磷脂酰丝氨酸结合分子阻断肿瘤相关外泌体的免疫抑制的制作方法

磷脂酰丝氨酸结合分子阻断肿瘤相关外泌体的免疫抑制
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2019年8月15日提交的美国临时申请号62/887,588的优先权，其公开内容通过引用并入本文。
3.关于联邦资助研究的声明
4.本发明是在政府支持下在美国国立卫生研究院(national institutes of health)授予的合同号ca131407下完成。政府对本发明享有一定的权利。


背景技术：

5.先前的研究已经确定，存在于许多不同肿瘤中的肿瘤相关免疫抑制性外泌体能够显著停滞t细胞功能(keller等人,cancer immunol.res.,2015,3(11):1269
–
78)。最近，据报道，癌症患者中黑色素瘤释放的外泌体抑制cd8 t细胞的功能并促进肿瘤生长(chen等人,nature,2018,560(7718):73
–
81)。已知外泌体在其表面展示磷脂酰丝氨酸(ps)和神经节苷脂gd3。先前在临床前研究中使用抗ps抗体和膜联蛋白v以阻断癌症和感染性疾病中的ps或在临床试验中使用ps特异性抗体(巴维妥昔单抗(bavituximab))治疗肺癌的尝试(birge等人,cell death differ.,2016,23(6):962
–
78)取得的成功有限，由于所用分子的ps结合亲和力相对较低。因此，需要开发能够有效阻断t细胞的外泌体抑制的药物。


技术实现要素：

6.本公开提供了结合磷脂酰丝氨酸(ps)的化合物。还提供了包含所述化合物的组合物以及使用所述化合物和/或组合物的方法。
7.在一个方面，本公开提供了包含具有以下结构的支化基团的化合物：
8.[0009][0010]
其中每个r在每次出现时独立地是氢或包含聚(乙二醇)(peg)基团或乙二醇基团、接头基团和端基。化合物还可以具有各种抗衡阴离子。一个或多个r基团可以相同或不同。在各种实例中，一个或多个r基团是氢(例如，对于式ia：一个、两个、三个、四个或五个r基团可以是氢；对于式ib和ic：一个、两个或三个r基团可以是氢，对于式id和ie：一个或两个r基团可以是氢)。
[0011]
端基包括各种芳基基团、杂芳基基团、叔胺和多个二价阳离子。杂芳基基团可以具有各种取代基，例如卤素(-f、-cl、-br和-i)、脂肪族基团(例如烷基基团、烯基基团、炔基基团等)、芳基基团、醇盐基、胺基、羧酸酯基、羧酸、醚基、醇基、炔基(例如，乙炔基基团等)等，及其组合。一个、一些或所有杂芳基可以是例如取代或未取代的吡啶基。二价阳离子可以与叔胺和一个或多个杂芳基螯合。二价阳离子的实例包括但不限于mn
2+
、fe
2+
、co
2+
、ni
2+
、cu
2+
、zn
2+
等。端基可以具有以下结构：
[0012][0013]
其中l是o或-ch
2-并且z是oh、o或h，其中o与m螯合，m是二价阳离子，r'在每次出现时独立地选自氢、卤素(-f、-cl、-br和-i)、脂肪族基团(例如烷基基团、烯基基团、炔基基团等)、芳基基团、醇盐基、胺基、羧酸酯基、羧酸、醚基、醇基、炔基(例如，乙炔基基团等)等，及其组合，并且x是1、2、3或4。在各种实例中，端基具有以下结构：
[0014]
[0015][0016]
在各种其它实例中，端基具有以下结构：
[0017]
[0018][0019]
其中m是二价阳离子，例如zn
2+
。
[0020]
在一个方面，本公开提供了包含一种或多种本公开化合物的组合物。组合物可以包含一种或多种药学上可接受的载体。
[0021]
在一个方面，本公开提供了使用本公开的一种或多种化合物的方法。例如，化合物可用于治疗患有癌症、一种或多种感染性疾病、慢性炎症和/或自身免疫病症的个体。
[0022]
在一个方面，本公开提供了试剂盒。试剂盒可包含含有化合物中的任何一种或任何组合的药物制剂，以及印刷材料。
附图说明
[0023]
为了更全面地理解本公开的性质和目的，应参考结合附图给出的以下详细描述。
[0024]
图1显示了生产(zndpa)
6-dp-15k即exoblock(9)的合成方案，以及每个步骤获得的产率。
[0025]
图2显示了zn-t-dpa(a)和exoblock(b)的结构。(c)exoblock抑制外泌体介导的t细胞活化停滞。pbl未活化(unt)，或在具有外泌体(exo)、外泌体与zn-t-dpa和exoblock(exo+zn-t-dpa和exo+exoblock)或没有外泌体(无exo)的情况下用固定化的cd3和cd28抗体活化2小时。使用共聚焦显微镜检测nfκb表达。
[0026]
图3显示在otx模型中tkt r438w细胞对dm6黑色素瘤的抗原特异性抑制随后是肿瘤逃逸。(a)将gfp+肿瘤靶细胞dm6-wt和dm6-mut植入nsg小鼠的网膜。(b)在肿瘤注射后5天注射到小鼠内的tkt细胞显著抑制dm6-mut而不是dm6-wt肿瘤的生长。(c)dm6-mut肿瘤显示在初始抑制后复发。(d)使用image j计算校正的总荧光。平均值
±
sem**p》0.01。(e)第25天的网膜总图像。
[0027]
图4显示了dm6黑色素瘤otx生长动力学。将用慢病毒表达系统转导以表达荧光素酶的dm6黑色素瘤肿瘤细胞(dm6 luc+)腹腔注射到nsg小鼠(n＝10)中。在不同的时间点，腹腔注射萤光素底物并测量生物发光。(a)第3、14和30天小鼠中dm6 luc+肿瘤负荷的代表性生物发光图像。(b)dm6 luc+肿瘤随时间在小鼠中的生长。(c)tkt r438w t细胞的过继转移抑制dm6-mut肿瘤的肿瘤生长。数据显示为算术平均值，误差线表示sem。*p≤0.05,***p≤0.001。
[0028]
图5显示抗pd-1和脂质体il-12延迟x-小鼠模型中的肿瘤逃逸。(a)实验方案和时间线。(b-c)抗pd-1实验(b)或il-12实验(c)中x小鼠模型中对应天数的肿瘤负荷。使用image j计算校正的总荧光。平均值
±
sem**p≤0.01。
[0029]
图6显示了来源于dm6异种移植物的外泌体的表征：(a)通过纳米颗粒追踪分析所分析的尺寸分布，(b)显示外泌体标志物存在的exo阵列，(c)附着于乳胶珠的外泌体上免疫抑制脂质磷脂酰丝氨酸(ps)和神经节苷脂gd3的存在。显示了未染色的(实心直方图)、二抗对照(虚线)和染色样品(实线)。(d)外泌体抑制t细胞活化。pbl未活化(unact)，或在具有(act+exo)或没有(act)外泌体的情况下用固定化的cd3和cd28抗体活化2小时。过夜孵育后通过流式细胞术检测cd69表达。
[0030]
图7显示了dm6细胞和dm6异种移植物来源的外泌体中的pd-l1表达。(a)在没有(u)或有(t)条件培养基(来自dm6-mut细胞与tkt r438w细胞的48小时共培养)的情况下培养48小时的dm6-mut细胞中的pd-l1表达。(b)来自具有未处理的dm6-mut异种移植物(1)、在第5天用tkt细胞处理的dm6-mut异种移植物(2)的小鼠的腹水来源外泌体中的pd-l1表达。
[0031]
图8显示在x-小鼠模型中exoblock抑制肿瘤生长并且具有与抗pd1治疗相当的功效。(a)实验方案和时间线。(b)第25天来自不同处理组的网膜的代表性图像。(c)表示为使用image j计算的校正的总荧光的肿瘤负荷。第25天未处理组的肿瘤太多而无法准确扫描。n＝4-5只小鼠/组。平均值
±
sem**p≤0.01。
[0032]
图9显示了制备6-臂zn-t-dpa-dp-15k(13)的合成方案。试剂：(i)戊二酸酐、chcl3(ii)s-nhs、edc、dmf(iii)6-arm(dp)-nh2-15k(3)(iv)zn(no3)2·
6h2o。
[0033]
图10显示(a)确定利用(zn-dpa)
6-peg的对来自卵巢腹水的外泌体的抑制作用的
实验设置。(b)利用(zn-dpa)
6-peg对来自卵巢腹水的外泌体的抑制作用。
[0034]
图11显示不同批次的exoblock在逆转外泌体的免疫抑制效果的能力方面是一致的。在存在或不存在外泌体和10μm exoblock的情况下，用固定化的抗cd3和cd28抗体将来自正常供体外周血白细胞(ndpbl)的t细胞活化2小时。通过监测cd69的上调来确定活化百分比。计算抑制和逆转的百分比。
[0035]
图12显示exoblock以剂量依赖性方式竞争性抑制psvue 499与凋亡细胞的结合。将jurkat细胞用10μm依托泊苷处理20h以诱导凋亡。然后用具有等摩尔或滴定摩尔量的exoblock的psvue对细胞进行染色。sytox red用于从分析中剔除死细胞。实验在一式三份孔中进行。代表性数据显示在(a)中，来自等摩尔量exoblock的三个孔的量化数据显示在(b)中。竞争性抑制的剂量依赖性显示在(c)和(d)中，突出了exoblock剂量与psvue荧光检测之间的反比关系。对于(c)，静息细胞中的荧光量显示为基线(21.3
±
5.7)。使用非配对student t检验进行统计分析。ns＝不显著；**p《0.01。
[0036]
图13显示(a)聚合物臂前体、(b)批次1exoblock、(c)批次2exoblock、(d)批次3exoblock、(e)批次4exoblock和(f)批次5exoblock的nmr谱。
具体实施方式
[0037]
尽管将根据某些实例来描述要求保护的主题，但其它实例，包括不提供本文所述的所有益处和特征的实例，也在本公开的范围内。在不脱离本公开的范围的情况下，可以进行各种结构、逻辑和过程步骤的改变。
[0038]
本文提供的所有范围包括落入小数点后十位范围内的所有值，除非另有说明。
[0039]
如本文所用，除非另有说明，否则术语“基团”是指单价(即，具有一个可与其它化学物质共价键合的末端)、二价或多价(即，具有两个或更多个可以与其它化学物质共价键合的末端)的化学实体。术语“基团”还包括自由基(radical)(例如单价和多价，例如二价自由基、三价自由基等)。基团的说明性实例包括：
[0040][0041]
如本文所用，除非另有说明，否则术语“烷基基团”是指支化或非支化的线性饱和烃基和/或环状烃基。烷基基团的实例包括但不限于甲基基团、乙基基团、丙基基团、丁基基团、异丙基基团、叔丁基基团、环丙基基团、环戊基基团、环己基基团等。烷基基团是饱和基团，除非它是环状基团。例如，烷基基团是c1至c
30
烷基基团，包括其间的所有整数碳数和碳数范围(例如，c1、c2、c3、c4、c5、c6、c7、c8、c9、c
10
、c
11
、c
12
、c
13
、c
14
、c
15
、c
16
、c
17
、c
18
、c
19
、c
20
、c
21
、c
22
、c
23
、c
24
、c
25
、c
26
、c
27
、c
28
、c
29
和c
30
)。烷基基团可以未被取代或被一个或多个取代基取代。取代基的实例包括但不限于卤素(-f、-cl、-br和-i)、脂肪族基团(例如烷基基团、烯基基团、炔基基团等)、卤代脂肪族基团(例如，三氟甲基基团)、芳基基团、卤代芳基基团、醇盐基、胺基、硝基、羧酸酯基、羧酸、醚基、醇基、炔基(例如，乙炔基基团等)等，及其组合。
[0042]
如本文所用，除非另有说明，否则术语“芳基基团”是指c5至c
30
芳香族或部分芳香族碳环基团，包括其间的所有整数碳数和碳数范围(例如，c5、c6、c7、c8、c9、c
10
、c
11
、c
12
、c
13
、c
14
、c
15
、c
16
、c
17
、c
18
、c
19
、c
20
、c
21
、c
22
、c
23
、c
24
、c
25
、c
26
、c
27
、c
28
、c
29
和c
30
)。芳基基团也可以称为
芳香族基团。芳基基团可包括多芳基，例如稠环、联芳基或其组合。芳基基团可以未被取代或被一个或多个取代基取代。取代基的实例包括但不限于卤素(-f、-cl、-br和-i)、脂肪族基团(例如烷基基团、烯基基团、炔基基团等)、芳基基团、醇盐、羧酸酯、羧酸、醚基等，及其组合。芳基基团的实例包括但不限于苯基、联芳基(例如联苯基等)、稠环基(例如萘基等)、羟基苄基、甲苯基、二甲苯基、呋喃基、苯并呋喃基、吲哚基、咪唑基、苯并咪唑基、吡啶基等。
[0043]
如本文所用，除非另有说明，否则术语“杂芳基”是指包含一个或两个芳香环的c1至c
14
单环、多环或双环基团(例如芳基基团)，在该芳香环中包含至少一个杂原子(例如氮、氧、硫等)，其包括其间的所有整数碳数和碳数范围(例如，c1、c2、c3、c4、c5、c6、c7、c8、c9、c
10
、c
11
、c
12
、c
13
和c
14
)。杂芳基基团可以是取代的或未取代的。杂芳基的实例包括但不限于苯并呋喃基、噻吩基、呋喃基、吡啶基、嘧啶基、恶唑基、喹啉基、噻吩基、异喹啉基、吲哚基、三嗪基、三唑基、异噻唑基、异恶唑基、咪唑基、苯并噻唑基、吡嗪基、嘧啶基、噻唑基和噻二唑基等。取代基的实例包括但不限于卤素(-f、-cl、-br和-i)、脂肪族基团(例如烷基基团、烯基基团、炔基基团等)、芳基基团、醇盐基、胺基、羧酸酯基、羧酸、醚基、醇基、炔基(例如，乙炔基基团等)等，及其组合。
[0044]
本公开提供了结合磷脂酰丝氨酸(ps)的化合物。还提供了包含所述化合物的组合物以及使用所述化合物和/或组合物的方法。
[0045]
在一个方面，本公开提供了包含具有以下结构的支化基团的化合物：
[0046][0047]
其中每个r在每次出现时独立地是氢或包含聚(乙二醇)(peg)基团或乙二醇基团、接头基团和端基。化合物还可以具有各种抗衡阴离子。一个或多个r基团可以相同或不同。在各种实例中，一个或多个r基团是氢(例如，对于式ia：一个、两个、三个、四个或五个r基团可以是氢；对于式ib和ic：一个、两个或三个r基团可以是氢，对于式id和ie：一个或两个r基
团可以是氢)。
[0048]
peg基团可以具有各种长度。peg基团可以具有2-500个重复单元，包括其间的每个整数值和范围。在各种实例中，peg基团的分子量(例如，mn)可以是2,000-60,000，包括其间的每个整数值和范围(例如，8,000-15,000)。
[0049]
接头基团在一端与peg基团或乙二醇基团连接(例如，共价键合)并且在另一端与端基连接。接头基团可以具有以下结构：
[0050]
(例如)、(例如)、或(例如)，其中x是间隔基团，例如取代或未取代的c1至c
10
烷基基团，并且n是2、3或4。
[0051]
端基包括各种芳基基团、杂芳基基团、叔胺和多个二价阳离子。杂芳基基团可以具有各种取代基，例如卤素(-f、-cl、-br和-i)、脂肪族基团(例如烷基基团、烯基基团、炔基基团等)、芳基基团、醇盐基、胺基、羧酸酯基、羧酸、醚基、醇基、炔基(例如，乙炔基基团等)等，及其组合。一个、一些或所有杂芳基基团可以是例如取代或未取代的吡啶基。二价阳离子可以与叔胺和一个或多个杂芳基基团螯合。二价阳离子的实例包括但不限于mn
2+
、fe
2+
、co
2+
、ni
2+
、cu
2+
、zn
2+
等。端基可以具有以下结构：
[0052][0053]
其中l是o或-ch
2-并且z是oh、o或h，其中o与m螯合，m是二价阳离子，r'在每次出现时独立地选自氢、卤素(-f、-cl、-br和-i)、脂肪族基团(例如烷基基团、烯基基团、炔基基团等)、芳基基团、醇盐基、胺基、羧酸酯基、羧酸、醚基、醇基、炔基(例如，乙炔基基团等)等，及其组合，并且x是1、2、3或4。在各种实例中，端基具有以下结构：
[0054]
[0055]
[0056][0057]
在各种其它实例中，端基具有以下结构：
[0058]
[0059][0060]
其中m是二价阳离子，例如zn
2+
。
[0061]
在各种实施例中，本公开的化合物可以具有以下结构：
[0062]
其中r”在每次出现时独立地是h或
[0063][0064]
其中m是二价阳离子，r'在每次出现时独立地选自卤素(-f、-cl、-br和-i)、脂肪族基团(例如，烷基基团、烯基基团、炔基基团等)、芳基基团、醇盐基、胺基、羧酸酯基、羧酸、醚基、醇基、炔基(例如，乙炔基基团等)等及其组合，a是一种或多种抗衡阴离子(例如no
3-、ch3co
2-、so
42-等及其组合)，x是1、2、3或4，并且n是1-500，包括其间的每个整数值和范围。
[0065]
本公开的化合物可以具有以下结构：
[0066][0067]
其中r”'是
[0068][0069]
其中n是1
–
500，包括其间的每个整数值和范围。具有这种结构的化合物可以结合2-24个ps分子，包括其间的每个整数值和范围。在各种实例中，该结构可以结合2-12、2-10、2-8或2-6个ps化合物(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个)。不旨在受任何特定理论的束缚，ps分子的结合可以取决于局部浓度。具有式vii结构的化合物，其中r”'是式viiia，可称为“exoblock”。参见图1和图2。
[0070]
在一个方面，本公开提供了包含一种或多种本公开化合物的组合物。组合物可以包含一种或多种药学上可接受的载体。
[0071]
在一个实施方案中，本公开的化合物可以提供在递送媒介中，例如脂质体、聚乳酸微球、纳米粒子(例如，乳胶珠粒、外泌体、聚乳酸共-乙醇酸纳米粒子(plga纳米粒子)等)等。在各种实例中，脂质体可引入一种或多种本公开的化合物。脂质体单层或双层可包含磷脂酰胆碱(“pc”)和/或磷脂酰甘油(“pg”)和任选的胆固醇。pg和pc在酰基链中可以有2-22个碳原子。在一个实施方案中，酰基链具有2至22或6至22个碳，包括其间的所有整数碳数和范围。酰基链可以是饱和的或不饱和的并且可以是相同或不同的长度。酰基链的一些实例是：月桂酸、肉豆蔻酸、棕榈酸、硬脂酸、花生酸、山嵛酸、油酸、棕榈油酸、亚油酸和花生四烯酸。pg或pc可以具有一个或两个酰基链。在各种实例中，磷脂以10:90、20:80、30:70、40:60、50:50、60:40、70:30、80:20或90:10的pg与pc比率存在。在各种实例中，50％、60％、70％、
80％、90％、95％或100％(包括50和100之间的所有百分比)的脂质体的尺寸为40nm至4μm，包括其间在纳米和微米范围内的所有尺寸。在各种实例中，脂质体可以是多层的。
[0072]
本文所述的组合物可以包括一种或多种标准的药学上可接受的载体。药学上可接受的载体可以部分地由所施用的特定组合物以及由用于施用该组合物的特定方法来确定。因此，本公开的药物组合物有多种合适的制剂。化合物可以自由地混悬在药学上可接受的载体中，或者化合物可以封装在脂质体中，然后混悬在药学上可接受的载体中。载体的实例包括溶液、混悬液、乳液、在使用前溶解或混悬在溶剂中的固体可注射组合物等。可以通过将一种或多种活性成分溶解、混悬或乳化在稀释剂中来制备组合物(例如，注射剂等)。稀释剂的实例包括但不限于注射用蒸馏水、生理盐水、植物油、醇、二甲亚砜等，及其组合。此外，注射剂可包含稳定剂、增溶剂、混悬助剂、乳化剂、舒缓剂、缓冲剂、防腐剂等，及其组合。组合物(例如，注射剂等)可以在配制步骤中灭菌或通过无菌程序制备。组合物可以例如通过冷冻干燥配制成无菌固体制剂，并且可以在使用前(例如，即将使用前)灭菌或溶解在无菌可注射水或其它无菌稀释剂中后使用。药学上的其它实例包括但不限于糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素，包括羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和醋酸纤维素；粉状黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡；油，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，例如丙二醇；多元醇，例如甘油、山梨糖醇、甘露醇和聚乙二醇；酯，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格液；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；和其它用于药物制剂的无毒相容性物质。药学上可接受的载体的其它非限制性实例可见于：remington:the science and practice of pharmacy(2005)第21版,philadelphia,pa.lippincott williams&wilkins。有效的制剂包括但不限于口服和鼻腔制剂、用于肠胃外施用的制剂和配制为延长释放的组合物。肠胃外施用包括输注，例如肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内、皮下施用等。
[0073]
组合物的实例包括但不限于：(a)液体溶液，例如有效量的本公开化合物混悬在稀释剂例如水、盐水或peg 400中；(b)胶囊、小袋、储库或片剂，每一种包含预定量的活性成分，作为液体、固体、颗粒或明胶；(c)在适当液体中的混悬液；(d)合适的乳液；以及(e)贴片(patch)。上述液体溶液可以是无菌溶液。所述组合物可包含例如乳糖、蔗糖、甘露醇、山梨糖醇、磷酸钙、玉米淀粉、马铃薯淀粉、微晶纤维素、明胶、胶体二氧化硅、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸和其它赋形剂、着色剂、填充剂、粘合剂、稀释剂、缓冲剂、润湿剂、防腐剂、矫味剂、染料、崩解剂和药学相容的载体中的一种或多种。
[0074]
组合物可以是单位剂型。在这种形式中，组合物可以细分为包含适量活性成分的单位剂量。单位剂型可以是包装的制剂，该包装包含离散量的制剂，例如包装的片剂、胶囊以及小瓶或安瓿中的粉末。此外，单位剂型本身可以是胶囊剂、片剂、扁囊剂(cachet)或锭剂，或者它可以是适当数量的以包装形式的任何这些。如果需要，该组合物还可以包含其它相容的治疗剂。组合物可以以缓释制剂递送本公开的化合物。
[0075]
在一个方面，本公开提供了使用本公开的一种或多种化合物的方法。例如，这些化合物可用于治疗患有癌症、一种或多种感染性疾病、慢性炎症和慢性炎症疾病和/或自身免疫病症的个体。
[0076]
感染性疾病的实例包括但不限于细菌性疾病、病毒性疾病、寄生虫病等，及其组
合。慢性炎性疾病的实例包括但不限于伴有鼻息肉的慢性鼻窦炎、特应性、肝炎等及其组合。自身免疫性疾病的实例包括但不限于类风湿性关节炎、系统性狼疮、红斑病、糖尿病等及其组合。
[0077]
治疗方法可以包括向个体施用一种或多种本公开的化合物或包含一种或多种本公开的化合物的组合物。在各种实例中，组合物包含一种或多种化合物和检查点抑制剂(例如，抗pd1抗体，例如，纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗(pembrolizumab)、德瓦鲁单抗(durvalumab)、卡瑞利珠单抗(camrelizumab)、西米普利单抗(cemiplimab)、信迪利单抗(sintilimab)、特瑞普利单抗(toripalimab)等，或其组合)。检查点抑制剂的其它实例包括但不限于抗ctla-4抗体、抗lag3抗体、抗tim3抗体等，及其组合。组合物可包含或进一步包含免疫治疗剂，例如细胞因子(例如，il-12、il-2等，及其组合，用于调节免疫应答。
[0078]
该方法可以在已被诊断患有或怀疑患有癌症(例如，实体瘤(例如，与黑色素瘤相关的实体瘤)、白血病、淋巴瘤等，及其组合)的个体中进行。
[0079]
在各种实例中，本公开的化合物和/或组合物比图2a中描绘的zn-t-dpa更有效。
[0080]
包含本文所述化合物的组合物可以使用任何已知方法和途径施用于个体，包括口服、肠胃外、皮下、腹膜内、肺内、鼻内和颅内注射。肠胃外输注包括但不限于肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内、皮下施用等。施用还可以包括但不限于局部和/或透皮施用。
[0081]
包含本公开的化合物和药剂的组合物的剂量可能需要取决于要向其施用本公开的组合物的个体的需求。这些因素包括例如体重、年龄、性别、病史以及需要治疗或预防效果的疾病的性质和阶段。所述组合物可以与旨在改善意图达到期望治疗性或预防性效果的疾病的任何其它常规治疗方式结合使用，其非限制性实例包括但不限于化学治疗、手术干预和放射治疗。例如，组合物与一种或多种已知的抗癌药物(例如，dna损伤性抗癌药物)组合使用(例如，共同施用)。
[0082]
化合物和包含化合物的组合物可以各种剂量施用。实例包括但不限于1至300mg/kg，包括其间的每0.1mg/kg的值和范围。在各种实例中，剂量可以是1
–
100mg/kg、1
–
200mg/kg、2
–
200mg/kg、2
–
300mg/kg、5
–
100mg/kg、5
–
200mg/kg、5
–
300mg/kg、40
–
80mg/kg、50
–
70mg/kg、50
–
100mg/kg、50
–
150mg/kg、50
–
200mg/kg、50
–
250mg/kg、50
–
300mg/kg、55
–
70mg/kg、25
–
100mg/kg、25
–
200mg/kg、25
–
300mg/kg、100
–
200mg/kg、100
–
300mg/kg、150
–
200mg/kg、150
–
300mg/kg、200
–
250mg/kg或200
–
300mg/kg。
[0083]
在一个方面，本公开提供了试剂盒。试剂盒可以包含含有化合物中的任何一种或任何组合的药物制剂和印刷材料。
[0084]
在各种实例中，试剂盒包括包含药物制剂的封闭或密封包装。在各种实例中，包装包括一个或多个封闭或密封的小瓶、瓶子、泡罩(气泡)包装或用于销售、分配或使用本公开的化合物和包含化合物的组合物的任何其它合适的包装。印刷材料可以包括印刷信息。印刷信息可以提供在标签上，或纸质插页上，或印刷在包装材料本身上。印刷信息可以包括识别包装中的化合物、其它活性和/或非活性成分的量和类型，以及服用组合物的说明，例如在给定时间段内服用的剂量数的信息，和/或针对药剂师和/或其它医疗保健提供者(例如医师)或患者的信息。印刷材料可以包括药物组合物和/或与其一起提供的任何其它药剂用于治疗患有癌症和/或其它疾病和/或与癌症和/或其它疾病相关的任何病症的受试者的指示。在各种实例中，产品包括标签，其描述容器内容物并提供关于使用容器内容物治疗患有
癌症、一种或多种感染性疾病、慢性炎症和/或自身免疫性病症的指示和/或说明。试剂盒可以包含单剂量或多剂量。
[0085]
本公开的方法可以用于各种个体。在各种实例中，个体是人或非人哺乳动物。非人哺乳动物的实例包括但不限于农场动物，例如牛、猪、绵羊等，以及服务动物、宠物和/或运动动物，例如马、狗、猫等。个体的其它非限制性实例包括但不限于兔、大鼠、小鼠等。本公开的化合物或组合物可以例如在药学上可接受的载体中施用于个体，这可以促进将化合物从身体的一个器官或部分运输到身体的另一个器官或部分。
[0086]
以下陈述描述了本公开的各种实施方案。
[0087]
陈述1.包含具有以下结构的支化基团的化合物：
[0088][0089]
其中每个r在每次出现时独立地是氢或包含聚(乙二醇)(peg)基团或乙二醇基团、接头基团和端基。
[0090]
陈述2.根据陈述1所述的化合物，其中所述接头基团具有以下结构：(例如)、(例如)、或(例如)，
[0091]
其中x是间隔基团(例如，取代或未取代的c1至c
10
烷基基团)。
[0092]
陈述3.根据陈述1或陈述2所述的化合物，其中所述端基具有以下结构：
[0093]
[0094]
其中l是o或-ch
2-并且z是oh、o或h，其中o与m螯合，r'在每次出现时独立地选自氢、卤素(-f、-cl、-br和-i)、脂肪族基团(例如烷基基团、烯基基团、炔基基团等)、芳基基团、醇盐基、胺基、羧酸酯基、羧酸、醚基、醇基、炔基(例如，乙炔基基团等)等，及其组合，并且x是1、2、3或4。
[0095]
陈述4.根据陈述3所述的化合物，其中所述端基具有以下结构：
[0096][0097]
陈述5.根据陈述3或陈述4所述的化合物，其中所述端基具有以下结构：
[0098][0099]
陈述6.根据前述陈述中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：
[0100][0101]
其中r”在每次出现时独立地是h或
[0102][0103]
其中m是二价阳离子，r'在每次出现时独立地选自卤素(-f、-cl、-br和-i)、脂肪族基团(例如，烷基基团、烯基基团、炔基基团等)、芳基基团、醇盐基、胺基、羧酸酯基、羧酸、醚基、醇基、炔基(例如，乙炔基基团等)等及其组合，a是一种或多种抗衡阴离子(例如no
3-、ch3co
2-、so
42-等及其组合)，x为1、2、3或4，n为1-500，包括其间的每个整数值和范围。
[0104]
陈述7.根据陈述6所述的化合物，其中所述化合物具有以下结构：
[0105][0106]
其中r”在每次出现时独立地是h或
[0107][0108]
其中n是1-500，包括其间的每个整数值和范围。
[0109]
陈述8.一种组合物，包含本公开(例如，根据前述陈述中的任一项)的化合物和一种或多种药学上可接受的载体。
[0110]
陈述9.根据陈述8所述的组合物，还包含抗pd1抗体(例如，选自纳武单抗、派姆单抗、德瓦鲁单抗、卡瑞利珠单抗、西米普利单抗、信迪利单抗、特瑞普利单抗等及其组合的抗pd1抗体)、抗ctla-4抗体、抗lag3抗体、抗tim3抗体等及其组合。
[0111]
陈述10.一种脂质体组合物，其中所述脂质体具有引入其中的根据陈述1-7中任一项所述的化合物。
[0112]
陈述11.根据陈述10所述的脂质体组合物，其中所述脂质体具有单层或双层并且所述单层或双层包含磷脂酰胆碱(“pc”)和/或磷脂酰甘油(“pg”)和任选的胆固醇。
[0113]
陈述12.一种治疗需要治疗癌症(例如，实体瘤(例如，与黑色素瘤相关的实体瘤)、白血病、淋巴瘤等，及其组合)、一种或多种感染性疾病、慢性炎症和/或自身免疫病症的个体(例如人或非人哺乳动物)的方法，包括向所述个体施用一种或多种本公开的化合物(例如，根据陈述1-7中任一项所述的化合物)或本公开的一种或多种组合物(例如，根据陈述8-10中任一项所述的组合物)。
[0114]
呈现以下实施例以说明本公开。它们不旨在在任何情况下进行限制。
[0115]
实施例1
[0116]
下面举例说明本发明化合物的合成和用途。
[0117]
与肿瘤相关外泌体结合并阻断它们停滞t细胞功能的能力的新的ps结合分子exoblock的设计、合成和测试。
[0118]
在临床前研究中使用抗ps抗体和膜联蛋白v阻断癌症和感染性疾病中的ps或在临床试验中使用ps特异性抗体(巴维妥昔单抗)治疗肺癌的策略，由于所用分子的ps结合亲和力相对较低，因此取得不太大的成功。exoblock代表一种外泌体阻断分子。exoblock是一种六聚体，其被设计携带六个ps结合位点，这多于抗体或膜联蛋白v，因此预期以高得多的亲和力结合ps。已确定exoblock确实以高亲和力结合ps，并且在体外阻断外泌体免疫抑制中比抗ps抗体和膜联蛋白v更有效。exoblock的体内治疗功效已使用一种新动物模型在临床前建立。
[0119]
新动物模型的设计和验证以确定外泌体阻断药物的功效。
[0120]
动物肿瘤异种移植模型是一个平台，它使用患者来源的肿瘤特异性t细胞来成功地并临床前测试基于免疫的治疗对人癌症的功效。该模型使用在hla i类的背景下对人肿瘤靶细胞上表达的新抗原(neo-antigen)肽具有特异性的t细胞。本文描述了该模型并展示了使用该模型生成的数据。
[0121]
具有多个磷脂酰丝氨酸(ps)结合位点的zn化合物的合成，被确定为比化合物zn-t-dpa更有效地阻断外泌体t细胞免疫抑制
[0122]
合成了exoblock[(zndpa)
6-dp-15k]，与zn-t-dpa相比，它对ps具有多个结合位点和更大亲合力。exoblock通过8个合成步骤(图1)以0.5g的规模合成，总合成产率为约18％。倒数第二个产品(减去锌离子)通过透析过程纯化，然后最终冻干以生产exoblock。
[0123]
步骤1：市售5-羟基-间苯二甲酸二甲酯和氢化铝锂之间在四氢呋喃中回流24小时的反应产生三醇(2)。步骤2：(2)和n-(4-溴丁基)邻苯二甲酰胺之间的反应通过在碳酸钾存在下在乙腈中将这两种化合物一起加热过夜来进行。步骤3：用四溴化碳和三苯基膦对(3)进行溴化然后进行在1-2g规模进行良好的色谱纯化，以高产率产生(4)。步骤4：通过将(4)与2摩尔当量的二-(2-甲基吡啶)-胺在包含碳酸钾的n,n-二甲基甲酰胺中剧烈搅拌24小时，该反应在小规模(1-2g)上以良好的产率进行。使用包含氢氧化铵的二氯甲烷/甲醇混合物通过正相硅胶色谱法纯化产物(5)。步骤5：从中间体(5)中除去邻苯二甲酰亚氨保护基的反应通过用浓盐酸回流进行，并且进行48小时完全反应。步骤6：(6)与戊二酸酐在氯仿中反应过夜以定量产率提供(7)，无需进行进一步纯化。步骤7：(7)的磺基琥珀酰亚胺酯在与水溶性碳二亚胺(edc)和n-羟基磺基琥珀酰亚胺反应时原位形成，然后将过量的这种活化酯混合物加入到dmf中的6-臂-peg-氨基官能化聚合物(mw＝15k)中。搅拌过夜后，将混合物用水透析(mwco＝8
–
10k)并将所得溶液冻干以提供(8)。步骤8：通过用12摩尔当量的硝酸锌水溶液处理(8)来以定量产率实现这种转化，然后冻干。
[0124]
在比较研究中，与化合物zn-t-dpa(30-45％逆转)相比，exoblock以更大功效逆转外泌体介导的t细胞功能停滞(75-96％逆转)(图2a-c)。这些研究已经针对不同的激活终点进行了重复，例如nfkb的核转位和细胞内细胞因子的表达，并且exoblock的功效在多个测定中具有高度可重复性。
[0125]
exoblock的毒性研究。
mut荷瘤小鼠的腹水和实体dm6-mut肿瘤异种移植物分离的外泌体上表达(图7b)，这与表明黑色素瘤患者的肿瘤确实脱落抑制肿瘤特异性t细胞并与肿瘤生长和进展相关的pd-l1+外泌体的数据一致。
[0134]
x-小鼠模型确定exoblock的体内功效。
[0135]
将x-小鼠模型用于测试exoblock的功效。将exoblock腹膜注射具有dm6-mut肿瘤异种移植物并用tkt细胞处理的nsg小鼠。exoblock的剂量(64mg/kg)是根据确定在体外阻断外泌体介导的t细胞抑制的浓度确定的。发现在测试剂量(64mg/kg)下，exoblock显著延迟了肿瘤逃逸(第25天肿瘤负荷的两倍变化)，这与抗pd1治疗(10mg/kg的纳武单抗)相当(图8)。这些数据确定了exoblock的功效，并证实了靶向肿瘤微环境中的免疫抑制外泌体的方法的可行性。
[0136]
在这些临床前功效研究中确定，在小鼠模型中exoblock没有可检测到的毒性，并且它不干扰肿瘤特异性t细胞的抗肿瘤反应。体外研究还证实，exoblock在所用剂量下不会直接杀死肿瘤靶细胞(dm6-mut)。
[0137]
实施例2
[0138]
该实施例为本公开的化合物提供了可能的毒理学研究和药代动力学研究。
[0139]
毒理学研究。
[0140]
可以进行在小鼠中确定exoblock的未观察到有害效应水平(noael)以指导非人灵长类动物研究，以完成双物种毒性研究以用于进一步开发和首次人体中施用。与各种免疫、肾脏、肝脏和注射部位毒性终点的剂量反应关系可以在短期重复剂量研究(小鼠中28个每日皮下剂量)中进行评估。可以在小鼠中评估五个剂量水平。由于免疫毒性是免疫疗法的关键部分，因此可以使用功能性和非功能性终点来评估exoblock引起这种毒性的潜能。可以评估肾和肝毒性的可能性。可以评估由于存在局部高积聚而导致的注射部位毒性的可能发展。
[0141]
方法和设计：cd1(icr)小鼠可用于本研究。这种远交品种是一种广为接受的用于一般毒理学和免疫毒理学评估的动物模型。从charles river laboratories(portage,mi)获得4-5周龄的小鼠，并允许在研究前适应1周。在22
±
2℃的温度和55
±
10％的湿度、12小时光照/黑暗周期下，可以每笼饲养三只小鼠。提供自由采食的标准食物和自来水。在短期、重复剂量研究中评估与各种免疫、肾脏、肝脏和注射部位毒性终点的剂量反应关系。剂量选择可以由来自功效研究的预期临床剂量指导。可以在小鼠中评估五个剂量水平，这些exoblock剂量包括皮下给予2.56mg/kg、6.4mg/kg、25.6mg/kg、64mg/kg和256mg/kg。可以在猕猴中评估适当的剂量，以完成用于进一步发展的双物种评估(使用配套资金进行)。小鼠和灵长类动物的总体研究设计和处理组总结在表2中。小鼠可以接受通过皮下注射连续28天的指定处理的每日剂量(灵长类动物经由每日皮下的21个剂量)。所有研究动物的健康状况可以通过身体检查每天进行监测并记录。要监测的因素包括但不限于：体重和注射部位反应的存在。
[0142]
表2
[0143][0144][0145]
样品收集和处理：小鼠的非末期血浆和全血样品可以通过隐静脉穿刺收集到肝素或edta涂覆的毛细管中。小鼠的末期血浆样品可以通过心脏穿刺以1:7的体积比收集到酸性柠檬酸右旋糖(acd：85mm柠檬酸钠、110mm d-葡萄糖、71mm柠檬酸)中。血清样品可以通过让不含抗凝剂的全血在室温下凝结30分钟然后离心来收集。edta-或柠檬酸盐抗凝血浆样品和血清样品将类似地从恒河猴收集。所有样品都可以立即分析或储存在-80℃直至分析。放血后立即收获小鼠脾脏、肝脏、肾脏和注射部位皮肤样品，称重并进行肉眼检查。可以将组织标本固定在10％缓冲的福尔马林磷酸盐中。石蜡包埋切片(n＝3/组织/处理组)可以用苏木精和伊红(h&e)染色剂染色以进行组织学检查。可以由不知道剂量信息的研究人员对组织学样本进行评分。可以评估组织切片的以下组织损伤的组织病理学特征：(a)炎症，(b)纤维化，和(c)细胞病变变化，包括坏死、凋亡、细胞质空泡变化、增生、肥大、萎缩、化生、细胞肿胀、蛋白质堆积、脂肪变化和钙化的特征。所有这些特征都可以由单个审阅者根据以下评分系统进行半定量评估：0＝不存在；1+＝《目标的5％；2+＝目标的6-25％；3+＝》目标的26％。小鼠外周血中的细胞计数可以分别使用bc-2800(mindray,mahwah,nj)和sysmex xt2000iv(sysmex,lincolnshire,il)自动血液分析仪进行分析。血清化学标志物可用于评估肝脏和肾脏的功能健康。可以使用vetscan vs2(abaxis diagnostics,union city ca)或olympus au400(beckman-coulter,brea,ca)分析仪分析小鼠血清样品。可以使用ck检测试剂分析血浆肌酸激酶(ck)浓度。可以如前所述进行功能性t细胞依赖性抗体反应(tdar)测定。
[0146]
统计分析：小鼠的平均抗klh滴度水平可以使用单因素方差分析(one-way anova)和dunnett事后分析进行比较。猴中的基线和第18天或第22天平均抗klh滴度水平可以使用配对的两个样品t检验进行比较。来自小鼠的免疫表型数据可以使用单因素方差分析和dunnett事后分析进行比较。exoblock处理小鼠的平均血浆ck浓度可以使用单因素方差分析和dunnett事后分析和重复测量anova进行比较。小于0.05的p值可被视为统计学显著。
[0147]
药代动力学研究。
[0148]
方法：可以在短期重复剂量研究中在静脉或腹腔.注射后在nsg小鼠中测量血浆exoblock浓度的药代动力学(pk)或时间进程。可以在小鼠中评估围绕临床相关剂量的五个
剂量(例如，2.56、6.4、25.6、64.6和245mg/kg)。根据毒性研究，可以以从5、10和50mg/kg开始的初始剂量进行初步研究。最后的5个目标剂量水平可以修改以实现特定的治疗效果或避免毒性。宽范围的剂量水平可以提供足够的数据来确定pk是线性的(即净暴露与剂量成正比)还是受容量限制的(即非线性)。可以静脉或腹腔注射100μl固定体积的药物，并且平均mg/kg/天剂量可以根据平均体重计算。幼稚(无肿瘤)nsg小鼠和荷dm6mut肿瘤异种移植物的nsg小鼠可以通过腹腔注射连续28天施用指定处理的每日剂量。小鼠的非末期血浆和全血样品可以通过隐静脉的静脉穿刺收集到肝素或edta涂覆的毛细管中。小鼠的末期血浆样品可以通过心脏穿刺以1:7的体积比收集到酸性柠檬酸右旋糖(acd：85mm柠檬酸钠、110mm d-葡萄糖、71mm柠檬酸)中。所有样品都可以立即分析或储存在-80℃直至分析。这些研究可以由临床实验室完成。啮齿动物血浆中的药物浓度可以使用经验证的酶联免疫吸附测定法(elisa)测定来确定。
[0149]
数据分析：测量的血浆exoblock浓度可以首先使用非隔室数据分析进行分析，以使用r统计软件包(https://www.r-project.org/)计算表观pk参数。静脉施用后药物浓度的面积/矩分析可用于计算血浆浓度-时间曲线下面积(auc)、一阶矩曲线下面积(aumc)、总全身清除率(cl＝剂量/auc)、稳态分布体积(v
ss
＝cl
·
aumc/auc)和血浆半衰期(t
1/2
＝0.693
·
aumc/auc)。腹腔施用后的药物生物利用度(f)可以计算为各个auc值的比率(f＝auc
i.p.
/auc
i.v.
)。为了描述药物暴露的时间进程，可以将基于生理学的最小pk(mpbpk)模型拟合到两种施用途径后测量的血浆药物浓度。基础结构模型可以稍作修改，以包括腹腔药物施用之后的一阶吸收过程。mpbpk结构受生理体积和血流量的限制，这允许估计具有生理意义的pk参数值，并为扩展模型以预测人体药物暴露形成天然基础。pk/pd系统建模软件adapt版本5(bmsr,usc,los angeles,ca)可用于开发pk模型。可以使用具有最大似然(ml)算法的汇总方法来分析pk数据。
[0150]
实施例3
[0151]
该实施例提供了本公开化合物的可能的剂量、时间表和递送。
[0152]
基本原理和设计：使用上面讨论的x小鼠模型，通过使用死后gfp荧光成像和荧光素酶依赖性生物发光的活体成像二者，其可以能够量化与药物剂量、时间表和药物递送方法的变化相关的肿瘤负荷变化(直接反映肿瘤特异性t细胞功能)。可以使用luc+dm6-mut细胞的生物发光在小鼠中非侵入性地每隔一天(在t细胞+/-药物的过继转移之后)确定肿瘤负荷。通过死后成像，可以在固定时间点(即第5天、第10天和第25天)监测肿瘤负荷。对于这些实验，已经滴定并确定了在第0天腹腔注射到每只小鼠的最佳肿瘤细胞数量(2.5x106)和第5天注射的肿瘤特异性t细胞数量(0.5x106)，以通过t细胞的过继转移在第10天实现可重复且统计学显著的肿瘤抑制。到第25天，在没有进一步治疗的情况下肿瘤逃脱这种最初的t细胞抑制。在第一时间表中，小鼠在第10天、第15天和第20天用腹腔给予的药物处理。其从2.56mg/kg、6.4mg/kg、25.6mg/kg、64mg/kg和256mg/kg的剂量开始。在初始exoblock毒性试验中，在64mg/kg药物剂量下观察到noael。然而，这些剂量可以根据上述更完整的毒性和pk研究进行调整。与增加药物剂量相关的肿瘤负荷(luc+dm6-mut肿瘤)的预期减少可以通过每隔一天的活体成像进行，持续30天。每隔一段时间，可以给小鼠注射荧光素，并在成像设备上对生物发光进行量化。可以将每个群组的数据报告为算术平均值、sem和p值，如上文和图3所示。在第10天和第25天也使用死后成像监测与药物处理相关的肿瘤体积变化，如上文
和图8中概述的。
[0153]
方法
[0154]
x小鼠模型的建立：使用全面免疫缺陷nsg小鼠。可以在第0天给5只小鼠的群组(处理和未处理)腹腔注射gfp+luc+dm6-mut肿瘤细胞。在大网膜中产生肿瘤异种移植物后5天，可以给小鼠注射肿瘤特异性t细胞(tkt r438w)。对照组不给予tkt细胞。实验小鼠的处理可以在第10天开始，采用不同的时间表、剂量和递送方法。小鼠的活体成像可以从第1天开始，并且可以每隔一天持续25天。死后成像可以在第5、10和25天进行。可以对这些时间点的小鼠群组实施安乐死，并且可以取出大网膜以制备在pbs中的全标本包埋。然后可以使用leica dm 6b直立荧光显微镜对这些进行gfp荧光扫描。然后可以使用imagej软件对荧光进行量化。如图8所示，在上述设计中所示的时间点绘制校正的总荧光数据(在减去每个网膜的背景后)并进行统计分析。
[0155]
exoblock剂量递增研究：对照小鼠群组包括给予(a)肿瘤但没有tkt细胞(b)肿瘤和tkt细胞但没有药物，和(c)肿瘤和最高剂量的exoblock(64mg/kg)的小鼠。可以给予肿瘤、tkt细胞和增加剂量的药物的实验群组可以被监测并比较肿瘤负荷的变化。用药物处理小鼠可以在第10天开始，并且可以在第15天和第20天重复。这个时间表可以在随后的时间表变化实验中进行调整。药物剂量可以根据本文所述的毒性和pk研究而改变。
[0156]
处理时间表：对于初始实验，可以每5天注射exoblock，并且注射频率可以根据pk研究中可获得的数据(包括exoblock在小鼠中的半衰期)进行修改。对于初始实验，可以测试3种不同的时间表，包括在注射t细胞之前(第3、8、13和18天)、注射t细胞同时(第5、10、15和20天)或注射t细胞之后(第10、15和20天，如之前使用的)。
[0157]
设计和使用pk/pd模型以预测exoblock减少x小鼠模型中的肿瘤负荷的最佳剂量和时间表：设计了pk/pd模型。该模型专门设计用于将药物浓度曲线与肿瘤生长动力学的时间进程联系起来，并将用于预测exoblock的最佳剂量和时间表，以最有效地增强肿瘤特异性t细胞的抗肿瘤活性，从而导致抑制原发部位(网膜)的肿瘤和防止肿瘤扩散到其它器官部位。在这个模型中，在x小鼠模型研究中获得的数据(使用活体成像和每隔一天监测肿瘤负荷的变化，持续30天)用于生成exoblock与在不同药物剂量和处理时间表下由肿瘤特异性t细胞介导的增强的肿瘤抑制的暴露-反应关系。可以将开发的pk模型和估计参数固定为将exoblock浓度与增强的治疗功效联系起来的pd模型中的驱动函数。应用一系列分层的pd模型来确定耦合pk和pd肿瘤反应数据的最佳结构。参数可以在adapt5中估计，并且包括与未受干扰的肿瘤生长动力学和效果参数相关的速率常数(有或没有容量限制)，例如二阶t细胞介导的肿瘤抑制速率常数和量化exoblock细胞相互作用的相互作用参数。最终模型可以通过将模拟的增强肿瘤抑制曲线与观察到的抑制曲线进行比较来验证。预测的最佳治疗方案可以在活体成像方案和死后成像方案二者中进行测试。
[0158]
通过组织病理学和免疫化学定量荧光和生物发光来确定肿瘤抑制的验证。可以在选定的时间间隔处死小鼠，并且可以取出网膜、固定和染色，并对载玻片进行组织学检查用于肿瘤的证据。这些组织切片用黑色素瘤特异性mel a抗体染色，以估计和确认用荧光和生物发光预测的肿瘤数量的巨大变化。
[0159]
已确定exoblock对体外dm6-mut细胞没有直接抑制作用。该方法中还包括了额外的对照组(肿瘤细胞+以最高剂量使用的exoblock，即64mg/kg)来解释药物对肿瘤的任何直
接效果。有证据表明，在x小鼠模型中，表达exoblock靶向标志物ps的外泌体从dm6-mut肿瘤中释放，并且这些外泌体是免疫抑制性的。通过使用具有激光的纳米颗粒跟踪分析(nta)工具(zetaview)，能够量化ps+外泌体的数量。目前可以确定，在具有或不具有exoblock处理的情况下，从异种移植物中分离出的等摩尔量外泌体的免疫抑制特性存在损失或降低。
[0160]
可获得来源于3名不同黑色素瘤患者的7种不同肿瘤特异性t细胞，它们识别并特异性杀死表达同源肿瘤肽的肿瘤靶细胞。此外，还有对g280-9v具有特异性的t细胞，g280-9v是来源于普遍存在于原发性患者来源的黑色素瘤表面以及dm6-mut细胞上的gp100蛋白的肽。exoblock可以在这些系统中进行测试，以确认其普遍适用性。这些额外的肿瘤特异性t细胞可以用来代替tkt细胞。
[0161]
为了改善检查点阻断抗体(例如，纳武单抗)的治疗功效，可以将上面开发的exoblock方案组合。
[0162]
实施例4
[0163]
该实施例提供了使用本公开化合物的可能实例。
[0164]
基本原理和设计：pd-1的阻断可以在一些癌症患者中诱导持续的临床反应，但是它们如何在体内发挥作用以及为什么它们不能在许多患者中产生任何反应或持久反应仍然不完全清楚。肿瘤微环境很复杂，并且包括许多免疫抑制细胞和可以协同t细胞功能的分子。这些免疫抑制因素之一是免疫抑制外泌体，已确定其作用类似于其它检查点分子。癌症患者中的转移性黑色素瘤会释放在其表面表达pd-l1的外泌体，抑制cd8 t细胞的功能并促进肿瘤生长。肿瘤微环境中存在的多种不同外泌体可能导致检查点治疗的失败，并且阻断免疫抑制性外泌体的多个子集可以增强检查点阻断治疗的功效并提高临床反应率和这些反应的持久性。已经用x小鼠模型确定，用抗pd-1抗体(纳武单抗)治疗小鼠增强肿瘤抑制并且延迟(但不能阻止)肿瘤复发。外泌体阻断药物与抗pd-1的组合可增强检查点阻断治疗的功效。
[0165]
方法：
[0166]
上面概述的用于监测exoblock治疗效果的x小鼠建立的步骤可以与此处使用的基本上相同，以量化抗pd-1抑制肿瘤进展的能力并将其与exoblock和抗pd-1的组合抑制肿瘤生长的能力进行比较。
[0167]
在第5天接受t细胞的5只荷瘤小鼠的群组可以用以下进行处理：(a)在第10、15和20天的10mg/kg的纳武单抗，(b)在相同方案中用相同剂量的同种型对照，(c)在第10、15和20天的10mg/kg的纳武单抗与鉴定的最佳剂量、递送方法和时间表的exoblock的组合，(d)仅最佳处理方案下的exoblock，并且对照小鼠群组在第5天注射肿瘤但是不接受处理。这里使用的另一个终点可以是存活(或安乐死日)。用于活体成像研究的小鼠可以不在第30天被安乐死，并且可以对其进行监测，直到它们出现人道的终点，即需要安乐死的痛苦、瘤形成或垂死的临床体征。
[0168]
可以每隔一天通过如上所述的活体成像和生物发光测定来监测所有小鼠的肿瘤负荷变化，持续25天。在单独的实验中，建立相同的组，并且可以通过测量gfp荧光在第5、10和25天量化肿瘤负荷。
[0169]
可以通过减去每个网膜的背景来计算校正的总荧光。数据可以绘制为平均值
±
sem。将student t检验用于建立统计学显著性。可以计算单一处理(纳武单抗或exoblock)
和组合群组(纳武单抗+exoblock)的肿瘤负荷降低百分比(由ctf表示)，并且与仅接受tkt细胞的群组进行比较。对于存活终点，除了绘制kaplan-meier曲线之外，还可以计算每个群组的平均寿命。组合群组中肿瘤负荷减少或寿命延长的显著改善(p《0.05)可以解释为相加效应。
[0170]
实施例5
[0171]
以下实施例提供了对本公开化合物的合成的描述。
[0172]
6臂zn-dpa-dp-15k的制备。2,2'-二甲基吡啶胺(dpa)通过5个合成步骤制备，并与戊二酸酐反应以提供dpa-酸。用磺基-n-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基碳二亚胺)(edc)活化dpa-酸原位形成活化酯，然后用6-arm(dp)-nh2-15k处理，最后用六水合硝酸锌处理，得到zn-dpa-dp-15k。参见图9。
[0173]
6臂zn-t-dpa-dp-15k的制备。酪氨酸-dpa通过两步制备，并与戊二酸酐反应以提供t-dpa-酸。用磺基-n-羟基琥珀酰亚胺和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基碳二亚胺)(edc)活化t-dpa-酸原位形成活化酯，然后用6-arm(dp)-nh2-15k处理，最后用六水合硝酸锌处理，得到zn-t-dpa-dp-15k。
[0174]
详细的实验程序：
[0175]
将dpa(0.523g,0.891mmol)和戊二酸酐(0.107g,0.935mmol)在20ml无水氯仿中搅拌过夜。通过旋转蒸发除去溶剂，并通过质子nmr表征所得油状物(0.593g)。将0.593g与s-nhs(0.234g,1.078mmol)和edc(0.189g,0.984mmol)在dmf(12ml)中搅拌过夜。然后加入含有n,n-二异丙基乙胺(50μl)的dmf(10ml)中的6-arm(dp)-nh2-15k(0.45g,29.7μmol,jenkem technology)，并将混合物在室温下搅拌过夜。然后通过旋转蒸发除去溶剂并将残余物吸收在40ml含有六水合硝酸锌(0.630g，2.12mmol)的甲醇中并搅拌过夜。然后除去溶剂，将残余物吸收在30ml水中，放入截留分子量为8-10k的透析袋中，用3l水进行透析，换水3次。然后将溶液通过0.2μm过滤器过滤并在冻干机上冷冻干燥过夜以提供0.56g白色固体。
[0176]
表3.exoblock的表征方法
[0177][0178]
实施例6
[0179]
以下实施例提供了本公开化合物的表征。
[0180]
使用标准比色2,4,6-三硝基苯磺酸(tnbs)测定法分析五个批次exoblock，该测定法使用340nm处的吸光度来检测游离氨基存在，并与从一系列已知浓度的6-臂-peg氨基起始聚合物(mw＝15k)生成的标准曲线进行比较。
[0181]
该测定产生以下结果：
[0182]
批次1(lot#mtti-045-174-1)：1.0％游离氨基
[0183]
批次2(lot#mtti-045-181)：2.7％游离氨基
[0184]
批次3(lot#mtti-045-182)：2.2％游离氨基
[0185]
批次4(lot#mtti-045-186)：2.4％游离氨基
[0186]
批次5(lot#mtti-045-187)：2.4％游离氨基
[0187]
这些数据表明，利用》97％初始可用胺在与zndpa部分反应的6-臂聚合物上产生了产品。
[0188]
尽管已经针对一个或多个具体实例描述了本公开，但是应当理解，在不脱离本公开范围的情况下，可以做出本公开的其它实例。