用作药物的(+)-顺式四氢大麻酚((+)-顺式-THC)的制作方法

用作药物的(+)-顺式四氢大麻酚((+)-顺式-thc)
发明领域
1.本发明涉及用作药物的四氢大麻酚(thc)型大麻素化合物。
2.thc型大麻素是(-)-反式-四氢大麻酚的对映异构体，(-)-反式-四氢大麻酚是天然存在的大麻素，其可以在已经被培育成产生thc作为主要大麻素的大麻属植物品系(cannabis plant strain)中找到。已经发现特定的对映异构体(+)-顺式四氢大麻酚具有不同于天然存在的(-)-反式-thc的性质。
3.已经发现大麻素(+)-顺式-thc在已经被培育成产生大麻二酚(cbd)作为主要大麻素的特定大麻属植物品系中以低浓度存在。此外，大麻素可以通过合成手段生产。
4.本文公开了展示(+)-顺式-thc在疾病模型中的效力的数据。此外，描述了用于合成(+)-顺式-thc的方法。
5.发明背景
6.大麻素是在结构上或药理学上与大麻属植物的成分或与大麻素受体cb1或cb2的内源性激动剂(内源性大麻素(endocannabinoid))相关的天然化合物和合成化合物。在自然界中产生这些化合物的唯一方式是通过大麻属植物。大麻属是大麻科(family cannabaceae)中的开花植物的属，其包括物种大麻(cannabis sativa)、印度大麻(cannabis indica)和莠草大麻(cannabis ruderalis)(有时被认为是大麻的一部分)。
7.大麻属植物包含化合物的高度复杂的混合物。已经鉴定出至少568种独特的分子。在这些化合物中有大麻素、萜类化合物、糖、脂肪酸、类黄酮、其他烃、含氮化合物和氨基酸。关于大麻素，已经鉴定出超过100种不同的大麻素(参见，例如，handbook of cannabis,roger pertwee,第1章，第3至15页)。
8.大麻素通过多种受体发挥它们的生理学作用，所述受体包括但不限于肾上腺素能受体、大麻素受体(cb1和cb2)、gpr55、gpr3或gpr5。大麻属植物中存在的主要大麻素是大麻素酸(cannabinoid acid)δ9-四氢大麻酚酸(δ9-tetrahydrocannabinolic acid)(δ9-thca)和大麻二酚酸(cbda)，以及少量的它们相应的中性的(脱羧的)大麻素。此外，大麻属可以含有较低水平的其他次要大麻素。“chemical composition,pharmacological profiling,and complete physiological effects of these medicinal plants,and moreimportantly the extracts from cannabis,remain to be fully understood.”lewis,m.m.等人,acs omega,2,6091-6103(2017)。
9.化合物四氢大麻酚(thc)以其(-)-反式-thc的天然形式具有精神活性。(-)-反式-thc的医学用途包括其用于治疗化学疗法诱导的恶心和呕吐的用途以及在治疗hiv/aids相关的厌食症中的用途，(-)-反式-thc也是在欧洲和加拿大被批准用于治疗与多发性硬化相关的痉挛状态的nabiximol(sativex)的组分。
10.已知四氢大麻酚分子以四种立体异构体存在：(-)-反式-δ-9-四氢大麻酚、(+)-反式-δ-9-四氢大麻酚、(-)-顺式-δ-9-四氢大麻酚和(+)-顺式-δ-9-四氢大麻酚；参见图1。
11.在存在手性中心的合成产生的药物中，并且由于可以形成这样的立体异构体，理解不同对映异构体的性质是重要的，因为时常地，合成形成外消旋混合物，由此产生(-)对
映异构体和(+)对映异构体两者。
12.thc的药理活性是立体特异性的；取决于测定，(-)-反式-thc异构体(屈大麻酚)比(+)-反式-thc异构体更有效6倍-100倍(dewey等人,1984)。
13.在其他药物中，两种对映异构体具有类似的活性，例如两种布洛芬对映异构体具有抗炎性质。还需要谨慎确保对映异构体中的一种对患者是无毒的或无害的。
14.在thc除了具有光学或镜像(+)对映异构体和(-)对映异构体之外还具有被称为顺式异构体和反式异构体的几何异构体的情况下。fda认为，由于几何异构体的化学上不同的性质，这些几何异构体应被视为单独的药物(https://www.fda.gov/regulatory-information/search-fda-guidance-documents/development-new-stereoisomeric-drugs)。
15.本发明令人惊讶地证明化合物(+)-顺式-thc已经被发现在动物疾病模型中显示出治疗效力。在这之前，尚未发现该化合物具有任何治疗效力。
16.本公开内容的简述
17.根据本发明的第一方面，提供了(+)-顺式-四氢大麻酚((+)-顺式-thc)，该(+)-顺式-四氢大麻酚((+)-顺式-thc)用作药物。
18.优选地，(+)-顺式-thc呈植物提取物的形式。更优选地，(+)-顺式-thc呈高度纯化的大麻属提取物的形式。
19.优选地，高度纯化的提取物包含至少80％(w/w)的(+)-顺式-thc，更优选地，高度纯化的提取物包含至少85％(w/w)的(+)-顺式-thc，更优选地，高度纯化的提取物包含至少90％(w/w)的(+)-顺式-thc，更优选地，高度纯化的提取物包含至少95％(w/w)的(+)-顺式-thc，还更优选地，高度纯化的提取物包含至少98％(w/w)的(+)-顺式-thc。
20.可选择地，(+)-顺式-thc作为合成化合物存在。
21.优选地，(+)-顺式-thc的剂量大于100mg/kg/天。更优选地，(+)-顺式-thc的剂量大于250mg/kg/天。更优选地，(+)-顺式-thc的剂量大于500mg/kg/天。更优选地，(+)-顺式-thc的剂量大于750mg/kg/天。更优选地，(+)-顺式-thc的剂量大于1000mg/kg/天。更优选地，(+)-顺式-thc的剂量大于1500mg/kg/天。
22.可选择地，(+)-顺式-thc的剂量小于100mg/kg/天。更优选地，(+)-顺式-thc的剂量小于50mg/kg/天。更优选地，(+)-顺式-thc的剂量小于20mg/kg/天。更优选地，(+)-顺式-thc的剂量小于10mg/kg/天。更优选地，(+)-顺式-thc的剂量小于5mg/kg/天。更优选地，(+)-顺式-thc的剂量小于1mg/kg/天。更优选地，(+)-顺式-thc的剂量小于0.5mg/kg/天。
23.根据本发明的第二方面，提供了一种组合物，该组合物用作药物，包含(+)-顺式-四氢大麻酚((+)-顺式-thc)和一种或更多种药学上可接受的赋形剂。
24.根据本发明的第三方面，提供了(+)-顺式-四氢大麻酚((+)-顺式-thc)，该(+)-顺式-四氢大麻酚((+)-顺式-thc)用于治疗癫痫。
25.根据本发明的第四方面，提供了一种用于生产(+)-顺式四氢大麻酚((+)-顺式-thc)的方法。
26.附图简述
27.参考附图，在下文中进一步描述本发明的实施方案，在附图中：
28.图1示出了四氢大麻酚的四种立体异构体；
31g*/sto-3g单点计算以通过resp程序5导出部分原子电荷。
51.通过使用与激动剂am11542(pdb id:5xra)复合的cb1r和与拮抗剂am10257(pdb id:5zty)复合的cb2r的晶体学结构，采用autodock 4.2发行版进行对接研究。
52.蛋白质和配体两者都用autodock tools(adt)软件包版本1.5.6rc16处理以合并非极性氢，计算gasteiger电荷并选择可旋转的侧链键。
53.使用autodock 4.2发行版中包含的程序autogrid 4.2生成以配体结合位点为中心的具有的间距和60
×
70
×
60个点的用于对接评价的网格。
54.通过使用柔性残基的不同组合进行不同的运行。
55.采用拉马克遗传算法(lga)以连同以下对接参数进行分子对接：在具有最多1500万次能量评价和最多37000代的群体中的100个个体，随后是300次solis和wets局部搜索的迭代。每次计算进行总共100次对接运行。
56.在本研究中使用的晶体学结构中缺少的环用modeller v9.11程序7建模。
57.配体和受体的每一种组合的代表性复合物通过添加所有氢原子完成并且经历能量最小化。使用charmm-gui网络界面将能量最小化的复合物嵌入popc双层中，并且然后膜环境中的分子动力学(md)模拟用amber16软件包8的pmemd.cuda模块，针对脂质使用脂质14ff、针对蛋白质使用ff14sb力场且针对配体使用gaff参数来进行。md产生运行进行持续100ns。
58.结果
59.thc异构体的比较：
60.为了比较多环部分的构象，如方法部分所描述获得的thc异构体的3d坐标在酚环水平上叠加并且在图2中示出。
61.发现(-)-顺式-thc异构体在二甲基-吡喃部分的水平上配合到(-)-反式-thc的骨架上，其中四氢苯并甲基环指向同一方向。
62.然而，(+)-顺式-thc异构体的构象与(-)-反式异构体和(-)-顺式异构体两者有很大不同。
63.cb1受体(cb1r)处的理论结合：
64.激动剂结合的cb1r的x射线结构被选择用于对接研究，因为(-)-反式-thc是已知的cb1r部分激动剂，如图3a中示出的。
65.出于比较目的，thc的顺式异构体以相同的x射线结构对接。图3b展示了(-)-顺式-thc的对接，并且图3c展示了(+)-顺式-thc的对接。
66.如可以看出的，(-)-反式-thc和(-)-顺式-thc两者采用l形构象。戊基链指向螺旋v上的trp2795.43，三环体系与环ecl2上的phe268、phe3797.35、phe1893.25和phe1772.64形成π
–
π和疏水性相互作用并且与ser3837.39形成氢键。
67.戊基链还与phe2003.36发生疏水性相互作用，phe2003.36是cb1r激活的关键残基，因为它与trp3566.48是拨动开关(toggle switch)的一部分。事实上，trp3566.48和phe2003.36之间的π-π堆叠使受体的非活性形式稳定。
68.(-)-顺式-thc采用与(-)-反式-thc相同的位姿，除了与反式-thc的四氢-甲基-苯基团相比倾斜的四氢-甲基-苯基团之外。
69.然而，(+)-顺式-thc在三环中采用相反的取向，其中戊基链指向n-末端和
phe1772.64，远离phe2003.36(图3c)。
70.cb2受体处的理论结合：
71.(-)-反式-thc与cb2r的结合在图4a中示出。
72.出于比较目的，thc的顺式异构体以相同的x射线结构对接。图4b展示了(-)-顺式-thc的对接，并且图4c展示了(+)-顺式-thc的对接。
73.所研究的化合物在cb2r配体结合位点内的整体排列与在cb1r复合物中已经观察到的整体排列良好重叠。(-)-反式-thc和cb2之间的相互作用主要是疏水性和芳香性的，并且涉及来自ecl2的残基以及螺旋ii、iii、v和vi。thc的三环与phe183ecl2形成相互作用并且与phe1063.25和phe942.64形成疏水性相互作用，而戊基链与trp1945.43和phe1173.36形成疏水性相互作用。该后者残基连同trp2586.48一起是开关拨动的一部分。thc的三环萜类化合物环的羟基基团与ser2857.39形成h键。
74.类似于cb1r处的结合，(-)-顺式-thc异构体采用与(-)-反式-thc类似的取向，而(+)-顺式thc在配体结合位点中是相反的。
75.结论
76.分子对接和分子动力学的组合方法允许确定(-)-反式-thc异构体和(-)-顺式-thc异构体两者以及(+)-顺式-thc异构体在cb1受体和cb2受体的配体结合位点内的推定结合模式。
77.这三种化合物在两种受体中的结合模式是类似的，因为残基和螺旋、n-末端和ecl2环的整体排列在两种亚型之间都是非常保守的。
78.thc的两种顺式异构体在三环骨架的构象方面彼此有很大不同，其中(-)-顺式-thc更类似于(-)-反式-thc。(+)-顺式-thc在两种受体的配体结合位点内采用相反的结合模式，并且预期该异构体具有不同的功能概况。
79.实施例2：对(+)-顺式-thc在全身性癫痫发作的小鼠超大电休克癫痫发作(mes)模型中的抗痉挛作用的评价
80.在小鼠癫痫发作模型中测试了(+)-顺式-thc的效力，即最大电休克(mes)测试。
81.方法
82.经由连接到恒流休克发生器(constant current shock generator)(ugo basile：7801型)的角膜电极对小鼠施用mes(30ma，方波电流：0.6ms脉冲宽度，0.2s持续时间，50hz)，以可靠地产生强直性后肢痉挛。记录强直性痉挛的次数。
83.每组研究16只小鼠。测试是盲法进行的。
84.测试物质(+)-顺式-thc以在mes之前60分钟i.p.施用的4种剂量(10mg/kg、50mg/kg、100mg/kg和150mg/kg)进行评价，并且与媒介物对照组(在相同的实验条件下施用)进行比较。
85.在mes之前30分钟以250mg/kg i.p.施用的丙戊酸盐(阳性对照)被用作参考物质，并且与媒介物组(在mes之前60分钟i.p.施用)进行比较。
86.通过使用2尾fisher精确概率检验(fisher's exact probability test)(p《0.05被认为是显著的)将治疗组与适合的媒介物对照进行比较来分析数据。
87.结果
88.表1展示了在此实验中产生的数据。
89.在阳性对照(丙戊酸盐)组中，与媒介物相比，在动物中观察到的强直性阵挛性癫痫发作的次数存在显著的100％变化，证明了预期的抗痉挛作用。
90.在经(+)-顺式-thc治疗的小鼠中，观察到在动物中观察到的强直性阵挛性癫痫发作次数与媒介物相比的百分比变化的剂量相关的增加。
91.在测试之前60分钟i.p.施用的150mg/kg的最高剂量，这导致与媒介物对照相比，强直性痉挛的显著(p《0.05)的37.5％减少。
92.在最低剂量(10mg/kg)未观察到作用。
93.表1：在mes之后强直性阵挛性癫痫发作的次数与媒介物相比的百分比变化
[0094][0095][0096]
^ptt(预治疗时间)。相对于媒介物的％变化指的是与媒介物相比的治疗的抗痉挛作用。*p《0.05和***p《0.001，当与对应的媒介物对照相比时强直性后肢癫痫发作的显著抑制(fisher检验)。ns：相对于媒介物对照无显著差异(fisher检验)。
[0097]
结论
[0098]
这些数据证明，对映异构体(+)-顺式-thc在mes模型中产生显著的抗痉挛作用。这些数据是首次证明这种thc对映异构体的治疗作用的数据。
[0099]
实施例3：使用热板法对(+)-顺式-thc在小鼠中的抗伤害感受潜能的评估
[0100]
在小鼠疼痛模型中测试了(+)-顺式-thc的效力，即热板测试。
[0101]
方法
[0102]
小鼠在研究开始之前经历7天的最小习惯期。首次用于实验的小鼠适应了在他们的居住笼中的操作室，其中食物和水随意地可获得。
[0103]
动物用以10ml/kg i.p.的治疗媒介物，以1mg/kg、15mg/kg、50mg/kg、100mg/kg、125mg/kg和150mg/kg的(+)-顺式-thc或者以10mg/kg的吗啡或以10ml/kg i.p.的吗啡媒介物(盐水)处理。
[0104]
将动物放置到设定为52℃的热板上，并且在治疗后1小时或在阳性对照之后0.5小时获取达到缩回阈值(withdrawal threshold)的时间(抬起、舔前足或后足或试图逃跑的第一反应)。
[0105]
在测量之后立即通过附表1方法来屠宰动物。
[0106]
通过将缩回阈值与经媒介物治疗的组进行比较来分析数据。
[0107]
结果
[0108]
表2展示了在此实验中产生的数据。
[0109]
在阳性对照(吗啡)组中，与媒介物相比，存在缩回阈值的显著增加，证明了预期的
抗伤害感受作用。
[0110]
在经(+)-顺式-thc治疗的小鼠中，当与媒介物相比时，所测试的剂量没有产生显著差异。
[0111]
表2：在治疗之后动物的缩回阈值
[0112][0113]
***p《0.001，当与对应的媒介物对照相比时显著(fisher检验)。
[0114]
结论
[0115]
这些数据证明，对映异构体(+)-顺式-thc在动物疼痛模型中不具有抗伤害感受作用。
[0116]
实施例4：用于(+)-顺式-四氢大麻酚的合成生产方法
[0117]
如先前描述的，化合物(+)-顺式-thc是由主要产生大麻素大麻二酚(cbd)的大麻属植物作为次要大麻素产生的。在高度纯化的cbd提取物中，鉴于总thc的量为基于制品中大麻素的总量约小于0.1％(w/w)，提取物中残留的(+)-顺式-thc的量非常小。
[0118]
已知从产生cbd的大麻属植物产生的纯化的提取物中的thc作为反式thc和顺式thc的两种几何异构体存在。我们还知道，在提取物的加工和纯化期间，反式-thc:顺式-thc的比例从约3.6:1反式-thc:顺式-thc变化为约0.8:1反式-thc:顺式-thc。
[0119]
还已经发现，在纯化的制品中存在的顺式-thc作为光学异构体(-)-顺式-thc和(+)-顺式-thc的混合物存在。(-)-顺式-thc:(+)-顺式-thc的比例在约9:1((-)-顺式-thc:(+)-顺式-thc)的范围内。
[0120]
鉴于在自然界中发现的化合物(+)-顺式-thc的非常低的水平，合成途径(下文描述为方案1)详细描述了可以被使用以便以较大量生产大麻素(+)-顺式-thc的方法。
[0121]
这些化合物被编号，并且它们的全称在途径下面的框中提供。
[0122]
方案1.外消旋顺式-thc的合成
[0123][0124]
化合物名称1橄榄醇(olivetol)2双-mom-保护的橄榄醇3双-mom-保护的橄榄醇的醇中间体4(+)-顺式-thc5(-)-顺式-thc
ꢀꢀ
mom-cl氯甲基甲醚
[0125]
所得到的顺式-thc外消旋体使用hplc柱phenomenex lux cellulose2手性柱使用对映异构体的手性分离来分离。
[0126]
使用mecn/h2o(0.1％hco2h)的反相梯度。
[0127]
通过光旋转、手性hplc、lcms和1h nmr来分析每种分离的材料。
[0128]
图5示出了hplc色谱图，其中峰2被观察到是具有99.4％的对映异构体过量的(+)-顺式-thc，而峰3被鉴定为具有96.8％的对映异构体过量的(-)-顺式-thc。