合之后免疫第一型干扰素受体ko小鼠并确认其保护免疫是否得到提升时，在gc-fc与np混合免疫的情况下有80％生存，在gn-fc与np混合免疫的情况下有70％生存，而在gn-fc以及gc-fc与np混合免疫的情况下有60％生存，借此可以确认，从整体上来讲混合免疫的情况与单独免疫的情况相比其生存率得到了提升。
11.本发明是以如上所述的实验结果为基础提供，本发明的疫苗组合物涉及一种作为活性成分包含gc蛋白的胞外结构域、gn蛋白的胞外结构域、全长np蛋白或所述之两种以上的混合物的对sfts病毒的疫苗组合物。
12.在本发明中，尤其是gc蛋白的胞外结构域或gn蛋白的胞外结构域可以为了提升生体内的半衰期而采用融合到人类抗体fc部位的形态，而在与fc融合的情况下，为了防止各个融合蛋白不会对彼此之间的三维结构的形成造成干扰，可以配置具有2～15个氨基酸的铰链(hinge)序列。此外，为了通过基因重组方式利用宿主细胞生产如上所述的蛋白，如下述实施例所述，可以通过在n端配置信号肽(signal peptide)序列而更加轻易地实现分离以及提纯。因为如上所述的序列在相应的蛋白分泌到细胞外部时会被去除，因此在经过分离以及提纯的蛋白中并不存在。
13.在本说明书中，“疫苗”是指通过在宿主即人类体内诱导对相应病原体的免疫反应而预防相应病原体的感染或重新感染、减轻或消除因为相应病原体而导致的症状、或实质上或完全消除相应病原体或因为相应病原体而导致的疾病。因此，本发明的疫苗组合物可以在感染相应病原体之前以预防为目的向人类给药，或在感染相应病原体之后以治疗为目的向人类给药。其中，所述“免疫反应”是指体液性免疫反应、细胞性免疫反应或所述两者。
14.此外，在本说明书中，“活性成分”是指可以单独诱导免疫反应或可以与其自身无法诱导免疫反应的载体一起诱导免疫反应的成分。因此，活性成分自身并不一定需要具有免疫原性(可以诱导免疫反应的能力)。在本发明中，所述活性成分经过提纯为宜，但并不是必须如此。其中，“经过提纯”是指相应的目标物质存在的原始有机体(即本发明中发生形质转化的微生物)中的细胞成分或其培养液成分等(属于污染物质)实质性减少或被去除的状态。污染物质实质性减少或被去除的状态是指纯度为50％以上，较佳地为90％以上，更较佳地为99％以上。纯度可以通过如色谱柱、凝胶电泳以及免疫学分析等相关行业所公知的方法进行评估，而提纯方法也可以使用后续说明的相关行业所公知的方法。
15.本发明的疫苗组合物可以被制造成任何适当的且药学上可接受的制剂。例如，可以制造成即席给药溶液或悬浮液形态，或适合于在给药之前进行稀释的浓缩原液形态，或如冻结干燥、冷冻-干燥或冷冻制剂形态等可重新调制的形态。
16.本发明的疫苗组合物可以在制剂化时包括药学上可接受的载体。关于可以在对疫
苗组合物进行制剂化时使用的药学上可接受的载体，在大韩民国药典或其他国家的药典尤其是美国、日本以及欧洲的药典上进行了列举以及规定，具体信息可以参阅这些药典。
17.如上所述的载体，通常可以包括如稀释剂、赋形剂、稳定剂以及防腐剂等。作为适当的稀释剂，可以以如丙二醇、聚乙二醇以及植物油(如橄榄油以及花生油等)等非水性溶剂或如盐水(较佳地为0.8％的盐水)以及包含缓冲介质的水(较佳地为0.05m的磷酸盐缓冲液)等水性溶剂为例，作为适当的赋形剂，可以以如淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩土、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、无水脱脂乳、甘油、丙烯、乙二醇、水以及乙醇等为例，而作为适当的稳定剂，可以以如山梨糖醇、甘露糖醇、淀粉、这趟、葡聚糖、谷氨酸以及葡萄糖等碳水化合物或如动物性、植物性或微生物性蛋白(如奶粉、血清白蛋白以及酪蛋白等)等蛋白为例。作为适当的防腐剂，可以以如硫汞撒、硫柳汞、庆大霉素、新霉素、制霉菌素、两性霉素b、四环素、青霉素、链霉素以及多粘菌素b等为例。
18.本发明的疫苗组合物还可以追加包含抗原佐剂(adjuvant)。抗原佐剂可以由可强化对抗原的免疫反应的一种以上的物质构成。佐剂可以起到用于缓慢释放抗原的组织贮存库和/或用于非特异性地强化免疫反应的淋巴系统激活剂的功能(hood et al.,immunology,second ed.,1984,benjamin/cummings:menlo park,california,p.384)。抗原佐剂可以是如弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、皂苷、凝胶性状的铝佐剂、表面活性物质(如溶血卵磷脂、聚醚二醇、聚阴离子、肽、油以及烃乳液等)、植物油(如棉籽油、花生油或玉米油等)、维生素e醋酸酯等。
19.目前在可适用于人体的抗原佐剂中使用最为广泛的是铝佐剂，而如上所述的铝佐剂是以如磷酸铝(aluminum phosphate)、硫酸铝钾(potassium aluminum sulfate)以及氢氧化铝(aluminum hydroxide)等铝盐(aluminium salts)的凝胶性状使用。目前已经得知如上所述的铝佐剂可以通过引发th2-type的免疫反应而强化免疫反应(sokolovska a et al.,vaccine.2007jun 625(23):4575-85；o'hagan dt and rappuoli r.，pharm res.2004sep；21(9):1519-30.)。在本发明的实施例中使用的invivogen公司的alhydrogel为氢氧化铝(aluminium hydroxide)的凝胶形态悬浮液(colloidal)。作为如上所述的铝佐剂，可以按照相关行业所公知的制造方法(r.bomford.immunological adjuvants and vaccines.nato asi series 1989；179:35-41；vogel fr and powell mf.pharm biotechnol.1995；6:141-228.；derek t.o'hagan,methods in molecular medicine.2000；april 15；42:65-90)直接制造使用，或购买在市面上流通的产品使用。作为在市面上流通的产品，可以以包括在下述实施例中使用的invivogen公司的alhydrogel 2％产品在内的如sigma公司的aluminum hydroxide gel产品以及brenntag公司的alhydrogel
tm
产品等为例。
20.本发明的疫苗组合物可以以任意的单位容量制造。单位容量是指以向人类进行一次以上的给药为目的进行包装的单个产品中所包含的活性成分以及药学上可接受的载体的量，如上所述的活性成分以及载体的适当的量是在利用本发明的疫苗组合物进行一次以上的接种时可以起到作为疫苗的功能的量，而如上所述的量可以在相关从业人员的一般的能力范围内通过非临床或临床方式决定。
21.本发明的疫苗组合物较佳地可以通过如直肠、经皮、静脉内注射、动脉内注射、肌内注射、皮内注射、皮下注射、腹膜内注射以及心室内注射等非经口的方式进行给药。
22.本发明的疫苗组合物可以通过调节释放系统进行给药。例如，作为如上所述的调节释放系统，可以以如脂质体、植入式渗透泵以及经皮贴剂等方式为例。较佳地，可以利用脂质体方式对活性成分进行传递。关于利用脂质体方式对活性成分进行传递的内容，可以参阅如文献[langer,science 249:1527-1533(1990)]以及文献[treat at al.,in liposomes in the therapy of infectious disease and cancer,lopez-berestein and fidler(des.),liss,new york,pp.353-365(1989)]等。关于其他活性成分的传递方式，可以参阅文献[langer,supra；sefton,crc crit.ref.biomed.eng.14:201(1987)]、文献[buchwald et al.,surgery 88:507(1980)]、文献[saudek et al.,n.engl.j.med.321:574(1989)]、文献[medical applications of controlled release,langer and wise(eds.),crc pres.,boca raton,florida(1974)]、文献[controlled drug bioavailability.drug product design and performance,smolen and ball(eds.),wiley,new york(1984)]、文献[ranger and peppas,j.macromol.sci.rev.macromol.chem.23:61(1983)]、文献[during et al.,ann.neurol.25:351(1989)]以及文献[howard et al.,j.neurosurg.71:105(1989)]等。如上所述的文献被视为本说明的一部分。
[0023]
本发明的疫苗组合物的给药量，可以由医务人员根据如年龄、体重、性别、症状、并发症以及是否患有其他疾病等患者的特性决定。
[0024]
此外，给药的时间间隔以及次数可以根据所使用的剂型或活性成分在血液中的半衰期等决定。
[0025]
如上所述，给药量和给药的时间间隔以及次数应该取决于医务人员的判断并由其个人决定，但是通常作为适当的给药量，应该以一天为基准在个人体重每1kg约0.1至10mg的范围内决定，给药间隔应该在3至10天内决定，而给药次数应该在1至5次的范围内决定。
[0026]
在本发明的疫苗组合物中作为活性成分使用的各个蛋白，可以利用对其进行编码的基因通过相关行业公知的dna重组技术制造。如上所述的方法，包括：(i)制造出包含对用于对所述各个蛋白进行编码的基因进行表达的表达载体；(ii)将所述表达载体在宿主细胞中进行形质转化；(iii)对经过形质转化的宿主细胞进行培养；以及，(iv)从所述培养物对所述各个蛋白进行分离以及提纯的步骤。在本说明书中公开了对所述各个蛋白进行编码的基因，而关于利用所述基因通过dna重组技术生产相应的各个蛋白的方法，具体来讲关于包含启动子或终止子等调节序列的信号肽序列、选择标记等的表达载体构成或重组dna技术、形质转化方法、培养基的构成以及形质转化之后的培养方法等，在相关行业中已经积累了相当多的文献，关于各个相关事项可以参阅这些文献。具体来讲，可以参阅如文献(nucl.acid res.14:5399-5467,1986)、文献(tet.lett.27:5575-5578,1986)、文献(nucl.acid res.4:2557,1977)、文献(lett.,28:2449,1978)、文献(sambrook et al.,molecular cloning,a laboratory manual,cold spring harbor laboratory press(2001))、文献(f m ausubel et al,current protocols in molecular biology,john wiley amp；sons,inc.(1994))、文献(marston,f(1987)dna cloning techniques)、文献(cohen,s.n.et al.,proc.natl.acac.sci.usa,9:2110-2114(1973))、文献(hanahan,d.,j.mol.biol.,166:557-580(1983))、文献(dower,w.j.et al.,nucleic.acids res.,16:6127-6145(1988))(capecchi,m.r.,cell,22:479(1980))、文献(graham,f.l.et al.,virology,52:456(1973))、文献(neumann,e.et al.,embo j.,1:841(1982))、文献(wong,
t.k.et al.,gene,10:87(1980))、文献(gopal,mol.cell biol.,5:1188-1190(1985))、文献(yang et al.,proc.natl.acad.sci.,87:9568-9572(1990))(maniatis et al.,molecular cloning:a laboratory manual,cold spring harbor laboratory(1982))、文献(hitzeman et al.,j.biol.chem.,255,12073-12080(1980))、文献(luchansky et al mol.microbiol.2,637-646(1988))、文献(sambrook,molecular cloning a laboratory mannual,cold spring harbor laboratory press,us(1989))、文献(ausubel等，current protocols in molecular biology,jon willey&sons,us(1993))、文献(sambrook,j.&russel,d.著，molecular cloning,a laboratory manual,cold spring harbor laboratory press,2001年01月15日发行的第一卷以及第二卷)等。
[0027]
发明效果
[0028]
如上所述，本发明可以提供一种作为活性成分包含gc蛋白的胞外结构域、gn蛋白的胞外结构域、全长np蛋白或所述之混合物的对sfts病毒的疫苗组合物。
附图说明
[0029]
图1是对本发明的疫苗组合物的活性成分即gc蛋白、gn蛋白或np蛋白的结构以及分子量进行图示的示意图。
[0030]
图2是本发明的疫苗组合物的活性成分即gc蛋白、gn蛋白或np蛋白的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)结果。
[0031]
图3是基于gn以及gc抗原免疫的特异性抗体诱导以及利用免疫血清的病毒中和能力检查结果(a：对gn以及gn蛋白的抗体滴度，b以及c：对sfts病毒的中和能力分析试验，frnt：病灶减少中和滴度)。
[0032]
图4是利用gc蛋白、gn蛋白或np蛋白免疫第一型干扰素受体ko小鼠并对其生存率以及体重变化进行测定的结果。
[0033]
图5是利用gc蛋白、gn蛋白和/或np蛋白的混合物免疫第一型干扰素受体ko小鼠并对其生存率以及体重变化进行测定的结果。
具体实施方式
[0034]
接下来，将参阅实施例对本发明进行详细的说明。但是，本发明的范围并不因为所述实施例而受到限定。
[0035]
《实施例1》作为疫苗抗原使用的病毒蛋白的生产
[0036]
《实施例1-1》作为疫苗抗原使用的病毒蛋白的氨基酸序列
[0037]
利用genbank上的氨基酸信息，生产出了作为疫苗抗原使用的gn蛋白、gc蛋白以及np蛋白。genbank上的氨基酸信息为genbank id：atw63054.1(gn蛋白)、genbank id：aoo85591.1(gc蛋白)以及genbank id：ajo16084.1(np蛋白)。
[0038]
gn以及gc蛋白仅使用了除信号肽(signal peptide)和跨膜结构域(transmembrane domain)以及胞浆结构域(cytoplasmic domain)之外的胞外结构域(extracellular domain)(分别为序列编号1以及2)，而np蛋白使用了全长序列(序列编号3)。
[0039]
《实施例1-2》病毒蛋白基因的克隆以及表达
[0040]
在合成出对gn以及gc蛋白(extracellular domain)进行编码的基因(分别为序列编号4以及5)之后，以如图1所示的方式，将ig kappa轻链(light chain)的信号肽(signal peptide)基因(序列编号6)融合到n端(n-terminal)并将人类(human)igg1 ch2-ch3部位fc结构域(domain)基因(序列编号7)以铰链序列(hinge region)(序列编号8)为媒介融合到c端(c-terminal)的重组基因克隆到pcep4哺乳动物表达载体(mammalian expression vector)。将用于对在n端以及c端分别连接有6his(以提纯为目的使用)的np蛋白进行编码的基因(序列编号9)克隆到pet28a载体(vector)。通过将经过克隆的基因分别导入到hek93t细胞(gn，gc)以及e.coli bl21(np)而诱导了蛋白表达，并分别利用蛋白a/g柱(protein a/g column)以及镍-氨基三乙酸柱(ni-nta column)进行了提纯。通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)对经过提纯的蛋白的大小以及纯度进行了确认(图2)。
[0041]
《实施例2》sfts病毒蛋白的免疫以及抗体分析
[0042]
分别利用gn-fc(序列编号10，序列编号10中的n端的dvaqaa氨基酸序列是为了进行克隆而插入的序列)、gc-fc(序列编号11，序列编号10中的n端的dvaqaa氨基酸序列式为了进行克隆而插入的序列)、np(序列编号12)以及人类fc在第一型干扰素受体ko小鼠(n＝4)中以两周为间隔进行三次免疫(20ug/mouse+alum,gn-fc,gc-fc,fc；10ug/mouse+alum,np)，在第三次免疫两周之后采集血液并通过酶联免疫吸附剂测定(elisa)法对gn、gc以及np的抗体滴度进行了测定(图3的a)。可以确认对各个抗原可以生成较高水准的抗体(anti-gn或anti-gc igg平均滴度＝1:4,096，anti-np igg平均滴度＝1:24,576；n＝4/组)，尤其是观察到了对np抗原诱导的抗体滴度较高。为了确认对病毒糖蛋白(gn以及gc)生成的抗体的病毒中和能力，将stfs病毒与免疫血清进行反应并感染到vero细胞之后执行了病灶减少分析(focus reduction assay)(图3的b以及c)。可以确认虽然生成了几乎类似水准的抗体，但是利用gn-fc进行免疫获得的血清与利用gc-fc进行免疫获得的血清相比形成了相对较高的中和抗体滴度，而且与在两种免疫血清中只利用fc进行免疫获得的血清相比具有显著较高水准的病毒中和能力(中和抗体滴度：gn-fc:929
±
1134,gc-fc:209
±
140,fc:42
±
29；n＝4/group,mean titer
±
s.d.)。
[0043]
《实施例3》对sfts病毒蛋白免疫的保护免疫效果
[0044]
分别利用gn-fc、gc-fc、np以及fc在第一型干扰素受体ko小鼠(n＝4～6)中以两周为间隔进行三次免疫(20ug/mouse+alum,gn-fc,gc-fc,fc；10ug/mouse+alum,np)，在第三次免疫两周之后利用103病灶形成单位(foci-forming unit，ffu)的sfts病毒进行了皮下感染。此外，对每天的体重变化以及死亡率进行了观察(图4)。
[0045]
利用磷酸盐缓冲液(bps)进行免疫的小鼠(对照组)的体重逐渐减轻且直至感染第六天为止全部死亡。利用fc进行免疫的小鼠(对照组)从感染第二天开始体重逐渐减轻且直至感染第五天为止全部死亡。利用gc-fc进行免疫的小鼠从感染第四天开始体重逐渐减轻且直至感染第八天为止全部死亡。利用gn-fc进行免疫的小鼠从感染第三天开始体重逐渐减轻且直至感染第八天为止死亡一半，但是剩余的小鼠在之后体重逐渐恢复并存活下来。利用np进行免疫的小鼠从感染第三天开始体重逐渐减轻且直至第八天为止死亡40％，但是剩余的60％的小鼠在之后体重逐渐恢复并存活下来。通过统计学分析可以确认(log-rank(mantel-cox)test)，基于疫苗的生存延长效果(gc-fc组：p＝0.0046)或死亡率减少效果
(gn-fc组：p＝0.0054，np组：p＝0.0023)与对照组相比呈现出了统计学上显著的提升效果。
[0046]
《实施例4》对sfts病毒蛋白混合免疫的保护免疫效果
[0047]
分别利用gn-fc与np的混合物(gn+np，混合比：10ug+10ug)、gc-fc与np的混合物(gc+np，混合比：10ug+10ug)、gn-fc和gc-fc与np的混合物(gn+gc+np，混合比：10ug+10ug)以及磷酸盐缓冲液(bps)(对照)在第一型干扰素受体ko小鼠(n＝7)中以两周为间隔进行三次免疫(20或30ug/mouse+alum)，在第三次免疫两周之后利用103病灶形成单位(foci-forming unit，ffu)的sfts病毒进行了皮下感染。此外，对每天的体重变化以及死亡率进行了观察(图5)。
[0048]
利用磷酸盐缓冲液(bps)进行免疫的小鼠(对照组)的体重逐渐减轻且直至感染第六天为止全部死亡。利用gn+np进行免疫的小鼠从感染第四天开始体重逐渐减轻，在感染第五天死亡14.3％且直至感染第六天为止死亡28.6％，但是剩余的小鼠在之后体重逐渐恢复并存活下来。利用gc+np进行免疫的小鼠从感染第五天开始体重逐渐减轻且在感染第六天死亡14.3％，但是剩余的小鼠在之后体重逐渐恢复并存活下来。利用gn+gc+np进行免疫的小鼠从感染第四天开始体重逐渐减轻且在感染第七天死亡42.9％，但是剩余的小鼠在之后体重逐渐恢复并存活下来。
[0049]
通过统计学分析可以确认(log-rank(mantel-cox)test)，基于疫苗的生存延长效果(gc-fc组：p＝0.0046)或死亡率减少效果(gn-fc组：p＝0.0054，np组：p＝0.0023)与对照组相比呈现出了统计学上显著的提升效果。