通过选择性糖皮质激素受体拮抗剂使癌症患者的中性粒细胞对淋巴细胞比例正常化的方法
背景技术：1.癌症是一组以异常细胞不受控制的生长和扩散为特征的多种疾病。癌症是美国和世界各地的主要死亡原因。调节细胞分裂和/或细胞交流的通路在癌细胞中发生改变，使得这些调节机制在控制和限制细胞生长方面的作用失效或被绕过。通过连续几轮的突变和自然选择，通常源自单个突变细胞的一组异常细胞积累了额外的突变，其提供了优于其他细胞的选择性生长优势，从而演变成在细胞群中占主导地位的细胞类型。随着癌细胞的进一步进化，其中一些会变得具有局部侵袭性，之后转移到癌细胞起源组织以外的组织中。这种特性以及肿瘤细胞群的异质性使癌症成为一种特别难以治疗和根除的疾病。
2.中性粒细胞的绝对计数与淋巴细胞的绝对计数之间的比例称为中性粒细胞对淋巴细胞比率(nlr)。在多种肿瘤学环境中，nlr能够预后或预测对化疗的反应(an等人，“中性粒细胞对淋巴细胞比例的升高预测晚期胰腺癌的存活率(elevated neutrophil to lymphocyte ratio predicts survival in advanced pancreatic cancer)”biomarkers.15(6)：516-522，2010；proctor等人，“衍生的中性粒细胞对淋巴细胞比例预测癌症患者的存活率(a derived neutrophil to lymphocyte ratio predicts survival in patients with cancer)”br j cancer.107(4)：695-699，2012；xue等人，“用于预测晚期胰腺癌患者姑息性化疗结果的中性粒细胞对淋巴细胞比例(neutrophil-to-lymphocyte ratio for predicting palliative chemotherapy outcomes in advanced pancreatic cancer patients)”cancer med.3(2)：406-15，2014；stotz等人，“中性粒细胞-淋巴细胞比例增加是原发性可手术和不可手术胰腺癌患者的不良预后因素(increased neutrophil-lymphocyte ratio is a poor prognostic factor in patients with primary operable and inoperable pancreatic cancer)”br j cancer.109(2)：416-421，2013；teo等人，“中性粒细胞对淋巴细胞比例在晚期胰腺导管腺癌中的预后作用：基线波动和化疗期间变化的影响(prognostic role of neutrophil-to-lymphocyte ratio in advanced pancreatic ductal adenocarcinoma:impact of baseline fluctuation and changes during chemotherapy)”tumori.99(4)：516-522，2013；wang等人，“胰腺癌患者各种炎症因素的预后价值比较(comparison of the prognostic values of various inflammation-based factors in patients with pancreatic cancer)”med oncol.29(5)：3092-3100，2012)。nlr还可以预测对检查点抑制剂的反应，其也称为免疫肿瘤疗法，例如pd-1抑制剂(sacdalan等人，“接受免疫检查点抑制剂的患者基线中性粒细胞对淋巴细胞比例的预后效用：回顾和荟萃分析(prognostic utility of baseline neutrophil-to-lymphocyte ratio in patients receiving immune checkpoint inhibitors:a review and meta-analysis)”oncotargets and therapy.11：955-65,2018)。在转移性肾细胞癌患者中，与nlr未降低的患者相比，抗癌治疗的nlr降低与更好的治疗结果相关(lalani等人，j.immunotherapy cancer 6：5(2018))。中性粒细胞对淋巴细胞比例低于每个淋巴细胞3个中性粒细胞的阈值(nlr《3)时，通常认为是低或正常的。小于3的nlr与多种肿瘤学环境中的
cancer cells)”j.endocrinol.211：17-25(2011))。另一方面，据报道，阻断gr信号通路的药剂可以增强化疗杀死上皮来源的癌细胞(如参见美国专利第9,149,485号)。
5.gr拮抗对nlr的影响(若有的话)尚不清楚。对健康男性施用米非司酮(也称为ru-486)不会改变血液中的中性粒细胞或淋巴细胞丰度(laue，1990)。艾迪生病患者的血清皮质醇水平通常低于正常水平；但是，这些患者具有正常的中性粒细胞丰度(de la balze，“某些肾上腺皮质疾病(库欣综合征、艾迪生病和全垂体功能减退)中的差异血细胞计数(differential blood counts in certain adrenal cortical disorder(cushing's syndrome,addison's disease and panhypopituitarism)”j clin endocrinol metab.6：312-9，1946)和功能(bancos等人，“原发性肾上腺功能不全与自然杀伤细胞功能受损有关：与死亡率增加的潜在联系(primary adrenal insufficiency is associated with impaired natural killer cell function:a potential link to increased mortality)”eur j endocrinol.176(4)：471-480，2017)。
6.因此，gr拮抗对nlr的影响(若有的话)尚不清楚，而仍然需要改进的抗癌治疗，包括利用nlr在抗癌治疗中的预后价值的治疗。
技术实现要素：7.本文中，申请人公开了使中性粒细胞对淋巴细胞比例(nlr)正常化的方法。对于癌症患者而言，高于正常(大于3)的nlr预示着较差的预后。降低nlr与改善抗癌治疗结果相关。将癌症患者的nlr降低至正常值(即小于约3)能改善这些患者的预后，改善他们对抗癌治疗的反应，改善癌症治疗的结果，能够减少肿瘤负荷并促进肿瘤消除。如上所述，米非司酮不会改变健康对象的中性粒细胞或淋巴细胞丰度，因此不会影响健康对象的nlr(laue，1990)。令人惊讶的是，如本文所公开的，施用非类固醇gra能有效降低接受抗癌治疗的癌症患者的nlr。
8.本文公开的方法包括选择nlr大于3的癌症患者以及与抗癌治疗组合施用诸如瑞拉可兰(relacorilant)等非类固醇糖皮质激素受体拮抗剂(gra)以正常化(降低)具有高nlr并接受抗癌治疗的癌症患者的nlr。本文公开的方法包括与抗癌治疗组合施用诸如瑞拉可兰等非类固醇gra以治疗具有高nlr的癌症患者。本文公开的方法包括与抗癌治疗组合施用诸如瑞拉可兰等非类固醇gra以增强具有高nlr并接受抗癌治疗的癌症患者对抗癌治疗的反应。本文公开的方法包括与抗癌治疗组合施用诸如瑞拉可兰等非类固醇gra以降低具有一个或多个肿瘤并具有高nlr并接受抗癌治疗的癌症患者的肿瘤负荷。本文公开的方法包括与抗癌治疗组合施用诸如瑞拉可兰等非类固醇gra以促进具有高nlr并接受抗癌治疗的癌症患者的肿瘤消除。本文公开的方法包括与抗癌治疗组合施用诸如瑞拉可兰等非类固醇gra以改善具有高nlr的癌症患者的健康。本文公开的方法包括与诸如白蛋白结合-紫杉醇(nab-paclitaxel)等紫杉烷组合对具有高nlr的癌症患者施用诸如瑞拉可兰等非类固醇gra，从而降低nlr，改善患者对紫杉烷的反应，并改善癌症患者的健康。
9.在实施方式中，抗癌治疗可以包括化疗剂(如紫杉烷，例如白蛋白结合-紫杉醇、吉西他滨、或其他化疗剂)的施用。在实施方式中，抗癌治疗可以包括免疫治疗剂(如检查点抑制剂，例如针对选自pd-1、pd-l1、ctka4、lag3、b7-h3、b7-h4、ox-40、cd-137、tim3的蛋白质目标的抗体，或其他免疫疗法)的施用。在实施方式中，抗癌治疗可以包括放疗(如针对肿瘤
的电离辐射、放射性药物组合物的输注、放射源的植入、或其他放射疗法)的施用。抗癌治疗可以包括手术和其他抗癌治疗，并且可以包括这些抗癌治疗的组合。
10.在本文公开的方法的实施方式中，非类固醇gra为非类固醇化合物，其包含稠合氮杂萘烷结构。在实施方式中，包含稠合氮杂萘烷结构的化合物是美国专利7,928,237和美国专利8,461,172中描述和公开的化合物。在实施方式中，包含杂芳基-酮稠合氮杂萘烷结构的化合物是美国专利8,859,774中描述和公开的化合物。在实施方式中，包含八氢稠合氮杂萘烷结构的化合物是美国专利10,047,082中描述和公开的化合物。这些专利的全部内容以及所有专利、专利申请、专利出版物和本文讨论的出版物的上下文均通过引用整体纳入本文。
11.在实施方式中，例如非类固醇gra为杂芳基-酮稠合氮杂萘烷化合物(如美国专利8,859,774中公开的化合物)。在具体实施方式中，非类固醇gra为(r)-(1-(4-氟苯基)-6-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)磺酰基)-4,4a,5,6,7,8-六氢-1h-吡唑并[3,4-g]异喹啉-4a-基)(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)甲酮，也称为“瑞拉可兰”和“cort125134”(美国专利8,859,774的实施例18)，其具有下列结构：
[0012][0013]
瑞拉可兰在化学上不同于类固醇化合物米非司酮。与米非司酮不同，瑞拉可兰不拮抗孕酮受体。因此，瑞拉可兰(以及如美国专利8,859,774、美国专利7,928,237、美国专利8,461,172、美国专利10,047,082以及本文引用的其他专利公开的其他稠合氮杂萘烷化合物)提供选择性拮抗糖皮质激素受体的方法。瑞拉可兰对nlr的效果未被描述。
[0014]
在某些情形中，口服施用选择性非类固醇gra。在一些情形中，选择性非类固醇gra通过注射、输注、透皮施用、雾化悬浮液、或气溶胶喷雾来施用。
[0015]
在一些情形中，非类固醇选择性gra的有效量是1到100mg/kg/天的日剂量。在一些实施方式中，非类固醇选择性gra的剂量为1、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、30、40、50、60、70、80、90或100mg/kg/天的日剂量。在一些情形中，gra至少施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75或80周，或者直到癌症恶化(疾病进展)。
[0016]
本方法提供正常化(降低)具有高nlr并接受抗癌治疗的癌症患者的nlr；增强具有高nlr并接受抗癌治疗的癌症患者对抗癌治疗的反应(如改善具有高nlr的癌症患者对紫杉烷(如白蛋白结合-紫杉醇)化疗的反应)；降低具有一个或多个肿瘤并具有高nlr并接受抗癌治疗的癌症患者的肿瘤负荷；促进具有高nlr并接受抗癌治疗的癌症患者的肿瘤消除；改善具有高nlr并接受抗癌治疗的癌症患者的健康的改善的方法。本方法通过改善和增强抗癌治疗、延缓疾病进展、提高患者寿命和存活率、生活质量、以及其他有益的健康结果来为患者提供优势。
附图说明
[0017]
图1a.瑞拉可兰对健康对象的中性粒细胞对淋巴细胞比例(nlr)的影响。健康对象研究的给药和评估时间表。(a)单个递增剂量(sad)强的松挑战设计。
[0018]
图1b.瑞拉可兰对健康对象的中性粒细胞对淋巴细胞比例(nlr)的影响。健康对象研究的给药和评估时间表。(b)多个递增剂量(mad)强的松挑战设计。
[0019]
图1c.瑞拉可兰对健康对象的中性粒细胞对淋巴细胞比例(nlr)的影响。健康对象研究的给药和评估时间表。(c)图例。
[0020]
图2.晚期实体瘤患者：第i段连续给药方案第1部分：剂量测定；第2部分：剂量扩展。“cort125134”表示瑞拉可兰。“pk抽血”表示为药代动力学测量而采集的血样(“抽血”)。“cort125134”表示瑞拉可兰。
[0021]
图3.晚期实体瘤患者：第ii段间歇给药方案：第1和第2部分。“pk抽血”表示为药代动力学测量而采集的血样(“抽血”)。“cort125134”表示瑞拉可兰。
[0022]
图4.在不存在和存在瑞拉可兰的情况下，对9名施用25毫克(mg)强的松的健康对象测定nlr。单个500mg剂量的瑞拉可兰能逆转25mg强的松对健康对象nlr的影响。
[0023]
图5.在不存在和存在瑞拉可兰的情况下，对施用强的松的健康对象测定nlr。与单个的25mg强的松相比，多个250mg剂量(连续14天，250mg/天)瑞拉可兰能逆转25mg强的松的影响。
[0024]
图6.与在强的松前连续14天施用安慰剂对照的健康对象所测定的nlr相比，多个250mg剂量(连续14天，250mg/天)瑞拉可兰能逆转25mg强的松对nlr的影响。
[0025]
图7a.与健康对象的nlr相比，许多癌症患者的nlr升高。
[0026]
图7b.单独用250mg瑞拉可兰不改变健康对象的nlr。
[0027]
图8.晚期实体瘤患者单独用瑞拉可兰7天期间，auc(右)或c
max
(左)相关的nlr变化。
[0028]
图9.瑞拉可兰+白蛋白结合-紫杉醇给药8天能降低实体瘤患者的nlr。
[0029]
图10.具有晚期实体瘤且基线nlr小于或等于3的患者的nlr变化(如左图所示)与具有晚期实体瘤且基线nlr大于3的患者的nlr变化(如右图所示)的比较。
[0030]
图11.卵巢癌患者的nlr降低(单独用瑞拉克兰7天后)，该患者之后对瑞拉克兰+白蛋白结合-紫杉醇的治疗达到完全反应。
[0031]
图12.在第1周期的前8(左)或15(右)天，具有进行性疾病(pd)、稳定疾病(sd)、部分或完全反应(pr/cr)的患者的nlr相对于基线的变化(log2量表)。水平线代表中值。
[0032]
发明详述
[0033]
a.引言
[0034]
本文公开的方法包括选择nlr大于3的癌症患者以及与抗癌治疗组合施用诸如瑞拉可兰等非类固醇糖皮质激素受体拮抗剂(gra)以正常化(降低)具有高nlr并接受抗癌治疗的癌症患者的nlr。与健康个体中观察到的nlr相比，癌症患者的中性粒细胞对淋巴细胞比例(nlr)通常有所增加。大于3的nlr是过度的，并且是经常在患有癌症的患者中发现的值。nlr恢复到更健康的值(如恢复到约3或更低)表明对抗癌治疗的有益反应。与未显示nlr正常化的癌症患者相比，nlr恢复到更健康的值(如恢复到约3或更低)与抗癌治疗结果的改善相关。据信，正常化(降低)nlr大于3并接受抗癌治疗的癌症患者的nlr有助于抗癌治疗，
改善抗癌治疗结果，可以减少具有一个或多个肿瘤的癌症患者的肿瘤负荷，并且可以促进具有一个或多个肿瘤的癌症患者的肿瘤消除，并且还帮助实现对抗癌治疗的有益反应。据信，通过与癌症化疗或其他抗癌治疗结合施用诸如杂芳基-酮稠合氮杂萘烷gra、如瑞拉可兰(也称为“cort125134”或“rela”)等非类固醇选择性糖皮质激素受体拮抗剂(gra)来拮抗皮质醇活性，在治疗癌症和降低接受治疗的癌症患者的nlr值方面是有效的。本文中，申请人公开了内源性皮质醇活性的拮抗与对瑞拉可兰和白蛋白结合-紫杉醇(np或nab-pac)结合治疗的反应相关。本文中，申请人公开了内源性皮质醇活性的拮抗与对瑞拉可兰和白蛋白结合-紫杉醇结合治疗的反应相关。
[0035]
包括内源性皮质醇在内的糖皮质激素通过上调诸如dusp1(“双特异性磷酸酶1”)和sgk1(“血清/糖皮质激素调节激酶1”)等控制细胞存活通路的基因来促进化学抗性(dusp1：注册号nm_004417.2，nsid号nm_004417.2：987；sgk1：注册号nm_005627.2，nsid号nm_005627.2：1790)。作为非类固醇选择性gra，瑞拉可兰能拮抗皮质醇的作用。在i期临床研究中，在16周或之后，瑞拉可兰+np对19/49(39％)名难治性晚期实体瘤患者实现疾病控制，包括那些在先前紫杉烷治疗中进展的患者。皮质醇活性的生物标志物是根据健康对象接受强的松挑战定义的，并在接受瑞拉可兰+白蛋白结合-紫杉醇的实体瘤患者中进行评估。
[0036]
方法：淋巴细胞和中性粒细胞丰度使用标准差异全血细胞计数测试确定。
[0037]
结果：在健康对象(n＝9)中，25毫克(mg)强的松的施用使中性粒细胞对淋巴细胞比例(nlr)急剧增加4.7倍。瑞拉可兰共同施用逆转了这种效果。在癌症患者中，nlr在基线处显著升高，但是通过瑞拉可兰正常化。
[0038]
这些结果表明，瑞拉可兰逆转了强的松在健康对象中对nlr的诱导。瑞拉可兰降低了癌症患者增加的nlr。这与癌症患者的内源性糖皮质激素受体(gr)活性升高相一致并表明了这一点。
[0039]
这些结果表明，对于具有高nlr并接受抗癌治疗的癌症患者而言，施用诸如瑞拉可兰等非类固醇选择性gra能有效地使高nlr正常化(降低)。因此，对具有高nlr并接受抗癌治疗的癌症患者施用非类固醇选择性gra可以使此类癌症患者的高nlr正常化(降低)并增强其癌症的治疗，从而为患者提供临床益处。
[0040]
因此，用于治疗中性粒细胞对淋巴细胞比例(nlr)大于3的癌症患者的本方法能有效降低患者的nlr并增强癌症患者的治疗。在实施方式中，抗癌治疗可以包括化疗、免疫疗法、放疗、抗血管生成剂的施用、生长因子抑制剂的施用、手术。该方法可以增强抗癌治疗，改善癌症患者的预后，延缓疾病进展，改善癌症患者的寿命和存活率，改善患者的生活质量，并提供其他有益的健康结果、有益的临床效果和给患者带来的其他益处。
[0041]
b.定义
[0042]
如本文所用，术语“对象”或“患者”指人类或非人类生物体。因此，本文所述的方法和组合物适用于人类和动物疾病。在某些实施方式中，对象是“患者”，即正在接受疾病或病症的医疗护理的活人。这包括没有明确疾病的人，他们正在接受病理迹象的调查。在一些情形中，对象可能同时患有一种或多种类型的癌症。癌症包括但不限于前列腺癌、乳腺癌、肾癌、黑色素瘤、胰腺癌、肾上腺皮质癌、宫颈癌、卵巢癌、子宫内膜(或子宫)癌、外阴癌、结肠癌、头颈癌、肺癌、肉瘤、肝细胞肿瘤、胶质母细胞瘤、神经内分泌肿瘤、膀胱癌、胆囊癌/胆管
癌、胃癌和间皮瘤。
[0043]
癌症的特征是异常细胞的不受控制的生长和/或扩散。通常会进行活组织检查，并在显微镜下检查活组织检查中的细胞或组织，以确认可疑情况。在某些情形中，需要对细胞的蛋白质、dna和rna进行额外的测试以验证诊断。
[0044]
如本文所用，术语“肿瘤”和术语“癌症”能互换使用，其均指由过度细胞分裂所导致的组织异常生长。侵入周围组织和/或可以转移的肿瘤被称为“恶性”。不转移的肿瘤被称为“良性”。
[0045]
本文中所用术语“肿瘤负荷”或“肿瘤负担”一般指任何给定时间处的对象身体中的癌细胞数量、肿瘤尺寸、或癌量。肿瘤负荷可通过，例如，通过本文公开的多种熟知的、生化或成像方法测量肿瘤特异性遗传标志物的表达和测量肿瘤尺寸来检测，见下文。
[0046]
如本文所用，术语“检查点蛋白质”是指存在于某些类型细胞(如t细胞和某些肿瘤细胞)表面上的蛋白质，其可以诱导检查点信号通路并导致免疫反应的调节。常见的检查点蛋白质包括ctla4、pd-1、pd-l1、lag3、b7-h3、b7-h4、tim3、cd160、cd244、vista、tigit、ox-40、cd137、btla。(pardoll,2012,nature reviews cancer 12:252-264；baksh,2015,semin oncol.2015六月；42(3):363-77)。其中，ctla4、pd-1和pd-l1的研究最为充分，针对这些蛋白质的疗法在临床上比针对其他检查点蛋白质的疗法更先进。
[0047]
如本文所用，术语“pd-1”是指程序性细胞死亡蛋白1(也称为cd279)，其为免疫球蛋白超家族的细胞表面膜蛋白。pd-1由b细胞、t细胞和nk细胞表达。pd1的主要作用是在反应感染的炎症期间限制外周组织中t细胞的活性，以及限制自身免疫性。pd1表达在活化的t细胞中被诱导，pd1与其内源性配体之一的结合通过抑制刺激性激酶来抑制t细胞活化。pd-1还起到抑制tcr“终止信号”的作用。pd1在treg细胞(调节性t细胞)上高度表达，并可在配体存在下增加其增殖(pardoll,2012,nature reviews cancer 12:252-264)。
[0048]
如本文所用，术语“pd-l1”是指程序性细胞死亡1配体1(也称为cd274和b7-h1)，其为pd-1的配体。pd-l1存在于活化的t细胞、b细胞、骨髓细胞、巨噬细胞和肿瘤细胞上。虽然pd-1有两种内源性配体，即pd-l1和pd-l2，但是抗肿瘤治疗主要集中于抗pd-l1。pd1和pd-l1的复合物抑制cd8+t细胞的增殖并降低免疫反应(topalian等,2012,n engl j.med 366:2443-54；brahmer等,2012,n engl j.med 366:2455-65)。
[0049]
如本文所用，术语“ctla4”是指细胞毒性t淋巴细胞抗原4(也称为cd152)，其为仅在t细胞上表达的免疫球蛋白超家族的成员。ctla4能抑制t细胞活化，据报道其能抑制辅助t细胞活性并增强调节性t细胞免疫抑制活性。尽管ctl4-a的确切作用机制仍在研究中，但是有人提出它通过与cd28竞争在抗原呈递细胞上与cd80和cd86的结合来抑制t细胞活化，并主动向t细胞传递抑制剂信号(pardoll,2012,nature reviews cancer 12:252-264)。
[0050]
如本文所用，术语“检查点抑制剂”是指调节由一种或多种检查点蛋白质诱导的免疫抑制通路的任何分子，其包括抗体和小分子。检查点抑制剂通常是针对至少一种检查点蛋白质的抗体(“cia”)。这种抗体可以阻断检查点蛋白质的免疫抑制活性。许多此类抗体已被证明能有效治疗癌症，如针对pd-1、ctla4和pd-l1的抗体。但是，检查点抑制剂也可以是阻断由一种或多种检查点蛋白质诱导的免疫抑制通路的小分子非蛋白质化合物(“cic”)。
[0051]
如本文所用，本文所用的术语“抗体”还包括全长抗体以及抗体的“抗原结合部分”。如本文所用，术语“抗原结合部分”是指保留特异性结合至抗原(如pd-1)的能力的一个
或多个抗体片段。术语抗体的“抗原结合部分”所包含的结合片段的实例包括(i)fab片段，由vl、vh、cl和ch1结构域组成的单价片段；(ii)f(ab')2片段，二价片段，包括在铰链区通过二硫桥联接的两个fab片段；(iii)由vh和ch1结构域组成的fd片段；(iv)由抗体单臂的vl和vh结构域组成的fv片段，(v)dab片段(ward等，(1989)nature 341：544-546)，其由vh结构域组成；以及(vi)分离的互补决定区(cdr)。此外，尽管fv片段的两个结构域vl和vh分别由不同基因编码，但是可通过重组方法利用合成接头使其连接成为一条蛋白链，其中vl和vh区配对形成单价分子，称为单链fv(scfv)。参见如bird等人，(1988)science 242：423-426；huston等人，(1988)proc.natl.acad.sci.usa 85：5879-5883；osbourn等人，1998,nature biotechnology 16：778。这种单链抗体也意为包含在术语抗体的“抗原结合部分”内。可以将特定scfv的任何vh和vl序列连接到人免疫球蛋白恒定区cdna或基因组序列，以产生编码完整igg分子或其他同种型的表达载体。vh和vi也可以用于产生fab、fv或其他免疫球蛋白片段，其使用蛋白质化学或重组dna技术。还包括其他形式的单链抗体，例如双抗体。双抗体是二价、双特异性抗体，其中vh和vl结构域表达于单个多肽链上，但是使用的接头太短而不能将两个结构域配对在同一条链上，从而迫使结构域与其他链的互补结构域配对，产生两个抗原结合位点(如参见holliger,p.等人，(1993)proc.natl.acad.sci.usa 90:6444-6448；poljak,r.j.等人，(1994)structure 2:1121-1123)。
[0052]
抗体可以是多克隆或单克隆的；异种、同种异体或同源的；或其修饰形式，如人源化、嵌合等。针对检查点蛋白质的抗体特异性地或基本上特异性地与一种或多种检查点蛋白质结合。术语“单克隆抗体”是指仅含有一种抗原结合位点的抗体分子群，该抗原结合位点能够与抗原的特定表位发生免疫反应，而术语“多克隆抗体”和“多克隆抗体组合物”是指含有多种抗原结合位点的抗体分子群，这些抗原结合位点能够与特定抗原相互作用。单克隆抗体组合物通常对与其发生免疫反应的特定抗原表现出单一的结合亲和力。
[0053]
如本文所用，术语“对检查点蛋白质有效的抗体”是指可以与检查点蛋白质结合并拮抗检查点蛋白质在抑制免疫反应中的功能的抗体。例如，针对pd-1的抗体是指能够与pd-1结合并通过如阻断pd-1与pd-l1之间的相互作用来阻断pd-1对免疫反应的抑制功能的抗体。在某些情形中，抗体可以针对两种检查点蛋白质，即具有结合两种检查点蛋白质并抑制其功能的能力。
[0054]
本文使用的术语“中性粒细胞”如医学领域所接受的那样，是指哺乳动物血液中发现的最丰富的粒细胞。中性粒细胞也称为多形核嗜中性粒细胞。作为免疫系统的一部分，中性粒细胞吞噬血液中的外来细胞和异物。当用苏木精和伊红染色剂处理时，中性粒细胞的细胞质染成中性粉红色。中性粒细胞通常具有带状或分段的细胞核。
[0055]
如医学领域所接受的那样，本文使用的术语“淋巴细胞”是指同样形成淋巴中细胞的主要部分的白细胞。淋巴细胞包括自然杀伤细胞、t细胞和b细胞。当血液样本用wright染色剂染色时，淋巴细胞显示出染色大而深的细胞核和少量嗜酸性细胞质。
[0056]
如本文所用，术语“中性粒细胞对淋巴细胞比例”和“nlr”是指从对象处获得的血液样品中中性粒细胞数量除以淋巴细胞数量的比例。
[0057]
nlr＝(绝对中性粒细胞计数)/(绝对淋巴细胞计数)
[0058]
健康对象的nlr一般为约3或更低。nlr值大于3被认为是高nlr值。nlr也可以通过以下公式表示为从基线起的nlr百分比变化(％cfb)：
[0059]
(其中“x”表示乘)
[0060]
因此，当使用此公式计算从基线起的nlr百分比变化时，任何小于0％的nlr％cfb都代表nlr的降低，而任何大于0％的nlr％cfb都代表nlr的增加。nlr也可以使用以下公式表示为从基线起的nlr倍数变化(倍数cfb)：
[0061][0062]
因此，当使用此公式计算从基线起的nlr倍数变化时，任何小于1的nlr倍数cfb都代表nlr的降低，而任何大于1的nlr倍数cfb都代表nlr的增加。
[0063]
如本文所用，术语“正常化”nlr是指将高(大于3的)nlr值朝着nlr值3降低，并且优选地降低到3或更小的nlr值。在最优选的实施例中，nlr降低到小于3的值。
[0064]
如本文所用，所用的术语“存活”，如关于患者存活，是指在患者开始治疗之后的死亡之前时间段。
[0065]
如本文所用，术语“无进展存活”是指最初患有肿瘤的患者在开始治疗后肿瘤没有显著生长(或“进展”)的时间段。
[0066]
如本文所用，术语“稳定响应”或“稳定反应”是指最初患有肿瘤的患者的肿瘤保持大致相同的大小，但是可以包括少量生长(通常小于20或25％)或少量收缩(但是收缩小于被称为“部分反应”的收缩)。
[0067]
如本文所用，术语“部分反应”(pr)是指最初患有肿瘤的患者的总肿瘤体积(大致)减少至少50％，但是仍有一些残留疾病的痕迹。在一些情形中，深度部分反应中的残留疾病可能实际上是死亡的肿瘤或疤痕，从而被分类为具有pr的少数患者可能实际上具有cr。同样地，在治疗过程中显示肿瘤缩小的许多患者在持续治疗后显示进一步的肿瘤缩小，并且可以达到cr。
[0068]
如本文所用，术语“完全反应”(cr)是指最初患有肿瘤的患者通过测试、身体检查和扫描指示所有可以检测到的肿瘤已经消失。
[0069]
如本文所用，术语“化疗”是指通常用于治疗癌症的医学治疗。化疗治疗包括使用对癌组织和细胞有毒的药剂，或者用于减缓或减少癌组织和细胞生长或扩散的药剂。化学治疗剂包括抗肿瘤剂，并且可以衍生自天然化合物(例如紫杉醇)；可以是，可以模仿，或可以减少或阻断天然存在的激素，生长因子或免疫活性分子的作用；可以是合成的小分子；可以是抗体或抗体偶联物；并且可以是其他试剂。示例性化学治疗剂包括但不限于：紫杉烷类、紫杉醇类(taxol)、多西紫杉醇、紫杉醇(paclitaxel)、吉西他滨、放线菌素、蒽环霉素、多柔比星、柔红霉素、戊柔比星、博来霉素、顺铂、曲妥珠单抗曲妥珠单抗爱玛塔新(emtasine)伊马替尼艾日布林以及parp抑制剂(“parp”代表聚adp核糖聚合酶的药理学抑制剂)、以及本领域已知的其他药物。
[0070]
如本文所用，术语“化合物”用于指具有独特、可鉴定的化学结构的分子部分。分子部分(“化合物”)可以游离物质形式存在，其中它不与其它分子相关联。化合物也可作为较
大聚集体的部分存在，其中它与一个或多个其它分子相关联，但仍保留其化学特点。其中具有确定化学结构的分子部分(“化合物”)与溶剂的分子相关联的溶剂合物是此类相关形式的示例。水合物是其中相关联的溶剂为水的溶剂合物。述及“化合物”，指(所述及结构的)分子部分本身，不论其是以游离形式还是缔合形式存在。
[0071]
本文中所用术语“组合物”旨在涵盖包含特定成分的产品，例如所述化合物、其互变异构形式、其衍生物、其类似物、其立体异构体、其多晶型物、其药学上可接受的盐、酯、醚、代谢物、异构体混合物、其药学上可接受的溶剂合物和特定量的药学上可接受的组合物、以及由特定量的特定成分的组合直接或间接产生的任何产品。对于药物组合物而言，该术语目的是涵盖包括活性成分和构成运载体的惰性成分的产品，以及任何直接或间接从任意两个或更多个成分组合、复合或聚集，或一个或更多成分的分解，或一个或更多成分的其他类型的反应或相互作用形成的任意产品。因此，本发明的药物组合物意在涵盖通过将本发明化合物与其药学上可接受的运载体混合而制得的任何组合物。
[0072]
本文所用术语“药学上可接受的赋形剂”和“药学上可接受的运载体”旨在包括与药物给予相容的任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。术语“药学上可接受的赋形剂”和“药学上可接受的运载体”指有助于活性剂施用于对象和被对象吸收的物质，且可被包括在本发明的组合物中而不会对患者造成明显的不良毒理作用。药学活性物质的这类介质和试剂的用法是本领域熟知的。除非任何常规介质或试剂都与活性化合物不相容，否则应考虑在组合物中使用这些介质或试剂。补充性活性化合物也可掺入所述组合物。药学上可接受的赋形剂的非限制性示例包括水、nacl、生理盐水、乳酸林格溶液、普通蔗糖、普通葡萄糖、粘合剂、填充剂、崩解剂、润滑剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和着色剂等。本领域普通技术人员应理解，其它药用赋形剂可用于本发明中。
[0073]
如本文所用，术语“给予”、“施用”、“给药”或“被给予”指向对象或患者提供化合物或组合物。施用可以口服施用(即对象口服接受化合物或组合物，其作为丸剂、胶囊、液体或适合口服施用其他形式。口服施用可以是含服的(其中化合物或组合物保持在口中，如在舌下，并且在那里被吸收)。可以通过注射施用，即通过针头、微针、压力注射器或其他刺穿皮肤或使化合物或组合物强行穿过对象皮肤的方式递送化合物或组合物。注射可以是静脉内(即进入静脉)；动脉内(即进入动脉)；腹膜内(即进入腹膜)；肌肉内(即进入肌肉)；或通过其他注射途径。施用途径还可以包括直肠、阴道、经皮、经肺(如通过吸入)、皮下(如通过从含有该化合物或组合物的植入物吸收到皮肤中)，或通过其他途径。
[0074]
如本文所用，术语“组合治疗”指给予对象至少两种药剂以治疗疾病。这两种药剂可同时给予，或可在整个或部分疗程中以任何顺序依序给予。所述至少两种药剂可按相同或不同给药方案给予。在一些情形中，一种药剂按预定方案给予，而另一种药剂间歇给予。在一些情形中，两种药剂均间歇给予。在一些实施方式中，一种药剂(如非类固醇sgrm)每天施用，而另一种药剂，例如，化学治疗剂，每两、三或四天施用。
[0075]
如本文所用，术语“共同施用”是指同时或在彼此短时间内施用两种组合物，例如彼此在约0.5、1、2、4、6、8、10、12、16、20或24小时内。
[0076]
如本文所用，术语“有效量”或“治疗量”指药剂有效治疗、消除或减缓被治疗疾病的至少一种症状的量。一些情形中，“治疗有效量”或“有效量”可指能够显示可检测的治疗或抑制作用的功能性物质或药物组合物的量。所述效果可通过本领域已知的任何试验方法
检测。有效量可以是有效地在患者中提供有益反应的量。有效量可以是有效引起抗肿瘤反应的量。有效量可以是有效在受体对象中引起体液和/或细胞免疫反应导致靶细胞生长抑制或死亡的量。出于本公开的目的，检查点抑制剂的治疗量是会降低肿瘤负荷或带来与癌症改善相关的其他期望的有益临床结果的量。
[0077]
如本文所用，短语“未另外表明用糖皮质激素受体调节剂治疗”或“未另外表明用糖皮质激素受体拮抗剂治疗”是指未患有医学界公认的可以用糖皮质激素受体拮抗剂有效治疗的任何病症的患者，肝脂肪变性除外。本领域已知并被医学界接受的可以用糖皮质激素受体拮抗剂有效治疗的病症包括：与干扰素-α治疗相关的精神病、精神病性重度抑郁症、痴呆、应激障碍、自身免疫性疾病、神经损伤和库欣综合征。
[0078]
在一些实施方式中，术语“基本由
……
组成”指制剂中唯一活性成分是所示活性成分的组合物，但也可包括其他化合物，这些其它化合物用于稳定、保存制剂等，但不直接涉及所示活性成分的治疗作用。在一些实施方式中，术语“基本由
……
组成”可指包含活性成分和促进活性成分释放的组分的组合物。例如，该组合物可包含使活性成分随时间推移缓释至对象的一种或多种组分。在一些实施方式中，术语“由
……
组成”指包含活性成分和药学上可接受的运载体或赋形剂的组合物。
[0079]
如本文所用，术语“类固醇”和短语“类固醇骨架”在糖皮质激素受体拮抗剂中是指包含皮质醇基础结构的修饰的糖皮质激素受体拮抗剂，皮质醇是内源性类固醇糖皮质激素受体配体。类固醇骨架的基础结构如式i所示：
[0080][0081]
术语“糖皮质类固醇”(“gc”)或“糖皮质激素”是指与糖皮质激素受体结合的类固醇激素。糖皮质类固醇的通常特征在于其具有21个碳原子、在环a中的α,β-不饱和酮、连接至环d的α-酮醇基团。它们在c-11、c-17和c-19的氧化程度和羟基化程度上存在差异(rawn,“膜脂质的生物合成和运输，胆固醇衍生物的形成(biosynthesis and transport of membrane lipids and formation of cholesterol derivatives),”biochemistry,daisy等人(编),1989,第567页)。
[0082]
盐皮质激素受体(mr)，也称为i型糖皮质激素受体(gr i)，被人体内的醛固酮激活。
[0083]
术语“皮质醇”是指由肾上腺束状带产生的天然存在的糖皮质激素(也称为氢化可的松)。皮质醇具有以下结构：
[0084]
[0085]
术语“米非司酮”是指11β-(4-二甲基氨基苯基)-17β-羟基-17α-(1-丙炔基)-雌-4,9-二烯-3-酮，具有以下结构：
[0086][0087]
米非司酮也称为ru486或ru38.486或17-β-羟基-11-β-(4-二甲基氨基苯基)-17-α-(1-丙炔基)-雌-4,9-二烯+-3-酮)。米非司酮与糖皮质激素受体(gr)、孕激素受体(pr)、雄激素受体(ar)结合，因此对gr没有选择性。
[0088]
术语“强的松”是指合成的糖皮质激素17α,21-二羟基孕酮-1,4-二烯-3,11,20-三酮，具有以下结构：
[0089][0090]
如本文所用，术语“糖皮质激素受体”(“gr”)指特异性结合至皮质醇和/或皮质醇类似物的胞内受体家族。所述糖皮质激素受体也称为皮质醇受体。该术语包括gr的异构体、重组gr和突变gr。“糖皮质激素受体”(“gr”)指与皮质醇和/或皮质醇类似物(例如地塞米松)特异性结合的ii型gr(参见例如，turner和muller,j mol endocrinol 2005年10月1日，35 283-292)。
[0091]
术语“糖皮质激素受体调节剂”(grm)指调节与gr和激动剂结合相关的任何生物应答的任何化合物。例如，作为激动剂的grm，例如地塞米松，能够增加hepg2细胞(人肝肝细胞癌细胞系；ecacc，英国)中酪氨酸氨基转移酶(tat)的活性。作为拮抗剂的grm，例如米非司酮，能够降低hepg2细胞中酪氨酸氨基转移酶(tat)的活性。
[0092]“糖皮质激素受体拮抗剂”(gra)指抑制与gr和激动剂结合相关的任何生物应答的任何化合物。因此，可以通过测量化合物抑制地塞米松作用的能力来鉴定gr拮抗剂。可如文献中所述检测tat活性：a.ali等,j.med.chem.,2004,47,2441-2452。调节剂是ic
50
(半最大抑制浓度)少于10微摩尔的化合物。参见实施例1，如下所述。
[0093]
如本文所用，术语“选择性糖皮质激素受体拮抗剂”(sgra)是指抑制与gr和激动剂结合相关的任何生物学反应的任何组合物或化合物(其中抑制是相对于在化合物不存在的情况下的反应确定的)。通过“选择性”，药物优先结合至gr而非其它核受体，例如黄体酮受体(pr)、盐皮质激素受体(mr)或雄激素受体(ar)。优选选择性糖皮质激素受体调节剂与gr结合的亲和性是其与所述mr、ar或pr，mr和pr两者，mr和ar两者，ar和pr两者，或者mr、ar和pr的结合的亲和性的10倍(kd值的1/10)以上。在一个更优选的实施方式中，选择性糖皮质激素受体拮抗剂与gr结合的亲和性是其与mr、ar或pr，mr和pr，mr和ar，ar和pr，或mr、ar和pr的结合的亲和性的100倍(kd值的1/100)以上。在另一实施方式中，选择性糖皮质激素受
体拮抗剂与gr结合的亲和性y是其与mr、ar或pr，mr和pr，mr和ar，ar和pr，或mr、ar和pr的结合的亲和性的1000倍(kd值的1/1000)以上。
[0094]
在关于gra的内容中，本文所用的短语“非类固醇骨架”指不与皮质醇(其类固醇骨架包含17个碳原子，以4个稠合环形式相连)共有结构同源性或非其修饰形式的gra。这些化合物包括蛋白质的合成模拟物和类似物，包括部分肽、伪肽和非肽分子实体。
[0095]
非类固醇选择性gra化合物包括包含稠合氮杂萘烷结构(也可称为稠合氮杂萘烷骨架)的化合物，包含杂芳基-酮稠合氮杂萘烷结构(也可称为杂芳基-酮稠合氮杂萘烷骨架)的化合物，以及包含八氢稠合氮杂萘烷结构(也可称为八氢稠合氮杂萘烷骨架)的化合物。示例性的具有稠合氮杂萘烷结构的非类固醇选择性gra化合物包括在美国专利第7,928,237和8,461,172号中所描述和公开的那些。包含杂芳基-酮稠合的氮杂萘醌结构的示例性非类固醇选择性gra化合物包括美国专利8,859,774中；美国专利9,273,047中；美国专利9,707,223中；美国专利9,956,216中描述和公开的那些。示例性的具有八氢稠合氮杂萘烷结构的非类固醇选择性gra化合物包括在美国专利10,047,082中所描述和公开的那些。本文上下文中提及的所有专利、专利出版物和专利申请均以参考的方式全文纳入本文。
[0096]
在实施方式中，杂芳基-酮稠合氮杂萘烷gra为化合物(r)-(1-(4-氟苯基)-6-((1-甲基-1h-吡唑-4-基)磺酰基)-4,4a,5,6,7,8-六氢-1h-吡唑并[3,4-g]异喹啉-4a-基)(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)甲酮(美国专利8,859,774的实施例18，也称为“瑞拉可兰”和“cort125134”)，其具有下列结构：
[0097][0098]
在实施方式中，杂芳基-酮稠合氮杂萘烷gra是化合物(r)-(1-(4-氟苯基)-6-((4-(三氟甲基)苯基)磺酰基)-4,4a,5,6,7,8-六氢-1h-吡唑并[3,4-g]异喹啉-4a-基)(吡啶-2-基)甲酮，(美国专利8,859,774的实施例1，称为“cort113176”)，其具有以下结构：
[0099][0100]
在实施方式中，八氢稠合氮杂萘烷gra是化合物((4ar,8as)-1-(4-氟苯基)-6-((2-甲基-2h-1,2,3-三唑-4-基)磺酰基)-4,4a,5,6,7,8,8a,9-八氢-1h-吡唑并[3,4-g]异喹啉-4a-基)(4-(三氟甲基)吡啶-2-基)甲酮(美国专利10,047,082的实施例2c，称为“艾昔可兰(exicorilant)”或“cort125281”)，其具有以下结构：
[0101][0102]
在实施方式中，八氢稠合氮杂萘烷gra是化合物((4ar,8as)-1-(4-氟苯基)-6-((2-异丙基-2h-1,2,3-三唑-4-基)磺酰基)-4,4a,5,6,7,8,8a,9-八氢-1h-吡唑并[3,4-g]异喹啉-4a-基)(噻唑-4-基)甲酮*(美国专利10,047,082的实施例2aj，称为“cort125329”)，其具有以下结构：
[0103][0104]
本发明的化合物的描述遵循本领域技术人员已知的化学成键原理。因此，当某一基团可被一种或多种取代基取代时，这类取代基的选择应符合化学成键原理并生成非内在不稳定和/或本领域普通技术人员已知其在环境条件(如水性、中性或生理条件)下可能是不稳定的化合物。
[0105]
c.糖皮质激素受体拮抗剂(gra)
[0106]
通常，可以通过施用有效量的任何化学结构或作用机制的非类固醇选择性糖皮质激素受体拮抗剂(gra)来实现具有高nlr并接受抗癌治疗的癌症患者的nlr正常化。
[0107]
包括杂芳基酮稠合氮杂萘烷结构的示例性的非类固醇选择性gra包括u.s.8,859,774中描述的那些，其可以如其中公开的那样制备，并且整体引入本文。这种示例性gra可以是sgra。某些情形中，包括杂芳基酮稠合氮杂萘烷结构的gra具有如下结构：
[0108][0109]
其中，
[0110]
r1是具有5至6个环原子和1至4个独立地选自：n、o和s的杂原子的杂芳基环，任选地被1至4个各自独立地选自r
1a
的基团取代；
[0111]
各r
1a
独立地选自：氢、c
1-6
烷基、卤素、c
1-6
卤代烷基、c
1-6
烷氧基、c
1-6
卤代烷氧基、-cn、n-氧化物、c
3-8
环烷基和c
3-8
杂环烷基；
[0112]
环j选自下组：环烷基环、杂环烷基环、芳基环和杂芳基环，其中所述杂环烷基和杂
芳基环具有5至6个环原子和1至4个独立地选自：n、o和s的杂原子；
[0113]
各r2独立地选自：氢、c
1-6
烷基、卤素、c
1-6
卤代烷基、c
1-6
烷氧基、c
1-6
卤代烷氧基、c
1-6
烷基-c
1-6
烷氧基、-cn、-oh、-nr
2ar2b
、-c(o)r
2a
、-c(o)or
2a
、-c(o)nr
2ar2b
、-sr
2a
、-s(o)r
2a
、-s(o)2r
2a
、c
3-8
环烷基和c
3-8
杂环烷基，其中所述杂环烷基任选地被1至4个r
2c
基团取代；
[0114]
或者，与同一碳相连的两个r2基团组合形成氧代基团(＝o)；
[0115]
或者，两个r2基团组合形成具有5至6个环原子和1至3个各自独立地选自：n、o和s的杂原子的杂环烷基环，所述杂环烷基环任选地被1至3个r
2d
基团取代；
[0116]r2a
和r
2b
各自独立地选自：氢和c
1-6
烷基；
[0117]
各r
2c
独立地选自：氢、卤素、羟基、c
1-6
烷氧基、c
1-6
卤代烷氧基、-cn和-nr
2ar2b
；
[0118]
各r
2d
独立地选自：氢和c
1-6
烷基，或者与相同环原子相连的两个r
2d
基团组合形成(＝o)；
[0119]
r3选自下组：苯基和吡啶基，其各自任选地被1-4个r
3a
基团取代；
[0120]
各r
3a
独立地选自：氢、卤素和c
1-6
卤代烷基；并且
[0121]
下标n是0至3的整数；
[0122]
或其盐及异构体。
[0123]
包括八氢稠合氮杂萘烷结构的示例性的非类固醇选择性gra包括u.s.10,047,082中描述的那些，其可以如其中公开的那样制备，并且整体引入本文。这种示例性gra可以是sgra。某些情形中，包括八氢稠合氮杂萘烷结构的gra具有如下结构：
[0124][0125]
其中，
[0126]
r1选自吡啶和噻唑，其任选地被1-4个各自独立地选自r
1a
的基团取代；
[0127]
各r
1a
独立地选自：氢、c
1-6
烷基、卤素、c
1-6
卤代烷基、c
1-6
烷氧基、c
1-6
卤代烷氧基、n-氧化物和c
3-8
环烷基；
[0128]
环j选自苯基、吡啶、吡唑、三唑；
[0129]
各r2独立地选自氢、c
1-6
烷基、卤素、c
1-6
卤代烷基、-cn；
[0130]r3a
为f；
[0131]
下标n是0至3的整数；
[0132]
或其盐及异构体。
[0133]
d.识别选择性糖皮质激素受体拮抗剂
[0134]
为了确定非类固醇测试化合物是否为非类固醇选择性gra(非类固醇sgra)，首先对该化合物进行测定以检测其结合至gr并抑制gr-介导的活性的能力，这确定该化合物是否为糖皮质激素受体拮抗剂。若该化合物被确认为糖皮质激素受体拮抗剂，随后对其进行特异性测试，以确定该化合物能否相较于非gr蛋白，例如雌激素受体、黄体酮受体、雄激素受体或盐皮质激素受体，选择性地结合至gr。在一个实施方式中，sgra以显著更高的亲和性
(例如相比非gr蛋白质高至少10倍的亲和性)结合至gr。相对于与非gr蛋白质的结合，对于与gr的结合，sgra可显示100倍、1000倍或更大选择性。
[0135]
i.结合
[0136]
测试化合物结合至糖皮质激素受体的能力可采用多种试验检测，例如，通过筛选该测试化合物和糖皮质激素受体配体(例如地塞米松)与糖皮质激素受体竞争性结合的能力。本领域技术人员应知晓，有许多方法来进行这样的竞争性结合试验。在一些实施方式中，糖皮质激素受体与带标记的糖皮质激素受体配体预孵育，随后与测试化合物接触。这种类型的竞争性结合试验在本文中也可被称作结合置换试验(binding displacement assay)。与糖皮质激素受体结合的带标记的配体的减少指示该测试化合物结合至糖皮质激素受体。在一些情形中，带标记的配体是荧光标记的化合物(例如，荧光标记的类固醇或类固醇类似物)。或者，可使用带标记的测试化合物直接检测测试化合物与糖皮质激素受体的结合。后一类型的试验被称为直接结合试验。
[0137]
可采用多种不同的形式的直接结合试验和竞争性结合试验。这些形式可与免疫测定和受体结合试验中使用的那些类似。对于结合试验(包括竞争性结合试验和直接结合试验)的不同形式的描述，参见《基础和临床免疫学》(basic and clinical immunology)第7版(d.stites和a.terr编)1991；《酶免疫试验》(enzyme immunoassay)，e.t.maggio编，crc出版社，佛罗里达州博卡拉顿(1980)；以及“酶促免疫实验的实践和理论(practice and theory of enzyme immunoassays)”，p.tijssen，laboratory《生物化学与分子生物学实验室技术》(techniques in biochemistry and molecular biology)，埃尔斯威尔科学出版社(elsevier science publishers b.v.)，阿姆斯特丹(1985)，其各自通过引用方式纳入本文。
[0138]
在固相竞争性结合试验中，例如，样品化合物可与带标记的分析物竞争结合于固体表面的结合剂上的特异性结合位点。在此类形式中，带标记的分析物可以是糖皮质激素受体配体，而结合剂可以是与固相结合的糖皮质激素受体。或者，带标记的分析物可以是带标记的糖皮质激素受体，而结合剂可以是固相糖皮质激素受体配体。与捕获剂结合的带标记的分析物的浓度与结合试验中测试化合物的竞争能力呈反比。
[0139]
或者，可在液相中进行竞争性结合试验，且可用各种本领域已知技术将结合的带标记蛋白质与未结合的带标记蛋白质分离。例如，已经开发了用于区分结合配体和过量结合配体或区分结合测试化合物和过量未结合测试化合物的数种操作。这些包括通过如下方式鉴定结合的复合物：蔗糖梯度沉降、凝胶电泳或凝胶等电聚焦，受体-配体复合物的硫酸鱼精蛋白沉淀或羟基磷灰石吸附，以及用葡聚糖包被的活性炭(dcc)吸附或通过固定化抗体结合除去未结合的化合物或配体。分离后，测定结合的配体或测试化合物的量。
[0140]
或者，可进行均质结合试验，其中不需要分离步骤。例如，通过糖皮质激素受体与其配体或测试化合物的结合来改变糖皮质激素受体上的标记物。带标记的糖皮质激素受体中的这一改变导致由该标记物发射的信号的减少或增加，从而使得结合试验结束时，对标记物的度量允许对结合状态下的糖皮质激素受体进行检测或定量。可使用多种标记物。组分可用数种方法中的任一种来标记。有用的放射性标记物包括引入3h、
125
i、
35
s、
14
c或
32
p的那些。有用的非放射性标记物包括引入荧光团，化学发光剂，磷光剂，电化学发光剂等的那些。荧光剂在用于检测蛋白质结构偏移的分析技术(如荧光各向异性和/或荧光极化)中特
别有用。标记物的选择取决于所需灵敏度、与化合物偶联的容易程度、稳定性要求和可用的仪器。对于可以使用的各种标记或信号产生系统的综述，参见美国专利号4,391,904，其通过引用全文纳入本文以用于全部目的。标记物可以按照本领域已知方法与试验所需组分直接或间接偶联。某些情形中，在对gr具有已知亲和性的荧光标记的配体(例如类固醇或类固醇类似物)的存在下，使测试化合物与gr接触，并通过检测带标记配体的荧光极化来估计结合与游离的带标记配体的量。
[0141]
ii.活性
[0142]
1)hepg2酪氨酸氨基转移酶(tat)试验
[0143]
测试显示对于gr的所需结合亲和性的化合物在抑制gr介导的活性方面的活性。通常对该化合物进行酪氨酸氨基转移酶测定(tat试验)，其评估测试化合物抑制地塞米松诱导酪氨酸氨基转移酶活性的能力。参见实施例1。适用于本文公开方法的gr调节剂具有少于10微摩尔的ic
50
(半最大抑制浓度)。也可以使用其他试验，包括但不限于以下描述的试验，以确认化合物的gr调节活性。
[0144]
2)基于细胞的试验
[0145]
涉及全细胞或含糖皮质激素受体的细胞组分的基于细胞的试验也可用于检测测试化合物的结合或对于糖皮质激素受体活性的调节。可用于本文公开的方法的示例性细胞类型包括，例如，任何哺乳动物细胞，包括白细胞，例如嗜中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞和淋巴细胞，例如t细胞和b细胞、白血病细胞、伯基特淋巴瘤细胞、肿瘤细胞(包括小鼠乳腺肿瘤病毒细胞)、内皮细胞、成纤维细胞、心肌细胞，肌肉细胞，乳腺肿瘤细胞，卵巢癌，宫颈癌，胶质母细胞瘤，肝细胞，肾细胞和神经元细胞，以及真菌细胞，包括酵母。细胞可以是原代细胞或肿瘤细胞或其它类型的永生细胞系。当然，糖皮质激素受体可在不表达糖皮质激素受体的内源性形式的细胞中表达。
[0146]
在一些情况下，糖皮质受体的片段以及蛋白质融合体可用于筛选。当需要与糖皮质激素受体配体竞争结合的分子时，所用的gr片段是能够与配体(如地塞米松)结合的片段。或者，gr的任何片段都可用作靶标以鉴定与糖皮质激素受体相结合的分子。糖皮质激素受体片段可包括糖皮质激素受体的任何片段，例如从其至少20、30、40、50个氨基酸到最多达与其全部仅相差一个氨基酸的蛋白质的片段。
[0147]
在一些实施方式中，通过糖皮质激素受体活化触发的信号转导的减少可用于鉴定糖皮质激素受体拮抗剂。糖皮质激素受体的信号转导活性可用许多方式确定。例如，可监测下游分子事件来确定信号转导活性。下游事件包括作为糖皮质激素受体的刺激的结果而出现的活动或表现。对于未经改变的细胞中的转录活化和拮抗的功能评价中有用的示例性下游事件包括，多种糖皮质激素反应元件(gre)-依赖性基因(pepck、酪氨酸氨基转移酶、芳香酶)的上调。此外，可以使用对于gr活化易感型的特定类型的细胞，如成骨细胞中骨钙素的表达(其由糖皮质激素下调)；显示糖皮质激素介导的pepck和葡萄糖-6-磷酸(g-6-pase)上调的原代肝细胞。已显示，使用熟知的gre调节的序列(例如，在报告基因构建体的上游转染的小鼠乳房肿瘤病毒启动子(mmtv))的经转染细胞系中的gre介导的基因表达。有用的报告基因构建体的示例包括萤光素酶(luc)，碱性磷酸酶(alp)和氯霉素乙酰转移酶(cat)。转录抑制的功能评价可以在细胞系(例如单核细胞或人皮肤成纤维细胞)中进行。有用的功能试验包括测量转染的细胞系中由nfkb或ap-1转录因子调控的基因表达；il-1β刺激的il-6表
达；胶原酶、环加氧酶-2和多种趋化因子(mcp-1、rantes)的下调；或lps刺激的细胞因子释放(例如tnfα)的那些试验。
[0148]
经全细胞试验测试的化合物还在细胞毒性试验中进行测试。细胞毒性试验用于确定感知效应在何种程度上缘于非糖皮质激素受体结合细胞效应。在示例性的实施方式中，细胞毒性试验包括使组成性活性细胞与测试化合物接触。任何细胞活力降低都指示细胞毒性作用。
[0149]
3)额外的试验
[0150]
对于可用于鉴定用于本文公开的方法的组合物的许多试验的进一步说明性示例是基于体内糖皮质激素活性的试验。例如，可采用评估推定gr调节剂抑制被糖皮质激素刺激的细胞中dna中3h-胸苷摄取能力的试验。或者，推定gr调节剂可与3h-地塞米松竞争与肝细胞瘤组织培养物gr结合(参见例如，choi等，steroids 57:313-318,1992)。作为另一示例，可利用推定gr调节剂阻遏3h-地塞米松-gr复合物的核结合的能力(alexandrova等，j.steroid biochem.mol.biol.41:723-725,1992)。为了进一步鉴定推定gr调节剂，还可使用能够通过受体结合性动力学来区分糖皮质激素激动剂和调节剂的动力学试验(描述于jones，biochem j.204:721-729，1982)。
[0151]
在另一说明性示例中，daune，molec.pharm.13:948-955，1977；和美国专利第4,386,085号中描述的试验可用于鉴定抗糖皮质激素活性。简言之，切除肾上腺的大鼠的胸腺细胞在包含地塞米松和不同浓度的测试化合物(推定gr调节剂)的营养培养基中孵育。将3h-尿苷添加至细胞培养基，其经进一步孵育，随后检测放射性标记物掺入多核苷酸的程度。糖皮质激素激动剂使掺入的3h-尿苷的量减小。因此，gr调节剂将对抗该作用。
[0152]
iii.选择性
[0153]
然后，使如上选择的gr拮抗剂经历选择性试验，以确定它们是否是sgra。通常，选择性试验包括在体外测试与糖皮质激素受体结合的化合物与非糖皮质激素受体蛋白质的结合程度。选择性试验可在体外或基于细胞的系统中进行，如上文所述。可测试针对任何合适的非糖皮质激素受体蛋白的结合，包括抗体、受体、酶等。在示例性的实施方式中，非糖皮质激素受体结合蛋白是细胞表面受体或核受体。在另一个示例性的实施方式中，非糖皮质激素受体蛋白是类固醇受体，如雌激素受体、孕酮受体、雄激素受体或盐皮质激素受体。
[0154]
相对于mr，针对gr的拮抗剂的选择性可采用本领域技术人员已知的多种试验来检测。例如，可通过检测拮抗剂与gr(相较于mr)相结合的能力来鉴定具体拮抗剂(参见例如，美国专利第5,606,021号；第5,696,127号；第5,215,916号；第5,071,773号)。所述分析可采用直接结合试验或通过评估在已知配体存在下与纯化的gr或mr的竞争性结合来进行。在一个示例性试验中，采用以高水平稳定表达糖皮质激素受体或盐皮质激素受体的细胞(参见例如，美国专利第5,606,021号)作为纯化受体的来源。然后直接检测配体对于受体的亲和性。然后选择相对于mr显示对于gr至少10倍、100倍更高亲和性，通常1000倍的那些gr调节剂用于本文公开的方法。
[0155]
选择性试验还可包括测试抑制gr-介导的活性而非mr-介导的活性的能力。鉴定此类gr特异性调节剂的一种方法是采用转染试验评估拮抗剂防止报告构建体活化的能力(参见例如，bocquel等，j.steroid biochem molec.biol.45:205-215,1993；美国专利第5,606,021号、第5,929,058号)。在一个示例性的转染试验中，将编码受体的表达质粒和包含
与受体特异性调节元件相连的报告基因的报告质粒共同转染进入合适的受体阴性宿主细胞。然后，转染的宿主细胞在存在或不存在激素(例如皮质醇或其类似物)的情况下培养，所述激素能够活化报告质粒的激素反应性启动子/增强子元件。随后，监测经转染和培养的宿主细胞的报告基因序列产物的诱导(即，存在)。最后，通过测定在存在或不存在拮抗剂的情况下的报告基因的活性，来监测激素受体蛋白(由表达质粒上的受体dna序列编码，并在经转染和培养的宿主细胞中产生)的表达和/或类固醇结合能力。可与gr和mr受体的已知拮抗剂相比来确定化合物的拮抗剂活性(参见例如，美国专利第5,696,127号)。然后，以相对于参比拮抗剂化合物，对于各化合物所观察到的最大反应百分比的方式，来报告功效。然后，选择相对于mr、pr或ar，针对gr显示至少100倍，通常1000倍或更高的活性的gr调节剂，用于本文公开的方法。
[0156]
d.药物组合物和施用
[0157]
在实施方式中，本发明提供用于使具有高nlr并接受抗癌治疗的癌症患者的nlr正常化的药物组合物，该药物组合物包括药学上可接受的赋形剂和gra。在一些实施方式中，药物组合物包含药学上可接受的赋形剂和sgra。在优选实施方式中，药物组合物包含药学上可接受的赋形剂和非类固醇sgra。
[0158]
非类固醇sgra可以以各种口服、胃肠外和局部剂型制备和给药。口服制剂包括适于患者摄取的片剂、丸剂、粉末剂、糖衣丸、胶囊、液体、锭剂、凝胶剂、糖浆、浆料、混悬剂等。非类固醇sgra也可通过注射给予，即静脉内、肌内、皮内、皮下、十二指肠内或腹膜内给予。同样，非类固醇sgra可通过吸入(例如鼻内吸入)的方式给予。此外，非类固醇sgra可以透皮给药。因此，本发明还提供包含药学上可接受的运载体或赋形剂和非类固醇sgra的药物组合物。
[0159]
对于从非类固醇sgra制备药物组合物而言，药学上可接受的运载体可以是固体或液体。固体形式制剂包括粉剂、片剂、丸剂、胶囊剂、扁囊剂、栓剂和可分散颗粒剂。固体运载体可以是一种或多种物质，其也可起到稀释剂、调味剂、粘合剂、防腐剂、片剂崩解剂或包封材料的作用。关于制剂和给药技术的细节在科学和专利文献中有广泛地描述，参见例如最新版本的《雷明顿药物科学》(remington's pharmaceutical sciences)，宾夕法尼亚州伊斯顿的麦克出版公司(mack publishing co)(“雷明顿”)。
[0160]
在粉末剂中，载体是细碎的固体，其与细碎的活性组分非类固醇sgra混合。在片剂中，活性组分与具有所需粘合性质的运载体以合适比例混合并压制为所需的形状和大小。
[0161]
所述粉末和片剂优选地包含5％或10％至70％的活性化合物。合适的运载体为碳酸镁、硬脂酸镁、滑石、糖、乳糖、果胶、糊精、淀粉、明胶、黄耆胶、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、低熔点蜡、可可油等。术语“制剂”旨在包括活性化合物伴有作为运载体的包封材料的制剂，所述运载体提供胶囊，其中，伴有或不伴有其它运载体的活性组分被载体包围，由此与其相联。类似地，包括扁囊剂和锭剂。片剂、粉末剂、胶囊剂、丸剂、扁囊剂和锭剂可用作适合于口服给药的固体剂型。
[0162]
合适的固体赋形剂是碳水化合物或蛋白质填料，包括但不限于：糖，包括乳糖、蔗糖、甘露醇或脱水山梨糖醇；来自玉米、小麦、稻、马铃薯或其它植物的淀粉；纤维素，例如甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素钠；树胶，包括阿拉伯胶和黄蓍胶；以及蛋白质，例如明胶和胶原。必要时，可添加崩解剂或增溶剂，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、藻
酸，或其盐，例如海藻酸钠。
[0163]
糖衣剂芯体具有合适的包衣剂，如浓缩糖溶液，其中还可包含阿拉伯胶、滑石粉、聚乙烯吡咯烷酮、卡波姆凝胶、聚乙二醇和/或二氧化钛、漆液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。片剂或糖衣剂包衣中可加有染料或颜料，用于产品标示或表征活性化合物的量(即剂量)。本文公开的药物制剂还可采用如下形式口服：例如明胶制成的推入式(push-fit)胶囊，以及明胶和包衣剂(如甘油或山梨糖醇)制成的密封软胶囊。推入式胶囊可含有与填充剂或粘合剂(如乳糖或淀粉)、润滑剂(如滑石粉或硬脂酸镁)以及任选的稳定剂混合的gr调节剂。软胶囊中，所述gr调节剂化合物可溶解或悬浮于合适的液体中，例如含有或不含稳定剂的脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。
[0164]
液体形式制剂包括溶液、悬浮液和乳液，例如水或水/丙二醇溶液。对于胃肠外注射，可将液体制剂在水性聚乙二醇溶液中配制成溶液。
[0165]
适于口服使用的水溶液可通过将活性组分溶解于水中并如需要添加合适的着色剂、调味剂、稳定剂和增稠剂来制备。适用于口服使用的水性悬浮液可通过将细碎活性组分分散在含有粘性物质的水中来制备，所述粘性物质例如，天然或合成的树胶、树脂、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、羟丙基甲基纤维素、海藻酸钠、聚乙烯吡咯烷酮、黄蓍胶和阿拉伯胶；分散剂或润湿剂，例如天然磷脂(例如卵磷脂)、环氧烷与脂肪酸的缩合产物(例如聚氧乙烯硬脂酸酯)、环氧乙烷与长链脂肪醇的缩合产物(例如，十七碳亚乙基氧基鲸蜡醇(heptadecaethylene oxycetanol))、环氧乙烷与脂肪酸和己糖醇所成偏酯的缩合产物(例如，聚氧乙烯山梨醇单油酸酯)。所述水性悬浮液还可含有一种或多种防腐剂(如对羟基苯甲酸乙酯或者对羟基苯甲酸正丙酯)、一种或多种着色剂、一种或多种调味剂和一种或多种甜味剂(如蔗糖、阿斯巴甜或糖精)。制剂可经渗透压调节。
[0166]
还包括用于临用前转变为口服液体形式制剂的固体形式制剂。这种液体形式包括溶液、悬浮液和乳液。除活性组分外，制剂还可包含着色剂、调味剂、稳定剂、缓冲剂、人工和天然甜味剂、分散剂、增稠剂、增溶剂等。
[0167]
可通过将非类固醇sgra悬浮在植物油(如花生油、橄榄油、芝麻油或椰子油)或矿物油(如液体石蜡)或其混合物中来配制油性悬浮剂。所述油性混悬剂可含有增稠剂，如蜂蜡、硬石蜡或鲸蜡醇。可加入甜味剂以提供适口的口服制剂，例如甘油、山梨醇或蔗糖。可通过加入抗氧化剂如抗坏血酸保存这些制剂。作为可注射油性运载体的例子，参见minto,j.pharmacol.exp.ther.281:93-102,1997。本文公开的药物制剂也可以是水包油乳剂的形式。油相可以是如上所述的植物油或矿物油或者它们的混合物。合适的乳化剂包括：天然树胶，例如阿拉伯树胶和黄蓍胶，天然磷脂，例如大豆卵磷脂，脂肪酸和己糖醇酐的酯或偏酯，例如脱水山梨醇单油酸酯，以及这些偏酯与环氧乙烷的缩合产物，例如聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯。乳剂还可包含甜味剂和调味剂，如糖浆剂和酏剂的情形。这类制剂还可含有缓和剂(demulcent)、防腐剂或着色剂。
[0168]
非类固醇sgra可以通过局部途径透皮递送，配制成涂抹棒、溶液剂、混悬剂、乳剂、凝胶剂、乳膏剂、软膏剂、糊剂、胶冻剂、涂布剂、粉末剂和气雾剂。
[0169]
非类固醇sgra还可以微球的形式递送，用于在体内缓释。例如，微球可以通过皮内注射含有药物的微球进行给药，其在皮下缓慢释放(参见rao,j.biomater.sci.polym.ed.7:623-645,(1995)；作为可生物降解和可注射的凝胶制剂(参
见例如gao,pharm.res.12:857-863,(1995))；或者作为用于口服给药的微球(例如参见eyles,j.pharm.pharmacol.49:669-674,(1997))。透皮和皮内途径均提供几周或几个月的稳定持续递送。
[0170]
本文公开的药物制剂可以盐形式提供并能用许多酸，包括但不限于盐酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸，琥珀酸等形成。盐倾向于更易溶于相应游离碱形式的水性或其它质子溶剂中。在其他情况下，所述制剂可以是在ph4.5到5.5范围内的1mm-50mm组氨酸，0.1％-2％蔗糖，2％-7％甘露醇中的冻干粉末，在使用前与缓冲液结合。
[0171]
在另一个实施方式中，本文公开的制剂可通过使用与细胞膜融合或内吞的脂质体递送，即通过使用连接至脂质体(或直接连接至寡核苷酸)的配体，其结合细胞的表面膜蛋白受体导致胞吞作用。通过使用脂质体，尤其是在脂质体表面携带有对靶细胞特异性的配体，或者否则优先定向到特定器官的情况下，可以在体内将gr调节剂的递送集中到靶细胞中。(参见例如，al-muhammed,j.microencapsul.13:293-306,1996；chonn,curr.opin.biotechnol.6:698-708,1995；ostro,am.j.hosp.pharm.46:1576-1587,1989)。
[0172]
所述药物制剂优选是单位剂型形式。以这种形式将所述制剂细分成含有适量活性组分非类固醇sgra的单位剂量。所述单位剂型可以是套装制剂，套装包含分散的定量制剂，如小瓶或安瓿瓶中的分装好的片剂、胶囊剂和粉末剂。另外，所述单位剂型本身可以是胶囊剂、片剂、扁囊剂或锭，或是适量的这些剂型的套装形式。
[0173]
单位剂量制剂中的活性组分的量可不同，或在如下范围内调节：0.1mg-10000mg，更典型地，1.0mg-6000mg，最典型地，50mg-500mg。根据具体应用和活性组分的功效，合适的剂量还包括约1mg、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、或2000mg。必要时，所述组合物还可包含其它相容的治疗剂。
[0174]
所述药物制剂优选是单位剂型形式。以这种形式将所述制剂细分成含有适量本发明的化合物和组合物的单位剂量。所述单位剂型可以是套装制剂，套装包含分散的定量制剂，如小瓶或安瓿瓶中的分装好的片剂、胶囊剂和粉末剂。另外，所述单位剂型本身可以是胶囊剂、片剂、扁囊剂或锭，或是适量的这些剂型的套装形式。
[0175]
非类固醇sgra可以口服施用。例如，非类固醇sgra可以作为如本文所述的丸剂、胶囊剂或液体制剂施用。或者，可以通过胃肠外施用提供非类固醇sgra。例如，非类固醇sgra可以静脉内施用(如通过注射或输注)。本文描述的化合物及其药物组合物或其制剂的其他施用方法在本文中进行了描述。
[0176]
在一些实施方式中，非类固醇sgra以一剂给药。在其他实施方式中，非类固醇sgra以多于一剂施用，如2剂、3剂、4剂、5剂、6剂、7剂或更多剂。在某些情况下，剂量是等量的。在其他情况下，剂量是不等量的。剂量可以在给药期间增加或逐渐减少。该量将根据例如非类固醇sgra特性和患者特征而变化。
[0177]
任何合适的非类固醇sgra剂量可以用于本文公开的方法中。施用的非类固醇sgra的剂量可以是至少约300毫克(mg)/天，或约600mg/天，如约600mg/天、约700mg/天、约800mg/天、约900mg/天、约1000mg/天、约1100mg/天、约1200mg/天或更多。例如，在非类固醇sgra是瑞拉可兰的情况下，非类固醇sgra剂量可以是例如50mg/天、或75mg/天、或100mg/天、或125mg/天、或150mg/天、或175毫克/天、或200毫克/天、或225毫克/天、或250毫克/天、
或300毫克/天、或350毫克/天、或400毫克/天、或其他量的瑞拉可兰。在实施方式中，非类固醇sgra口服施用。在一些实施方式中，非类固醇sgra以至少一剂给药。换而言之，非类固醇sgra可以以每天1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多剂给药。在实施方式中，非类固醇sgra以每天1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多剂口服给药。
[0178]
可以在例如2-48小时期间以一剂或多剂向对象给药至少一剂非类固醇sgra。在一些实施方式中，非类固醇sgra以一剂给药。在其他实施方式中，非类固醇sgra以多于一剂给药，如2剂、3剂、4剂、5剂或更多剂，在2-48小时期间，如2小时期间、3小时期间、4小时期间、5小时期间、6小时期间，7小时期间、8小时期间、9小时期间、10小时期间、11小时期间、12小时期间、14小时期间、16小时期间、18小时期间、20小时期间，22小时期间、24小时期间、26小时期间、28小时期间、30小时期间、32小时期间、34小时期间、36小时期间、38小时期间、40小时期间、42小时期间、44小时期间、46小时期间或48小时期间。在一些实施方式中，非类固醇sgra在2-48小时、2-36小时、2-24小时、2-12小时、2-8小时、8-12小时、8-24小时、8-36小时、8-48小时、9-36小时、9-24小时、9-20小时、9-12小时、12-48小时、12-36小时、12-24小时、18-48小时、18-36小时、18-24小时、24-36小时、24-48小时、36-48小时或42-48小时施用。
[0179]
可根据患者所需并耐受的剂量和频率进行单次或多次制剂给药。所述制剂应提供足量的活性剂以有效治疗疾病状态。因此，在一个实施方式中，用于口服给予非类固醇sgra的药物制剂的日剂量是每天每千克体重约0.01mg至约150mg之间。在一些实施方式中，日剂量为约1.0-100mg/kg/天、5-50mg/kg/天、10-30mg/kg/天和10-20mg/kg/天。可以使用更低的剂量，特别是当药物给予与口服给药相比在解剖学上隐蔽的部位，如脑脊髓液(csf)空腔，进入血液，进入体腔或器官内腔。明显较高的剂量可用于局部给药。用于制备可胃肠外给予的制剂的实际方法对本领域技术人员是已知的或显而易见的，并在出版物中有更详细的描述，如雷明顿，同上。还参见nieman，“受体介导的抗类固醇作用(receptor mediated antisteroid action)”agarwal等编，de gruyter，纽约(1987)。
[0180]
用非类固醇sgra治疗以降低nlr、治疗具有高nlr的癌症患者、增强患者的抗癌治疗、辅助癌症患者的化疗(如紫杉烷相关治疗，例如改善具有高nlr的癌症患者对白蛋白结合-紫杉醇治疗的反应)、或改善癌症患者的健康、或以其他方式改善癌症患者的癌症症状，其治疗周期可以根据对象病情的严重程度以及对象对非类固醇sgra的反应而变化。在一些实施方式中，非类固醇sgra的给药时程可以是约1周至104周(2年)，更典型为约6周至80周，最典型为约9周至60周。给药的合适时程还包括5-9周、5-16周、9-16周、16-24周、16-32周、24-32周、24-48周、32-48周、32-52周、48-52周、48-64周、52-64周、52-72周、64-72周、64-80周、72-80周、72-88周、80-88周、80-96周、88-96周、和96-104周。给药的合适时程还包括5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、24、25、30、32、35、40、45、48、50、52、55、60、64、65、68、70、72、75、80、85、88、90、95、96、100、和104周。通常非类固醇sgra的给药应当持续直到观察到临床上显著的减少或改善。根据本发明使用非类固醇sgra治疗可以持续两年之久或更长。
[0181]
在一些实施方式中，非类固醇sgra给药不是持续的，可以中止一个或多个时程，然后恢复给药一个或多个时程。其中给药中止的合适时程包括5-9周、5-16周、9-16周、16-24周、16-32周、24-32周、24-48周、32-48周、32-52周、48-52周、48-64周、52-64周、52-72周、64-72周、64-80周、72-80周、72-88周、80-88周、80-96周、88-96周、和96-100周。其中给药中
止的合适时程还包括5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、24、25、30、32、35、40、45、48、50、52、55、60、64、65、68、70、72、75、80、85、88、90、95、96、和100周。
[0182]
所述剂量方案还考虑了本领域众所周知的药代动力学参数，即吸收率，生物利用度，代谢，清除率等(参见，例如，hidalgo-aragones(1996)j.steroid biochem.mol.biol.58:611-617；groning(1996)pharmazie 51:337-341；fotherby(1996)contraception 54:59-69；johnson(1995)j.pharm.sci.84:1144-1146；rohatagi(1995)pharmazie 50:610-613；brophy(1983)eur.j.clin.pharmacol.24:103-108；最新的雷明顿，同上)。现有技术允许临床医生确定每个患者，gr调节剂和治疗的疾病或病症的剂量方案。
[0183]
非类固醇sgra可与已知的可用于调节糖皮质激素受体的其它活性剂结合使用，或与单独可能无效但可有助于活性剂功效的辅助剂结合使用。
[0184]
在一些实施方式中，共同给药包括在一种活性剂非类固醇sgrm的0.5、1、2、4、6、8、10、12、16、20或24小时内给予第二活性剂。共同给药包括同时、大约同时(例如在彼此的约1、5、10、15、20或30分钟内)或以任意顺序依次施用两种活性剂。在一些实施方式中，共同给药可通过共同配制完成，即制备包含两种活性剂的单一药物组合物。在其它实施方式中，所述活性剂可分开配制。在另一个实施方式中，所述活性剂和/或辅助剂可彼此连接或偶联。
[0185]
在可接受的运载体中制备包括非类固醇gr的药物组合物后，可将其放置于合适的容器中，并贴上用于治疗所示病症的标签。对于非类固醇sgra的给药，这种标签应包括，例如，给药的量、频率和方法的相关说明。
[0186]
本发明所述的药物组合物可以盐形式提供，并能用许多酸，包括但不限于盐酸、硫酸、乙酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸等形成。盐倾向于更易溶于相应游离碱形式的水性或其它质子溶剂中。在其它情况下，所述制剂可以是在ph 4.5到5.5范围内的1mm-50mm组氨酸，0.1％-2％蔗糖，2％-7％甘露醇中的冻干粉末，其在使用前与缓冲液合并。
[0187]
在另一个实施方式中，本发明所述的组合物可用于胃肠外给药，如静脉内(iv)给药或给予体腔或器官腔中。用于给药的制剂通常将包含溶解在药学上可接受的运载体中的本发明所述的组合物的溶液。可用的可接受的运载体和溶剂包括水和林格氏溶液(等渗氯化钠)。此外，通常采用无菌非挥发油作为溶剂或悬浮介质。为此，可采用各种低刺激非挥发油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，注射剂的制备中也同样可使用脂肪酸如油酸。这些溶液是无菌的并且通常不含不需要的物质。这些制剂可以通过常规公知的灭菌技术灭菌。制剂可含有模拟生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，如ph调节剂和缓冲剂，毒性调节剂，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。这些制剂中本发明组合物的浓度可在较大范围内调整，主要根据所选定的给药模式和患者的需要，基于流体体积、粘度、体重等来选择。对于静脉注射给药，制剂可以是无菌可注射制剂，如无菌可注射水性或油脂性悬浮液。可利用合适的分散剂或湿润剂和悬浮剂，按照已知方法配制混悬液。无菌可注射制剂也可以是无毒的胃肠外可接受的稀释剂或溶剂如1,3-丁二醇的溶液配制的无菌可注射溶液或悬浮液。
[0188]
e.抗癌治疗
[0189]
癌症化疗剂
[0190]
在实施方式中，对具有高nlr的患者施用的抗癌治疗可以包括化疗剂的施用。适合
与非类固醇sgra联合使用以使具有高nlr并接受抗癌治疗的癌症患者的nlr正常化(降低)的化学治疗剂包括具有杀死癌细胞或抑制癌细胞生长特性的药物，包括但不限于抗微管剂(如紫杉烷、长春花生物碱和普那布林)、拓扑异构酶抑制剂和抗代谢物(如核苷类似物，例如吉西他滨)、有丝分裂抑制剂、烷化剂、抗代谢物、抗肿瘤抗生素、有丝分裂抑制剂、蒽环类、嵌入剂、能够干扰信号转导途径的试剂、促进细胞凋亡的试剂、蛋白酶体抑制剂等。额外的抗癌剂也可以用于本文公开的方法的实践中，例如美国专利公开第20150218274中、以及如在网站“chemocare.com”上的chemotherapy/what-is-chemotherapy/types-of-chemotherapy.aspx中公开的那些。
[0191]
抗微管剂包括紫杉烷、长春花生物碱和普那布林。可以与非类固醇sgra组合使用以治疗癌症患者的示例性紫杉烷包括但不限于紫杉醇和多西他赛。紫杉醇试剂的非限制性实例包括纳米颗粒白蛋白结合紫杉醇(abraxane，由abraxis bioscience销售)、二十二碳六烯酸结合紫杉醇(dha-paclitaxel，taxoprexin，由protarga销售)、聚谷氨酸结合紫杉醇(pg-paclitaxel，paclitaxel poliglumex、ct-2103、xyotax，由cell therapeutic销售)、肿瘤激活前药(tap)、ang105(与三分子紫杉醇结合的angiopep-2，由immunogen销售)、paclitaxel-ec-1(与erbb2结合的紫杉醇识别肽ec-1；参见li等人，biopolymers(2007)87：225-230)和葡萄糖偶联的紫杉醇(例如，2'-紫杉醇甲基-2-吡喃葡萄糖基琥珀酸酯，参见liu等人，bioorganic&medicinal chemistry letters(2007)17：617-620)。可与非类固醇sgra联合使用以治疗癌症患者的示例性长春花生物碱包括但不限于酒石酸长春瑞滨长春新碱和长春碱长春花碱(也称为硫酸长春花碱、长春花碱和vlb、和)；和长春瑞滨普那布林是一种小分子，其能阻断微管组装(如聚合)，具有抗血管生成活性(如减少肿瘤血管化)，并能够诱导细胞凋亡和有丝分裂生长停滞。
[0192]
烷化剂在细胞的静止期最活跃。这些类型的药物是细胞周期非特异性的。可与非类固醇sgra组合使用以治疗癌症患者的示例性烷基化剂包括但不限于氮芥、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸酯/盐、亚硝基脲和三氮杂萘)：尿嘧啶芥(aminouracil物、烷基磺酸酯/盐、亚硝基脲和三氮杂萘)：尿嘧啶芥(aminouraciluracil nitrogennitrogen)、氯甲碱环磷酰胺(revimmune
tm
)、异环磷酰胺美法仑苯丁酸氮芥哌泊溴烷三乙烯三聚氰胺三乙烯硫代磷胺、噻替哌白消安卡莫斯汀洛莫司汀链脲佐菌素以及达卡巴嗪另外的示例性烷化剂包括但不限于奥沙利铂替莫唑胺(和)；更生霉素(也称为放线菌素d、)；美法仑(也称为l-pam、l-沙可来新、和苯丙氨酸氮芥、)；六甲蜜胺(也称为六甲基三聚氰
胺(hmm)、)；卡莫司汀苯达莫司汀白消安(和)；卡铂洛莫司汀(也称为ccnu、)；顺铂(也称为cddp、和-aq)；苯丁酸氮芥环磷酰胺(和)；达卡巴嗪(也称为dtic、dic和咪唑甲酰胺、)；六甲蜜胺(也称为六甲基三聚氰胺(hmm)、)；异环磷酰胺prednumustine；丙卡巴肼二氯甲基二乙胺(也称为氮芥、啶芥和盐酸氮芥、)；链佐星噻替哌(也称为thiophosphoamide、tespa和tspa、)；环磷酰胺)；环磷酰胺和苯达莫司汀hcl
[0193]
抗肿瘤抗生素是从由土壤真菌链霉菌(streptomyces)属物种产生的天然产物获得的化学药剂。这些药物在细胞周期的多个阶段起作用，并被认为是细胞周期特异性的。存在几种类型的抗肿瘤抗生素，包括但不限于蒽环类抗生素(例如阿霉素，柔红霉素，表柔比星，米托蒽醌和伊达比星)、色霉素(例如，更生霉素和普鲁卡霉素)、丝裂霉素和博来霉素。
[0194]
抗代谢物是细胞周期特异性的化疗类型。当细胞将这些抗代谢物质结合到细胞代谢中时，它们不能分裂。这些类型的化疗剂包括叶酸拮抗剂，如甲氨蝶呤；嘧啶拮抗剂，如5-氟尿嘧啶、氟尿苷、阿糖胞苷、卡培他滨、和吉西他滨；嘌呤拮抗剂，如6-巯嘌呤和6-硫鸟嘌呤；腺苷脱氨酶抑制剂，如克拉屈滨、氟达拉滨、奈拉滨和喷司他丁。
[0195]
可以与非类固醇sgra组合使用来治疗癌症患者的示例性蒽环霉素包括，例如，多柔比星(和)；博来霉素柔红霉素(盐酸柔红霉素、道诺霉素和盐酸铷霉素、)；柔红霉素脂质体(柔红霉素柠檬酸脂质体、)；米托蒽醌(dhad、)；表柔比星(表阿霉素)；伊达比星(idamycin)；丝裂霉素c格尔德霉素；除莠霉素；灰霉素(ravidomycin)；和去乙酰基灰霉素(desacetylravidomycin)。
[0196]
可与非类固醇sgra组合使用以治疗癌症患者的示例性蛋白酶体抑制剂包括但不限于，硼替佐米(velcade.rtm.)；卡非佐米(px-171-007，(s)-4-甲基-n
‑‑
((s)-1-(((s)-4-甲基-1-((r)-2-甲基环氧乙烷-2-基)-1-氧代戊-2-基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)-2-((s)-2-(2-吗啉代乙酰胺-邻)-4-苯基丁酰氨基)-戊酰胺)；马丽佐米(npi-0052)；爱卡佐米柠檬酸盐(mln-9708)；德兰佐米(cep-18770)；和o-甲基-n-[(2-甲基-5-噻唑基)羰基]-l-丝氨酰-o-甲基-n-[(1s)-2-[(-2r)-2-甲基-2-环氧乙烷]-2-氧代-1-(苯甲基)乙基]-l-丝氨酰胺(onx-0912)。
[0197]
在一些实施方式中，所述化学治疗剂选自苯丁酸氮芥、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑、链脲佐菌素、卡莫司汀、洛莫司汀、苯达莫司汀、尿嘧啶芥、雌莫司汀、卡莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀、甘露舒凡、白消安、达卡巴嗪、替莫唑胺、噻替哌、六甲蜜胺、5-氟尿嘧啶(5-fu)、6-巯基嘌呤(6-mp)、卡培他滨、阿糖胞苷、氟尿苷、氟达拉滨、吉西他滨、羟基脲、氨甲喋
呤、培美曲塞、柔红霉素、多柔比星、表柔比星、伊达比星、sn-38、arc、npc、喜树碱、拓扑替康、9-硝基喜树碱、9-氨基喜树碱、盐酸哌甲酯(rubifen)、吉马替康、二氟替康、bn80927、dx-895if、mag-cpt、安吖啶、依托泊苷、磷酸依托泊苷、替尼泊苷、多柔比星、紫杉醇、多西紫杉醇、吉西他滨、accatin iii、10-脱乙酰红豆杉醇、7-木糖基-10-脱乙酰红豆杉醇、三尖杉宁碱、10-脱乙酰-7-表红豆杉醇、7-表红豆杉醇、10-脱乙酰基浆果赤霉素iii、10-脱乙酰黄芩灵甘菊碱、吉西他滨、伊立替康、白蛋白结合紫杉醇、奥沙利铂、卡培他滨、顺铂、多西紫杉醇、伊立替康脂质体、和依托泊苷、和它们的组合。
[0198]
在某些实施方式中，化学治疗剂可以以美国食品和药物管理局(fda)或其他监管机构批准的剂量和时间表指导的剂量和时间表给予，并受经验优化。在一些情况中，所述化学治疗剂以约100-1000mg，例如约200mg-800mg、约300mg-700mg、或约400mg-600mg，例如约200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、或700mg的剂量给予。给药方案可以从例如每周、每五天、每四天、每隔一天向每天一次、每天两次或每天三次变化。在一个实施方式中，化学治疗剂以每天约100mg至600mg的口服剂量或静脉内剂量施用，如每天约100mg、200mg、260mg、300mg、400mg或600mg，整个或部分治疗期中，每隔一天或每四天一次。在一些实施方式中，化疗剂是紫杉烷并且可以根据本文公开的方法以任何标准剂量使用，例如fda批准的那些紫杉烷剂量。在各个实施方式中，所述紫杉烷是白蛋白结合型紫杉醇，其以每平方米体表面积80mg至125mg的剂量范围在每28天周期的第1、8和15天以30分钟的静脉输注给予。
[0199]
在另外的实施方式中，可以同时给予一种以上的化学治疗剂，或可在整个或部分疗程中以任何顺序依序给予。这两种药剂可按相同或不同给药方案给予。
[0200]
免疫治疗剂
[0201]
在实施方式中，对具有高nlr的患者施用的抗癌治疗可以包括免疫治疗剂的施用。适合与非类固醇sgra联合使用以使具有高nlr并接受抗癌治疗的癌症患者的nlr正常化(降低)的免疫治疗剂包括针对检查点蛋白质的抗体，并包括检查点活性的小分子抑制剂。许多此类抗体已被证明能有效治疗癌症，如针对pd-1、ctla4和pd-l1的抗体。在实施方式中，使用非类固醇sgra进行的抗癌治疗可能包括检查点抑制剂的给药，并且检查点抑制剂可以是检查点抑制剂抗体(cia)。
[0202]
抗pd-1抗体已用于治疗黑色素瘤、非小细胞肺癌、膀胱癌、前列腺癌、结直肠癌、头颈癌、三阴性乳腺癌、白血病、淋巴瘤和肾细胞癌。示例性抗pd-1抗体包括派姆单抗(也称为兰博利珠单抗和mk-3475，merck)、纳武利尤单抗(也称为bms-936558，bristol myers squibb)、西米普利单抗(sanofi)、斯巴达珠单抗(pdr001，novartis)、amp-224(astrazeneca)、amp-514(medi0680，astrazeneca)、regn2810(regeneron)、替雷利珠单抗(bgb-a317，beigene)、bgb-a317(beigene)、匹地珠单抗(ct-011，curetech ltd)、jtx-4014(jounce therapeutics)、卡瑞利珠单抗(shr1210，江苏恒瑞医药股份有限公司)、辛迪利单抗(ibi308,eli lilly)、特瑞普利单抗(js001，上海君实生物医药科技股份有限公司)、多斯达利单抗(tsr-042，wbp-285，glaxosmithkline)和incmga00012(mga012，incyte和macrogenics)。
[0203]
抗pd-l1抗体已用于治疗非小细胞肺癌、黑色素瘤、结直肠癌、肾细胞癌、胰腺癌、胃癌、卵巢癌、乳腺癌和血液系统恶性肿瘤。示例性抗pd-l1抗体包括阿特珠单抗(
roche)、阿维鲁单抗(msb0010718c、merckkgaa和pfizer)、杜瓦鲁单抗(astrazeneca)、mdx-1105(bristol myers squibb)、medi4736(medimmune)、mpdl3280a(roche)、bms-936559(bristol myers squibb)、可西贝利单抗(ck-301(checkpoint therapeutics)和恩伐利单抗(kn035，一种“纳米抗体”(骆驼抗体)，tracon therapeutics)。
[0204]
抗ctla4抗体已用于治疗黑色素瘤、前列腺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌的临床试验。抗ctl4a的显著特征是抗肿瘤作用的动力学，其生理反应所需的初始治疗后的滞后期最长达6个月。在一些情况中，肿瘤尺寸实际上在治疗起始后、观察到减少之前，会增加(pardoll，2012，nature reviews cancer 12:252-264)。示例性的抗ctla4 cia包括伊匹单抗(bristol myers squibb)和特姆单抗(以前称为替西单抗，cp-675,206，astrazeneca)。
[0205]
针对其他检查点蛋白质的cia，例如varlilumab、argx-110、lag3、lag525、b7-h3、b7-h4、ox-40、cd137、medi6383、medi6469、moxr0916和tim3，也可以与本文公开的非类固醇sgra组合使用治疗癌症。
[0206]
本公开中使用的cia可以是不同cia的组合，特别是若目标检查点蛋白质(如pd-1和ctla4)通过不同的信号通路抑制免疫反应。因此，针对任一检查点蛋白质的cia组合或针对两种检查点蛋白质的单个cia可以提供增强的免疫反应。
[0207]
生成cia
[0208]
可以使用本领域熟知的方法开发cia。例如，参见kohler和milstein，nature 256：495(1975)，以及coligan等人(eds.)，current protocols in immunology，第1卷，第2.5.1-2.6.7页(john wiley&sons 1991)。单克隆抗体可以通过以下方法获得：给小鼠注射包含抗原的组合物(如检查点蛋白质或其表位)，去脾获得b-淋巴细胞，将b-淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合产生杂交瘤，克隆杂交瘤，选择产生抗原抗体的阳性克隆，培养产生抗体的克隆抗原，并从杂交瘤培养物中分离抗体。
[0209]
可以通过各种成熟的技术从杂交瘤培养物中分离和纯化产生的单克隆抗体。这种分离技术包括使用蛋白-a sepharose的亲和层析、尺寸排阻层析和离子交换层析。例如，参见coligan第2.7.1-2.7.12页和第2.9.1-2.9.3页。另见baines等人，“免疫球蛋白g(igg)的纯化”，methodsin molecular biology，第10卷，第79-104页(the humana press,inc.1992)。在最初产生针对检查点蛋白质的抗体后，可以对抗体进行测序，随后通过重组技术进行制备。鼠抗体和抗体片段的人源化和嵌合是本领域技术人员熟知的。例如，参见leung等人，hybridoma 13:469(1994)；us20140099254 a1。
[0210]
可以使用转基因小鼠生产人类抗体，这些转基因小鼠经过基因工程改造，可以使用检查点蛋白质产生特异性人类抗体，以应对抗原性挑战。参见green等人，nature genet，7:13(1994)、lonberg等人，nature 368:856(1994)。针对检查点蛋白质的人抗体也可以通过遗传或染色体转染方法、噬菌体展示技术或通过体外活化的b细胞构建。参见例如mccafferty等人，1990，nature 348：552-553；美国专利第5,567,610和5,229,275号。
[0211]
修饰cia
[0212]
cia也可以通过引入相对于现有cia的保守性修饰来产生。例如，修饰的cia可以包
含重链和轻链可变区、和/或与上面产生的抗体的对应物同源的fc区。可用于本文公开的方法的修饰的cia必须保留能够阻断检查点信号通路的所需功能特性。
[0213]
cia也可以通过改变蛋白质修饰位点来产生。例如，可以改变抗体的糖基化位点以产生缺乏糖基化的抗体，如此修饰的cia通常具有增加的抗体对抗原的亲和力。抗体也可以通过在一个或多个peg基团与抗体连接的条件下与聚乙二醇(peg)反应来进行聚乙二醇化。聚乙二醇化可以增加抗体的生物半衰期。具有此类修饰的抗体也可与本文公开的选择性gr调节剂组合使用，只要其保留阻断检查点通路的所需功能特性即可。
[0214]
ii.小分子、非蛋白质检查点抑制剂化合物(“cic”)
[0215]
在另一个实施方式中，使用非类固醇sgra进行的抗癌治疗可能包括检查点抑制剂的给药，并且检查点抑制剂可以是cic。cic是一种小分子非蛋白质化合物，可拮抗检查点蛋白质的免疫抑制功能。许多cic在本领域中是已知的，例如，小分子检查点抑制剂ca-170(aurigene)、肽检查点抑制剂aunp12(aurigene and laboratoire pierre-fabre)和bms-986189(bristol myers squibb)，以及在美国专利9,872,852；在美国专利9,422,339中；在美国专利公开2013-0022629a1中公开的那些。
[0216]
cic也可以使用本领域已知并公开于例如欧洲专利申请ep2360254中的组合库方法中的众多方法中的任一种来鉴定。组合库包括：生物库(biological libraries)；空间可寻址平行固相或溶液相库(spatially addressable parallel solid phase or solution phase libraries)；需要反卷积的合成库方法(synthetic library methods requiring deconvolution)；“一珠一化合物”库法(the'one-bead one-compound'library method)和使用亲和层析选择的合成库方法(synthetic library methods using affinity chromatography selection)。生物库方法仅限于肽库，而其他四种方法适用于肽、非肽寡聚体或化合物的小分子库(lam,k.s.(1997)anticancer drug des.12:145)。
[0217]
放射抗癌治疗
[0218]
放射可用于治疗癌症。在实施方式中，对具有高nlr的患者施用的抗癌治疗可以包括放疗(如针对肿瘤的电离辐射、放射性药物组合物的输注、放射源的植入、或其他放射疗法)的施用。适合与非类固醇sgra联合使用以使患有nlr并接受抗癌治疗的癌症患者的nlr正常化的放射治疗包括将放射引导至肿瘤或癌变区域(可称为“外照射放疗”或“远程治疗”)；在肿瘤或癌变区域内或附近植入放射发射材料(可称为“近距离放射治疗”)；施用有效地将放射引导至癌性肿瘤或癌性区域的放射性标记的药物组合物(例如，靶向在癌细胞上表达且优选过表达的受体的放射性标记的配体)。
[0219]
抗血管生成抗癌治疗
[0220]
抗血管生成剂可减少或阻断新血管的形成，并可用于治疗癌症；人们认为抗血管生成剂通过限制对肿瘤的血液供应来减缓、阻断甚至逆转肿瘤的生长。在实施方式中，给予具有高nlr的患者的抗癌治疗可以包括给予抗血管生成疗法，例如，包括给予抗血管生成剂。抗血管生成剂包括阻断血管上皮生长因子(vegf)作用的抗体，例如贝伐单抗羧基氨基三唑、伊曲康唑；血管生成素2；可溶性vegf受体和vegf可能结合的其他“诱饵”分子，从而减少其与内源性vegf受体的结合和激活，否则会刺激血管生成；血管抑制素；内皮抑素；干扰素-α、干扰素-β和干扰素-γ；血小板因子-4；血管抑制素；钙网蛋白；催乳素；骨桥蛋白；分泌的蛋白质和富含半胱氨酸(sparc)，也称为骨连接蛋白和bm-40；和
其他血管生成抑制剂，其可用于治疗癌症，并且是用于本文公开的方法中的合适的抗癌治疗方法，用于使具有高nlr和接受抗癌治疗的癌症患者的nlr正常化(降低)。
[0221]
生长因子抑制治疗
[0222]
在实施方式中，对具有高nlr的患者施用的抗癌治疗可以包括生长因子抑制剂的施用。生长因子抑制剂(包括例如表皮生长因子(egf)、成纤维细胞生长因子(fgf)和其他)的施用可以包括对具有高nlr的癌症患者施用抗癌治疗，以及非类固醇sgra和生长因子抑制剂的施用可以有效地使癌症患者的nlr正常化(降低)，增强生长因子治疗，减少肿瘤负荷或促进肿瘤的消除，以及以其他方式为癌症患者提供临床益处。生长因子抑制剂包括，例如酪氨酸激酶抑制剂(例如阿西替达沙替尼厄洛替尼伊马替尼尼罗替尼培唑帕尼和舒尼替尼)；蛋白酶体抑制剂(例如硼替佐米组蛋白脱乙酰酶抑制剂(例如，伏立诺他和帕比司他)；刺猬通路抑制剂(例如，维斯莫吉布磷脂酰肌醇3激酶(pip3)抑制剂(例如依达拉西布哺乳动物(或mechinistic)雷帕霉素靶点(mtor)抑制剂(例如，西罗莫司和依维莫司)等。
[0223]
手术抗癌治疗
[0224]
在实施方式中，对具有高nlr的患者施用的抗癌治疗可以包括对癌症的手术治疗。手术可用于通过切除肿瘤或切除部分肿瘤来治疗癌症，以减少患有肿瘤的患者的肿瘤负荷。可以在手术之前、期间或之后进行非类固醇sgra的施用，以使具有高nlr的癌症患者的nlr正常化，并且可以帮助使患者的nlr正常化，并且可以增强癌症患者的治疗和健康。
[0225]
f.联合疗法
[0226]
可以采用非类固醇sgra和一种或多种抗癌治疗的各种组合来治疗癌症患者，例如以降低具有高nlr的癌症患者的nlr。对于“组合疗法”或“组合使用”，并不意味着必须同时给予治疗剂和/或配制用于一起递送，尽管这些递送方法在本文所述的范围内。非类固醇sgra和化疗剂可以按照相同或不同的剂量方案给药。在一些实施方式中，可在整个或部分疗程中以任何顺序依序给予非类固醇sgra和化疗剂。在一些实施方式中，非类固醇sgra和抗癌剂同时或大约同时给药(例如，在彼此的约1、5、10、15、20或30分钟内)。组合疗法的非限制性实例如下，以非类固醇sgra和化疗剂的给药为例，非类固醇sgra为“a”，而作为化疗方案的一部分给予的抗癌剂或化合物为“b”：
[0227]
a/b/ab/a/bb/b/aa/a/ba/b/bb/a/aa/b/b/b b/a/b/b
[0228][0229]
将该实施方式的治疗化合物或药剂给予患者需要遵循给予该化合物的一般方案，(必要时)考虑疗法的毒性。外科干预也可以与所述疗法组合应用。
[0230]
本方法可以与抗癌治疗的其他方式组合，例如手术、放疗、免疫疗法、使用生长因子抑制剂、抗血管生成因子和其他治疗、及其组合。
[0231]
g.评估降低nlr的改进
[0232]
本文公开的非类固醇sgra疗法可以降低具有高nlr(如nlr为3或更大)的癌症患者的nlr，并且可以赋予此类癌症患者有益的临床结果。用于测量对抗癌治疗的反应的方法是抗癌治疗领域的技术人员众所周知的，例如，如实体肿瘤反应评估标准(“recist”)指南中所述的(eisenhauer等人，新反应评估标准：修订的recist指南(1.1版)eur.j.cancer 45：228-247(2009))。
[0233]
在一种方法中，通过确定从癌症患者获得的血液样本中中性粒细胞的数量和淋巴细胞的数量来测量nlr。用非类固醇sgra(如瑞拉可兰)治疗后nlr水平的下降可能表明对癌症患者的治疗是有益的。
[0234]
接受本文公开的治疗的患者可显示不同程度的nlr减小。在某些情况下，患者在治疗前测量的nlr可降低约10％；在实施方式中，具有高nlr的癌症患者的nlr相较于治疗前测量的nlr降低约15％，或约20％，或约25％，或约30％，或约33％，或约35％，或约40％，或约45％，或约50％，或更多。在优选实施方式中，nlr降低到3或更小；并且在最优选的实施方式中，nlr降低到小于3。
[0235]
由联合治疗所致的所需益处或所需临床结果还可包括如肿瘤负荷的降低；癌细胞向外周器官的浸润减少(即，减缓至一定程度和/或终止)；肿瘤转移的抑制(即，减缓至一定程度和/或终止)；响应率(rr)的增加；响应持续时间的增加；与癌症相关联的一种或多种症状减轻至一定程度；治疗疾病所需的其它药物剂量的减少；疾病进展的延迟；和/或患者存活的延长；和/或生活质量的提高。用于评价这些作用的方法是为人熟知的和/或公开于，例如，cancerguide.org/endpoints.html和recist指南，同上。
[0236]
虽然出于阐明目的已经通过说明和举例的方式详细描述了本发明，但本领域普通技术人员根据本发明的教导不难了解，可以在不背离所附权利要求书的构思或范围的情况下作出某些改变和修改。
实施例
[0237]
提供以下实施例仅为说明而非限定。本领域技术人员不难发现有多项非关键参数可变或可修饰并得出基本相同或相似的结果。
[0238]
实施例1.hepg2酪氨酸氨基转移酶(tat)试验
[0239]
以下实验方案描述了用于测量hepg2细胞(一种人肝细胞癌细胞系；ecacc，英国)中地塞米松对tat诱导的试验。在37℃、5％/95％(v/v)co2/空气下使用补充了10％(v/v)胎牛血清、2mm l-谷氨酰胺和1％(v/v)neaa的meme培养基培养hepg2细胞。然后对hepg2细胞进行计数并调整，使其在不含酚红的rpmi 1640、10％(v/v)活性炭剥离的fbs、2mm l-谷氨酰胺中产生0.125x 106个细胞/ml的密度，并以200μl中25,000个细胞/孔接种在96孔无菌组织培养微量滴定板中，并在37℃、5％co2下孵育24小时。
[0240]
然后，除去生长培养基并使用测试培养基{rpmi 1640，无酚红、2mm l-谷氨酰胺+10μm毛喉素}代替。然后，针对100nm地塞米松攻击对测试化合物进行筛选。随后，将化合物从10mm储液中连续半对数稀释至100％(v/v)二甲亚砜中。然后，生成8-点半对数稀释曲线，随后在试验培养基中1:100稀释以产生10
×
最终化合物试验浓度，这导致最终化合物试验浓度范围为0.1％(v/v)二甲亚砜中的10-0.003μm。
[0241]
在37℃、5/95(v/v)co2/空气下在微量滴定板中将测试化合物与细胞预孵育30分
钟，之后加入100nm地塞米松并随后再孵育20小时以使得tat诱导最优化。
[0242]
然后，hepg2细胞采用包含蛋白酶抑制剂混合物的30μl的细胞裂解缓冲液在4℃裂解15分钟。然后，可添加155μl的底物混合物，其包含0.1m磷酸钾缓冲液(ph 7.4)中的5.4mm酪氨酸钠盐、10.8mmα酮戊二酸和0.06mm吡哆醛5’磷酸。37℃孵育2小时之后，可通过添加15μl的10m氢氧化钾水溶液终止该反应，然后使板在37℃另孵育30分钟。tat活性产物可通过λ340nm处的吸光度测量。
[0243]
可通过使用抑制百分比(针对100nm地塞米松tat刺激进行标准化)对比化合物浓度作图并将数据拟合至4参数逻辑方程来计算ic
50
值。可使用cheng和prusoff方程将ic
50
值转化为ki(平衡解离常数)，前提是拮抗剂是竞争性抑制剂(相对于地塞米松)。
[0244]
实施例2.瑞拉可兰对nlr和抗癌治疗的效果
[0245]
在健康对象中，血液中中性粒细胞对淋巴细胞比例(nlr)通常低于3(图7a)。然而，这一比例在许多癌症患者中远高于3，如图7a所示的实体瘤患者的nlr值所示。在本实施例中，在健康对象和癌症患者中测定了瑞拉可兰给药对nlr的影响。这种瑞拉可兰给药的结果表明瑞拉可兰给药降低了癌症患者的nlr，并且可以使nlr正常化。
[0246]
方法：
[0247]
健康对象
[0248]
招募健康对象进行瑞拉可兰的nct03508635研究。单次和多次递增剂量组(sad和mad)的给药和分析如图1中所述，该图显示了本研究中健康对象的给药和评估时间表。图1的(a)部分显示了该研究的单次递增剂量(sad)强的松挑战设计。图1的(b)部分显示了该研究的多次递增剂量(mad)强的松挑战设计。(c)为图例。
[0249]
在时间0(早晨，给药前)以及之后的2、4、8、12和24小时进行密集的nlr采样。在早晨给药前收集单次nlr样本。该实验的sad部分使用500mg剂量，而mad使用每日一次250mg剂量。
[0250]
癌症患者
[0251]
癌症患者参加了nct02762981研究，这是一项瑞拉可兰联合白蛋白结合紫杉醇(nab-pac1itaxel)治疗实体瘤患者的1/2期研究，其基于以下标准：
[0252]
·
所包括的关键纳入标准
[0253]
ο患有疾病进展的晚期或转移性实体瘤的≥18岁患者同意
[0254]
ο在晚期情形中接受最多达3种先前的治疗线治疗。允许先前的nab-pac
[0255]
οecog-ps(东部肿瘤协作组表现状态(eastern cooperative oncology group performance status))0-1
[0256]
ο足够的肾、肝和骨髓功能
[0257]
ο可测量或可评估的疾病
[0258]
·
对于纳入特定剂量测定胰腺组的患者，关键纳入标准包括
[0259]
ο组织学确诊为胰腺腺癌。患有胰腺神经内分泌肿瘤、胰腺淋巴瘤或壶腹癌的患者不符合条件。
[0260]
οca19-9(cea，或非ca 19-9升高的肿瘤中的ca-125)，其在研究药物首次给药前14天内测量
[0261]
ο可通过recist 1.1测量的转移性(非辐照)病变
[0262]
·
所包括的关键排除标准
[0263]
ο需要用慢性或经常使用的口服皮质类固醇治疗医疗症状或疾病(如类风湿性关节炎、器官移植后的免疫抑制)。
[0264]
评估
[0265]
在筛选时、第2周期结束时以及此后每6-8周进行一次肿瘤评估，并根据recist(版本1.1)并根据需要进行肿瘤反应确认。
[0266]
患者每天服用瑞拉可兰(见图2)或间歇服用(见图3)，并以28天的周期给予白蛋白结合-紫杉醇。图中所用的缩写：nab-pac，白蛋白结合-紫杉醇；pk，药代动力学。
[0267]
瑞拉可兰导入包括每天单独使用瑞拉可兰(不含白蛋白结合-紫杉醇)，持续7天。
[0268]
用于药物浓度测定的样本采集
[0269]
药物浓度在研究nct02762981中确定。在瑞拉可兰给药的第7天，在多个时间点采集血液。收集后，血液与edta螯合，离心，血浆被等分。生物分析型分析由microconstants(san diego,ca,usa)进行。简而言之，用柠檬酸铵溶液缓冲含有瑞拉可兰及其稳定标记的类似物作为内标和k3edta作为抗凝剂的人血浆样品，并用2-丁醇：己烷(2.5:97.5,v/v)萃取。将样品涡旋混合、离心并将下部在超冷冰箱中冷冻。将有机部分转移到干净的管中并在氮气下蒸发。将提取物干燥、复溶并使用ace ultracore superphenylhexyl柱通过反相hplc分析。在设置为电喷雾正离子化模式的z喷雾源/接口中使用加热的氮气将流动相雾化。使用ms/ms检测离子化的化合物。
[0270]
cbc样本采集
[0271]
在图1-3中指定的日期采集血液。早上也进行抽血，在给药前。来自全血的细胞与复染剂一起孵育以区分细胞类型。使用标准方法对中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞进行分类全血细胞计数(cbc)。
[0272]
数据分析
[0273]
使用以下公式计算nlr：
[0274]
nlr＝(绝对中性粒细胞计数)/(绝对淋巴细胞计数)
[0275]
nlr也使用以下公式表示为相对于基线(cfb)的百分比变化：
[0276]
(其中“x”表示乘)
[0277]
使用这个公式，任何nlr cfb《0％都是nlr的减少。nlr也使用以下公式表示为相对于基线(cfb)的倍数变化：
[0278]
nlr倍数cfb＝(时间2的nlr)/(时间1的nlr)
[0279]
使用这个公式，任何小于1的nlr倍数cfb都是nlr的减少。
[0280]
标准t检验用于评估统计显著性并重新生成报告的p值。药代动力学分析由corcept therapeutics使用phoenix winnonlin 8.1版(certara，new jersey，usa)进行。简而言之，包括auc
0-24
和c
max
在内的瑞拉可兰的药代动力学参数使用非房室分析方法(模型200)基于在瑞拉可兰导入阶段的第7天给予瑞拉可兰后24小时内的密集pk采样估计。
[0281]
结果
[0282]
瑞拉可兰抑制健康对象因强的松引起的nlr增加
[0283]
单剂量25mg强的松导致9名健康对象的nlr急剧增加。nlr从基线时的小于2上升到强的松后8小时的大于6。nlr在24小时后恢复到基线。单剂量500mg瑞拉可兰与强的松一起给药显著减弱了这种nlr效应(图4)。单独强的松的曲线下面积为54.6nlr*hr，单剂量瑞拉可兰则降低至12.5nlr*hr。
[0284]
还评估了强的松在连续14天每天250mg瑞拉可兰给药后的nlr效果。包括两个对照。首先，在相同的对象中评估单独使用25mg强的松的效果(第-5天；图5)。曲线下面积从单独使用强的松的61.7nlr*hr减少到强的松+瑞拉可兰后的9.6nlr*hr(在连续14天瑞拉可兰给药后给予25mg强的松)。其次，在不同对象中评估了连续14天服用安慰剂(代替瑞拉可兰)后25mg强的松的效果(图6)。曲线下面积从强的松+安慰剂的72nlr*hr减少到强的松+瑞拉可兰后的9.6nlr*hr(在连续14天250mg/天瑞拉可兰给药后给予25mg强的松)。与任一对照相比，14天的瑞拉可兰给药显著减弱了强的松的nlr作用。
[0285]
瑞拉可兰不影响健康对象的nlr
[0286]
瑞拉可兰使nlr正常化被认为是通过拮抗内源性皮质醇而发生的。如果患者的皮质醇活性升高，瑞拉可兰有望使这种活性正常化。或者，单独使用瑞拉可兰可通过拮抗正常内源性皮质醇引起中性粒细胞减少症(中性粒细胞减少)或淋巴细胞增多症(淋巴细胞增加)。为了区分这两种可能性，我们评估了单独使用瑞拉可兰对内源性皮质醇正常的健康对象的影响。在连续14天给予250mg瑞拉可兰后，在7名健康对象的组中未观察到nlr变化(图7)。没有一个健康对象在基线时的nlr大于3。
[0287]
单剂瑞拉可兰后晚期实体瘤患者的nlr变化
[0288]
评估了对瑞拉可兰的暴露与nlr之间的关系。测定第7天的暴露(auc)和c
最大
，并将其视为7天导入期的稳定状态。nlr表示为相对于基线的变化(cfb)，其中cfb《0％表示在瑞拉可兰导入期间nlr降低。在auc在0-8000hr*ng/ml范围内的患者中，随着暴露量的增加，nlr有降低的趋势(图8，左)。在c
最大
在0-1000ng/ml范围内的患者中观察到类似的趋势(图8，右)。
[0289]
在此期间，auc《2011ng*hr/ml或c
最大
《442ng/ml的患者均未出现nlr下降。相比之下，auc在2011-8000ng*hr/ml之间的患者中有6/13(46％)并且c
最大
在442-1000ng/ml之间的患者中有6/9(67％)经历了nlr下降。auc在3740-8000ng*hr/ml之间的患者的nlr平均变化为-6.1％，代表nlr下降。c
最大
在595-836ng/ml之间的患者的nlr平均变化为-4.4％，代表nlr下降。
[0290]
瑞拉可兰+白蛋白结合-紫杉醇使患有晚期实体瘤的nlr患者正常化
[0291]
nlr在瑞拉可兰+白蛋白结合-紫杉醇组合的第1周期第1天和第8天测量。59名晚期实体瘤患者中有35名在第1周期第1天时nlr》3。在这59名患者中观察到瑞拉可兰+白蛋白结合-紫杉醇给药8天后，nlr显著降低(p＝0.012)(图9)。第1周期第1天的平均nlr为4.4，在第1周期第8天降至3.6。
[0292]
nlr降低主要在基线nlr》3的患者中观察到。对于基线nlr≤3的24名患者，在8天给药期间nlr没有显著变化(图10，左)。对于基线nlr》3的35名患者，nlr在相同给药期间显著降低(p＝0.029)(图10，右)。对于基线nlr》3的患者，第1周期的平均值为5.6，在第1周期的第8天降低至4.5。
[0293]
瑞拉可兰+白蛋白结合-紫杉醇可降低经历完全反应的卵巢癌患者的nlr
[0294]
患者038-4004是一名57岁的女性，患有复发性iiib期高级别乳头状浆液性卵巢癌，最初对紫杉醇+顺铂治疗敏感。然后她的疾病在3年后复发，并在随后的两条治疗线(吉西他滨+卡铂+贝伐单抗和脂质体多柔比星)后进展。在用瑞拉可兰+白蛋白结合-紫杉醇进行第一个研究治疗周期后，患者的肿瘤标志物ca125降低(1225.9至63.7单位/ml)，并在两个治疗周期后在放射学上达到完全反应。该患者在5个月后因毒性停止了研究治疗，并且她的疾病在研究治疗开始后8个月后进展。
[0295]
在7天的瑞拉可兰导入期间，患者038-4004的nlr从5.5下降到2.5(图11)。这表示nlr变化为-46％。在评估nlr对免疫治疗或化疗结果的预测价值的肿瘤学研究中，nlr高于5被一致解释为“高”，而nlr低于2.5被一致解释为“低”(sacdalan，2018；goldstein，2015)。这表示在瑞拉可兰导入期间，nlr相对于基线的变化(cfb)为-55％(即下降55％)。
[0296]
nlr降低与肿瘤反应有关
[0297]
比较了recist标准定义的具有不同肿瘤反应类别的患者的nlr变化。患者按照疾病进展(pd)、疾病稳定(sd)和部分或完全缓解(pr/cr)的recist标准进行分组。在第1周期的前8或15天，pr/cr患者的nlr下降趋势更加明显(图12)。在那些经历进展性疾病的患者中，第15天的平均nlr比第1天的nlr高48％。在经历部分或完全反应的患者中，第15天的平均nlr比第1天的nlr低25％。总之，nlr降低与对瑞拉可兰+白蛋白结合-紫杉醇的更显著的反应相关。
[0298]
结论
[0299]
降低的nlr预示着接受化疗或免疫疗法治疗的癌症患者的更好的结果。瑞拉可兰是一种选择性gr拮抗剂，可抑制强的松引起的nlr增加。瑞拉可兰药代动力学参数在最佳范围内的患者在单独使用瑞拉可兰7天后更有可能出现nlr降低。瑞拉可兰+白蛋白结合-紫杉醇降低了基线nlr升高的癌症患者的nlr。瑞拉可兰对基线nlr在正常范围内的健康对象或癌症患者的nlr没有影响。这种观察以前没有被描述过。此外，这一观察结果可能表明皮质醇活性升高是晚期实体瘤患者nlr升高的部分原因。
[0300]
本文公开的结果表明，瑞拉可兰给药可以降低癌症患者的nlr，并且可以使癌症患者的nlr正常化。据信，具有升高的nlr的癌症患者的这种nlr降低为这些患者提供了治疗益处。
[0301]
本技术中引用的所有专利、专利出版物、专利申请和出版物均通过引用整体并入本文，就好像每个单独的专利、专利出版物、专利申请或出版物被具体地和单独地指示通过引用并入一样。此外，虽然出于阐明目的已经通过说明和举例的方式详细描述了本发明，但本领域普通技术人员根据本发明的教导不难了解，可以在不背离所附权利要求书的构思或范围的情况下作出某些改变和修改。