与小鼠和人成纤维细胞激活蛋白(FAP)交叉反应的抗犬成纤维细胞激活蛋白单克隆抗体

与小鼠和人成纤维细胞激活蛋白(fap)交叉反应的抗犬成纤维细胞激活蛋白单克隆抗体
1.相关申请的交叉引用
2.本技术根据35u.s.c.
§
119(e)有权要求2019年9月23日提交的美国临时专利申请号62/904,272的优先权，其特此通过引用以其全部内容并入。
3.关于联邦资助的研究或开发的声明
4.本发明是在美国国立卫生研究院授予的授权号ca172921下通过政府支持完成的。政府对本发明享有一定的权利。


背景技术：

5.肿瘤由异质细胞群构成，包括转化细胞和大量未转化细胞。尽管不同细胞类型的流行性因肿瘤和肿瘤进展的不同阶段而异，但它们包括浸润性炎症和免疫细胞、内皮细胞、间充质来源的平滑肌细胞、周细胞、和肿瘤相关成纤维细胞(taf)，其在本文中统称为基质细胞。taf是一种异质群体，可以在表型上与正常成纤维细胞区分开来。成纤维细胞激活蛋白(fap)已成为肿瘤以及肉芽组织中和纤维变性病变中反应性成纤维细胞的标志物。
6.fap是一种ii型跨膜细胞表面蛋白，属于后脯氨酸二肽基氨基肽酶家族，与二肽基肽酶iv(dppiv/cd26)具有最高的相似性。fap在超过90％的人上皮癌中由taf和周细胞选择性表达。它还在胚胎发育过程中、伤口愈合组织中、和慢性炎症与纤维变性状况(如肝硬化和特发性肺纤维化)中以及骨和软组织肉瘤和某些黑素瘤上表达。然而，在良性病变或正常成人组织中检测不到fap的表达，而dppiv在多种细胞类型中更广泛地表达。体外研究表明，fap具有二肽基肽酶和内肽酶活性，包括能够降解明胶和i型胶原蛋白的胶原分解活性，但它的体内底物(一种或多种)尚未确定。
7.本领域对能够与犬、小鼠、和人成纤维细胞激活蛋白交叉反应的抗体的开发存在需要。本发明解决了这种需要。


技术实现要素：

8.如本文所述，本发明涉及对成纤维细胞激活蛋白(fap)具有特异性的能够与犬、小鼠、和人fap交叉反应的抗体、结合多肽、和scfv。
9.一方面，本发明提供了分离的结合多肽，其包含特异性结合人和犬、和/或鼠成纤维细胞激活蛋白(fap)的表位的抗原结合结构域。
10.在某些实施方式中，抗原结合结构域包括：重链可变区，其包括三个重链互补决定区(hcdr)，其中hcdr1包含氨基酸序列ytitsyslh(seq id no:1)，hcdr2包含氨基酸序列einpangdhnfsekfeik(seq id no:2)，并且hcdr3包含氨基酸序列lddsrfhwyfdv(seq id no:3)；和轻链可变区，其包括三个轻链互补决定区(lcdr)，其中lcdr1包含氨基酸序列tasssvsymy(seq id no:4)，lcdr2包含氨基酸序列ltsnla(seq id no:5)，并且lcdr3包含氨基酸序列qqwsgyppit(seq id no:6)。
11.在某些实施方式中，结合多肽：(a)结合成纤维细胞激活蛋白(fap)；和/或(b)包括
抗体或其抗原结合片段；和/或(c)包括重链可变区，所述重链可变区包含与seq id no:7中所示的重链可变区的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；和/或(d)包括重链可变区，所述重链可变区包含seq id no:7中所示的氨基酸序列；和/或(e)由重链可变区构成，所述重链可变区由seq id no:7中所示的氨基酸序列构成；和/或(f)包括轻链可变区，所述轻链可变区包含与seq id no:9中所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；和/或(g)包括轻链可变区，所述轻链可变区包含seq id no:9中所示的氨基酸序列；和/或(h)由轻链可变区构成，所述轻链可变区包含seq id no:9中所示的氨基酸序列。
12.在某些实施方式中，(a)抗原结合片段选自fab、单链可变片段(scfv)、或单结构域抗体；和/或(b)抗原结合片段选自fab、单链可变片段(scfv)、或单结构域抗体，并且其中抗体是全长抗体；和/或(c)抗原结合片段选自fab、单链可变片段(scfv)、或单结构域抗体，并且其中抗体或抗原结合片段是人源化抗体或其抗原结合片段。
13.另一方面，本发明提供了分离的结合多肽，其包括：重链可变区，其包含seq id no:7中所示的氨基酸序列；和轻链可变区，其包含seq id no:9中所示的氨基酸序列。
14.另一方面，本发明提供了单链可变片段(scfv)，其包含特异性结合人和犬、和/或鼠成纤维细胞激活蛋白(fap)的表位的抗原结合结构域。
15.在某些实施方式中，抗原结合结构域包括：重链可变区，其包括三个重链互补决定区(hcdr)，其中hcdr1包含氨基酸序列ytitsyslh(seq id no:1)，hcdr2包含氨基酸序列einpangdhnfsekfeik(seq id no:2)，并且hcdr3包含氨基酸序列lddsrfhwyfdv(seq id no:3)；和轻链可变区，其包括三个轻链互补决定区(lcdr)，其中lcdr1包含氨基酸序列tasssvsymy(seq id no:4)，lcdr2包含氨基酸序列ltsnla(seq id no:5)，并且lcdr3包含氨基酸序列qqwsgyppit(seq id no:6)，其中重链可变区和轻链可变区由连接体分隔。
16.另一方面，本发明提供了单链可变片段(scfv)，其包括：重链可变区，其包含seq id no:7中所示的氨基酸序列；和轻链可变区，其包含seq id no:9中所示的氨基酸序列，其中重链可变区和轻链可变区由连接体分隔，并且任选地其中连接体包含seq id no:15中所示的氨基酸序列。
17.另一方面，本发明提供了单链可变片段(scfv)，其包含seq id no:11或13中所示的氨基酸序列；或由seq id no:11或13中所示的氨基酸序列构成。
18.另一方面，本发明提供了分离的核酸，其编码本文所考虑的任意结合多肽或任意scfv。
19.另一方面，本发明提供了编码结合多肽的分离的核酸，所述结合多肽包括特异性结合人和犬、和/或鼠成纤维细胞激活蛋白(fap)的表位的抗原结合结构域。
20.在某些实施方式中，抗原结合结构域包括：重链可变区，其包括三个重链互补决定区(hcdr)，其中hcdr1包含氨基酸序列ytitsyslh(seq id no:1)，hcdr2包含氨基酸序列einpangdhnfsekfeik(seq id no:2)，并且hcdr3包含氨基酸序列lddsrfhwyfdv(seq id no:3)；和轻链可变区，其包括三个轻链互补决定区(lcdr)，其中lcdr1包含氨基酸序列tasssvsymy(seq id no:4)，lcdr2包含氨基酸序列ltsnla(seq id no:5)，并且lcdr3包含氨基酸序列qqwsgyppit(seq id no:6)。
21.在某些实施方式中，(a)结合多肽包括抗体或其抗原结合片段，并且任选地其中抗
体是全长抗体；和/或(b)抗原结合片段选自fab、单链可变片段(scfv)、或单结构域抗体；和/或(c)抗体或抗原结合片段是人源化抗体或其片段。
22.在某些实施方式中，(a)重链可变区由包含与seq id no:8具有至少80％、85％、90％、95％、96％、96％、97％、98％、99％同一性的多核苷酸序列的核酸编码；和/或(b)重链可变区由包含seq id no:8中所示的多核苷酸序列的核酸编码；和/或(c)重链可变区由核酸编码，所述核酸由seq id no:8中所示的多核苷酸序列构成；和/或(d)轻链可变区由核酸编码，所述核酸包含与seq id no:10中所示的轻链可变区的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、96％、97％、98％、99％同一性的多核苷酸序列；和/或(e)轻链可变区由包含seq id no:10中所示的多核苷酸序列的核酸编码；和/或(f)轻链可变区由核酸编码，所述核酸由seq id no:10中所示的多核苷酸序列构成。
23.另一方面，本发明提供了编码结合多肽的分离的核酸，所述结合多肽包括由包含seq id no:8中所示的多核苷酸序列的核酸序列编码的重链可变区；和由包含seq id no:10中所示的多核苷酸序列的核酸序列编码的轻链可变区。
24.另一方面，本发明提供了分离的核酸，其(a)编码单链可变片段(scfv)，所述单链可变片段(scfv)包括：重链可变区，其包括三个重链互补决定区(hcdr)，其中hcdr1包含氨基酸序列ytitsyslh(seq id no:1)，hcdr2包含氨基酸序列einpangdhnfsekfeik(seq id no:2)，并且hcdr3包含氨基酸序列lddsrfhwyfdv(seq id no:3)；和轻链可变区，其包括三个轻链互补决定区(lcdr)，其中lcdr1包含氨基酸序列tasssvsymy(seq id no:4)，lcdr2包含氨基酸序列ltsnla(seq id no:5)，并且lcdr3包含氨基酸序列qqwsgyppit(seq id no:6)；或(b)编码单链可变片段(scfv)，所述单链可变片段(scfv)包括：重链可变区，其包含seq id no:8中所示的核苷酸序列；和轻链可变区，其包含seq id no:10中所示的核苷酸序列，其中重链可变区和轻链可变区由连接体分隔，并且任选地其中连接体包含seq id no:15中所示的氨基酸序列；和/或(c)编码包含seq id no:12或14中所示的多核苷酸序列的单链可变片段(scfv)；和/或(d)编码由seq id no:12或14中所示的多核苷酸序列构成的单链可变片段(scfv)。
25.另一方面，本发明提供了载体，其包含本文所考虑的任意分离的核酸。
26.在某些实施方式中，载体是表达载体；和/或载体选自dna载体、rna载体、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、和逆转录病毒载体。
27.另一方面，本发明提供了宿主细胞：(a)其包含本文所考虑的任意载体；和/或(b)其中宿主细胞是真核或原核来源的；和/或(c)其中宿主细胞是哺乳动物来源的；和/或(d)其中宿主细胞是细菌来源的。
28.另一方面，本发明提供了产生结合fap的结合多肽或scfv的方法。所述方法包括培养本文所考虑的任意宿主细胞。
29.另一方面，本发明提供了药物组合物，其包含本文所考虑的任意结合多肽或任意scfv。
30.另一方面，本发明提供了用于鉴定适合于针对成纤维细胞激活蛋白(fap)的过继性细胞疗法的对象的方法。所述方法包括：(a)从对象分离患病组织；(b)使分离的组织与特异性结合fap的结合多肽接触；和(c)检测分离的组织中表达fap的细胞，从而鉴定过继性细胞疗法的合适的对象。
31.在某些实施方式中，结合多肽包括：重链可变区，其包括三个重链互补决定区(hcdr)，其中hcdr1包含氨基酸序列ytitsyslh(seq id no:1)，hcdr2包含氨基酸序列einpangdhnfsekfeik(seq id no:1)id no:2)，并且hcdr3包含氨基酸序列lddsrfhwyfdv(seq id no:3)；和轻链可变区，其包括三个轻链互补决定区(lcdr)，其中lcdr1包含氨基酸序列tasssvsymy(seq id no:4)，lcdr2包含氨基酸序列ltsnla(seq id no:5)，并且lcdr3包含氨基酸序列qqwsgyppit(seq id no:6)。
32.在某些实施方式中，(a)结合多肽包括抗体或其抗原结合片段；和/或(b)抗原结合片段选自fab、单链可变片段(scfv)、或单结构域抗体，并且任选地其中抗体是全长抗体；和/或(c)抗体或抗原结合片段是人源化抗体或其抗原结合片段；和/或(d)结合多肽与治疗分子或诊断分子缀合；和/或(e)结合多肽与诊断分子缀合，其中诊断分子包含可检测标记；和/或(f)结合多肽与诊断分子缀合，其中诊断分子包含可检测标记，并且进一步其中可检测标记是放射性标记、荧光团、酶、半抗原、生物素、或发色团。
33.在某些实施方式中，在对象被鉴定为合适的对象之后，向对象施用过继性细胞疗法。
34.在某些实施方式中，(a)过继性细胞疗法包括修饰的免疫细胞，所述修饰的免疫细胞包含嵌合抗原受体(car)；和/或(b)过继性细胞疗法包括修饰的免疫细胞，所述修饰的免疫细胞包含嵌合抗原受体(car)并且其中免疫细胞是t淋巴细胞；和/或(c)过继性细胞疗法包括修饰的免疫细胞，所述修饰的免疫细胞包含嵌合抗原受体(car)并且其中免疫细胞是nk细胞；和/或(d)过继性细胞疗法包括修饰的免疫细胞，所述修饰的免疫细胞包含嵌合抗原受体(car)，其中car特异性结合fap。
35.在某些实施方式中，结合多肽：(a)包括重链可变区，所述重链可变区包含与seq id no:7中所示的重链可变区的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；和/或(b)包括重链可变区，所述重链可变区包含seq id no:7中所示的氨基酸序列；和/或(c)由重链可变区构成，所述重链可变区由seq id no:7中所示的氨基酸序列构成；和/或(d)包括轻链可变区，所述轻链可变区包含与seq id no:9中所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列；和/或(e)包括轻链可变区，所述轻链可变区包含seq id no:9中所示的氨基酸序列；和/或(f)由轻链可变区构成，所述轻链可变区包含seq id no:9中所示的氨基酸序列。
36.另一方面，本发明提供了用于治疗对其需要的对象中的癌症的方法，包括向对象施用分离的结合多肽，所述分离的结合多肽包括：重链可变区，其包含与seq id no:7同一性至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列；和轻链可变区，其包含与seq id no:9同一性至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的氨基酸序列。
37.在某些实施方式中，(a)癌症与表达成纤维细胞激活蛋白(fap)的细胞相关；和/或(b)表达fap的细胞是癌症相关细胞；和/或(c)表达fap的细胞是癌症相关细胞，其中癌症相关细胞是癌症相关成纤维细胞(caf)；和/或(d)表达fap的细胞是癌症相关细胞，其中表达fap的癌症相关细胞是表达fap的脂肪细胞；和/或(e)表达fap的细胞是癌症相关细胞，其中表达fap的癌症相关细胞是肿瘤相关巨噬细胞(tam)；和/或(f)表达fap的细胞是癌症相关细胞，其中表达fap的癌症相关细胞是肿瘤相关嗜中性粒细胞(tan)；和/或(g)表达fap的细
胞是癌症相关细胞，其中表达fap的癌症相关细胞是骨髓来源抑制细胞(mdsc)；和/或(h)表达fap的细胞是癌症相关细胞，其中表达fap的癌症相关细胞是癌症起始细胞。
38.在某些实施方式中，(a)结合多肽特异性结合成纤维细胞激活蛋白(fap)；和/或(b)结合多肽包括抗体或其抗原结合片段；和/或(c)抗原结合片段选自fab、单链可变片段(scfv)、或单结构域抗体，并且任选地其中抗体是全长抗体；和/或(d)抗体或抗原结合片段是人源化抗体或其抗原结合片段。
39.另一方面，本发明提供了用于治疗对其需要的对象中的癌症的方法，包括：(a)将对象鉴定为合适的对象，其中鉴定包括：(i)从对象分离患病组织；(ii)使分离的组织与特异性结合fap的结合多肽接触；和(iii)检测分离的组织中表达fap的细胞；和(b)向合适的对象施用包括修饰的t细胞的过继性细胞疗法，所述修饰的t细胞包含特异性结合成纤维细胞激活蛋白(fap)的嵌合抗原受体(car)。
附图说明
40.当结合附图阅读时，以下对本发明优选实施方式的详细描述将得到更好理解。以示例本发明为目的，附图中显示了目前优选的实施方式。然而，应理解，本发明不限于附图中所示的实施方式的确切安排和手段。
41.图l是ncbi数据库(xm_005640252.2)中列出的犬fap基因序列与采用使用该ncbi序列所产生的两个引物对犬fap基因进行pcr扩增的产物之间的序列比对。在核苷酸水平上，产物在t127和a603处具有两个保守的碱基对取代(加框的残基，左侧；嵌入的序列，右侧)。
42.图2a-图2c是示例重组表达犬fap的细胞的产生的载体图谱和图。犬fap pcr产物被克隆到真核表达质粒(pcdna3.1)中(图2a)，然后被亚克隆到慢病毒质粒(plenti6/v5-d-topo)中(图2b)。用包装质粒将慢病毒质粒转染到hek293细胞中，其用于生成含病毒的上清液。所得的含有病毒颗粒的上清液用于转导balb/c 3t3细胞。使用绵羊抗人fap抗体，通过流式细胞术确认重组犬fap的表达(图2c)。
43.图3是展示产生抗fap抗体的杂交瘤细胞的生成的流式细胞术图。犬fap转导的balb/c 3t3细胞用于免疫14周龄balb/c小鼠。将脾细胞与sp2/0细胞融合，并针对pkh标记的mc kosa亲本(fap无效)细胞和表达犬fap转基因的mc kosa.k9fap细胞筛选所得的杂交瘤。一次染色由杂交瘤产生的抗体提供。使用山羊抗小鼠igg二抗进行二次染色，之后通过流式细胞术读出。
44.图4a-图4c示例了新产生的4g5抗犬fap抗体的同种型的表征。在这些研究中使用了基于elisa的商业分型试剂盒。图4a显示了来自elisa的比色数据。列代表每行的重复孔。阳性反应出现在a和g行。图4b是elisa板的图像，显示a和g行中显著的阳性信号。图4c是显示4g5抗体对igg1和κ同种型免疫球蛋白测试呈阳性的研究的板图(plate map)。
45.图5描绘了证明4g5抗体和小鼠igg1同种型对照抗体生成相似带型的蛋白质凝胶。
具体实施方式
46.a.定义
47.除非另外定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域普
通技术人员的普遍理解相同的含义。尽管在测试本发明的实践中可以使用与本文描述的那些相似或等同的任何方法和材料，但本文对优选的材料和方法进行了描述。在描述和要求保护本发明的过程中，将使用以下术语。
48.还要理解，本文使用的术语仅仅以描述具体实施方式为目的，而非意图限制。
49.冠词“一个”和“一种”在本文中用于指代一个或多于一个(即，至少一个)该冠词的语法对象。举例来说，“一个元素”意为一个元素或多于一个元素。
50.当涉及诸如量、持续时间等的可测量值时，本文所用的“约”意指包括指定值的
±
20％或
±
10％，更优选
±
5％，甚至更优选
±
1％，还更优选
±
0.1％的变化，因为这样的变化适于实施本公开的方法。
51.如本文所用，术语“抗体”是指与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子。抗体可以是源自天然来源或源自重组来源的完整免疫球蛋白，并且可以是完整免疫球蛋白的免疫反应部分。抗体一般是免疫球蛋白分子的四聚体。四聚体可以是天然存在的或由单链抗体或抗体片段重建。抗体还包括可以天然存在的或由单链抗体或抗体片段构建的二聚体。本发明中的抗体可以以多种形式存在，包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、fv、fab和f(ab')2以及单链抗体(scfv)、人源化抗体、和人抗体(harlow等人,1999,in:using antibodies:a laboratory manual,cold spring harbor laboratory press,ny；harlow等人,1989,in:antibodies:alaboratory manual,cold spring harbor,new york；houston等人,1988,proc.natl.acad.sci.usa 85:5879-5883；bird等人,1988,science 242:423-426)。
52.术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分，并且指代完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的实例包括但不限于fab、fab'、f(ab')2和fv片段、线性抗体、scfv抗体、单结构域抗体，例如骆驼(camelid)抗体(riechmann,1999,journal of immunological methods231:25-38)，由对靶标展现出足够亲和力的vl或vh结构域构成，以及由抗体片段形成的多特异性抗体。抗体片段还包括人抗体或人源化抗体或人抗体或人源化抗体的部分。
53.如本文所用，“抗体重链”是指所有抗体分子其天然存在构象中存在的两种类型的多肽链中的较大者。
54.如本文所用，“抗体轻链”是指所有抗体分子其天然存在构象中存在的两种类型的多肽链中的较小者。κ和λ轻链是指两个主要抗体轻链同种型。
55.如本文所用，术语“合成抗体”是指利用重组dna技术生成的抗体，如，例如，本文所述的由噬菌体表达的抗体。该术语还应被解释意为通过合成编码抗体的dna分子(并且该dna分子表达抗体蛋白质)或限定抗体的氨基酸序列而生成的抗体，其中该dna或氨基酸序列已利用本领域可获得和公知的合成dna或氨基酸序列技术获得。
56.如本文所用，术语“抗原”或“ag”被定义为引起免疫应答的分子。这种免疫应答可涉及抗体产生，或特定免疫学感受态细胞的激活，或两者兼之。本领域技术人员将会理解，任何大分子，包括基本上所有蛋白质或肽，都可充当抗原。此外，抗原可以来源于重组dna或基因组dna。技术人员将会理解，包含编码引起免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何dna因此编码如本文所用的术语“抗原”。此外，本领域技术人员将理解，抗原无需纯粹地由基因的全长核苷酸序列编码。显而易见，本发明包括但不限于使用多于一个基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列以引起期望的免疫应答的各种组合排列。而且，技术人员将理解抗原完全无需由“基因”编码。显而易见，抗原可以被合成生成或可以源
自生物样品。这种生物样品可以包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或生物流体。
57.如本文所用的术语“抗肿瘤效果”是指可以通过肿瘤体积减小、肿瘤细胞数量减少、转移数量减少、预期寿命增加、或与癌性状况相关的各种生理症状减轻而展现的生物学效果。“抗肿瘤效果”还可以通过本发明的肽、多核苷酸、细胞和抗体预防肿瘤最初发生的能力而展现。
58.如本文所用，术语“自体的”意指源自同一个体的任何物质，其随后被再引入该个体。
[0059]“同种异体的”指的是源自同一物种的不同动物的移植物。
[0060]“异种的”是指源自不同物种的动物的移植物。
[0061]
如本文所用的术语“癌症”被定义为以异常细胞快速且不受控生长为特征的疾病。癌细胞可以局部扩散或通过血流和淋巴系统扩散到身体的其它部位。各种癌症的实例包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等。
[0062]
如本文所用，术语“保守序列修饰”意图指代不显著影响或改变含有该氨基酸序列的抗体的结合特征的氨基酸修饰。这种保守修饰包括氨基酸取代、添加和删除。修饰可以通过本领域已知的标准技术，如定点诱变和pcr介导的诱变，被引入本发明的抗体中。保守氨基酸取代是氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基置换的氨基酸取代。具有相似侧链的氨基酸残基家族在本领域中已被定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、具有β-分支侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，本发明的抗体的cdr区内的一个或多个氨基酸残基可以被来自同一侧链家族的其它氨基酸残基置换，并且可以利用本文描述的功能试验来测试改变后的抗体的fap结合能力。
[0063]
如本文使用的术语“共刺激配体”包括抗原呈递细胞(例如，aapc、树突状细胞、b细胞等)上的这样的分子：特异性结合t细胞上的同源共刺激分子，从而除通过例如将tcr/cd3复合物与使用肽负载的mhc分子结合提供的初级信号之外，还提供介导t细胞应答——包括但不限于增殖、激活、分化等——的信号。共刺激配体可以包括但不限于cd7、b7-1(cd80)、b7-2(cd86)、pd-l1、pd-l2、4-1bbl、ox40l、诱导型共刺激配体(icos-l)、细胞间粘附分子(icam)、cd30l、cd40、cd70、cd83、hla-g、mica、micb、hvem、淋巴毒素β受体、3/tr6、ilt3、ilt4、hvem、结合toll配体受体和与b7-h3特异性结合的配体的激动剂或抗体。共刺激配体还包括与存在于t细胞上的共刺激分子特异性结合的抗体等，如但不限于cd27、cd28、4-1bb、ox40、cd30、cd40、pd-1、icos、淋巴细胞功能相关抗原-1(lfa-1)、cd2、cd7、light、nkg2c、b7-h3、和与cd83特异性结合的配体。
[0064]“共刺激分子”是指与共刺激配体特异性地结合从而介导通过t细胞的共刺激应答——诸如但不限于增殖——的t细胞上的同源结合配偶体。共刺激分子包括但不限于mhc i类分子、btla和toll配体受体。
[0065]
当在fap的表达或活性水平的背景下使用时，术语“失调的”是指与在其它方面相
同的健康动物、生物体、组织、细胞或其组分中的表达水平或活性所不同的fap表达或活性水平。术语“失调的”还指与在其它方面相同的健康动物、生物体、组织、细胞或其组分中的调节相比发生改变的fap表达和活性水平的调节。
[0066]“编码”是指多核苷酸如基因、cdna或mrna中的具体核苷酸序列充当用于合成生物过程中具有限定的核苷酸(即，rrna、trna和mrna)序列或限定的氨基酸序列的其它多聚体和大分子的模板的固有性质以及由此产生的生物学性质。因此，基因编码蛋白质——如果对应于该基因的mrna的转录和翻译在细胞或其它生物系统中产生该蛋白质的话。用作基因或cdna的转录模板的编码链(其核苷酸序列与mrna序列相同并且通常被提供在序列表中)和非编码链都可以被称为编码该基因或cdna的蛋白质或其它产物。
[0067]
除非另有说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括彼此为简并形式且编码同一氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质的核苷酸序列和rna可包括内含子。
[0068]“有效量”或“治疗有效量”在本文中可互换使用，并且是指如本文所述有效实现特定生物学结果的化合物、制剂、材料、或组合物的量。这样的结果可以包括但不限于通过适用于本领域的任意手段确定的对病毒感染的抑制。
[0069]
如本文所用，“内源”是指来自生物体、细胞、组织或系统内或在生物体、细胞、组织或系统内产生的任何物质。
[0070]
如本文所用，术语“外源”是指从生物体、细胞、组织或系统外引入或在生物体、细胞、组织或系统外产生的任何物质。
[0071]
如本文所用，术语“表达”被定义为特定核苷酸序列通过其启动子驱动的转录和/或翻译。
[0072]“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，该重组多核苷酸包含与待表达的核苷酸序列可操作地连接的表达控制序列。表达载体包含充足的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其它元件可以由宿主细胞提供或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的所有那些表达载体，如包含该重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸露的或包含在脂质体中的)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
[0073]
如本文所用，“同源的”是指两个多聚体分子之间，例如两个核酸分子之间——如两个dna分子或两个rna分子之间——或两个多肽分子之间的亚单位序列同一性。当两个分子中的亚单位位置均被同一单体亚单位占据时；例如，如果两个dna分子中每一个中的一个位置均被腺嘌呤占据，则其在该位置处是同源的。两个序列之间的同源性是匹配或同源位置的数量的直接函数；例如，如果两个序列中的一半位置(例如，十个亚单位长度的多聚体中的五个位置)是同源的，则这两个序列是50％同源的；如果90％的位置(例如，10个中的9个)匹配或同源，则这两个序列是90％同源的。
[0074]“人源化”和“嵌合”形式的非人(例如，鼠)抗体是包含源自非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如fv、fab、fab'、f(ab')2或抗体的其它抗原结合子序列)。就大部分而言，人源化抗体和嵌合抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的互补决定区(cdr)的残基被来自具有期望的特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)如小鼠、大鼠或兔的cdr的残基置换。在一些情况下，人免疫球蛋白的fv框架区(fr)残基被相应的非人残基置换。此外，人源化抗体和嵌合抗体可以包含在受体抗体和导入的cdr或框架序列中均找不到的残基。这些修饰被进行以进一步改进和优化抗体性能。总
体上，人源化抗体和嵌合抗体将包含基本上全部的至少一个可变结构域，一般两个可变结构域，其中全部或基本上全部cdr区对应于非人免疫球蛋白的cdr区，并且全部或基本上全部fr区是人免疫球蛋白序列的fr区。人源化抗体和嵌合抗体最佳地还将包含免疫球蛋白恒定区(fc)的至少一部分，一般是人免疫球蛋白的。世界卫生组织(who)国际非专有名称(inn)专家组定义了将非人衍生抗体视为“人源化”的要求。根据指南，候选抗体与人序列的比较应通过international immunogenetics informationdomaingapalign工具(www.imgt.org)进行。此工具查询抗体种系可变区基因的数据库，其中仅针对种系序列可变区外显子进行比对评分，因此从分析中省略了部分cdr3和j区。对于待“人源化”的抗体，除了“比其它物种更接近人”之外，最热门的“中选者(hit)”应该是人，并且与人序列的同一性必须至少为85％，否则该抗体将被指定为是“嵌合的”。更多细节参见jones等人,nature,321:522-525,1986；reichmann等人,nature,332:323-329,1988；presta,curr.op.struct.biol.,2:593-596,1992。
[0075]“全人”是指整个分子是人来源的或由与人形式抗体相同的氨基酸序列构成的免疫球蛋白，如抗体。
[0076]
如本文所用，“说明材料”包括可用于传达本发明组合物和方法的有用性的出版物、记录、图、或任何其它表达介质。例如，本发明的试剂盒的说明材料可以例如被附于含有本发明的核酸、肽、和/或组合物的容器，或者与含有核酸、肽、和/或组合物的容器一起装运。可选地，说明材料可以与容器分开装运，目的是说明材料和化合物被接受者配合地使用。
[0077]
如本文所用的“同一性”是指两个多聚体分子之间，特别是两个氨基酸分子之间，如两个多肽分子之间的亚单位序列同一性。当两个氨基酸序列在相同位置处具有相同的残基时；例如，如果两个多肽分子中的每一个中的一个位置被精氨酸占据，则其在该位置处具有同一性。同一性或在比对中两个氨基酸序列在相同位置处具有相同残基的程度通常以百分比表示。两个氨基酸序列之间的同一性是匹配或同一位置数量的直接函数；例如，如果两个序列中一半位置(例如，10个氨基酸长度的多聚体中的5个位置)相同，则两个序列具有50％同一性；如果90％的位置(例如，10个中的9个)匹配或相同，则两个氨基酸序列具有90％同一性。
[0078]“分离的”是指自天然状态改变或移出的。例如，活体动物中天然存在的核酸或肽不是“分离的”，但是与其天然状态的共存物质部分或完全分开的同一核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白质可以以基本上纯化的形式存在，或者可以存在于非天然环境，如，例如宿主细胞中。
[0079]
在本发明的上下文中，对于常出现的核酸碱基使用以下缩写。“a”是指腺苷，“c”是指胞嘧啶(胞苷，cytosine)，“g”是指鸟苷，“t”是指胸苷，“u”是指尿苷。
[0080]
除非另有说明，否则“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括作为彼此的简并形式并且编码同一氨基酸序列的所有核苷酸序列。短语编码蛋白质或rna的核苷酸序列还可以包括内含子，使得编码该蛋白质的核苷酸序列在一些形式中可以含有内含子(一个或多个)。
[0081]
如本文所用，“慢病毒”是指逆转录病毒科的一个属。慢病毒在逆转录病毒中的独特之处在于能够感染非分裂细胞；其可以将大量的遗传信息传递到宿主细胞的dna中，因此其是基因传递载体的最有效的方法之一。hiv、siv和fiv都是慢病毒的实例。衍生自慢病毒
的载体提供了实现体内显著水平基因转移的手段。
[0082]
术语“可操作地连接”是指调控序列与异源核酸序列之间的导致后者的表达的功能性连接。例如，当使第一核酸序列与第二核酸序列处于功能性关系时，第一核酸序列与第二核酸序列被可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子可操作地连接至编码序列。总体上，可操作地连接的dna序列是连续的，并且在连接两个蛋白编码区需要时处于同一阅读框中。
[0083]
免疫原性组合物的“肠胃外”施用包括例如皮下(s.c)、静脉内(i.v.)、肌内(i.m.)、或胸骨内注射、或输注技术。
[0084]
如本文所用，术语“多核苷酸”被定义为核苷酸链。此外，核酸是核苷酸的多聚体。因此，如本文所使用的核酸和多核苷酸是可互换的。本领域技术人员具有如下公知常识：核酸是多核苷酸，其可被水解成单体“核苷酸”。单体核苷酸可被水解成核苷。如本文所用，多核苷酸包括但不限于通过本领域任何可利用的手段(非限制地包括重组手段，即利用普通克隆技术和pcr
tm
由重组文库或细胞基因组克隆核酸序列)以及通过合成手段获得的所有核酸序列。
[0085]
如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且是指由通过肽键共价连接的氨基酸残基构成的化合物。蛋白质或肽必定含有至少两个氨基酸，并且对于可构成蛋白质或肽序列的氨基酸最大数量没有限制。多肽包括包含通过肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所用，该术语既指代短链(其在本领域中也常被称为例如肽、寡肽和低聚物)，也指代较长链(其总体上在本领域被称为蛋白质，其中有很多种类)。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体、多肽变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白及其它。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽、或其组合。
[0086]
如本文所用，术语“启动子”被定义为启动多核苷酸序列的特异性转录所需的由细胞的合成机构或引入的合成机构所识别的dna序列。
[0087]
如本文所用，术语“启动子/调控序列”意为与启动子/调控序列可操作地连接的基因产物的表达所需的核酸序列。在一些情况下，此序列可以是核心启动子序列，并且在其它情况下，此序列还可以包括基因产物表达所需的增强子序列和其它调控元件。启动子/调控序列可以例如是以组织特异性方式表达基因产物的启动子/调控序列。
[0088]“组成型”启动子是在细胞的大多数或全部生理条件下，在与编码或限定基因产物的多核苷酸可操作地连接时导致基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。
[0089]“诱导型”启动子是基本上只有在与启动子相对应的诱导物在细胞中存在时，才在与编码或限定基因产物的多核苷酸可操作地连接时导致基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。
[0090]“组织特异性”启动子是基本上只有在细胞是与启动子相对应的组织类型的细胞时，才在与编码或限定基因的多核苷酸可操作地连接时导致基因产物在细胞中产生的核苷酸序列。
[0091]“信号转导途径”是指对信号从细胞一部分向细胞另一部分的传递有影响的各种信号转导分子之间的生物化学关系。短语“细胞表面受体”包括能够接收信号并将信号跨过细胞的质膜传递的分子和分子复合物。
[0092]“单链抗体”是指通过重组dna技术形成的抗体，其中免疫球蛋白重链和轻链片段使用氨基酸工程改造段(an engineered span of amino acids)相互连接以将抗体的fv区概括为单个多肽。生成单链抗体的各种方法是已知的，包括在美国专利号4,694,778；bird(1988)science 242:423-442；huston等人(1988)proc.natl.acad.sci.usa 85:5879-5883；ward等人(1989)nature 334:54454；skerra等人(1988)science 242:1038-1041中描述的那些。
[0093]
术语“对象”旨在包括可引发免疫应答的活生物体(例如，哺乳动物)。如本文使用的“对象”或“患者”可以是人或非人哺乳动物。非人哺乳动物包括例如家畜和宠物，如羊科、牛科、猪科、犬科、猫科和鼠科的哺乳动物。优选地，对象是人。
[0094]
如本文所用，“基本上纯化的”细胞是基本上不含其它细胞类型的细胞。基本上纯化的细胞也指代已经与在其天然存在状态下其通常相关的其它细胞类型分离的细胞。在一些情况下，基本上纯化的细胞群指代均质的细胞群。在其它情况下，此术语仅指已经与在其天然状态下其天然相关的细胞分离的细胞。在一些实施方式中，细胞被体外培养。在其它实施方式中，细胞不被体外培养。
[0095]
如本文所用，术语“治疗性”意为治疗和/或预防。治疗效果通过疾病状态的抑制、缓解或根除而获得。
[0096]
如本文所用，术语“转染”或“转化”或“转导”是指将外源核酸转移或引入宿主细胞中的过程。“转染”或“转化”或“转导”的细胞是已经用外源核酸转染、转化或转导的细胞。该细胞包括原生对象细胞和其后代。
[0097]
如本文所用，短语“在转录控制下”或“可操作地连接”意为启动子相对于多核苷酸处于恰当的位置和定向以控制通过rna聚合酶进行的转录的开始和多核苷酸的表达。
[0098]“载体”是包含分离的核酸并且可被用于将该分离的核酸递送至细胞内部的物质组合物。多种载体在本领域已知，包括但不限于线性多核苷酸、与离子型或两亲性化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语还应被解释为包括促进核酸到细胞中转移的非质粒和非病毒化合物，如，例如，聚赖氨酸化合物、脂质体等。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体等。
[0099]
如本文所用，术语“特异性结合”是指识别存在于样品中的同源结合配偶体(例如，存在于t细胞上的刺激和/或共刺激分子)蛋白并与之结合的抗体或配体，但所述抗体或配体不实质上识别或结合样品中的其它分子。
[0100]
术语“刺激”意为通过刺激分子(例如，tcr/cd3复合物)与其同源配体结合，从而介导信号转导事件(诸如但不限于，经由tcr/cd3复合物的信号转导)引起的初次应答。刺激可以介导某些分子的表达改变，如tgf-β下调和/或细胞骨架结构重整和类似情况。
[0101]
本文使用的术语“刺激分子”意为t细胞上与抗原呈递细胞上和/或肿瘤细胞上存在的同源刺激配体特异性结合的分子。
[0102]
如本文所用，“刺激配体”意为在存在于抗原呈递细胞(例如，aapc、树突状细胞、b细胞等)或肿瘤细胞上时可以与t细胞上的同源结合配偶体(在本文中称为“刺激分子”)特异性结合从而介导t细胞的初次应答(包括但不限于激活、免疫应答的启动、增殖等)的配体。刺激配体在本领域中是公知的并且尤其包括装载有肽的mhc i类分子、抗cd3抗体、超激
动剂抗cd28抗体、和超激动剂抗cd2抗体。
[0103]
范围：贯穿本公开，本发明的各个方面可以以范围形式展示。应理解，范围形式的描述仅仅是为了方便和简洁，而不应被解释为对本发明的范围的僵硬限制。因此，范围的描述应该被认为是已具体公开了该范围内所有可能的子范围以及个体数值。例如，诸如1至6的范围描述应被认为已具体公开了子范围，如1至3、1至4、1至5、2至4、2至6、3至6等，以及该范围内的个体数值，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。这不论范围宽度地适用。
[0104]
b.结合多肽、抗体和scfv
[0105]
本发明的结合多肽和抗体的特征在于抗体的特定功能特征或特性。在这样的实施方式中，抗原结合结构域可称为具有跨物种反应性。例如，结合多肽和抗体与犬成纤维细胞激活蛋白(fap)特异性结合并且还对小鼠和人fap交叉反应。优选地，本发明的结合多肽和抗体以高亲和力结合犬、小鼠、和人fap。优选地，本发明的结合多肽和抗体特异性识别细胞上天然表达的犬fap蛋白而不对该细胞上的其它表面分子交叉反应。
[0106]
在某些方面中，本发明提供了分离的结合多肽，其包含特异性结合人和犬、和/或鼠成纤维细胞激活蛋白(fap)的表位的抗原结合结构域。在某些实施方式中，抗原结合结构域包括：重链可变区，其包括三个重链互补决定区(hcdr)；和轻链可变区，其包括三个轻链互补决定区(lcdr)。
[0107]
在某些实施方式中，本发明提供了包括包含三个重链互补决定区(hcdr)的重链可变区的分离的结合多肽。在某些实施方式中，hcdr1包含氨基酸序列ytitsyslh(seq id no:1)，和/或hcdr2包含氨基酸序列einpangdhnfsekfeik(seq id no:2)，和/或hcdr3包含氨基酸序列lddsrfhwyfdv(seq id no:3)。在某些实施方式中，抗原结合结构域包括包含三个轻链互补决定区(lcdr)的轻链可变区，其中lcdr1包含氨基酸序列tasssvsymy(seq id no:4)，和/或lcdr2包含氨基酸序列ltsnla(seq id no:5)，和/或lcdr3包含氨基酸序列qqwsgyppit(seq id no:6)。
[0108]
在某些方面中，本发明提供了分离的结合多肽，其包括包含氨基酸序列ytitsyslh(seq id no:1)的hcdr1。还提供了包括包含氨基酸序列gytitsyslh(seq id no:17)的hcdr1的分离的结合多肽。还提供了包括包含氨基酸序列einpangdhnfsekfeik(seq id no:2)的hcdr2的分离的结合多肽。还提供了包括包含氨基酸序列lddsrfhwyfdv(seq id no:3)的hcdr3的分离的结合多肽。还提供了包括包含氨基酸序列trlddsrfhwyfdv(seq id no:19)的hcdr3的分离的结合多肽。还提供了包括轻链可变区的分离的结合多肽，所述轻链可变区包括包含氨基酸序列tasssvsymy(seq id no:4)的lcdr1。还提供了包括包含氨基酸序列ltsnla(seq id no:5)的lcdr2的分离的结合多肽。还提供了包括包含氨基酸序列ltsnlas(seq id no:20)的lcdr2的分离的结合多肽。还提供了包括包含氨基酸序列qqwsgyppit(seq id no:6)的lcdr3的分离的结合多肽。
[0109]
在某些实施方式中，本发明提供了包括重链可变区的分离的结合多肽，所述重链可变区包括三个重链互补决定区(hcdr)，其中hcdr1包含氨基酸序列ytitsyslh(seq id no:1)，和/或hcdr2包含氨基酸序列einpangdhnfsekfeikat(seq id no:18)，和/或hcdr3包含氨基酸序列trlddsrfhwyfdv(seq id no:19)。在某些实施方式中，分离的结合多肽包括轻链可变区，所述轻链可变区包括三个轻链互补决定区(lcdr)，其中lcdr1包含氨基酸序列tasssvsymy(seq id no:4)，和/或lcdr2包含氨基酸序列ltsnla(seq id no:5)，和/或
lcdr3包含氨基酸序列qqwsgyppit(seq id no:6)。
[0110]
在某些方面中，本发明提供了分离的结合多肽，其包括包含氨基酸序列gytitsyslh(seq id no:17)的hcdr1、包含氨基酸序列einpangdhnfsekfeik(seq id no:2)的hcdr2、包含氨基酸序列lddsrfhwyfdv(seq id no:3)的hcdr3、包含氨基酸序列tasssvsymy(seq id no:4)的lcdr1、包含氨基酸序列ltsnlas(seq id no:20)的lcdr2、和包含氨基酸序列qqwsgyppit(seq id no:6)的lcdr3。
[0111]
在某些实施方式中，本发明提供了包括重链可变区的分离的结合多肽，所述重链可变区包括如本文所述的三个重链互补决定区hcdr1、hcdr2和hcdr3中的任一个。在某些实施方式中，分离的结合多肽包括轻链可变区，所述轻链可变区包括如本文所述的三个轻链互补决定区lcdr1、lcdr2和lcdr3中的任一个。在某些实施方式中，分离的结合多肽包括如本文所述的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3的任意组合。鉴于本文提供的重链和轻链可变区序列，技术人员将能够基于氨基酸编号容易地确定相关的互补决定区。
[0112]
本领域技术人员将已知互补决定区(cdr)序列的容许的变化。例如，在一些实施方式中，所述多肽包括互补决定区(hcdr或lcdr)，所述互补决定区(hcdr或lcdr)包含与seq id no:1、2、3、4、5、6、17、18、19、或20中所示的任意氨基酸序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
[0113]
在一些实施方式中，结合多肽结合成纤维细胞激活蛋白(fap)。在一些实施方式中，结合多肽包括抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，抗原结合片段选自fab、单链可变片段(scfv)、或单结构域抗体。在进一步的实施方式中，抗体是全长抗体。在更进一步的实施方式中，抗体或抗原结合片段是小鼠抗体或其抗原结合片段。在一些实施方式中，抗体或抗原结合片段是人源化抗体或其抗原结合片段。
[0114]
在某些实施方式中，结合多肽包括重链可变区，所述重链可变区包含与seq id no:7中所示的重链可变区的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，结合多肽包括重链可变区，所述重链可变区包含seq id no:7中所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，结合多肽由重链可变区构成，所述重链可变区由seq id no:7中所示的氨基酸序列构成。
[0115]
在某些实施方式中，结合多肽包括轻链可变区，所述轻链可变区包含与seq id no:9中所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、或99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，结合多肽包括轻链可变区，所述轻链可变区包含seq id no:9中所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，结合多肽由轻链可变区构成，所述轻链可变区包含seq id no:9中所示的氨基酸序列。
[0116]
还提供了分离的结合多肽，其包括：重链可变区，其包含seq id no:7中所示的氨基酸序列；和轻链可变区，其包含seq id no:9中所示的氨基酸序列。
[0117]
在某些实施方式中，本发明包括这样的抗体：其与本发明的抗体(即，具有与任意本发明的抗体交叉竞争与犬fap结合的能力的抗体)所结合的是人、小鼠、或犬fap上的同一表位。在优选的实施方式中，用于交叉竞争研究的参考抗体可以是本文所述的抗体中的一种(例如，4g5)。例如，biacore分析、elisa测定或流式细胞术可用于证明与本发明的抗体的
交叉竞争。测试抗体抑制例如4g5与犬fap结合的能力证明了测试抗体可以与4g5竞争与犬、小鼠、和人fap的结合，因此被认为与4g5所结合的是fap的同一表位。
[0118]
本发明的抗体可以使用具有本文公开的vh和/或vl序列中的一个或多个的抗体作为起始材料工程改造成修饰的抗体来制备，所述修饰的抗体与起始抗体相比可以具有改变的特性。可以通过修饰一个或两个可变区(即，vh和/或vl)内，例如一个或多个cdr区内和/或一个或多个框架区内的一个或多个氨基酸来工程改造抗体。另外地或可选地，可以通过修饰恒定区(一个或多个)内的残基来工程改造抗体，例如从而改变抗体的效应物功能(一种或多种)。
[0119]
还提供了单链可变片段(scfv)，其包含特异性结合人和/或犬和/或鼠成纤维细胞激活蛋白(fap)的表位的抗原结合结构域。
[0120]
如本文所用，术语“单链可变片段”或“scfv”是免疫球蛋白(例如，小鼠或人)的经共价连接形成vh::vl异二聚体的重链(vh)可变区与轻链(vl)可变区的融合蛋白。重链(vh)和轻链(vl)直接连接或通过将vh的n-末端与vl的c-末端，或将vh的c-末端与vl的n-末端连接的编码肽的连接体连接。在一些实施方式中，抗原结合结构域(例如，fap结合结构域)包括具有从n-末端到c-末端的构型——vh-连接体-vl的scfv。在一些实施方式中，抗原结合结构域包括具有从n-末端到c-末端的构型——vl-连接体-vh的scfv。本领域技术人员将能够选择适当的构型用于本发明。
[0121]
通常，连接体为了柔韧性(flexibility)而富含甘氨酸，以及为了溶解性而富含丝氨酸或苏氨酸。连接体可以连接胞外抗原结合结构域的重链可变区和轻链可变区。连接体的非限制性实例公开于shen等人,anal.chem.80(6):1910-1917(2008)和wo 2014/087010中，其内容特此通过引用以其整体并入。本领域已知各种连接体序列，非限制地包括甘氨酸丝氨酸(gs)连接体，例如(gs)n、(gsggs)n(seq id no:21)、(gggs)n(seq id no:22)和(ggggs)n(seq id no:23)，其中n代表至少为1的整数。示例性连接体序列可包括氨基酸序列，其非限制地包括ggsg(seq id no:24)、ggsgg(seq id no:25)、gsgsg(seq id no:26)、gsggg(seq id no:27)、gggsg(seq id no:28)、gsssg(seq id no:29)、ggggs(seq id no:30)、ggggsggggsggggs(seq id no:15)等。本领域技术人员将能够选择合适的连接体序列用于本发明。在一个实施方式中，本发明的scfv包括重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)，其中vh和vl由具有氨基酸序列ggggsggggsggggs(seq id no:15)的连接体序列分隔，所述连接体序列可由核酸序列ggtggcggtggctcgggcggtggt gggtcgggtggcggcggatct(seq id no:31)编码。
[0122]
尽管去除了恒定区并引入了连接体，但scfv蛋白保留了原始免疫球蛋白的特异性。单链fv多肽抗体可以由包含vh-和vl-编码序列的核酸表达，如huston等人(proc.nat.acad.sci.usa,85:5879-5883,1988)所述。另见美国专利号5,091,513、5,132,405和4,956,778；和美国专利公开号20050196754与20050196754。已描述了具有抑制活性的拮抗性scfv(参见，例如，zhao等人,hyrbidoma(larchmt)2008 27(6):455-51；peter等人,j cachexia sarcopenia muscle 2012august 12；shieh等人,j imunol 2009 183(4):2277-85；giomarelli等人,thromb haemost 2007 97(6):955-63；fife eta.,j clin invst 2006 116(8):2252-61；brocks等人,immunotechnology 1997 3(3):173-84；moosmayer等人,ther immunol 1995 2(10:31-40)。已描述了具有刺激活性的激动性scfv
(参见，例如，peter等人,j bioi chem 200325278(38):36740-7；xie等人,nat biotech 1997 15(8):768-71；ledbetter等人,crit rev immunol 1997 17(5-6):427-55；ho等人,biochim biophys acta 2003 1638(3):257-66)。
[0123]
在某方面中，本发明提供了单链可变片段(scfv)，其包含特异性结合人和犬、和/或鼠成纤维细胞激活蛋白(fap)的表位的抗原结合结构域，其中抗原结合结构域包括：重链可变区，其包括三个重链互补决定区(hcdr)；和轻链可变区，其包括三个轻链互补决定区(lcdr)。
[0124]
在scfv的某些实施方式中，hcdr1包含氨基酸序列ytitsyslh(seq id no:1)，和/或hcdr2包含氨基酸序列einpangdhnfsekfeik(seq id no:2)，和/或hcdr3包含氨基酸序列lddsrfhwyfdv(seq id no:3)，和/或lcdr1包含氨基酸序列tasssvsymy(seq id no:4)，和/或lcdr2包含氨基酸序列ltsnla(seq id no:5)，和/或lcdr3包含氨基酸序列qqwsgyppit(seq id no:6)。重链可变区和轻链可变区由连接体分隔。
[0125]
在scfv的某些实施方式中，hcdr1包含氨基酸序列gytitsyslh(seq id no:17)，和/或hcdr2包含氨基酸序列einpangdhnfsekfeik(seq id no:2)，和/或hcdr3包含氨基酸序列lddsrfhwyfdv(seq id no:3)，和/或lcdr1包含氨基酸序列tasssvsymy(seq id no:4)，和/或lcdr2包含氨基酸序列ltsnlas(seq id no:20)，和/或lcdr3包含氨基酸序列酸序列qqwsgyppit(seq id no:6)。重链可变区和轻链可变区由连接体分隔。
[0126]
还提供了单链可变片段(scfv)，其包括：重链可变区，其包含seq id no:7中所示的氨基酸序列；和/或轻链可变区，其包含seq id no:9中所示的氨基酸序列。重链可变区和轻链可变区由连接体分隔。
[0127]
另一方面，提供了包含seq id no:11或13中所示的氨基酸序列的单链可变片段(scfv)。另一方面，提供了由seq id no:11或13中所示的氨基酸序列构成的单链可变片段(scfv)。
[0128]
本领域技术人员将已知scfv序列的容许的变化。例如，在一些实施方式中，scfv包含与seq id no:1、2、3、4、5、6、7、9、11、13、15、17、18、19或20中所示的任意氨基酸序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
[0129]
表1：氨基酸和核苷酸序列
[0130]
[0131]
[0132][0133]
c.核酸和表达载体
[0134]
本公开提供了编码结合多肽(例如抗体或其片段，例如scfv)的分离的核酸，所述结合多肽包括特异性结合人和犬、和/或鼠成纤维细胞激活蛋白(fap)的表位的抗原结合结构域。本公开的核酸可以包含编码本文公开的结合多肽、scfv、或抗体中的任一个的多核苷酸序列。
[0135]
在某些实施方式中，结合多肽包括抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包括重链可变区，所述重链可变区包括三个重链互补决定区(hcdr)，其中hcdr1包含氨基酸序列ytitsyslh(seq id no:1)，和/或hcdr2包含氨基酸序列einpangdhnfsekfeik(seq id no:
2)，和/或hcdr3包含氨基酸序列lddsrfhwyfdv(seq id no:3)。在某些实施方式中，抗原结合结构域还包括轻链可变区，所述轻链可变区包括三个轻链互补性决定区(lcdr)，其中lcdr1包含氨基酸序列tasssvsymy(seq id no:4)，和/或lcdr2包含氨基酸序列ltsnla(seq id no:5)，和/或lcdr3包含氨基酸序列qqwsgyppit(seq id no:6)。
[0136]
在某些实施方式中，结合多肽包括抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包括：重链可变区，其中hcdr1包含氨基酸序列gytitsyslh(seq id no:17)，和/或hcdr2包含氨基酸序列einpangdhnfsekfeik(seq id no:2))，和/或hcdr3包含氨基酸序列lddsrfhwyfdv(seq id no:3)；和/或轻链可变区，其中lcdr1包含氨基酸序列tasssvsymy(seq id no:4)，和/或lcdr2包含氨基酸序列ltsnlas(seq id no:20)，和/或lcdr3包含氨基酸序列序列qqwsgyppit(seq id no:6)。
[0137]
在某些实施方式中，结合多肽包括抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包括：重链可变区，其中hcdr1包含氨基酸序列ytitsyslh(seq id no:1)，和/或hcdr2包含氨基酸序列einpangdhnfsekfeikat(seq id no:18)，和/或hcdr3包含氨基酸序列trlddsrfhwyfdv(seq id no:19)；和/或轻链可变区，其中lcdr1包含氨基酸序列tasssvsymy(seq id no:4)，和/或lcdr2包含氨基酸序列ltsnla(seq id no:5)，和/或lcdr3包含氨基酸序列qqwsgyppit(seq id no:6)。
[0138]
在某些实施方式中，编码结合多肽的核酸包括抗原结合结构域，所述抗原结合结构域包括重链可变区，所述重链可变区包括如本文所述的三个重链互补决定区hcdr1、hcdr2和hcdr3中的任一个。在某些实施方式中，抗原结合结构域包括轻链可变区，所述轻链可变区包括如本文所述的三个轻链互补决定区lcdr1、lcdr2和lcdr3中的任一个。在某些实施方式中，抗原结合结构域包括本文所述的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3的任意组合。鉴于本文提供的重链和轻链可变区序列，技术人员将能够基于氨基酸编号容易地确定相关的互补决定区。
[0139]
在某些实施方式中，结合多肽包括抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，抗原结合片段选自fab、单链可变片段(scfv)、或单结构域抗体。在某些实施方式中，抗体是全长抗体。在某些实施方式中，抗体或抗原结合片段是人源化抗体或其片段。
[0140]
还提供了编码结合多肽的核酸，所述结合多肽包括特异性结合人和犬、和/或鼠成纤维细胞激活蛋白(fap)的表位的抗原结合结构域，其中重链可变区由包含与seq id no:8具有至少80％、85％、90％、95％、96％、96％、97％、98％、99％同一性的多核苷酸序列的核酸编码。在某些实施方式中，重链可变区由包含seq id no:8中所示的多核苷酸序列的核酸编码。在某些实施方式中，重链可变区由核酸编码，所述核酸由seq id no:8中所示的多核苷酸序列构成。
[0141]
在某些实施方式中，轻链可变区由包含与seq id no:10中所示的轻链可变区的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、96％、97％、98％、99％同一性的多核苷酸序列的核酸编码。在某些实施方式中，轻链可变区由包含seq id no:10中所示的多核苷酸序列的核酸编码。在某些实施方式中，轻链可变区由核酸编码，所述核酸由seq id no:10中所示的多核苷酸序列构成。
[0142]
还提供了编码结合多肽的分离的核酸，所述结合多肽包括：重链可变区，由包含seq id no:8中所示的多核苷酸序列的核酸序列编码；和轻链可变区，由包含seq id no:10
中所示的多核苷酸序列的核酸序列编码。
[0143]
还提供了编码单链可变片段(scfv)的分离的核酸，所述单链可变片段(scfv)包括：重链可变区，其包括三个重链互补决定区(hcdr)；和轻链可变区，其包括三个轻链互补决定区(lcdr)。在某些实施方式中，hcdr1包含氨基酸序列gytitsyslh(seq id no:17)，和/或hcdr2包含氨基酸序列einpangdhnfsekfeik(seq id no:2)，和/或hcdr3包含氨基酸序列lddsrfhwyfdv(seq id no:3)，和/或lcdr1包含氨基酸序列tasssvsymy(seq id no:4)，和/或lcdr2包含氨基酸序列ltsnlas(seq id no:20)，和/或lcdr3包含氨基酸序列qqwsgyppit(seq id no:6)。
[0144]
在某些实施方式中，核酸编码包括单链可变片段，所述单链可变片段包括重链可变区，所述重链可变区包括三个重链互补决定区(hcdr)，其中hcdr1包含氨基酸序列ytitsyslh(seq id no:1)，和/或hcdr2包含氨基酸序列einpangdhnfsekfeik(seq id no:2)，和/或hcdr3包含氨基酸序列lddsrfhwyfdv(seq id no:3)。在某些实施方式中，轻链可变区包括三个轻链互补决定区(lcdr)，其中lcdr1包含氨基酸序列tasssvsymy(seq id no:4)，和/或lcdr2包含氨基酸序列ltsnla(seq id no:5)，和/或lcdr3包含氨基酸序列qqwsgyppit(seq id no:6)。
[0145]
在某些实施方式中，核酸包括单链可变片段，所述单链可变片段包括重链可变区，所述重链可变区包括三个重链互补决定区(hcdr)，其中hcdr1包含氨基酸序列gytitsyslh(seq id no:17)，和/或hcdr2包含氨基酸序列einpangdhnfsekfeik(seq id no:2)，和/或hcdr3包含氨基酸序列lddsrfhwyfdv(seq id no:3)。在某些实施方式中，抗原结合结构域包括轻链可变区，所述轻链可变区包括三个轻链互补决定区(lcdr)，其中lcdr1包含氨基酸序列tasssvsymy(seq id no:4)，和/或lcdr2包含氨基酸序列ltsnlas(seq id no:20)，和/或lcdr3包含氨基酸序列qqwsgyppit(seq id no:6)。
[0146]
在某些实施方式中，核酸包括单链可变片段，所述单链可变片段包括重链可变区，所述重链可变区包括三个重链互补决定区(hcdr)，其中hcdr1包含氨基酸序列ytitsyslh(seq id no:1)，和/或hcdr2包含氨基酸序列einpangdhnfsekfeikat(seq id no:18)，和/或hcdr3包含氨基酸序列trlddsrfhwyfdv(seq id no:19)。在某些实施方式中，单链可变片段还包括轻链可变区，所述轻链可变区包括三个轻链互补决定区(lcdr)，其中lcdr1包含氨基酸序列tasssvsymy(seq id no:4)，和/或lcdr2包含氨基酸序列ltsnla(seq id no:5)，和/或lcdr3包含氨基酸序列qqwsgyppit(seq id no:6)。
[0147]
在某些实施方式中，包含单链可变片段的核酸包括重链可变区，所述重链可变区包括如本文所述的三个重链互补决定区hcdr1、hcdr2和hcdr3中的任一个。在某些实施方式中，单链可变片段包括轻链可变区，所述轻链可变区包括如本文所述的三个轻链互补决定区lcdr1、lcdr2和lcdr3中的任一个。在某些实施方式中，单链可变片段包括本文所述的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3的任意组合。鉴于本文提供的重链和轻链可变区序列，技术人员将能够基于氨基酸编号容易地确定相关的互补决定区。
[0148]
还提供了编码单链可变片段(scfv)的分离的核酸，所述单链可变片段(scfv)包括由seq id no:8中所示的多核苷酸序列编码的重链可变区；和/或由seq id no:10中所示的多核苷酸序列编码的轻链可变区。重链可变区和轻链可变区由连接体分隔。在某些实施方式中，连接体包含seq id no:15中所示的氨基酸序列。
[0149]
还提供了编码单链可变片段(scfv)的分离的核酸，其中所述核酸包含seq id no:12或14中所示的多核苷酸序列。还提供了编码单链可变片段(scfv)的分离的核酸，其中所述核酸由seq id no:12或14中所示的多核苷酸序列构成。
[0150]
本领域技术人员将已知核酸序列的容许的变化。例如，在一些实施方式中，核酸包含与seq id no:8、10、12或14中所示的任意核苷酸序列具有至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的核苷酸序列。
[0151]
在某些实施方式中，本公开的核酸包含第一多核苷酸序列和第二多核苷酸序列。在某些实施方式中，第一多核苷酸序列包括编码本公开的靶向fap的结合多肽的多核苷酸序列。在一些实施方式中，本公开的靶向fap的结合多肽可以与其它治疗剂，例如但不限于免疫疗法(如免疫肿瘤抗体疗法和检查点阻断)、或其它car-t细胞疗法组合使用。因此，在这样的实施方式中，第二多核苷酸序列可包括编码抗癌抗体、检查点阻断分子、或car的多核苷酸序列。
[0152]
第一和第二多核苷酸序列可以通过连接体分隔。例如，在某些实施方式中，scfv的重链可变区和轻链可变区由连接体分隔。在某些实施方式中，连接体包含seq id no:15中所示的氨基酸序列。用于本公开的连接体允许多个蛋白由同一核酸序列(例如，多顺反子序列或双顺反子序列)编码，其被翻译为解离成单独的蛋白组分的多蛋白。在某些实施方式中，核酸从5’到3’包括第一多核苷酸序列、连接体、和第二多核苷酸序列。在某些实施方式中，核酸从5’到3’包括第二多核苷酸序列、连接体和第一多核苷酸序列。
[0153]
在一些实施方式中，连接体包含编码内部核糖体进入位点(ires)的核酸序列。如本文所用，“内部核糖体进入位点”或“ires”是指促进内部核糖体直接进入蛋白编码区的起始密码子(如atg)，进而引起对该基因的帽独立性(cap-independent)翻译的元件。各种内部核糖体进入位点是本领域技术人员已知的，其非限制地包括可获自以下的ires：病毒或细胞mrna来源，例如，免疫球蛋白重链结合蛋白(bip)；血管内皮生长因子(vegf)；成纤维细胞生长因子2；胰岛素样生长因子；翻译起始因子eif4g；酵母转录因子tfiid和hap4；和可获自以下的ires：例如，心病毒、鼻病毒、口蹄疫病毒、hcv、弗兰德鼠白血病病毒(frmlv)、和莫洛尼鼠白血病病毒(momlv)。本领域技术人员将能够选择用于本发明的适合的ires。
[0154]
在一些实施方式中，连接体包含编码自切割肽的核酸序列。如本文所用，“自切割肽”或“2a肽”是指允许多个蛋白编码为多蛋白的寡肽，多蛋白在转录后解离成组分蛋白。术语“自切割”的使用不意图暗示蛋白水解切割反应。各种自切割肽或2a肽是本领域技术人员已知的，其非限制性包括在小核糖核酸病毒科病毒家族成员中发现的那些，例如，口蹄疫病毒(fmdv)、马甲型鼻炎病毒(erav0、明脉扁刺蛾β四体病毒(tav)和猪捷申病毒-1(ptv-1)；和心病毒，如泰勒病毒(theilovirus)和脑心肌炎病毒。源自fmdv、erav、ptv-1、和tav的2a肽在本文中分别被称为“f2a”、“e2a”、“p2a”和“t2a”。本领域技术人员将能够选择用于本发明的适合的自切割肽。
[0155]
在一些实施方式中，连接体进一步包含编码弗林蛋白酶切割位点的核酸序列。弗林蛋白酶是无所不在地表达的蛋白酶，位于反式高尔基体中并在蛋白前体分泌前对其加工。弗林蛋白酶在其共有识别序列的cooh-末端切割。各种弗林蛋白酶共有识别序列(或“弗
林蛋白酶切割位点”)是本领域技术人员已知的，其非限制地包括arg-x1-lys-arg(seq id no:32)或arg-x1-arg-arg(seq id no:33)、x2-arg-x1-x3-arg(seq id no:34)和arg-x1-x1-arg(seq id no:35)，如arg-gln-lys-arg(seq id no:36)，其中x1是任意天然存在的氨基酸，x2是lys或arg，并且x3是lys或arg。本领域技术人员将能够选择用于本发明的适合的弗林蛋白酶切割位点。
[0156]
在一些实施方式中，连接体包含编码弗林蛋白酶切割位点和2a肽的组合的核酸序列。实例非限制地包括：包含编码弗林蛋白酶切割位点和f2a的核酸序列的连接体、包含编码弗林蛋白酶切割位点和e2a的核酸序列的连接体、包含编码弗林蛋白酶切割位点和p2a的核酸序列的连接体、包含编码弗林蛋白酶切割位点和t2a的核酸序列的连接体。本领域技术人员将能够选择用于本发明的适合的组合。在这样的实施方式中，连接体可进一步包含在弗林蛋白酶切割位点与2a肽之间的间隔区序列。在一些实施方式中，连接体包含弗林蛋白酶切割位点5’至2a肽。在一些实施方式中，连接体包含2a肽5’至弗林蛋白酶切割位点。各种间隔区序列是本领域已知的，其非限制地包括甘氨酸丝氨酸(gs)间隔区，如(gs)n、(gsggs)n(seq id no:21)和(gggs)n(seq id no:22)，其中n代表至少为1的整数。示例性间隔区序列可包含氨基酸序列，其非限制地包括ggsg(seq id no:24)、ggsgg(seq id no:25)、gsgsg(seq id no:26)、gsggg(seq id no:27)、gggsg(seq id no:28)、gsssg(seq id no:29)等。本领域技术人员将能够选择用于本发明的适合的间隔区序列。
[0157]
本发明的另一方面提供了包含本文公开的任一种分离的核酸的载体。在某些实施方式中，载体选自dna载体、rna载体、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、和逆转录病毒载体。在某些实施方式中，载体是表达载体。
[0158]
还提供了包含本文公开的任意载体或核酸的宿主细胞。宿主细胞可以是真核、原核、哺乳动物、或细菌来源的。本文还提供了产生结合fap的结合多肽或scfv的方法，其中所述方法包括培养宿主细胞。
[0159]
在一些实施方式中，本公开的核酸可以可操作地连接至转录控制元件，例如启动子和增强子等。合适的启动子和增强子元件是本领域技术人员已知的。
[0160]
在某些实施方式中，核酸与启动子可操作地连接。在某些实施方式中，启动子是磷酸甘油酸激酶-1(pgk)启动子。
[0161]
为了在细菌细胞中表达，合适的启动子包括但不限于laci、lacz、t3、t7、gpt、λp和trc。为了在真核细胞中表达，合适的启动子包括但不限于轻链和/或重链免疫球蛋白基因启动子元件和增强子元件；巨细胞病毒即时早期启动子；单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶启动子；早期和晚期sv40启动子；存在于来自逆转录病毒的长末端重复序列的启动子；小鼠金属硫蛋白-i启动子；和各种本领域已知的组织特异性启动子。合适的可逆启动子(包括可逆诱导型启动子)是本领域已知的。这样的可逆启动子可从多种生物体分离和源自多种生物体，例如，真核生物和原核生物。对源自第一生物体的可逆启动子的修饰用于第二生物体(例如，第一原核生物和第二真核生物、第一真核生物和第二原核生物等)是本领域公知的。这样的可逆启动子和基于这样的可逆启动子的系统还包含其它控制蛋白，包括但不限于醇调控启动子(例如，醇脱氢酶i(alca)基因启动子、响应于醇反式激活蛋白(a1cr)的启动子等)、四环素调控启动子(例如，包括tet激活子(tetactivators)、teton、tetoff等的启动子系统)、类固醇调控启动子(例如，大鼠糖皮质激素受体启动子系统、人雌性激素受体启动子
系统、类视黄醇启动子系统、甲状腺启动子系统、蜕皮素启动子系统、米非司酮启动子系统等)、金属调控启动子(例如，金属硫蛋白启动子系统等)、发病机理相关调控启动子(例如，水杨酸调控启动子、乙烯调控启动子、苯并噻二唑调控启动子等)、温度调控启动子(例如，热激诱导型启动子(例如，hsp-70、hsp-90、大豆热激启动子等)、光调控启动子、合成诱导型启动子等。
[0162]
在一些实施方式中，启动子是cd8细胞特异性启动子、cd4细胞特异性启动子、嗜中性粒细胞特异性启动子、或nk特异性启动子。例如，可以使用cd4基因启动子；参见，例如，salmon等人proc.natl.acad.sci.usa(1993)90:7739；和marodon等人(2003)blood 101:3416。作为另一实例，可以使用cd8基因启动子。可通过使用ncri(p46)启动子实现nk细胞特异性表达；参见，例如，eckelhart等人blood(2011)117:1565。
[0163]
为了在酵母细胞中表达，合适的启动子是组成型启动子，如adh1启动子、pgk1启动子、eno启动子、pyk1启动子等；或可调控启动子，如gal1启动子、gal10启动子、adh2启动子、phos启动子、cup1启动子、galt启动子、met25启动子、met3启动子、cyc1启动子、his3启动子、adh1启动子、pgk启动子、gapdh启动子、adc1启动子、trp1启动子、ura3启动子、leu2启动子、eno启动子、tp1启动子、和aox1(例如，用于毕赤酵母属)。对适合的载体和启动子进行选择完全是在本领域普通技术人员的水平内的。用于原核宿主细胞的合适的启动子包括但不限于噬菌体t7 rna聚合酶启动子；trp启动子；lac操纵子启动子；杂合启动子，例如，lac/tac杂合启动子、tac/trc杂合启动子、trp/lac启动子、t7/lac启动子；trc启动子；tac启动子等；arabad启动子；体内调控启动子，如ssag启动子或相关启动子(参见，例如，美国专利公开号20040131637)、pagc启动子(pulkkinen和miller,j.bacteriol.(1991)173(1):86-93；alpuche-aranda等人,proc.natl.acad.sci.usa(1992)89(21):10079-83)、nirb启动子(harborne等人mol.micro.(1992)6:2805-2813)等(参见，例如，dunstan等人,infect.immun.(1999)67:5133-5141；mckelvie等人,vaccine(2004)22:3243-3255；和chatfield等人,biotechnol.(1992)10:888-892)；σ70启动子，例如，共有σ70启动子(参见，例如，genbank登录号ax798980、ax798961、和ax798183)；稳定期启动子，例如，dps启动子、spv启动子等；源自毒力岛spi-2(pathogenicity island spi-2)的启动子(参见，例如，wo96/17951)；acta启动子(参见，例如，shetron-rama等人,infect.immun.(2002)70:1087-1096)；rpsm启动子(参见，例如，valdivia和falkow mol.microbiol.(1996).22:367)；tet启动子(参见，例如，hillen,w.和wissmann,a.(1989)in saenger,w.和heinemann,u.(eds),topics in molecular and structural biology,protein
‑‑
nucleic acid interaction.macmillan,london,uk,第10卷,第143-162页)；sp6启动子(参见，例如，melton等人,nucl.acids res.(1984)12:7035)；等等。用于原核生物(如大肠杆菌)的合适的强启动子包括但不限于trc、tac、t5、t7、和pλ。用于细菌宿主细胞的操纵子的非限制性实例包括乳糖启动子操纵子(当与乳糖接触时，laci抑制蛋白改变构象，进而防止lad抑制蛋白与操纵子结合)、色氨酸启动子操纵子(当与色氨酸复合时，trpr抑制蛋白具有结合操纵子的构象；在色氨酸不存在时，trpr抑制蛋白具有不与操纵子结合的构象)、和tac启动子操纵子(参见，例如，deboer等人,proc.natl.acad.sci.u.s.a.(1983)80:21-25)。
[0164]
合适的启动子的其它实例包括即时早期巨细胞病毒(cmv)启动子序列。此启动子序列是强组成型启动子序列，能够驱动与其可操作地连接的任意多核苷酸序列的高水平表
达。还可以使用其它组成型启动子序列，包括但不限于猿猴病毒40(sv40)早期启动子、小鼠乳腺肿瘤病毒(mmtv)或人免疫缺陷病毒(hiv)长末端重复序列(ltr)启动子、momulv启动子、禽白血病病毒启动子、爱泼斯坦-巴尔病毒即时早期启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、ef-1α启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于，肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红蛋白启动子、和肌酸激酶启动子。进一步，本发明不应限于组成型启动子的使用。诱导型启动子也被考虑作为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，该分子开关能够能够开启诱导型启动子可操作地连接的多核苷酸序列的表达(当期望这种表达时)，或使该表达关闭(当不期望该表达时)。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白(metallothionine)启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子、和四环素启动子。
[0165]
在一些实施方式中，含有合适的启动子的基因座或构建物或转基因通过诱导系统的诱导，是不可逆地开关的。用于诱导不可逆开关的合适的系统是本领域公知的，例如，不可逆开关的诱导可利用cre-lox介导的重组(参见，例如，fuhrmann-benzakein,等人,proc.natl.acad.sci.usa(2000)28:e99，其公开内容通过引用并入本文)。本领域已知的重组酶、核酸内切酶、连接酶、重组位点等的任意合适的重组都可用于产生不可逆地开关的启动子。本文其它部分描述的用于执行位点特异性重组的方法、机理、和要求可用于产生不可逆地开关的启动子，并且是本领域公知的，参见，例如，grindley等人annual review of biochemistry(2006)567-605；和tropp,molecular biology(2012)(jones&bartlett publishers,sudbury,mass.)(其公开内容通过引用并入本文)。
[0166]
本公开的核酸可存在于表达载体和/或克隆载体内。表达载体可包括可选标记物、复制起始点、和提供载体的复制和/或维护的其它特征。合适的表达载体包括，例如，质粒、病毒载体等。本领域技术人员已知多种合适的载体和启动子；很多都可商业获得以用于产生对象重组构建物。以下载体通过实例的方式提供并且不应以任何方式解释为是限制性的：细菌的：pbs、phagescript、psix174、pbluescript sk、pbs ks、pnh8a、pnh16a、pnh18a、pnh46a(stratagene,la jolla,calif.,usa)；ptrc99a、pkk223-3、pkk233-3、pdr540、和prit5(pharmacia,uppsala,瑞典)。真核生物的：pwlneo、psv2cat、pog44、pxr1、psg(stratagene)psvk3、pbpv、pmsg和psvl(pharmacia)。
[0167]
表达载体通常具有靠近启动子序列的便利的限制性位点，以提供编码异源蛋白质的核酸序列的插入。在表达宿主中有效的(operative)可选标记物可以存在。合适的表达载体包括但不限于病毒载体(例如基于以下的病毒载体：牛痘病毒；脊髓灰质炎病毒；腺病毒(参见，例如，li等人,invest.opthalmol.vis.sci.(1994)35:2543-2549；borras等人,gene ther.(1999)6:515-524；li和davidson,proc.natl.acad.sci.usa(1995)92:7700-7704；sakamoto等人,h.gene ther.(1999)5:1088-1097；wo 94/12649,wo 93/03769；wo93/19191；wo 94/28938；wo 95/11984和wo 95/00655)；腺相关病毒(参见，例如，ali等人,hum.gene ther.(1998)9:81-86,flannery等人,proc.natl.acad.sci.usa(1997)94:6916-6921；bennett等人,invest.opthalmol.vis.sci.(1997)38:2857-2863；jomary等人,gene ther.(1997)4:683 690,rolling等人,hum.gene ther.(1999)10:641-648；ali等人,hum.mol.genet.(1996)5:591-594；srivastava in wo 93/09239,samulski等人,j.vir.(1989)63:3822-3828；mendelson等人,virol.(1988)166:154-165；和flotte等人,proc.natl.acad.sci.usa(1993)90:10613-10617)；sv40；单纯疱疹病毒；人免疫缺陷病毒
(参见，例如，miyoshi等人,proc.natl.acad.sci.usa(1997)94:10319-23；takahashi等人,j.virol.(1999)73:7812-7816)；逆转录病毒载体(例如，鼠白血病病毒、脾坏死病毒、和源自以下逆转录病毒的载体：如劳斯肉瘤病毒、哈维肉瘤病毒、禽白血病病毒、人免疫缺陷病毒、骨髓增生肉瘤病毒、和乳腺肿瘤病毒)；等等。
[0168]
适合使用的其它表达载体是，例如，但不限于慢病毒载体、γ逆转录病毒载体、泡沫病毒载体、腺相关病毒载体、腺病毒载体、痘病毒载体、疱疹病毒载体、工程改造的杂合病毒载体、转座子介导的载体等。病毒载体技术在本领域是公知的，并且例如在sambrook等人,2012,molecular cloning:a laboratory manual,第1-4卷,cold spring harbor press,ny)和其它病毒学和分子生物学手册中描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、和慢病毒。
[0169]
总体上，合适的载体包含在至少一种生物体中具有功能的复制起始点、启动子序列、便利的限制性核酸内切酶位点、和一个或多个可选标记物(例如，wo 01/96584；wo01/29058；和美国专利号6,326,193)。
[0170]
在一些实施方式中，表达载体(例如，慢病毒载体)可用于将核酸导入到宿主细胞中。因此，本发明的表达载体(例如，慢病毒载体)可包含编码多肽的核酸。在一些实施方式中，表达载体(例如，慢病毒载体)将包含将辅助其中所编码的多肽的功能表达的其它元件。在一些实施方式中，包含编码多肽的核酸的表达载体进一步包含哺乳动物启动子。在一个实施方式中，载体进一步包含延长因子-1-α启动子(ef-1α启动子)。ef-1α启动子的使用可提高下游转基因表达的效率。生理启动子(例如，ef-1α启动子)不太可能诱导整合介导的基因毒性，而可能废除逆转录病毒载体转化干细胞的能力。适用于载体(例如，慢病毒载体)的其它生理启动子对本领域技术人员是已知的，并且可并入到本发明的载体中。在一些实施方式中，载体(例如，慢病毒载体)进一步包含可提供可提高滴定度和基因表达的非必需顺式作用序列。非必需顺式作用序列的一个非限制实例是中心多聚嘌呤区(central polypurine tract)和中心终止序列(cppt/cts)，其对高效逆转录和核输入是很重要的。其它非必需顺式作用序列对本领域技术人员是已知的，并且可并入到本发明的载体(例如，慢病毒载体)中。在一些实施方式中，载体进一步包含转录后调控元件。转录后调控元件可提高rna转录、提高转基因表达和稳定rna转录物。转录后调控元件的一个实例是土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(wpre)。因此，在一些实施方式中，本发明的载体进一步包含wpre序列。各种转录后调控元件对本领域技术人员是已知的，并且可并入到本发明的载体(例如，慢病毒载体)中。本发明的载体可进一步包含其它元件，如用于rna运输、包装序列的rev应答元件(rre)，和5’和3’长末端重复序列(ltr)。术语“长末端重复序列”或“ltr”是指碱基对的位于逆转录病毒dna末端的包含u3、r和u5区域的结构域。ltr总体上提供逆转录病毒基因表达(例如，启动、起始和基因转录物的聚腺苷酸化)和病毒复制所需的功能。在一个实施方式中，本发明的载体(例如，慢病毒载体)包括3’u3缺失的ltr。因此，本发明的载体(例如，慢病毒载体)可包含本文所述的元件的任意组合，以增强转基因的功能表达的效率。例如，本发明的载体(例如，慢病毒载体)除编码car的核酸外可包括wpre序列、cppt序列、rre序列、5’ltr、3’u3缺失的ltr’。
[0171]
本发明的载体可以是自失活载体。如本文所用，术语“自失活载体”是指3’ltr增强启动子区(u3区)已被修饰(例如，通过缺失或取代)的载体。自失活载体可防止病毒转录超
出第一轮病毒复制。因此，自失活载体能够感染，然后仅一次就能整合到宿主基因组(例如，哺乳动物基因组)中，并且无法进一步去除(passed)。因此，自失活载体可大大地降低产生具有复制能力的病毒的风险。
[0172]
在一些实施方式中，本发明的核酸可以是rna，例如，体外合成的rna。用于体外合成rna的方法是本领域技术人员已知的；可以使用任何已知的方法来合成包含编码本公开的多肽的序列的rna。用于将rna导入到宿主细胞的方法是本领域已知的。参见，例如，zhao等人cancer res.(2010)15:9053。将包含编码本公开的多肽的核苷酸序列的rna导入到宿主细胞可在体外或离体或者体内实施。例如，可用包含编码本公开的多肽的核苷酸序列的rna将宿主细胞(例如，nk细胞、细胞毒性t淋巴细胞等)体外或离体电穿孔。
[0173]
为了评估多肽或其部分的表达，待导入细胞的表达载体还可以包含可选标记基因或报告基因，或两者，以便于从寻求通过病毒载体转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在一些实施方式中，可选标记物可携带在单独的dna片段上并在共转染程序中使用。可选标记物和报告基因的两侧都可以有适当的调控序列，以能够在宿主细胞中表达。有用的可选标记物非限制地包括抗生素抗性基因。
[0174]
报告基因用于鉴定潜在转染的细胞和用于评价调控序列的功能性。一般来说，报告基因是不存在于受体生物体或组织中或由其表达的编码多肽的基因，该多肽的表达通过某些易于检测的特性(例如，酶活性)来表现。报告基因的表达在dna导入受体细胞后的适当时间进行评估。合适的报告基因可非限制地包括编码萤光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶的基因，或绿色荧光蛋白基因(例如，ui-tei等人,2000febs letters 479:79-82)。
[0175]
在一些实施方式中，提供本公开的核酸用于例如在宿主细胞中产生如本文所述的多肽。在一些实施方式中，本公开的核酸提供对编码多肽的核酸的扩增。
[0176]
d.使用方法
[0177]
本文公开的抗fap抗体、结合多肽和scfv也可用于诊断和成像应用。
[0178]
例如，本文所述的抗fap抗体可用于使用本领域技术人员已知的经典免疫组织学方法，包括免疫测定，如酶联免疫吸附测定(elisa)、免疫沉淀、蛋白质印迹法、或免疫组织化学测定生物样品中的fap蛋白水平。合适的抗体测定标记是本领域已知的并且包括但不限于酶标记，如葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶；放射性同位素，如碘(
125
i,
121
i)、碳(
14
c)、硫(
35
s)、氚(3h)、铟(
121
in)和锝(
99
mtc)；发光标记，如鲁米诺；和荧光标记，如荧光素和罗丹明，以及生物素。此类标记可用于标记本文所述的结合多肽、抗体、或其抗原结合片段(例如scfv)。
[0179]
可选地，识别本文所述的抗fap抗体或其抗原结合片段的第二抗体可被标记并与抗fap抗体或其抗原结合片段组合使用以检测fap蛋白水平。在一个实施方式中，本发明涉及本发明的抗fap抗体用于在体外测定和/或检测生物样品中或在体内测定和/或检测对象中的fap蛋白水平的应用。
[0180]
fap蛋白表达水平的测定意图包括直接(例如，通过测定或估计绝对蛋白水平)或相对(例如，通过与第二生物样品中的疾病相关蛋白水平进行比较)定性或定量测量或估计第一生物样品中fap蛋白的水平。可以测量或估计第一生物样品中的fap多肽表达水平并与标准fap蛋白水平进行比较。所述标准可以取自从未患有该障碍的个体获得的第二生物样
品，或者可以通过对未患有该障碍的个体群体的水平进行平均来确定。如本领域将要理解的，一旦“标准”fap多肽水平已知，其就可以重复作为比较标准来使用。
[0181]
本文所述的抗fap抗体或其抗原结合片段可用于预后、诊断、监测、或筛选应用，包括对技术人员而言是公知和标准的体外和体内应用并且是基于本描述的。
[0182]
用于体外评估和评价免疫系统状态和/或免疫应答的预后、诊断、监测和筛选测定和试剂盒可用于预测、诊断和监测或评价患者样本，包括已知或疑似患有免疫系统功能障碍或疾病或状况，或关于与疾病或状况的治疗有关的所预期或期望的免疫系统应答、抗原响应或疫苗响应的那些患者样本。免疫系统状态和/或免疫应答的评估和评价还用于确定患者对药物的临床试验或对施用特定化疗剂或抗体或其抗原结合片段(包括其组合)相对于不同的试剂或抗体或其抗原结合片段的适合性。此类型的预后和诊断性监测与评估已经在实践中使用抗乳腺癌中her2蛋白的抗体(herceptest
tm
,dako)，其中所述测定还用于评价患者使用进行的抗体疗法。体内应用包括定向的细胞疗法和免疫系统调节以及免疫应答的放射成像。
[0183]
一方面，本发明涉及作为诊断使用的本发明的抗fap抗体和/或药物组合物。
[0184]
一方面，本发明涉及本发明的抗fap抗体和/或药物组合物，其用于预测、诊断和/或监测免疫系统功能障碍和/或癌症的方法中。
[0185]
在一个实施方式中，本发明涉及本发明的抗fap抗体用于通过测定和/或检测体外对象的生物样品中fap蛋白水平来预测、诊断和/或监测对象的免疫系统功能障碍和/或癌症的应用。
[0186]
在一个实施方式中，抗fap抗体或其抗原结合片段可用于活检样品的免疫组织化学。在另一个实施方式中，抗fap抗体或其抗原结合片段可用于检测fap的水平，或在其膜表面含有fap的细胞的水平，然后所述水平可与某些疾病症状相关联。本文所述的抗fap抗体或其抗原结合片段可携带可检测的或功能性标记。当使用荧光标记时，当前可用的显微术和荧光激活细胞分选仪分析(facs)或本领域已知的两种方法程序的组合可用于鉴定和定量特异性结合成员。
[0187]
本文所述的抗fap抗体或其抗原结合片段可携带荧光标记。示例性荧光标记包括，例如，反应性和缀合的探针，例如氨基香豆素、荧光素和德克萨斯红、alexa fluor染料、cy染料和dylight染料。抗fap抗体或其抗原结合片段可携带放射性标记，例如同位素3h、
14
c、
32
p、
35
s、
36
c1、
51
cr、
52
co、
57
co、
59
fe、
67
cu、
90
y、
99m
tc、
111
in、
117
lu、
121
i、
124
i、
125
i、
131
i、
198
au、
211
at、
213
bi、
225
ac和
186
re。当使用放射性标记时，本领域已知的当前可用的计数程序可用于鉴定和定量抗fap抗体或其抗原结合片段与fap的特异性结合。在标记是酶的情况下，可以通过本领域已知的任意目前使用的比色技术、分光光度技术、荧光分光光度技术、电流测量技术或气体测量技术来完成检测。这可以通过在允许抗体或其抗原结合片段与fap之间形成复合物的条件下使样品或对照样品与抗fap抗体或其抗原结合片段接触来实现。在样品和对照中检测并比较抗体或其抗原结合片段与fap之间形成的任意复合物。鉴于本文所述的抗体对fap的特异性结合，该抗体或其抗原结合片段可用于特异性检测细胞表面上的fap表达。本文所述的抗体或其抗原结合片段也可用于通过免疫亲和纯化来纯化fap。本文还包括测定系统，其可被制备成测试试剂盒形式以用于定量分析例如fap或ctla-4/fap配体复合物的存在程度。系统或测试试剂盒可以包含标记的组分，例如标记的抗体，以及一种或多种
另外的免疫化学试剂。
[0188]
在一个实施方式中，本发明涉及用于测定和/或检测生物样品中的fap蛋白水平的体外方法，包括(1)使样品和任选地对照样品与本发明的抗fap抗体或其抗原结合片段在允许该抗体或其抗原结合片段与fap之间形成复合物的条件下接触，和(2)检测和比较样品和任选地对照中所形成的复合物。
[0189]
在某些实施方式中，通过使用合适的成像技术例如正电子发射断层扫描(pet)检测本文公开的经可检测地标记的抗体，在体内(例如，非侵入性地)测定fap的水平和/或分布。例如，靶抗体-pet或免疫-pet(例如，抗fap pet)可用于检测体内表达靶fap的细胞的水平和/或分布(例如，肿瘤定位)。用于抗体成像(例如，抗体-pet成像)的技术是本领域已知的，例如，如下所描述的：lamberts,l.e.等人(2015)j.clin.oncol.33(doi:10.1200/jco.2014.57.8278)；tavare,r.等人(2014)pnas 111(3):1108-1113；pampaloni等人,j clin oncol 32:5s,2014(suppl；abstr 3084)；和boerman and oyen(2011)the journal of nuclear medicine 52(8):1171-72；美国专利号5,192,525、美国专利号5,219,548、美国专利号5,399,338；所有这些都通过引用并入本文。
[0190]
在一个实施方式中，例如通过检测用pet试剂可检测地标记的抗fap抗体，例如与5-2-(4-异硫氰酸苄基)-1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(5-2-(4-isothiocyanatobenzyl)-1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid)缀合以供
64
cu放射性标记，在体内测定fap的水平和/或分布，例如，如tavare,r.等人(2014)pnas111(3):1108-1113中所描述的。在另一实施方式中，例如通过检测用pet试剂可检测地标记的抗fap抗体，例如对抗体、抗体片段、或靶向fap的多肽进行氟18标记，在体内测定fap的水平和/或分布。在又另一实施方式中，例如通过检测用pet试剂可检测地标记的抗fap抗体，在体内测定fap的水平和/或分布，例如，如美国专利号9,988,452中所描述的。在又另一实施方式中，靶向fap的多肽共价连接至螯合用去铁胺(desferoxamine)至适当的放射性同位素。
[0191]
在其它实施方式中，测定从对象获得的样品(例如，肿瘤活检)中fap的水平(例如，使用免疫组织化学技术)。
[0192]
检测试剂也在本发明的范围内。例如，提供了包括如本文所述的抗fap抗体分子的免疫pet试剂。示例性标记试剂包括但不限于砹211(211at)、溴76(
76
br)、钙47(
47
ca)、碳11(
11
c)、碳14(
14
c)、铬51(
51
cr)、钴-57(
57
co)、钴-58(
58
co)、铜-64(
64
cu)、铒-169(
169
er)、氟-18(
18
f)、氟脱氧葡萄糖(
18
f-fdg)、镓-67(
67
ga)、镓-68(
68
ga)、氢-3(3h)、铟-111(
111
in)、碘-123(
123
i)、碘-124(
124
i)、碘-125(
125
i)、碘-131(
131
i)、铁-59(
59
fe)、氪-81m(
81m
kr)、镥-177(
177
lu)、氮-13(
13
n)、氧-15(
150
)、磷-32(
32
p)、钐-153(
153
sm)、硒75(
75
se)、锶89(89sr)、铊201(
201
t1)、钠22(
22
na)、钠24(
24
na)、锝99m(
99m
tc)、氙133(
133
xe)、钇-86(
86
y)、钇88(
88
y)、钇90(
90
y)、和锆89(
89
zr)。其它示例性标记试剂及其在免疫pet中的应用例如在lamberts,l.e.等人(2015)j.clin.oncol.33(doi:10.1200/jco.2014.57.8278)和boerman与oyen(2011)the journal of nuclear medicine 52(8):1171-72中有所描述。
[0193]
一方面，本发明提供了用于鉴定适合于针对成纤维细胞激活蛋白(fap)的过继性细胞疗法的对象的方法。所述方法包括(a)从对象分离患病组织，(b)使分离的组织与特异性结合fap的结合多肽接触，和(c)检测分离的组织中表达fap的细胞，从而鉴定过继性细胞
疗法的合适的对象。
[0194]
在某些实施方式中，结合多肽包括：重链可变区，其包括三个重链互补决定区(hcdr)的，其中hcdr1包含氨基酸序列gytitsyslh(seq id no:17)，hcdr2包含氨基酸序列einpangdhnfsekfeik(seq id no:17)id no:2)，并且hcdr3包含氨基酸序列lddsrfhwyfdv(seq id no:3)；和轻链可变区，其包括三个轻链互补决定区(lcdr)，其中lcdr1包含氨基酸序列tasssvsymy(seq id no:4)，lcdr2包含氨基酸序列ltsnlas(seq id no:20)，并且lcdr3包含氨基酸序列qqwsgyppit(seq id no:6)。
[0195]
在某些实施方式中，分离的结合多肽包括：重链可变区，其包括三个重链互补决定区(hcdr)，其中hcdr1包含氨基酸序列ytitsyslh(seq id no:1)，和/或hcdr2包含氨基酸序列einpangdhnfsekfeik(seq id no:2)，和/或hcdr3包含氨基酸序列lddsrfhwyfdv(seq id no:3)；和轻链可变区，其包括三个轻链互补决定区(lcdr)，其中lcdr1包含氨基酸序列tasssvsymy(seq id no:4)和/或lcdr2包含氨基酸序列ltsnla(seq id no:5)，和/或lcdr3包含氨基酸序列qqwsgyppit(seq id no:6)。
[0196]
在某些实施方式中，分离的结合多肽包括：重链可变区，其包括三个重链互补决定区(hcdr)，其中hcdr1包含氨基酸序列gytitsyslh(seq id no:17)，和/或hcdr2包含氨基酸序列einpangdhnfsekfeik(seq id no:2)，和/或hcdr3包含氨基酸序列lddsrfhwyfdv(seq id no:3)；和轻链可变区，其包括三个轻链互补决定区(lcdr)，其中lcdr1包含氨基酸序列tasssvsymy(seq id no:4)，和/或lcdr2包含氨基酸序列ltsnlas(seq id no:20)，和/或lcdr3包含氨基酸序列qqwsgyppit(seq id no:6)。
[0197]
在某些实施方式中，分离的结合多肽包括：重链可变区，其包括三个重链互补决定区(hcdr)，其中hcdr1包含氨基酸序列ytitsyslh(seq id no:1)，和/或hcdr2包含氨基酸序列einpangdhnfsekfeikat(seq id no:18)，和/或hcdr3包含氨基酸序列trlddsrfhwyfdv(seq id no:19)；和轻链可变区，其包括三个轻链互补决定区(lcdr)，其中lcdr1包含氨基酸序列tasssvsymy(seq id no:4)，和/或lcdr2包含氨基酸序列ltsnla(seq id no:5)，和/或lcdr3包含氨基酸序列qqwsgyppit(seq id no:6)。
[0198]
在某些实施方式中，分离的结合多肽包括包含如本文所述的三个重链互补决定区hcdr1、hcdr2和hcdr3中的任一个的重链可变区。在某些实施方式中，抗原结合结构域包括包含如本文所述的三个轻链互补决定区lcdr1、lcdr2和lcdr3中的任一个轻链可变区。在某些实施方式中，抗原结合结构域包括本文所述的hcdr1、hcdr2、hcdr3、lcdr1、lcdr2和lcdr3的任意组合。鉴于本文提供的重链和轻链可变区序列，技术人员将能够基于氨基酸编号容易地确定相关的互补决定区。
[0199]
在某些实施方式中，结合多肽包括抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，抗原结合片段选自fab、单链可变片段(scfv)、或单结构域抗体。在某些实施方式中，抗体是全长抗体。在某些实施方式中，抗体或抗原结合片段是人源化抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，结合多肽与治疗分子或诊断分子缀合。在某些实施方式中，诊断分子包含可检测标记。在某些实施方式中，可检测标记是放射性标记、荧光团、酶、半抗原、生物素、或发色团。
[0200]
在某些实施方式中，在对象被鉴别为合适的对象之后，向对象施用过继性细胞疗法。在某些实施方式中，过继性细胞疗法包括修饰的免疫细胞，所述修饰的免疫细胞包含嵌
合抗原受体(car)。在某些实施方式中，免疫细胞是t淋巴细胞。在某些实施方式中，免疫细胞是nk细胞。在某些实施方式中，car特异性结合fap。
[0201]
在某些实施方式中，结合多肽包括重链可变区，所述重链可变区包含与seq id no:7中所示的重链可变区的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，结合多肽包括重链可变区，所述重链可变区包含seq id no:7中所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，结合多肽由重链可变区构成，所述重链可变区由seq id no:7中所示的氨基酸序列构成。在某些实施方式中，结合多肽包括轻链可变区，所述轻链可变区包含与seq id no:9中所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，结合多肽包括轻链可变区，所述轻链可变区包含seq id no:9中所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，结合多肽由轻链可变区构成，所述轻链可变区包含seq id no:9中所示的氨基酸序列。
[0202]
e.治疗方法
[0203]
本文所述的抗体、结合多肽、和scfv可以包括在用于治疗对其需要的对象中的疾病或状况的组合物中。所述组合物可以包括药物组合物并且进一步包括药学上可接受的载体。可以将治疗有效量的药物组合物施用于对象。
[0204]
一方面，本发明提供了用于治疗对其需要的对象中的癌症的方法。所述方法包括向对象施用分离的结合多肽，所述分离的结合多肽包括特异性结合人和犬、和/或鼠成纤维细胞激活蛋白(fap)的表位的抗原结合结构域。在某些实施方式中，结合多肽包括本文所考虑的任意hcdr或lcdr。在某些实施方式中，结合多肽包括：重链可变区，其包含与seq id no:7同一性至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的氨基酸序列；和/或轻链可变区，其包含与seq id no:9同一性至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的氨基酸序列。
[0205]
在某些实施方式中，癌症与表达成纤维细胞激活蛋白(fap)的细胞相关。在某些实施方式中，表达fap的细胞是癌症相关细胞。在某些实施方式中，癌症相关细胞是癌症相关成纤维细胞(caf)。在某些实施方式中，表达fap的癌症相关细胞是表达fap的脂肪细胞。在某些实施方式中，表达fap的癌症相关细胞是肿瘤相关巨噬细胞(tam)。在某些实施方式中，表达fap的癌症相关细胞是肿瘤相关嗜中性粒细胞(tan)。在某些实施方式中，表达fap的癌症相关细胞是骨髓来源抑制细胞(mdsc)。在某些实施方式中，表达fap的癌症相关细胞是癌症起始细胞。
[0206]
在某些实施方式中，结合多肽特异性结合成纤维细胞激活蛋白(fap)。在某些实施方式中，结合多肽包括抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，抗原结合片段选自fab、单链可变片段(scfv)、或单结构域抗体。在某些实施方式中，抗体是全长抗体。在某些实施方式中，抗体或抗原结合片段是人源化抗体或其抗原结合片段。
[0207]
在一些实施方式中，本公开的靶向fap的结合多肽可以与其它治疗剂，例如但不限于免疫疗法(如免疫肿瘤抗体疗法和检查点阻断)、或car-t疗法组合使用。因此，在这样实施方式中，第二多核苷酸序列可包含编码抗癌抗体、检查点阻断分子、或car的多核苷酸序列。
[0208]
本发明的另一方面包括用于治疗对其需要的对象中的癌症的方法，所述方法包
of pharmacy,lippincott williams&wilkins；21st ed.(2005年5月1日)中有更详细的描述。
[0216]
制剂可包括水溶液。制剂或组合物还可包含多于一种的活性成分，活性成分可用于用组合物治疗的特定适应症、疾病或状况，优选活性与所述组合物互补的活性成分，其中各自的活性彼此不产生不利影响。此类活性成分适当地以对预期目的有效的量组合存在。因此，在一些实施方式中，药物组合物进一步包括其它药学活性剂或药物，如化疗剂，例如天门冬酰胺酶、白消安、卡铂、顺铂、柔红霉素、阿霉素、氟尿嘧啶、吉西他滨(gemcitabine)、羟基脲、甲氨蝶呤、紫杉醇、利妥昔单抗(rituximab)、长春花碱、和/或长春新碱。在一些实施方式中，药物组合物含有有效治疗或预防疾病或状况的量(如治疗有效或预防有效量)的组合物。在一些实施方式中，通过对所治疗的对象周期性评估来监测治疗或预防功效。所期望的剂量可通过组合物的单次弹丸施用、组合物的多次弹丸施用，或通过组合物的连续输注施用来递送。
[0217]
制剂包括口服、静脉内、腹膜内、皮下、肺部、经皮、肌肉内、鼻内、口腔、舌下、或栓剂施用的制剂。在一些实施方式中，肠胃外施用组合物。如本文所用，术语“肠胃外”包括静脉内、肌肉内、皮下、直肠、阴道、和腹膜内施用。在一些实施方式中，利用外周全身性递送，通过静脉内注射、腹膜内注射、或皮下注射将组合物施用对象。在一些实施方式中，组合物作为无菌液体制剂提供，例如等渗水溶液、悬浮液、乳液、分散体、或粘性组合物，其在某些方面可缓冲至选定的ph值。液体制剂通常比凝胶、其它粘性组合物和固体组合物更容易制备。另外，液体组合物更便于施用，尤其是通过注射。另一方面，粘性组合物可在适当的粘度范围内配制以提供与特定组织的较长接触时间。液体组合物或粘性组合物可包含载体，其可以是溶剂或分散介质，溶剂或分散介质含有，例如，水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇)及其合适的混合物。
[0218]
无菌可注射溶液可通过将组合物并入溶剂中制备，诸如与合适的载体、稀释剂或赋形剂(如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋糖等)混合。组合物可包含辅助物质，如润湿剂、分散剂或乳化剂(例如，甲基纤维素)、ph缓冲剂、凝胶或粘性增强添加剂、防腐剂、调味剂、和/或色素，这取决于施用途径和所期望的制剂。在某些方面可以参考标准文本来制备合适的制剂。
[0219]
可以添加各种增强组合物的稳定性和无菌性的添加剂，包括抗菌防腐剂、抗氧化剂、螯合剂、和缓冲剂。各种抗菌剂和抗真菌剂，例如，对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚和山梨酸可以确保对微生物作用的预防。通过使用延迟吸收的试剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)可以延长可注射的药物形式的吸收。
[0220]
待用于体内施用的制剂通常是无菌的。无菌性可以很容易地实现，例如通过无菌过滤膜来过滤。
[0221]
本文提到或引用的文章、专利和专利申请以及所有其它文件和可以电子方式获得的信息的内容特此通过引用以其整体并入，其程度与所指示通过引用将每一个独立的出版物具体且独立地并入一样。申请人保留将来自任何此类文章、专利、专利申请、或其它实体和电子文件中的任何以及所有材料和信息实体并入本技术的权利。
[0222]
g.本公开的实施方式
[0223]
一方面，本发明提供了分离的结合多肽，其包含特异性结合人和犬、和/或鼠成纤
维细胞激活蛋白(fap)的表位的抗原结合结构域。
[0224]
在某些实施方式中，抗原结合结构域包括：重链可变区，其包括三个重链互补决定区(hcdr)，其中hcdr1包含氨基酸序列ytitsyslh(seq id no:1)，hcdr2包含氨基酸序列einpangdhnfsekfeik(seq id no:2)，并且hcdr3包含氨基酸序列lddsrfhwyfdv(seq id no:3)；和轻链可变区，其包括三个轻链互补决定区(lcdr)，其中lcdr1包含氨基酸序列tasssvsymy(seq id no:4)，lcdr2包含氨基酸序列ltsnla(seq id no:5)，并且lcdr3包含氨基酸序列qqwsgyppit(seq id no:6)。
[0225]
在某些实施方式中，结合多肽结合成纤维细胞激活蛋白(fap)。在某些实施方式中，结合多肽包括抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，抗原结合片段选自fab、单链可变片段(scfv)、或单结构域抗体。在某些实施方式中，抗体是全长抗体。在某些实施方式中，抗体或抗原结合片段是人源化抗体或其抗原结合片段。
[0226]
在某些实施方式中，结合多肽包括重链可变区，所述重链可变区包含与seq id no:7中所示的重链可变区的氨基酸序列同一性至少80％、85％、90％、95％、96％、96％、97％、98％、99％的氨基酸序列。在某些实施方式中，结合多肽包括重链可变区，所述重链可变区包含seq id no:7中所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，结合多肽由重链可变区构成，所述重链可变区由seq id no:7中所示的氨基酸序列构成。
[0227]
在某些实施方式中，结合多肽包括轻链可变区，所述轻链可变区包含与seq id no:9中所示的氨基酸序列同一性至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％的氨基酸序列。在某些实施方式中，结合多肽包括轻链可变区，所述轻链可变区包含seq id no:9中所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，结合多肽由轻链可变区构成，所述轻链可变区包含seq id no:9中所示的氨基酸序列。
[0228]
另一方面，本发明提供了分离的结合多肽，其包括：重链可变区，其包含seq id no:7中所示的氨基酸序列；和轻链可变区，其包含seq id no:9中所示的氨基酸序列。
[0229]
另一方面，本发明提供单链可变片段(scfv)，其包含特异性结合人和犬、和/或鼠成纤维细胞激活蛋白(fap)的表位的抗原结合结构域。
[0230]
在scfv的某些实施方式中，抗原结合结构域包括：重链可变区，其包括三个重链互补决定区(hcdr)，其中hcdr1包含氨基酸序列ytitsyslh(seq id no:1)，hcdr2包含氨基酸序列einpangdhnfsekfeik(seq id no:2)，并且hcdr3包含氨基酸序列lddsrfhwyfdv(seq id no:3)；和轻链可变区，其包括三个轻链互补决定区(lcdr)，其中lcdr1包含氨基酸序列tasssvsymy(seq id no:4)，lcdr2包含氨基酸序列ltsnla(seq id no:5)，并且lcdr3包含氨基酸序列qqwsgyppit(seq id no:6)，其中重链可变区和轻链可变区由连接体分隔。
[0231]
另一方面，本发明提供了单链可变片段(scfv)，其包括：重链可变区，其包含seq id no:7中所示的氨基酸序列；和轻链可变区，其包含seq id no:9中所示的氨基酸序列，其中重链可变区和轻链可变区由连接体分隔。
[0232]
在scfv的某些实施方式中，连接体包含seq id no:15中所示的氨基酸序列。
[0233]
另一方面，本发明提供了单链可变片段(scfv)，其包含seq id no:11或13中所示的氨基酸序列。另一方面，本发明提供了单链可变片段(scfv)，其由seq id no:11或13中所示的氨基酸序列构成。
[0234]
另一方面，本发明提供了分离的核酸，其编码本文所考虑的任意结合多肽或任意
scfv。
[0235]
另一方面，本发明提供了编码结合多肽的分离的核酸，所述结合多肽包括特异性结合人和犬、和/或鼠成纤维细胞激活蛋白(fap)的表位的抗原结合结构域。
[0236]
在核酸的某些实施方式中，抗原结合结构域包括：重链可变区，其包括三个重链互补决定区(hcdr)，其中hcdr1包含氨基酸序列ytitsyslh(seq id no:1)，hcdr2包含氨基酸序列einpangdhnfsekfeik(seq id no:2)，并且hcdr3包含氨基酸序列lddsrfhwyfdv(seq id no:3)；和轻链可变区，其包括三个轻链互补决定区(lcdr)，其中lcdr1包含氨基酸序列tasssvsymy(seq id no:4)，lcdr2包含氨基酸序列ltsnla(seq id no:5)，并且lcdr3包含氨基酸序列qqwsgyppit(seq id no:6)。
[0237]
在核酸的某些实施方式中，结合多肽包括抗体或其抗原结合片段。在核酸的某些实施方式中，抗原结合片段选自fab、单链可变片段(scfv)、或单结构域抗体。在核酸的某些实施方式中，抗体是全长抗体。在核酸的某些实施方式中，抗体或抗原结合片段是人源化抗体或其片段。
[0238]
在核酸的某些实施方式中，重链可变区由包含与seq id no:8具有至少80％、85％、90％、95％、96％、96％、97％、98％、99％同一性的多核苷酸序列的核酸编码。在核酸的某些实施方式中，重链可变区由包含seq id no:8中所示的多核苷酸序列的核酸编码。在核酸的某些实施方式中，其中重链可变区由核酸编码，所述核酸由seq id no:8中所示的多核苷酸序列构成。
[0239]
在核酸的某些实施方式中，轻链可变区由核酸编码，所述核酸包含与seq id no:10中所示的轻链可变区的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、96％、97％、98％、99％同一性的多核苷酸序列。在核酸的某些实施方式中，轻链可变区由包含seq id no:10中所示的多核苷酸序列的核酸编码。在核酸的某些实施方式中，轻链可变区由核酸编码，所述核酸由seq id no:10中所示的多核苷酸序列构成。
[0240]
另一方面，本发明提供了编码结合多肽的分离的核酸，所述结合多肽包括由包含seq id no:8中所示的多核苷酸序列的核酸序列编码的重链可变区；和由包含seq id no:10中所示的多核苷酸序列的核酸序列编码的轻链可变区。
[0241]
另一方面，本发明提供了分离的核酸，其编码单链可变片段(scfv)，所述单链可变片段(scfv)包括：重链可变区，其包括三个重链互补决定区(hcdr)，其中hcdr1包含氨基酸序列ytitsyslh(seq id no:1)，hcdr2包含氨基酸序列einpangdhnfsekfeik(seq id no:2)，并且hcdr3包含氨基酸序列lddsrfhwyfdv(seq id no:3)；和轻链可变区，其包括三个轻链互补决定区(lcdr)，其中lcdr1包含氨基酸序列tasssvsymy(seq id no:4)，lcdr2包含氨基酸序列ltsnla(seq id no:5)，并且lcdr3包含氨基酸序列qqwsgyppit(seq id no:6)。
[0242]
另一方面，本发明提供了分离的核酸，其编码单链可变片段(scfv)，所述单链可变片段(scfv)包括：重链可变区，其包含seq id no:8中所示的核苷酸序列；和轻链可变区，其包含seq id no:10中所示的核苷酸序列，其中重链可变区和轻链可变区由连接体分隔。在某些实施方式中，连接体包含seq id no:15中所示的氨基酸序列。
[0243]
另一方面，本发明提供了分离的核酸，其编码包含seq id no:12或14中所示的多核苷酸序列的单链可变片段(scfv)。另一方面，本发明提供了分离的核酸，其编码由seq id no:12或14中所示的多核苷酸序列构成的单链可变片段(scfv)。
no:9中所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，结合多肽包括轻链可变区，所述轻链可变区包含seq id no:9中所示的氨基酸序列。在某些实施方式中，结合多肽由轻链可变区构成，所述轻链可变区包含seq id no:9中所示的氨基酸序列。
[0258]
另一方面，本发明提供了用于治疗对其需要的对象中的癌症的方法。所示方法包括向对象施用分离的结合多肽，所述分离的结合多肽包括：重链可变区，其包含与seq id no:7同一性至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的氨基酸序列；和轻链可变区，其包含与seq id no:9同一性至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、或100％的氨基酸序列。
[0259]
在某些实施方式中，癌症与表达成纤维细胞激活蛋白(fap)的细胞相关。在某些实施方式中，表达fap的细胞是癌症相关细胞。在某些实施方式中，癌症相关细胞是癌症相关成纤维细胞(caf)。在某些实施方式中，表达fap的癌症相关细胞是表达fap的脂肪细胞。在某些实施方式中，表达fap的癌症相关细胞是肿瘤相关巨噬细胞(tam)。在某些实施方式中，表达fap的癌症相关细胞是肿瘤相关嗜中性粒细胞(tan)。在某些实施方式中，表达fap的癌症相关细胞是骨髓来源抑制细胞(mdsc)。在某些实施方式中，表达fap的癌症相关细胞是癌症起始细胞。
[0260]
在某些实施方式中，结合多肽特异性结合成纤维细胞激活蛋白(fap)。在某些实施方式中，结合多肽包括抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中，抗原结合片段选自fab、单链可变片段(scfv)、或单结构域抗体。在某些实施方式中，抗体是全长抗体。在某些实施方式中，抗体或抗原结合片段是人源化抗体或其抗原结合片段。
[0261]
另一方面，本发明提供了用于治疗对其需要的对象中的癌症的方法，包括：(a)将对象鉴定为合适的对象，其中鉴定包括(i)从对象分离患病组织；(ii)使分离的组织与特异性结合fap的结合多肽接触；和(iii)检测分离的组织中表达fap的细胞；和(b)向合适的对象施用包括修饰的t细胞的过继性细胞疗法，所述修饰的t细胞包含特异性结合成纤维细胞激活蛋白(fap)的嵌合抗原受体(car)。
[0262]
尽管已经参照其具体实施方式描述了本发明，但是本领域技术人员应该理解，在不背离本发明的真实精神和范围的情况下，可以做出各种改变和等同物替换。对于本领域技术人员而言将显而易见的是，在不脱离本文所公开的实施方式的范围的情况下，可以使用合适的等同物对本文描述的方法进行其它合适的修改和改编。另外，可以做出许多修改以使特定情况、材料、物质组成、过程、一个或多个工艺步骤适应本发明的目的、精神和范围。所有这些修改都旨在落入所附权利要求的范围内。现在已经详细描述了某些实施方式，通过参考以下实例将会对其更清楚地了解，这些实施方式仅出于说明的目的被包括在内而不旨在限制。
[0263]
实验实施例
[0264]
通过参考以下实验实施例进一步详细描述本发明。提供这些实施例仅仅是为了说明的目的，而不旨在限制，除非另有说明。因此，本发明绝不应被解释为受限于以下实施例，而是应被解释为涵盖由于本文提供的教导而显而易见的任何和所有改动。
[0265]
无进一步描述时，认为本领域的普通技术人员能够利用前文描述和下文示例性实施例来制备和应用本发明的化合物以及实践请求保护的方法。因此，下文工作实施例具体
地指出了本发明的优选实施方式，而不被解释为以任何方式限制本公开的其余部分。
[0266]
现对本文公开的实验的执行中所使用的材料和方法进行描述。
[0267]
犬fap基因序列的生物信息学推断：使用犬fap的ncbi预测序列(xm_005640252.2)设计pcr引物。得到的pcr产物在蛋白质水平上与预测序列100％匹配。在核苷酸水平上t127和a603有两个保守的碱基对置换。
[0268]
犬fap cdna pcr、亚克隆和表达：用1ml trizol(life technologies,#15596-026)处理汇合的10cm培养皿的表达内源fap的犬sk骨肉瘤细胞，并按照制造商方案提取总rna。使用superscript first strand合成试剂盒(life technologies,#11904-018)从5μg总rna中逆转录cdna。此cdna充当降落pcr的模板，使用以下引物：正向5’atgtagacgtggttaaaaattg(seq id no:37)；反向5’cgtcatcttcagtcggacaa(seq id no:38)。在1％琼脂糖凝胶上检测到2291bp的扩增子。
[0269]
将得到的pcr产物纯化并克隆到pgem-t easy(promega)中并测序。此穿梭载体是线性化的并且包含单一“t”突出端。这允许利用通过taq聚合酶添加到pcr产物中的3
’“
a”突出端对pcr产物进行简单的非定向克隆。在此基础上，使用ecori克隆位点将cdna非定向地克隆到质粒pcdna3.1中。
[0270]
使用spei切除cdna并使用xbai打开plenti6/v5-d-topo，将犬fap cdna从pcdna3.1亚克隆到慢病毒质粒(plenti6/v5-d-topo)中。这些限制位点具有兼容的末端。这样产生了犬fap.plenti6/v5-d-topo。
[0271]
将犬fap.plenti/v5-d-topo与包装质粒(pmd2.g,pcmvδr8.2)共转染到hek 293细胞中。48小时后收获含有病毒的上清液。通过p24 elisa测定病毒滴度，并以0.5:1至10:1的不同moi’s转导balb/c 3t3成纤维细胞。
[0272]
利用流式细胞术确认balb/c 3t3.犬fap中转基因的表达。使用的一抗是来自r&dsystems的生物素化绵羊抗hufap多克隆抗体(5μg/ml)。二抗是来自biolegend的apc-链霉亲和素(1μg/ml)。
[0273]
免疫和杂交瘤生成：用表达全长犬fap的balb/c 3t3细胞免疫14周龄的balb/c.fap-\-小鼠。所有注射均在腹膜内给予并且由0.5ml无菌pbs中的1x107个细胞构成。初始免疫后在第14天和第28天加强；然后在第42天使动物流血，之后在第56天加强，在第63天流血，并在第70、217和238天再加强三次。2017年第241天收获脾脏，制备单细胞悬液，并通过upenn杂交瘤core facility将脾细胞与sp2/0细胞融合。使用杂交瘤上清液作为一抗并用af488山羊抗小鼠igg作为二抗，最初通过facs在mc kosa亲本(fap无效)vs.表达犬fap转基因的mc kosa.k9fap上筛选杂交瘤上清液。克隆4g5被鉴定为对所转导的细胞而非亲本细胞有反应，并在其它细胞上进行筛选以确认与表达fap的细胞而非fap阴性细胞的反应性：人原代成纤维细胞、表达鼠或人fap转基因的balb/c 3t3、犬原代成纤维细胞、sk kosa(表达fap)、和balb/c 3t3(fap阴性)细胞。然后使用thermo fisher rapid elisa小鼠mab分型试剂盒#37503确定4g5为igg1k同种型抗体
[0274]
实施例1：用于设计pcr引物的犬fap基因序列的生物信息学推断
[0275]
作为第一步，通过pcr扩增犬fap基因的序列。使用犬fap的ncbi预测序列(xm_005640252.2)设计犬fap特异性pcr引物。得到的pcr产物在蛋白质水平上与犬fap的序列100％匹配(图1)。随后的测序显示犬fap在核苷酸水平上于t127和a603处具有两个保守的
碱基对置换。
[0276]
实施例2：犬fap cdna pcr、亚克隆、测序和表达
[0277]
作为生成抗犬fap抗体的第一步，创建了能够生成重组犬fap蛋白的构建物。为了提供犬fap cdna，对表达内源fap的犬sk骨肉瘤细胞进行基于trizol的rna提取，然后将分离的rna逆转录为cdna。此cdna用作降落pcr的模板，其产生2291bp的扩增子。将扩增的pcr产物纯化并克隆到穿梭载体中，这允许对pcr产物进行简单的非定向克隆。在此基础上，将cdna克隆到真核表达质粒中(图2a)。然后将犬fap cdna亚克隆到慢病毒质粒中以允许转导入哺乳动物细胞系中(图2b)。然后将得到的犬fap-慢病毒构建物与包装质粒共转染到hek 293细胞中。然后48小时后收获含有病毒的上清液。通过p24 elisa测定病毒滴度，并以0.5:1至10:1的不同moi转导balb/c来源的3t3成纤维细胞。利用流式细胞术确认3t3-犬fap细胞中转基因的表达(图2c)。
[0278]
实施例3：免疫、融合和筛选
[0279]
然后用经转导以表达全长犬fap的balb/c 3t3成纤维细胞免疫14周龄的balb/c.fap-\-小鼠。所有注射均在腹膜内给予并且由0.5ml无菌pbs中的1x107个细胞构成。初始免疫之后是在接下来的八个月内以定期间隔进行六次加强免疫。在研究结束时，收集脾脏，并将所得的单细胞悬液用于通过与sp2/0细胞融合生成杂交瘤。然后筛选所得的杂交瘤中产生抗犬fap抗体的杂交瘤。作为初始筛选，通过流式细胞术鉴定能够使表达犬fap转基因的mc kosa细胞染色但不能使fap无效mc kosa亲本细胞染色的产生免疫球蛋白的细胞(图3)。结果，4g5克隆被鉴定为潜在的候选者。后续研究进一步表明，该克隆产生的免疫球蛋白能够使表达fap的人原代成纤维细胞、表达鼠或人fap转基因的balb/c 3t3细胞、犬原代成纤维细胞、和表达fap的sk kosa细胞染色。类似地，4g5免疫球蛋白不能使fap阴性亲本balb/c 3t3细胞染色，进一步表明了其特异性。最后，使用商业的基于elisa的抗体分型试剂盒进一步表征由4g5产生的免疫球蛋白。这些结果证明了4g5是小鼠-igg1-κ同种型抗体(图4a-图4c)。将4g5与小鼠igg1同种型对照进行比较的后续蛋白质凝胶产生了相似的重链和轻链带型，进一步证明了4g5的同种型同一性(图5)。
[0280]
其它实施方式
[0281]
本文对变量的任何定义中的元素罗列记载包括该变量被定义为所列元素中的任何单个元素或组合(或子组合)。本文的实施方式的记载包括作为任何单个实施方式或与任何其它实施方式或其部分组合的实施方式。
[0282]
本文引用的每个专利、专利申请和出版物的公开内容其整体在此通过引用并入本文。虽然已经参考具体实施方式公开了本发明，但显然本领域技术人员可以在未偏离本发明的实际精神和范围的情况下想到本发明的其它实施方式5和变型。所附权利要求意图被解释为包括所有这样的实施方式和等同变型。