低污染抗微生物疫苗的制作方法

低污染抗微生物疫苗
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求2019年11月13日提交的美国临时申请第62/934,925号的优先权，其通过引用整体并入本文。
技术领域
3.本发明涉及包含寡糖β-(1
→
6)-葡糖胺基团的组合物。这些疫苗组合物提供针对具有细胞壁结构的微生物的免疫力，该细胞壁结构包含聚合n-乙酰基-β-(1
→
6)-葡糖胺结构，其中聚合物中高达约20％的所述n-乙酰基被脱乙酰基(“pnag结构”)。


背景技术：

4.包含通过接头与类毒素载体连接的寡糖β-(1
→
6)-葡糖胺抗原的疫苗是已知的。这些疫苗在体内产生抗体，这些抗体对在细胞壁中包含pnag结构的微生物具有细胞毒性。如此产生的抗体与补体和免疫系统的其他组分组合以杀死这些微生物。
5.在美国序列号10/713,790中公开了采用破伤风类毒素作为载体的疫苗，该载体具有与其结合的寡糖的多个拷贝，该专利通过引用整体并入本文。通常，寡糖基团与类毒素的连接是通过共价接头与类毒素上的反应性氨基(例如，在赖氨酸残基上发现的-nh2)连接。尽管该化学方法已确立，但在处理类毒素化学时仍存在许多并发症。
6.首先，破伤风类毒素是通过用一种化学物质如甲醛处理破伤风毒素来制备的，这种化学物质使破伤风毒素无毒但仍具有抗原性。甲醛与毒素上的反应性氨基反应。此外，还添加了例如甘氨酸和赖氨酸的氨基酸，以稳定类毒素并抑制恢复为毒素。其次，除了未反应量的甘氨酸和赖氨酸外，制造过程还导致毒素/类毒素碎片脱落到类毒素组合物中。这些片段包含一个或多个氨基。
7.然后破伤风类毒素与具有两个官能团的间隔臂反应——第一个官能团与类毒素上的反应性氨基组合，与第一个官能团正交的第二个官能团将与苷元上的互补官能团反应。此外，间隔臂增加了待添加的寡糖和类毒素之间的距离。然后将寡糖苷元与装载有间隔臂的破伤风类毒素组合以形成疫苗化合物。这在以下反应方案中进行了说明：
[0008][0009]
其中n表示双功能间隔臂的摩尔数，p表示加入到类毒素的间隔臂-y的数量并且不大于n，q表示与破伤风类毒素组合的接头寡糖基团的数量，前提是q不能大于p。请注意，连接到寡糖的苷元和连接到类毒素的间隔臂组合形成接头。
[0010]
上述反应中的一个问题源于在寡糖苷元与类毒素偶联期间类毒素组合物中这些
含氨基的污染物的存在。具体来说，这些氨基还可以与间隔臂上的第一个反应性官能团反应，然后使间隔臂上的第二个反应性官能团与苷元上的互补官能团反应，从而导致寡糖苷元的损失和生成疫苗组合物中不需要的杂质。这在以下反应中得到说明：
[0011][0012]
其中m是氨基的总含量，m'是被反应氨基的分数并且小于总氨基含量m；m”是与污染物相连的被反应寡糖的分数并且小于m'。
[0013]
这些寡糖-接头-nh-污染物是不希望的，尤其是那些具有约100,000或更小的分子量的污染物。
[0014]
此外，破伤风类毒素易于低聚化，因此类毒素可以单体、二聚体、三聚体和高级的低聚物形式存在(例如，4-10个类毒素单元)。在越来越高的低聚度下，随着基于每个单体的可用表面积由于低聚而减少，基于每个单体的能够与类毒素结合的寡糖的数量减少。因此，类毒素的低聚物(如三聚体和高级的低聚物)是不太理想的。虽然繁琐的纯化过程可以提供单体破伤风类毒素，但这些过程由于单体会随着时间的推移而再次低聚化这一事实而变得复杂。


技术实现要素：

[0015]
在一个实施方案中，本发明提供了一种包含药学上可接受的赋形剂和有效量的疫苗的疫苗组合物，所述疫苗包含至少10个，优选地约10至约40个通过接头连接到破伤风类毒素载体上的低聚-β-(1
→
6)-葡糖胺基团连接的单元，所述低聚物包含3至12个重复的β-(1
→
6)-葡糖胺单元，条件是此类单元的总数量中少于约40数量百分比的单元是n-乙酰化的，
[0016]
其中所述疫苗组合物包含小于3％的可检测杂质，每种杂质的分子量小于100,000；
[0017]
进一步，其中所述组合物包含单体和二聚体类毒素，其中可检测到的高级低聚物少于10％；和
[0018]
更进一步，其中将所述组合物维持在足以抑制类毒素的低聚化而不诱导变性的温度。
[0019]
在一个实施方案中，本发明提供了一种包含药学上可接受的赋形剂和有效量的疫苗的疫苗组合物，所述疫苗包含至少25个，优选地约30至约40个通过接头连接到破伤风类毒素载体上的低聚-β-(1
→
6)-葡糖胺基团连接的单元，所述寡糖基团包含3至12个重复的β-(1
→
6)-葡糖胺单元，条件是此类单元的总数量中少于约40数量百分比的单元是n-乙酰化的，
[0020]
其中所述疫苗组合物包含小于3重量百分比的分子量小于50,000的可检测杂质；
[0021]
进一步，其中所述组合物包含单体和二聚体类毒素，其中可检测到的高级低聚物少于5％，和
[0022]
更进一步，其中将所述组合物维持在足以抑制类毒素的低聚化而不诱导变性的温度。
[0023]
在一个实施方案中，本发明涉及疫苗组合物，其包含药学上可接受的赋形剂和有效量的式i的疫苗化合物：
[0024]
(a-b)
x-c
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀi[0025]
其中a包含3至12个重复的β-(1
→
6)-葡糖胺单元或其混合物，具有下式：
[0026][0027]
b具有下式：
[0028][0029]
其中该式的左边连接在c上，右边连接在a上；并且c是破伤风类毒素；
[0030]
x是约10至约40的整数；
[0031]
y是1至10的整数；和
[0032]
r是氢或乙酰基，前提是不超过40％的r基团是乙酰基，
[0033]
其中所述组合物包含小于3％的具有约100,000或更小的分子量的可检测杂质；
[0034]
进一步，其中所述组合物包含单体和二聚体类毒素，其中可检测到的高级低聚物少于约5％，
[0035]
更进一步，其中将所述组合物维持在足以抑制类毒素的低聚化而不诱导变性的温度。
[0036]
在上述疫苗组合物的一个实施方案中，其中使用的疫苗化合物由式ii表示：
[0037]
(a
′‑
b)
x-c
ꢀꢀꢀꢀꢀꢀꢀ
ii
[0038]
其中a
′
是下式的五-β-(1
→
6)-葡糖胺(碳水化合物配体)基团：
[0039]
[0040]
并且b、c和x如上所定义。
[0041]
在一个实施方案中，本发明的疫苗为患者提供了对在细胞壁中包含聚合n-乙酰基-β-(1
→
6)-葡糖胺基团的微生物的有效免疫力，其中聚合物中高达约20％的所述n-乙酰基基团被脱乙酰基。
[0042]
在一个实施方案中，本发明提供了一种为患者赋予对在细胞壁中包含聚合n-乙酰基-β-(1
→
6)-葡糖胺基团的微生物的有效免疫力的方法，其中聚合物中高达约20％的所述n-乙酰基基团被脱乙酰基，该方法包括将本文所述的药物组合物施用于所述患者。
[0043]
本发明的代表性疫苗化合物列于下表：
[0044][0045][0046]
[0047]
在一个实施方案中，本发明的组合物包含不超过约0.5重量百分比的粒径小于1微米的连接寡糖的污染物，其中所述重量百分比基于疫苗化合物的重量。
附图说明
[0048]
图1说明了化合物17的1h nmr(如下所述)。
[0049]
图2说明了化合物17的
13
c nmr。
[0050]
图3提供了二硫化物化合物16转化为二当量单硫化物化合物17的hplc曲线。
具体实施方式
[0051]
本发明提供了包含寡糖β-(1
→
6)-葡糖胺基团的药物组合物。
[0052]
本文所述的疫苗组合物为患者提供了针对微生物感染的有效免疫力，其中所述微生物在其细胞壁中包含低聚n-乙酰基-β-(1
→
6)-葡糖胺结构，其中聚合物中高达约20％的所述n-乙酰基被脱乙酰基。
[0053]
在更详细地描述本发明之前，首先定义以下术语。如果本文中使用的术语未定义，则具有其普遍接受的科学或医学含义。
[0054]
本文使用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，并不旨在限制本发明。如本文所用，单数形式“一”、“一个”和“该”旨在也包括复数形式，除非上下文另有明确指示。
[0055]“任选的”或“任选地”意思是随后描述的事件或情况可能发生，也可能不发生，并且该描述包括该事件或情况发生的情形以及该事件或情况不发生的情形。
[0056]
当在数字名称(例如温度、时间、量、浓度等，包括一个范围)之前使用的术语“约”表示可以变化(+)或(-)10％、5％、1％或它们之间的任何子范围或子值的近似值。优选地，术语“约”在用于剂量时是指剂量可以变化+/-10％。
[0057]“包含(comprising)”或“包含(comprises)”旨在表示组合物和方法包括所列举的元素，但不排除其他元素。当用于定义组合物和方法时，“基本上由...组成”是指排除对用于所述目的的组合具有任何基本意义的其他元素。因此，基本上由本文定义的元素组成的组合物不排除不会实质影响要求保护的发明的基本和新颖特征的其他材料或步骤。“由
……
组成”应表示排除其他成分的痕量元素和实质性方法步骤。由这些过渡术语中的每一个定义的实施方案都在本发明的范围内。
[0058]
如本文所用，“可检测杂质百分比”是面积百分比。这不包括高级的低聚物。评估面积百分比的测定在下面的实施例6中给出。通过例如尺寸排阻色谱分析将杂质评估为它们在总面积中所占的百分比。可以通过尺寸排阻色谱法和其他分子量截止过滤方法来分离和控制所提及的杂质。缓冲盐、ph值和工艺条件可用于确保期望的特性、质量和稳定性。
[0059]
如本文所用，“抑制疫苗中类毒素的低聚化而不诱导变性”部分是指使用单体和/或二聚体类毒素疫苗进行工作的操作参数。例如，当本文公开的疫苗组合物在约2℃至约8℃范围内的温度下储存时，单体和/或二聚体类毒素可表现出对抗低聚化的长期稳定性。在一些实施方案中，当组合物在0℃或更低温度下储存时，本文公开的疫苗组合物可能发生变性。同样，如果疫苗组合物储存在高于8℃或更可能高于20℃的温度下，则可能发生单体和/或二聚体类毒素的低聚化。
[0060]
如本文所用，“可检测杂质”是指由类毒素降解产生的低分子量杂质(分子量小于
100,000)，并且可以通过使用检测器的色谱分离来测量。在实施方案中，色谱分离可以通过过滤、尺寸排阻色谱等进行。检测器可以采用uv检测手段、折射率等。类似地，“可检测的高级低聚物的百分比”可以通过与检测联用的色谱技术以类似的方式确定。
[0061]
如本文所用，“连接寡糖且含氨基的污染物”是指由于存在痕量的低分子量杂质而可能形成的两种形式的污染物。连接寡糖的污染物包括在类毒素制剂中存在的降解杂质和用于将寡糖连接到类毒素的连接试剂之间形成的加合物。因此，连接寡糖的污染物包括来自类毒素制剂的含胺降解产物，该降解产物通过降解产物的一个或多个氨基连接到构成接头的间隔臂，以及最终连接到远离污染物氨基的间隔臂的寡糖。这些副产物加合物消耗旨在与单体和/或二聚体类毒素反应的试剂，从而耗尽试剂的供应。试剂中的任何缺陷都可能导致第二种形式的污染物，即“含氨基污染物”，它们是位于最终疫苗组合物的类毒素上的未反应氨基。本文提供了通过本文所述的分阶段过滤方法使这些产物最小化的实施方案。
[0062]
术语“β-(1
→
6)-葡糖胺单元”或“葡糖胺单元”是指如下的单独葡糖胺结构：
[0063][0064]
其中6-羟基与前面的葡糖胺单元的1个羟基缩合，并且其中虚线表示与前面和后面的葡糖胺单元的结合位点。当与另一个“β-(1
→
6)-葡糖胺单元”组合时，所得二糖具有以下结构：
[0065][0066]
术语“具有n-乙酰基的β-(1
→
6)-葡糖胺单元”是指以下结构：
[0067][0068]
其中第二个单元的6-羟基与前面的葡糖胺单元的1-羟基缩合。
[0069]
术语“包含β-(1
→
6)-葡糖胺基团的寡糖”是指疫苗化合物上模拟病原菌细胞壁的一部分的基团，其被定义为“寡糖β-(1
→
6)-葡糖胺结构”(定义如下)。同样，此类基团限于3至12个β-(1
→
6)-葡糖胺单元，其中高达40％的所述单元可具有n-乙酰基。在一个实施方案中，少于30％的所述β-(1
→
6)-葡糖胺单元是n-乙酰化的。在另一个实施方案中，少于20％的所述β-(1
→
6)-葡糖胺单元是n-乙酰化的。此外，在另一个实施方案中，少于10％的所述β-(1
→
6)-葡糖胺单元是n-乙酰化的。然而，在另一个实施方案中，所述β-(1
→
6)-葡糖胺单元没有一个是n-乙酰化的。
[0070]
术语“包含n-乙酰基β-(1
→
6)-葡糖胺结构的寡糖”或“包含n-乙酰基β-(1
→
6)-葡糖胺结构的多糖”是指在微生物细胞壁中发现的那些结构，其中聚合物中高达约20％的所
述n-乙酰基被脱乙酰基。微生物壁包含大量这些结构，这些结构在许多微生物系中都是保守的。这些结构主要是n-乙酰基β-(1
→
6)-葡糖胺，但由于酶如聚-β-1,6-d-葡糖胺-n-脱乙酰酶的作用而包括脱乙酰糖的区域。因此，本发明的疫苗产生的抗体包括那些靶向这类脱乙酰寡糖区域的抗体。不受任何理论的限制，针对此类脱乙酰糖的抗体在体内针对此类微生物具有细胞毒性。
[0071]
如本文所用，术语“疫苗组合物”或“药物组合物”是指包含上述式i和ii的化合物的药物组合物，包括佐剂和药物载体。这些组合物还包含有限量的连接寡糖和含氨基的污染物，包括其中此类污染物的量不超过3％，优选地小于2％，更优选地小于1％的那些。这些组合物提供针对任何在其细胞壁中包含具有n-乙酰基-β-(1
→
6)-葡糖胺结构的寡糖/多糖的微生物的有效免疫力。因此，与针对单一细菌接种的经典疫苗不同，本文所述的疫苗组合物能够提供针对具有本文所述的寡糖结构的任何微生物的有效免疫力。此类微生物包括但不限于革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、抗生素抗性细菌(例如，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)、真菌等。
[0072]
如本文所用的术语“有效免疫力”是指确定量的疫苗组合物在体内产生足以治疗、预防或改善微生物感染的抗体反应的能力，其中所述微生物在其细胞壁中含有包含n-乙酰基-β-(1
→
6)-葡糖胺的寡糖/多糖。
[0073]
疫苗化合物是指式i和ii的化合物。这些化合物可能以溶剂化物形式存在，尤其是水合物。水合物可在化合物或包含这些化合物的组合物的制造过程中形成，或者由于化合物的吸湿性，水合物可随时间形成。本发明的化合物也可以作为有机溶剂化物存在，包括dmf、醚和醇溶剂化物等。任何特定溶剂化物的鉴定和制备在合成有机或药物化学的普通技术人员的技能范围内。
[0074]
术语“类毒素”是指单体和低聚破伤风类毒素形式。低聚破伤风类毒素组分的存在减少了暴露的反应氨基的平均数量，因为低聚物中每个单体类毒素的表面积因低聚而减少。反过来，这导致与类毒素结合的寡糖的因子较低。本文公开的疫苗组合物包含呈单体和/或二聚体形式的类毒素。在实施方案中，单体与二聚体的比率在约10:1至约1:10、或约5:1至约1:5、或约2:1至约1:2的范围内。
[0075]“受试者”是指哺乳动物。哺乳动物可以是人类或非人类哺乳动物，但优选是人类。
[0076]“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”受试者的疾病或病症是指1)防止该疾病或病症在易患该疾病或病症或尚未表现出该疾病或病症的症状的受试者中发生；2)抑制该疾病或病症或阻止其发展；或3)改善或引起该疾病或病症的消退。
[0077]“有效量”是指本发明的疫苗组合物的量，其足以治疗影响受试者的疾病或病症或防止在所述受试者或患者中出现此类疾病或病症。
[0078]“反应性氨基官能团”是指在破伤风类毒素的赖氨酸和胍侧链上发现但不包括在破伤风类毒素的肽键或酰胺侧链中发现的(例如在谷氨酰胺中发现的)酰胺基(-nhc(o)-)的伯氨基(-nh2)。
[0079]“低分子量氨基化合物”是指作为污染物存在于破伤风类毒素组合物中的含氨基化合物，包括类毒素片段、含有氨基的缓冲剂、反应猝灭剂如赖氨酸、甘氨酸、硫酸铵等、毒素解毒剂如福尔马林，以及与破伤风类毒素接触的其他含氨基试剂。通常，这类低分子量反应性氨基化合物的分子量小于约100,000，优选小于10,000。
[0080]
一般合成方法
[0081]
本发明的化合物可以使用以下一般方法和程序从容易获得的起始原料制备。应当理解，在给出典型或优选的工艺条件(即反应温度、时间、反应物的摩尔比、溶剂、压力等)的情况下，除非另有说明，否则也可以使用其他工艺条件。最佳反应条件可随所用的具体反应物或溶剂而变化，但此类条件可由本领域技术人员通过常规优化程序确定。
[0082]
此外，如对本领域技术人员显而易见的，常规保护基团可能是必要的以防止某些官能团发生不希望的反应。用于各种官能团的合适保护基团以及用于保护和去保护特定官能团的合适条件是本领域公知的。例如，t.w.greene和p.g.m.wuts,protecting groups in organic synthesis,third edition,wiley,new york,1999以及其中引用的参考文献中描述了许多保护基团。
[0083]
用于以下反应的起始原料是通常已知的化合物，或者可以通过已知的程序或其明显的修改来制备。例如，许多起始原料可从商业供应商处获得，例如sigmaaldrich(st.louis,missouri,usa)、bachem(torrance,california,usa)、emka-chemce(st.louis,missouri,usa)。其他起始原料可以通过标准参考文本中描述的程序或其明显修改来制备，例如fieser and fieser’s reagents for organic synthesis,第1-15卷(john wiley,and sons,1991)，rodd’s chemistry of carbon compounds,第1-5卷和增刊(elsevier science publishers,1989)，organic reactions,第1-40卷(john wiley,and sons,1991)，march’s advanced organic chemistry,(john wiley,and sons,第5版,2001)，和larock’s comprehensive organic transformations(vch publishers inc.,1989)。
[0084]
本发明的代表性疫苗化合物的合成
[0085]
本发明的疫苗化合物的一般合成在本领域中是已知的并且公开于美国专利申请序列号10/713,790以及美国专利号7,786,255和8,492,364中，每一个都通过引用以其整体并入本文。
[0086]
在本文所述的疫苗化合物的一个实施方案中，β-(1
→
6)-葡糖胺基团限于4至6个单元，优选5个单元，例如，式i中y＝2至4。
[0087]
在一些实施方案中，化合物是均质的，因为y是选自1至10的单个整数，包括端值。因此，本文公开的化合物可以设计为均质的，其中y＝1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。在一些实施方案中，式i化合物可以设计为异质的，具有两个或更多个y值，例如y＝1和2，或y＝2和y＝3，或y＝3和y＝4，或y＝4和y＝5，或y＝5和y＝6，或y＝6和y＝7，或y＝7和y＝8，或y＝8和y＝9，或y＝9和y＝10的混合物。y的这种配对不必是连续的。因此，化合物可以包括y＝1和y＝3，或y＝1和y＝4，或y＝2和y＝4，或y＝2和y＝5的混合物，以及y为2或更多不同的值的任何组合。在一些实施方案中，化合物可以是异质的，具有3个或更多个y值，或4个或更多个y值，或5个或更多个y值，至多所有10个不同的y值。在一些实施方案中，y的每个取值在式i化合物中是独立的。
[0088]
在一些实施方案中，两种或更多种式i化合物可用于药物组合物中，其中每种单独的式i化合物在y上是均质的，而式i的其他化合物具有不同的y值。在此类实施方案中，所用的均质化合物以限定的重量百分比简单地混合在一起。例如，药物组合物可以包含其中y＝1的式i化合物与其中y为2的式i化合物的混合物。当药物组合物或方法包括式i化合物的异质混合物时，混合物可以是根据每种式i化合物的相对重量百分比定义的混合物。例如，混
合物可以包括50重量百分比的其中y等于1的式i化合物和50重量百分比的其中y等于2的式i化合物。考虑了总计为100％的化合物的任何组合，例如，1、2、3、4、5种或更多种各自具有不同y值的化合物可以与总计为100％的已知相对重量百分比混合。因此，式i化合物的任何重量百分比的组合可用于本文公开的药物组合物和方法。因此，对于两种式i化合物的组合，百分比可以表示为两种化合物的比率并且可以在从0.1:99.9到99.9:0.1的任何范围内，包括端值，以及它们之间的任何值，例如1:99、5:95、10:90、15:85、20:80等直到99:1，包括小数值。类似地，当在药物组合物中使用3、4、5或更多种式i化合物时，每种化合物的相对重量百分比可以从0.1重量百分比变化至最大99重量百分比，前提是不同的式i化合物的总量加起来为100％。
[0089]
接头基团的形成是通过本领域公认的合成技术实现的，这些合成技术通过在美国专利号8,492,364和以下实施例中发现的那些举例说明但不限于它们。在一个实施方案中，苷元的第一部分连接至还原性β-(1
→
6)-葡糖胺单元，保留硫醇(-sh)基团，如下文式iii所示：
[0090][0091]
其中y为1至10的整数，并且任选不超过40％的氨基为n-乙酰基。
[0092]
破伤风类毒素的制备
[0093]
破伤风类毒素可以以不同的纯度在市场上买到，其中类毒素总是含有大量氨基衍生的污染物。这些污染物包括由酶促或水解过程释放的含有氨基官能团的类毒素片段，以及来自在毒素转化为类毒素期间添加的未反应甘氨酸和精氨酸的氨基衍生污染物。
[0094]
除了低分子量污染物外，初始类毒素制剂可能含有不同量的类毒素单体、二聚体、三聚体和高级的低聚物。当存在于类毒素制剂中时，包含三个或更多个单体单元的低聚物损害了产生寡糖的高负载因子的能力。负载因子是连接到给定单体或二聚体类毒素单元的寡糖单元数。令人惊讶地发现，破伤风类毒素单体和二聚体的组合物允许合适的负载因子，避免了将单体类毒素与二聚体类毒素分离的需要。然而，应去除高级低聚物，并且在实施方案中，高级低聚物应占可检测的高级低聚物的不到5％。高级低聚物和低分子量污染物可以通过分阶段(或顺序)过滤去除，同时提供具有可接受的负载因子的产物。在实施方案中，本文公开的纯化类毒素制剂具有至少25，优选至少30的负载因子。较低的负载因子通常是杂质与寡糖连接化学物反应的结果，从而基于使用相对于单体加二聚体类毒素的理论可用位点过量35倍的连接试剂的化学计量，降低了负载因子。请注意，杂质存在的问题并不能简单地通过使用大量过量的试剂来解决。这是因为它既不经济，又会由于寡糖试剂与类毒素的非特异性结合而导致难以处理的纯化问题。
[0095]
在实施方案中，提供了采用分阶段过滤以最小化包括类毒素的高级低聚物的高分子量杂质和包括类毒素降解产物的低分子量杂质的方法。在实施方案中，分阶段过滤的方
法包括用一个或多个3至5微米孔径的过滤器过滤。
[0096]
这些过滤器在通过类毒素的单体和二聚体时捕获高级低聚物。在实施方案中，这样的过滤可以分阶段进行，即可以例如使用5微米过滤器进行第一次过滤，然后通过4微米过滤器过滤，然后通过3微米过滤器过滤。在3微米或更大时，预计类毒素的大部分二聚体和单体将通过过滤器，而过滤材料捕获高级的低聚物。不受理论束缚，假定具有3微米或更大孔径的过滤器将允许类毒素单体或和一些二聚体通过，因为单体的特征在于约2.5微米长和约0.5微米宽。
[0097]
在另一个过滤阶段，可以通过使用孔径为2.5微米或更小的过滤器去除低分子量杂质。在实施方案中，通过使类毒素混合物通过例如2.5微米孔径的过滤器来去除低分子量杂质，其中类毒素的单体和二聚体形式保留在过滤器上并且低分子量杂质通过过滤器。在实施方案中，去除低分子量杂质的第二阶段包括使用2微米过滤器，或在其他实施方案中，使用1.5微米过滤器。在实施方案中，去除低分子量杂质的孔径也可以是分阶段的，例如将孔径从2.5微米减小到1.5微米。
[0098]
在实施方案中，可以在进行任何官能化化学以产生寡糖-类毒素共价加合物之前进行两个过滤阶段以去除高分子量和低分子量杂质。因此，在实施方案中，制备本文公开的疫苗组合物的方法包括使类毒素制剂通过第一过滤器以去除高级低聚杂质，其中二聚体和单体类毒素通过该第一过滤器，然后在通过该第一过滤器之后，使类毒素制剂通过第二过滤器以去除低分子量杂质，其中单体和二聚体类毒素保留在该过滤器上，并且较小分子量的杂质通过该过滤器。在实施方案中，在使用两种过滤器之后，单体和二聚体类毒素混合物与间隔臂反应，该间隔臂将产生接头，然后寡糖可以共价连接至该接头。具有适当孔径的过滤器在本领域中是众所周知的，并且可从spherotech,inc.,lake forest,illinois,usa,www.spherotech.com/contact.htm商购获得。
[0099]
在实施方案中，可以首先通过使用较小的过滤器孔径去除低分子量杂质，然后使用较大的过滤器尺寸去除较高分子量的杂质。
[0100]
在实施方案中，连接寡糖的反应化学可以在任何过滤步骤之间进行。例如，在实施方案中，可以进行第一次过滤以去除小杂质，并且高级低聚物连同单体和二聚体可以与间隔臂反应，然后连接寡糖。然后可以对加合物进行第二阶段过滤以去除高级低聚物。类似地，可以单独去除较高分子量的杂质，然后形成寡糖加合物，然后用第二阶段过滤较低分子量杂质纯化加合物。然而，本领域技术人员将理解，通过在寡糖连接化学之前去除低分子量和高分子量杂质将最大化期望的试剂反应反应的效率，即在单体和/或二聚体类毒素的氨基上的试剂反应。
[0101]
如本领域技术人员将进一步理解的，本文所述的寡糖连接分两步进行，并且分阶段过滤可以在连接间隔臂的第一步之前和/或之后进行。因此，间隔臂可在高分子量过滤、低分子量过滤或两者之后连接。因此，最终的寡糖连接化学可以在任何中间过滤步骤之后进行。污染物的氨基最初与如上所述的间隔物反应形成中间体，该中间体具有与同样如上所述的苷元的反应性以形成含有寡糖的氨基衍生污染物。基于类毒素的重量，这些污染物可以以通常高达20重量百分比的量填充疫苗组合物剩余部分。
[0102]
接头的第二部分以如式iv所示的以下方式连接到破伤风类毒素上。
[0103][0104]
在该式中，破伤风类毒素的单独部分用波浪线表示，仅是说明性的，并不旨在提供类毒素的完整结构。任何二硫键都由连接各部分的单线表示。为清楚起见，仅说明了接头的单个第二部分，而有多个这样的第二部分共价连接到类毒素上的氨基上。
[0105]
当接头的第一部分和第二部分在偶联条件下组合时，形成硫醚键。该反应在惰性稀释剂中任选地在碱存在下进行以清除所产生的酸。硫醚键连接接头的第一部分和第二部分，从而通过组合接头将破伤风类毒素与寡糖β-(1
→
6)-葡糖胺基团共价连接，如下文针对疫苗化合物所示，其中y如本文所定义。
[0106][0107]
其中不超过40％的氨基任选地是n-乙酰基。
[0108]
可以理解的是，连接到破伤风类毒素的β-(1
→
6)-葡糖胺基团-接头基团的数量是化学计量控制的，因此约31到约39个这样的基团与类毒素结合，从而提供了本发明的疫苗化合物。
[0109]
方法、效用和药物组合物
[0110]
本发明的疫苗组合物能够引发针对在细胞壁中具有pnag寡糖β-(1
→
6)-葡糖胺结构的微生物的有效免疫反应。患者接种后，约4周后产生有效的免疫反应。在产生有效的免疫反应后，患者具备针对随后微生物感染的保护，其中有害微生物具有包含pnag的细胞壁。
[0111]
当如此使用时，将本发明的疫苗组合物施用于处于由此类微生物引起的微生物感染风险的患者。仅举例来说，此类患者包括年长者、即将进行选定手术的患者、前往微生物感染爆发的目的地的患者等。疫苗通常与合适的佐剂一起肌肉内施用于具有免疫能力的患者以增强免疫反应。潜伏期过去后，患者获得了对此类微生物的天然免疫力。这种具有免疫
能力的患者具有有效的免疫系统，可以对抗原产生免疫反应。优选地，此类患者具有至少约1000wbc/微升、优选至少约1500wbc/微升、更优选至少约2000wbc/微升、甚至更优选约3000wbc/微升、最优选约4000wbc/微升的活性白细胞计数(wbc)。
[0112]
在另一个实施方案中，本发明的疫苗组合物可治疗性使用，特别是当微生物感染是局部的和/或无生命威胁时。在这种情况下，将本发明的疫苗组合物施用于患有由这类微生物引起的微生物感染的患者。疫苗通常与合适的佐剂一起肌肉内施用于具有免疫能力的患者以增强免疫反应。施用后，在约4周内产生有效的免疫力。如果患者仍然感染，则疫苗产生的天然免疫力有助于康复。
[0113]
当如此使用时，本发明的疫苗组合物以治疗有效量通过任何可接受的用于具有相似效用的药剂的施用方式施用。本发明的疫苗化合物即活性成分的实际量将取决于许多因素，例如待治疗疾病的严重程度、受试者的年龄和相对健康状况、所用疫苗化合物的效力、施用途径和形式，以及技术人员熟知的其他因素。
[0114]
本发明的疫苗化合物的有效量或治疗有效量是指产生足够滴度的抗体以改善受试者的症状或延长生存期的疫苗化合物的量。此类疫苗化合物和疫苗组合物的毒性和治疗功效可以在细胞培养物或实验动物通过标准药学程序确定。
[0115]
本文所述的疫苗组合物通常作为可注射的无菌水性组合物施用，所述水性组合物包含一种或多种本领域熟知的常规成分，包括(仅举例说明)佐剂、稳定剂、防腐剂等。
[0116]
组合
[0117]
本发明的疫苗化合物和组合物可以与主治临床医生认为合适的其他治疗化合物或其他合适的药剂联合使用。在选定的情况下，本发明的疫苗化合物可以与用于治疗细菌感染的抗生素以及增强由疫苗化合物和/或组合物诱导的免疫反应的药剂同时施用。在抗生素的情况下，选择合适的抗生素或抗生素混合物以及给予患者的量完全在主治医生的技能范围内，具体取决于致病细菌的具体情况、细菌感染的程度、患者的年龄、体重和其他相关健康状况。适当时，主治医师可与本文所述的疫苗联合共同施用免疫增强药物或佐剂。
[0118]
本发明的疫苗组合物可以与增强患者对抗原的免疫反应的佐剂一起施用。佐剂包括但不限于铝化合物，例如凝胶、氢氧化铝和磷酸铝，以及弗氏完全或不完全佐剂(例如，其中抗原掺入到稳定的石蜡油包水乳液的水相中)。显然，石蜡油可以用其他类型的油如角鲨烯或花生油代替。其他具有佐剂特性的材料包括bcg(减毒结核分枝杆菌)、磷酸钙、左旋咪唑、异丙肌苷、聚阴离子(例如polya:u)、香菇多糖、百日咳毒素、脂质a、皂苷、qs-21和肽，例如胞壁酰二肽，和免疫刺激性寡核苷酸，例如cpg寡核苷酸。稀土盐，例如镧和铈，也可用作佐剂。所用佐剂的量取决于被治疗的受试者和所用的特定抗原，并且可以由本领域技术人员容易地确定。
[0119]
实施例
[0120]
通过参考以下实施例可以进一步理解本发明，这些实施例旨在仅是举例说明本发明。本发明的范围不受示例性实施方案的限制，这些示例性实施方案仅旨在说明本发明的单个方面。任何功能等效的方法都在本发明的范围内。根据前述描述和附图，除了本文所述的那些之外的本发明的各种修改对于本领域技术人员而言将变得显而易见。此类修改落入所附权利要求的范围内。
[0121]
以下术语在本文中使用并具有以下含义。如果未定义，则缩写具有其通常公认的
定义。
[0122][0123]
aq.＝含水
[0124]
biotage＝biotage,div.dyax corp.,charlottesville,virginia,usa
[0125]
bp＝沸点
[0126]
cad＝带电气溶胶检测器
[0127]
dcm＝二氯甲烷
[0128]
deg＝度
[0129]
dmso＝二甲亚砜
[0130]
eq.＝当量
[0131]
etoac＝乙酸乙酯
[0132]
fep＝氟化乙烯丙烯
[0133]
g＝克
[0134]h1-nmr＝质子核磁共振
[0135]
h＝小时
[0136]
hdpe＝高密度聚乙烯
[0137]
hplc＝高效液相色谱
[0138]
mecn＝乙腈
[0139]
kg＝公斤
[0140]
mbar＝毫巴
[0141]
meoh＝甲醇
[0142]
mg＝毫克
[0143]
ml＝毫升
[0144]
mm＝毫摩尔的
[0145]
mmol＝毫摩尔
[0146]
n＝当量浓度(normal)
[0147]
nbs＝n-溴代琥珀酰亚胺
[0148]
nis＝n-碘代琥珀酰亚胺
[0149]
nmt＝n-甲基色胺
[0150]
pp＝聚丙烯
[0151]
qhnmr＝定量质子核磁共振
[0152]
rbf＝圆底烧瓶
[0153]
ro＝反渗透
[0154]
sec hplc＝尺寸排阻色谱hplc
[0155]
sim＝二次离子质量
[0156]
tcep＝三(2-羧乙基)膦
[0157]
tlc＝薄层色谱
[0158]
tmsotf＝1,1,1-三氟-甲磺酸三甲基甲硅烷酯
[0159]
tt＝破伤风类毒素
[0160]
μl＝微升
[0161]
μm＝微米
[0162]
w/w＝重量比重量
[0163]
w/v＝重量比体积
[0164]
实施例1-破伤风类毒素分阶段过滤
[0165]
包含单体和二聚体类毒素的粗制破伤风类毒素制剂的样品首先通过3至5微米的过滤器以去除高级低聚物。这可以在减小过滤器孔径的阶段进行。因此，类毒素制剂可以通过5微米过滤器，然后通过3微米过滤器。或者，类毒素制剂可以通过5微米过滤器，然后通过4微米过滤器，然后通过3微米过滤器。通过光散射技术评估5微米过滤的功效，这些技术可用于检测高级低聚物的存在。根据需要，添加分级过滤以进一步去除高级低聚物。所得滤液含有单体和二聚体类毒素。在完全纯化之后进行寡糖连接化学的情况下，滤液然后通过2.5微米过滤器，以使单体和二聚体类毒素作为滤饼分离，而低分子量杂质随滤液通过。在每个过滤步骤(高分子量和低分子量)，可以对滤饼进行冲洗。
[0166]
实施例2-sbap与tt单体的连接
[0167]
步骤1：n-baba的制备：
[0168][0169]
市售的β-丙氨酸(化合物1)通过与至少化学计算量的市售溴乙酰溴反应而转化为n-baba(溴乙酰-β-丙氨酸)(化合物2)。在第一个容器中，将β-丙氨酸与碳酸氢钠或其他合适的碱一起混合到水中，以清除反应过程中产生的酸。在约20
±
5℃下混合水溶液直至获得溶液。然后将溶液保持在约5
±
5℃。在单独的容器中，加入所需量的溴乙酰溴，然后加入二氯甲烷。合并两个容器的内容物。反应完成后，加入6n hcl并混合至ph值约为2。用合适的溶剂如乙酸乙酯从溶液中萃取得到的n-baba。有机层在常规条件下例如在真空和例如60℃的高温下浓缩。然后加入庚烷以沉淀n-baba，然后将其收集在过滤器上并在40℃的真空烘箱中干燥。该产物在下一步中按原样使用。
[0170]
步骤2：sbap的制备：
[0171][0172]
n-baba(化合物2)与n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)在本领域熟知的常规条件下反应生成sbap(化合物3)。特别地，在合适的惰性溶剂如甲醇、乙醇、异丙醇等中，将n-baba与至少化学计算量的nhs组合。将所得溶液在约20
±
5℃下搅拌直至获得澄清溶液。然后将n-二异丙基碳二亚胺加入到反应混合物中并混合产生固体。然后将系统冷却至0
±
5℃，并通过过滤提供所得的sbap。进一步纯化需要预冷异丙醇和庚烷的混合物并洗涤滤饼，然后在约30℃的真空烘箱中干燥湿滤饼。得到的sbap原样用于与tt单体的偶联反应。
[0173]
或者，可以按照美国专利号5,286,846中所述的方式制备sbap，该专利的全部内容
通过引用并入本文。具体地，其中描述的方法由以下合成方案提供：
[0174][0175]
步骤3-缀合
[0176]
如上所述，纯化的tt单体每摩尔含有43个赖氨酸残基，通过游离胺测定法定量。tt单体与浓度从0逐渐增加到170摩尔当量的sbap的反应导致在15-110摩尔当量的sbap范围内游离胺含量相应降低。在sbap负载》110当量时实现了稳态转化。假设游离胺的损失与sbap接头的负载成正比，饱和时的接头密度估计为43摩尔sbap/tt单体。还评估了每个滴定点时的接头tt/单体中间体的单体/聚集体含量和蛋白质浓度。加入接头前的单体含量为99.7％，并且加入越来越多的sbap接头没有显著改变单体水平(未检测到聚集体)。此外，在各滴定步骤中蛋白质的回收率是相似的。基于该集体数据，选择在环境温度下历时1小时的110摩尔当量的sbap的值作为所有后续合成的合适反应条件。
[0177]
实施例3-寡糖合成
[0178]
构建单元的合成
[0179]
下面的反应方案说明了用于制备下文详述的化合物3、5和8的合成步骤。
[0180][0181]
化合物d的合成.
[0182]
将市售的1,3,4,6-四-o-乙酰基-2-脱氧-2-n-邻苯二甲酰亚胺基-β-d-吡喃葡萄糖苷(化合物c)(120.6g，252.6mmol)和甲苯(200ml)装入到1l b
ü
chi烧瓶中，并在40℃下旋转直至溶解(《5分钟)。蒸发溶剂并得到泡沫。将甲苯(200ml)装入烧瓶中并在40℃下旋转直至溶解(《5分钟)。再次蒸发溶剂直至干燥。形成结晶固体，粘附在壁上。将二氯甲烷(800ml)装入烧瓶中并在环境下旋转直至溶解；将所得深棕色溶液装入5l夹套反应器中，并用另外的二氯甲烷(200ml)冲洗烧瓶并加入到反应中。将加热/冷却夹套设置为20℃，并机械搅拌
反应器内容物。将乙硫醇(40ml，540mmol)溶解在50ml二氯甲烷中并加入到容器中，并用50ml二氯甲烷冲洗烧瓶并加入到容器中。将三氟化硼乙醚合物(50ml，390.1mmol)溶解在二氯甲烷(50ml)中并加入到反应器中，用二氯甲烷(50ml)冲洗并加入到容器中。将混合物在20℃搅拌2小时。通过tlc检查反应的残留c。流动相为甲苯:乙酸乙酯(3:1，v/v)，产物rf～0.45，crf～0.3，紫外可见。如果存在大量c，则需要延长反应时间。
[0183]
搅拌设置为高速并加入4m乙酸钠水溶液(1.25l，5100mmol)。各相充分混合30分钟。用试纸检查水层的ph并确认为～ph＝7。停止搅拌并将反应混合物静置70分钟。
[0184]
分离并收集各层。将有机层(底层，1.2l)和乙醇(840ml，14400mmol)装入反应器。将夹套设置为60℃并在大气压下蒸馏溶剂(二氯甲烷沸点40℃和乙硫醇沸点35℃，接收烧瓶在冰浴中)。当蒸馏变慢时，夹套温度升至70℃。收集到1300ml馏出物后，取出容器内容物样品，并通过1h-nmr确定二氯甲烷与乙醇的比例，确认二氯甲烷含量低于10mol％。如果存在更多二氯甲烷，则需要进一步蒸馏。加入额外的乙醇(400ml)，然后加入d的晶种。经30分钟将夹套冷却至5℃。将晶体浆液在5℃搅拌3天。将固体收集在烧结漏斗上并用石油醚(60-80℃)洗涤：1x500ml浆液，1x300ml塞子。将固体转移到500ml rbf中并在旋转蒸发器(浴温45℃)上干燥至恒重(约4小时)，提供灰白色固体。预期产量：～86g(71％来自c)。
[0185]
化合物1的合成
[0186]
将无水甲醇(33ml)装入50ml圆底烧瓶中。加入甲醇中的甲醇钠(30％溶液，25μl，0.135mmol)并将所得溶液在环境温度下搅拌5分钟。以使固体在加入过程中溶解的速率，经10分钟分批(约200mg)加入乙基3,4,6-四-o-乙酰基-2-脱氧-2-n-邻苯二甲酰亚胺基-β-硫代-d-吡喃葡萄糖苷(化合物d)(3.09g，6.44mmol)。将反应在环境温度搅拌2.5小时。tlc(etoac)显示化合物d完全消耗(rf＝0.9)并形成一个更具极性的斑点：rf＝0.5。取样并通过hplc(2.5μl反应混合物在0.8ml乙腈和0.2ml水中)进行反应完成ipc，通过条件为nmt 1.00面积％化合物d。加入乙酸(8μl，0.1397mmol)。用试纸检查ph并确认为～ph 5-6。将混合物在旋转蒸发器(50℃)上浓缩至接近干燥。加入etoac(15ml)并且大部分蒸发。将残留物溶解/浆化在15ml etoac中并从旋转蒸发器中去除。加入2ml石油醚并将混合物在环境温度下搅拌。将晶体浆液搅拌过夜。在烧结漏斗上收集固体，用汽油(2x10ml)洗涤并在旋转蒸发器(45℃浴温)上干燥至恒重。预期产量：1.94g(85％来自化合物d)。
[0187]
化合物2的合成
[0188]
将化合物1(2.040g)溶解在吡啶(28ml)中，并将溶液在旋转蒸发器中在40℃浴温下浓缩至大约一半体积(～14ml)，得到黄色溶液。加入更多的吡啶(14ml)并以相同方式再次将溶液浓缩至大约14ml。将溶液置于氩气下并加入三苯甲基氯(2.299g,1.36eq)，然后连接空气冷却冷凝器并将溶液在搅拌下加热至50℃。4小时后，运行ipc(hplc；5μl加入800μl mecn，残留化合物1的nmt 3.00面积％)。一旦符合ipc，反应就冷却至10-15℃。经20分钟滴加苯甲酰氯(1.60ml，2.34eq)，保持反应温度低于20℃。一旦加入完成，使反应升温至环境温度并搅拌至少3小时。此时运行ipc(hplc；5μl加入1500μl mecn，化合物1的残留单bz衍生物总计nmt 3.00面积％)。一旦符合ipc，将反应冷却至0℃，并通过缓慢加入甲醇(0.8ml)淬灭，确保反应温度保持在20℃以下。然后将淬灭的反应升温至环境温度。
[0189]
产物混合物用甲苯(20ml)稀释并在环境温度下搅拌1小时，然后通过烧结漏斗过滤去除沉淀物。然后用柠檬酸(20％w/w,4x20ml)洗涤甲苯溶液，然后用饱和nahco3(9％w/
v,20ml)洗涤，这导致与存在的任何残留柠檬酸的轻微反应。然后用盐水(20ml)洗涤甲苯(上)层，然后在旋转蒸发器中在40℃浴温下蒸发，得到黄色/橙色浆液(6.833g)。将浆液提交给ipc(h
1 nmr，通过条件nmt 30wt％残留甲苯)。预期产量：约6.833g(147％)。
[0190]
化合物3的合成
[0191]
将冰乙酸(648ml)和超纯水(72ml)混合在一起，得到90％的乙酸溶液。将一部分乙酸溶液(710ml)连同搅拌棒一起加入粗化合物2(111g)中。将空气冷却冷凝器连接到烧瓶上，然后将混合物加热至70℃。由于2的粘性，混合物直到1小时20分钟后才完全溶解，此时开始搅拌。2小时后，运行ipc(hplc；5μl加入800μl mecn，残留化合物2的nmt 3.00面积％)。一旦ipc符合规范，将反应冷却至环境温度。将混合物转移到烧结漏斗中并使用室内真空过滤出沉淀的三苯甲基醇(31.09g)。用另一份90％乙酸(40ml)冲洗烧瓶，并将全部洗液转移到混合容器中。添加甲苯(700ml)和水(700ml)并充分混合。水(下)层是混浊的白色溶液，并测试了ph值(预计《2)。用水重复再洗涤两次(2x700ml；ph分别为约2.4和约3，无色透明溶液)。将饱和nahco3(9％w/v，700ml)加入到混合容器中，导致轻微反应(气体逸出)。然后用盐水(700ml)洗涤甲苯(上)层，然后在旋转蒸发器中在40℃浴温下蒸发，得到黄色/橙色固/液混合物(86g)。将该混合物溶解在400ml甲苯(300ml+100ml洗液)中并加载到硅胶柱(450g硅胶)上，该硅胶柱用3个柱体积(cv)的石油醚:甲苯(1:1，v:v)平衡。使用逐步梯度洗脱柱，收集1cv(790ml)的级分。使用的梯度是：
[0192]
石油醚:甲苯(1:1v:v，4cv)中的4vol％乙酸乙酯
[0193]
石油醚:甲苯(1:1v:v，12cv)中的8vol％乙酸乙酯
[0194]
石油醚:甲苯(1:1v:v，4cv)中的15vol％乙酸乙酯
[0195]
石油醚:甲苯(1:1v:v，4cv)中的20vol％乙酸乙酯
[0196]
石油醚:甲苯(1:1v:v，1cv)中的30vol％乙酸乙酯
[0197]
产物洗脱超过14个级分。tlc用于定位含有产物的级分。所有级分均提交至ipc(hplc，10.14分钟时峰的nmt 1.50面积％和10.94分钟时峰的nmt 1.50面积％)。留出不符合ipc的级分用于处理成化合物4。合并的级分在旋转蒸发器中在45℃浴温下蒸发，得到无色浆液。预期产量：约60g，(78％)。
[0198]
化合物4的合成
[0199]
将粗化合物3(39.54g，含有约21g化合物3，约37mmol，在3的色谱即将进行之前获取)溶解在甲苯(7.2ml)和无水吡啶(14.2ml，176mmol，约4.8eq.)中已得到均质溶液。加入乙酸酐7.2ml(76mmol，约2.1eq.)并将混合物在25℃搅拌18小时。在反应固体沉淀期间，该沉淀中的一些可能是化合物4。对反应取样以进行ipc，如果检测到的化合物3的量》1.00面积％，则进一步加入无水吡啶(1.4ml，17当量)，并继续反应直到液相中残留的化合物3≤1.00面积％。
[0200]
将反应用二氯甲烷(112ml)稀释，然后加入水(2.8ml)和甲醇(2.8ml)。将混合物在25℃搅拌3小时。显示该搅拌时间足以淬灭过量的乙酸酐。用柠檬酸一水合物/水20/80w/w(112ml)洗涤混合物。水相用二氯甲烷(50ml)反萃取。将用于反萃取的二氯甲烷放在一边，用于从剩余的柠檬酸洗液中反萃取水相。将主要的二氯甲烷萃取物返回容器并重复柠檬酸洗涤过程，直到水相的ph≤2(通常再洗涤两次)。将合并的柠檬酸洗液反萃取。然后将反萃取物和主要二氯甲烷萃取物合并。所得二氯甲烷溶液用5％w/v nahco3(100ml)洗涤，取出
二氯甲烷相并用水(100ml)洗涤。将二氯甲烷相转移到蒸发容器中并加入乙酸乙酯(50ml)并将溶液浓缩成浆液。
[0201]
加入乙酸乙酯(150ml)，并通过在搅拌下加热至55℃溶解产物。加入石油醚60-80(200ml)并将溶液重新加热至55℃并保持5分钟。将溶液冷却至45℃并加入晶种(30mg)，然后在搅拌下历经3小时将其冷却至18℃并在18℃保持至少1小时。通过过滤收集晶体并用乙酸乙酯/石油醚(1/2v/v，60ml)洗涤。真空干燥得到化合物4(16.04g，77％来自2)。预期产量：16.0g(77％来自化合物2)。
[0202]
化合物3.1的合成
[0203]
将3-氨基丙-1-醇(7.01g，93mmol)溶解在dcm(70ml)中并冷却至0℃。将氯甲酸苄酯(5.40ml，32mmol)溶解在dcm(20ml)中并滴加，保持内部反应温度低于10℃。一旦完成，将烧瓶在室温下搅拌2小时。取出样品进行nmr分析(ipc：20l+0.6ml d6-dmso)表明氯甲酸苄酯试剂已消耗。然后用柠檬酸(10％w/w，2x90ml)、水(90ml)和盐水(90ml)洗涤产物混合物。然后在旋转蒸发器中在40℃浴温下蒸发dcm(下)层，得到轻微混浊的油/液体(6.455g)。将该油溶解在乙酸乙酯(7ml)中，必要时升温至40℃以溶解任何沉淀的固体，然后冷却至室温。将石油醚(4ml)连同晶种一起缓慢加入搅拌溶液中，此时产物开始缓慢结晶。一旦大部分产物沉淀，然后缓慢加入最后部分的石油醚(17ml)(加入的总溶剂：乙酸乙酯:石油醚1:3，21ml)。然后将产物在真空下过滤并用石油醚(5ml)洗涤，得到白色细粉状的产物(4.72g)。预期产量：约4.7g(61％)。
[0204]
化合物5的合成
[0205]
在环境温度下将化合物4(1.05g，1.73mmol)溶解在无水丙酮(12ml，0.06％w/w水)和水(39μl，2.15mmol，1.3eq.)中。然后将溶液冷却至-10℃。nbs(0.639g，3.59mmol，2.08eq.)一次性加入。预计会有大约+7℃的放热，然后立即将溶液重新冷却至-10℃。加入nbs后15分钟，将反应混合物提交至ipc(hplc，通过条件：剩余小于2.00面积％的化合物4)。如果反应不完全，一次性加入1.00eq.的nbs(0.307g，1.73mmol，1.00eq.)，然后将反应在-10℃再保持15分钟并进行进一步的ipc。通过加入nahco3水溶液(5％w/v，5ml)淬灭反应，并停止冷却并且在随后的加入过程中使混合物升温至10-20℃。搅拌3-5分钟后，再加入nahco3水溶液(5％w/v，5ml)并继续搅拌5分钟。在搅拌下加入nahco3水溶液的最后一份等分试样(5％w/v，10ml)，然后加入硫代硫酸钠(20％w/v，5ml)。将混合物在10-20℃搅拌20分钟，然后通过过滤收集固体。用nahco3(5％w/v，25ml)冲洗容器并加入到过滤垫上，并将该冲洗液过滤掉。然后依次用nahco3(5％w/v，25ml)和水(25ml)冲洗滤饼。将(仍然潮湿的)滤饼溶解在dcm(20ml)中并用两批nahco3(5％w/v，20ml)洗涤，然后用水(20ml)洗涤一次。通过旋转蒸发干燥二氯甲烷层，然后在65℃溶解在乙酸乙酯(36ml)中。然后在搅拌下缓慢加入石油醚60-80(10ml)并将混合物冷却至45℃并在45℃搅拌30分钟。在搅拌下加入额外的石油醚60-80(22ml)，并历经2小时将搅拌的混合物冷却至15℃。通过过滤收集产物，用石油醚/乙酸乙酯2/1v/v(20ml)洗涤，然后真空干燥，得到化合物5(0.805g，83％产率，通过hplc测得的α和β端基异构体组合纯度为98％)。
[0206]
化合物7的合成
[0207]
将化合物4(500mg)和中间体3.1(211mg，1.2eq.)称重到干燥烧瓶中，加入甲苯(5ml)并将溶液在旋转蒸发器上浓缩(45℃浴温)。再次重复此操作，然后从无水dcm(5ml)中
浓缩起始原料。一旦去除所有溶剂，将残留固体在真空下干燥10分钟。干燥后，将起始原料置于氩气下，溶解在无水dcm(5.0ml)中，并加入活化的分子筛(450mg，颗粒形式)。此时，将nis试剂置于高真空下干燥。10分钟后，加入干燥的nis(400mg，2.0当量)并将溶液在室温搅拌30分钟。然后快速加入tmsotf(8μl，5mol％)，导致溶液从红色/橙色变为深红色/棕色。反应温度也从22℃上升到27℃。一旦加入tmsotf，立即运行ipc，仅供参考(hplc；10μl加入1ml mecn-h2o(8:2))。然后通过加入吡啶(20μl，0.245mmol)淬灭反应并在环境温度下搅拌5分钟。过滤dcm溶液以去除分子筛，然后用10％na2s2o3(3x5ml)、盐水(5ml)洗涤，然后在旋转蒸发器(40℃浴温)上浓缩，得到泡沫状黄色油状的粗化合物7(616mg)。预期产量：约616mg，(99％)。
[0208]
化合物8的合成
[0209]
通过从甲苯(2x30ml)中然后从无水dcm(30ml)中蒸发来干燥粗化合物7(16.6g)以产生黄色泡沫/油状物。然后将烧瓶置于氩气氛下，然后加入无水dcm(100ml)和无水meoh(260ml)并搅拌混合物。然后将烧瓶冷却至0℃。滴加乙酰氯(3.30ml，2.0eq.)，同时保持内部温度低于10℃。一旦添加完成，将混合物在环境温度下搅拌16小时。此时运行ipc(hplc；20μl加入1ml mecn，残留化合物7不超过3面积％)。然后将烧瓶冷却至0℃并通过加入n-甲基吗啉(总共需要7.0ml)将产物溶液的ph调节至ph 6.5-7.5。产物混合物用dcm(50ml)稀释并用h2o(2x200ml)洗涤。第二次h2o洗液是浑浊的并通过tlc检测含有目标物质，因此用dcm(50ml)反萃取。然后将合并的dcm层用盐水(8ml)洗涤，然后在旋转蒸发器中在40℃浴温下蒸发，得到灰白色泡沫/油状物(约16.8g)。将该混合物溶解在140ml甲苯(100ml+40ml洗液)中并加载到硅胶柱(85g硅胶)上，该硅胶柱用3个柱体积(cv)的在石油醚中的30vol％乙酸乙酯平衡。使用逐步梯度洗脱柱，收集1cv(140ml)的级分。使用的梯度是：
[0210]
石油醚中的30vol％乙酸乙酯(3cv)
[0211]
石油醚中的35vol％乙酸乙酯(4cv)
[0212]
石油醚中的40vol％乙酸乙酯(9cv)
[0213]
石油醚中的50vol％乙酸乙酯(4cv)
[0214]
石油醚中的60vol％乙酸乙酯(3cv)
[0215]
产物洗脱超过12个级分。所有级分均提交至ipc(hplc，230nm处任何杂质峰的nmt 1.50面积％)。将合并的级分在旋转蒸发器中在40℃浴温下蒸发，得到灰白色泡沫，其固化得到松脆固体状的8(10.45g)。预期产量：10.45g(66％)。
[0216]
实施例4-二硫化物(化合物17)的合成
[0217][0218]
化合物17
[0219]
用于合成化合物17的整个合成程序描述于以下合成方案中。
[0220][0221]
化合物9的合成
[0222]
将化合物5(1620g，1.18eq.)和甲苯(18kg)依次装入50l b
ü
chi碗中。将碗在设置为50
±
10℃的水浴中加热30分钟。使用50
±
10℃的水浴温度在真空下进行蒸发，直至不再蒸馏出溶剂。将水浴冷却至20
±
10℃。在氮气气氛下将三氯乙腈(7.1kg，21当量)和无水dcm(6.5kg)装入碗中。在氮气气氛下将氢化钠(5.6g，0.060当量)在无水dcm(250g)中的悬浮液装入碗中。在水浴温度为20
±
10℃的情况下，通过旋转混合碗中的内容物1-2小时。化合物5在反应过程中溶解。对碗内容物取样并进行反应完成ipc(h
1 nmr，相对于6.35ppm(起始原料)的三重峰，对6.42ppm(产物)的三重峰进行积分；通过条件≤5％残留起始原料)。将化合物3(1360g，2.35mol)、无水dcm(12.3kg)和粉状分子筛(136g)依次装入50l反应器中。将反应器内容物混合24小时。通过注射器过滤器对反应器内容物进行取样，并由karl fisher(am-gen-011，通过条件≤0.03％w/w)进行分析。达到水分阈值(约24小时)后，将反应器内容物调节至0
±
5℃。b
ü
chi碗的内容物在体积允许时转移到反应器集管中。在氮气气氛下将三甲基甲硅烷基三氟甲磺酸酯(100g，0.18eq.)在无水dcm(1250g)中的溶液装入反应器。将集管内容物排入反应器，在整个加入过程中将反应器内容物保持在0
±
10℃。加入耗时15-20分钟。将无水dcm(1250g)装入b
ü
chi碗中，然后转移到反应器集管中。将集管内容物排入反应器，在整个加入过程中将反应器内容物保持在0
±
10℃。将反应器内容物在0
±
5℃搅拌60分钟。对反应器内容物进行取样以使用ipc(hplc，通过标准≤5％起始原料)测量反应完成情况。通过向反应器中装入n-甲基吗啉(85g，0.36eq.)来淬灭反应。对反应器内容物进行取样以使用ipc(润湿ph试纸，通过标准≥ph 7)测量淬灭完成情况。将硅胶(4.9kg)
装入b
ü
chi碗中。将反应器内容物转移到b
ü
chi碗中。使用40
±
10℃的水浴温度在真空下进行蒸发，直至不再蒸馏出溶剂。将硅胶(1.4kg)装入b
ü
chi碗中，然后装入二氯甲烷(7.0kg)用于冲洗反应器。旋转碗内容物以确保固体不粘附到碗表面。使用40
±
10℃的水浴温度在真空下进行蒸发，直至不再蒸馏出溶剂。将碗内容物分成三部分用于硅胶色谱。biotage系统中安装了150l kp-sil滤芯。将乙酸乙酯(7.8kg)和石油醚(22kg)连同吸附在硅胶上的1/3反应混合物一起装入50l反应器中，充分混合，然后转移到biotage溶剂储存器中。溶剂储存器内容物通过柱洗脱以调节柱。将洗脱液收集在20l油桶中并丢弃。柱分三批运行，每批用乙酸乙酯/石油醚洗脱，如下所述：
[0223]
将乙酸乙酯(1.6kg)和石油醚(4.4kg)装入biotage溶剂储存器中，充分混合，然后通过柱洗脱。柱流出物收集在20l油桶中。
[0224]
将乙酸乙酯(25kg)和石油醚(26kg)装入50l反应器中，充分混合，转移到两个biotage溶剂储存器中，然后通过柱洗脱。柱流出物收集在20l油桶中。
[0225]
将乙酸乙酯(31kg)和石油醚(22kg)装入50l反应器中，充分混合，转移到两个biotage溶剂储存器中，然后通过柱洗脱。柱流出物收集在5l玻璃实验室瓶中。
[0226]
将乙酸乙酯(16kg)装入biotage溶剂储存器中，然后通过柱洗脱。柱流出物收集在20l油桶中。
[0227]
如上所述用剩余的两份制备的干负载二氧化硅重复该柱。
[0228]
对柱级分进行取样以测定产品纯度(tlc[10％丙酮的甲苯溶液，rf 0.5]以鉴定具有产品的级分。将接受的柱级分合并并放入100l b
ü
chi碗中。甲苯用于将任何结晶材料从接受的级分容器中冲洗到碗中。使用40
±
10℃的水浴温度在真空下进行蒸发，直至不再蒸馏出溶剂。将甲苯(1.7kg)装入碗中并旋转内容物，直到固体溶解。经20-40分钟将叔丁基甲基醚(4.4kg)加入到碗中。碗内容物在20
±
5℃的温度下旋转12-24小时。将碗内容物转移至6l nutsche过滤器并通过真空过滤去除溶剂。将叔丁基甲基醚(620g)装入碗中，转移至nutsche过滤器并通过滤饼。滤饼在过滤器中风干，然后转移到真空烘箱中并在真空下在30℃的设定下干燥以去除残留溶剂。对固体取样以进行分析和保留。将固体转移到螺口nalgene容器中并在≤-15℃下储存。预期产量：1.68-1.94kg化合物9(65-75％)。
[0229]
化合物10的合成
[0230]
试剂制备如下：n-碘代琥珀酰亚胺(241g，2.20eq.)在设定为30℃的真空烘箱中真空干燥24小时。在5l实验室瓶中制备氯化钠(300g)在水(3000g)中的溶液。在50l反应器中制备硫代硫酸钠(1100g)在水(6000g)中的溶液，并将其分成两部分。
[0231]
将化合物8(355g，0.486mol)和化合物9(634g，1.10eq.)装入20l b
ü
chi碗中，然后装入甲苯(1500g)并在40
±
5℃加热直至溶解。使用35
±
10℃的水浴温度在真空下进行蒸发，直至不再蒸馏出溶剂。将甲苯(1500g)装入b
ü
chi碗中。使用35
±
10℃的水浴温度在真空下进行蒸发，直至不再蒸馏出溶剂。将无水二氯甲烷(4000g)装入b
ü
chi碗中。旋转碗直到固体溶解并将溶液转移到夹套温度为20℃
±
5℃的5l反应器中。将无水二氯甲烷(710g)装入b
ü
chi碗中。旋转碗以冲洗碗表面并将溶液转移到5l反应器中。对反应器内容物取样以进行试剂比例ipc(h
1 nmr)。在氮气气氛下将干燥的n-碘代琥珀酰亚胺加入反应器中并将反应器搅拌5-15分钟。将反应器内容物调节至20℃
±
3℃。经5-15分钟将无水dcm(60g)中的三甲基甲硅烷基三氟甲磺酸酯(5.94g，0.055eq.)装入反应器中，同时将内容物温度保持在20℃
±
3℃。将反应混合物在20℃
±
3℃搅拌20
±
3分钟。对反应器内容物取样以测量反应完成情况(hplc)。将n-甲基吗啉(98g，2当量)装入反应器并充分混合。将上述制备的硫代硫酸钠溶液的一部分装入50l反应器中。将5l反应器内容物转移到含有硫代硫酸钠溶液的50l反应器中并充分混合。将底层排放到hdpe油桶中。
[0232]
将dcm(570g)与来自50l反应器的顶层一起装入5l反应器并充分混合。底层与hdpe油桶中的前述底层合并。将顶层转移到单独的hdpe油桶中并保留直到确认产量。将合并的有机相(底层)装入到50l反应器中，然后装入另一部分硫代硫酸钠并充分混合。将底层排放到hdpe油桶中。顶层保留在hdpe油桶中，直到确认产量。将氯化钠溶液与有机相(底层)一起装入50l反应器并充分混合。将硅胶(1300g)装入b
ü
chi碗并配备旋转蒸发器。将反应器的底层装入b
ü
chi碗中。旋转碗内容物以防止吸附到碗上，并使用40
±
5℃的水浴温度在真空下蒸发，直到不再蒸馏出固体。碗内容物被分成两等份。将硅胶(200g)装入b
ü
chi碗中，然后装入二氯甲烷(700g)。旋转碗内容物以确保固体不会粘附到碗表面。将碗在40℃
±
10℃的水浴温度下真空蒸发，直到不再蒸馏出溶剂。将碗内容物分成两部分，并将一部分加入到之前的每个硅胶样品中。
[0233]
使用以下程序在硅胶上独立纯化每个部分(样品在≤15℃下储存，同时等待纯化)：biotage系统中安装了150l kp-sil滤芯。将乙酸乙酯(15.5kg)和石油醚(16.5kg)装入50l反应器，充分混合，然后转移到两个biotage溶剂储存器中。溶剂储存器内容物通过柱洗脱以调节柱。将洗脱液收集在20l油桶中并丢弃。将来自上文的一部分干负载二氧化硅装入biotage样品注入模块(sim)，然后如下用乙酸乙酯/石油醚洗脱：
[0234]
将乙酸乙酯(6.2kg)和石油醚(6.6kg)装入50l反应器中，充分混合，然后转移到biotage溶剂储存器中。柱流出物收集在20l油桶中。
[0235]
将乙酸乙酯(19.5kg)和石油醚(19.2kg)装入50l反应器中，充分混合，转移到两个biotage溶剂储存器中，然后通过柱洗脱。柱流出物收集在20l油桶中。
[0236]
将乙酸乙酯(13.6kg)和石油醚(12.3kg)装入50l反应器中，充分混合，转移到两个biotage溶剂储存器中，然后通过柱洗脱。柱流出物收集在20l油桶中。
[0237]
将乙酸乙酯(14.2kg)和石油醚(11.9kg)装入50l反应器中，充分混合，转移到两个biotage溶剂储存器中，然后通过柱洗脱。柱流出物收集在20l油桶中。
[0238]
将乙酸乙酯(29.7kg)和石油醚(22.9kg)装入biotage溶剂储存器，然后通过柱洗脱。柱流出物收集在20l油桶中，直到级分11，然后收集在5l hdpe油桶中。
[0239]
将乙酸乙酯(15.5kg)和石油醚(11.0kg)装入biotage溶剂储存器，然后通过柱洗脱。柱流出物收集在5l hdpe油桶中。
[0240]
将乙酸乙酯(29.7kg)和石油醚(13.2kg)装入biotage溶剂储存器，然后通过柱洗脱。柱流出物收集在5l hdpe油桶中。
[0241]
将乙酸乙酯(15.5kg)装入biotage溶剂储存器中，然后通过柱洗脱。柱流出物收集在5l hdpe油桶中。
[0242]
对柱级分进行取样以测定产品纯度(tlc用于鉴定具有产品的级分)。将前两个柱中化合物10面积为75-95％的级分合并到装有硅胶(400g)的b
ü
chi碗中，并在真空下使用40
±
10℃的水浴温度进行蒸发，直到不再蒸馏出溶剂。碗内容物如下纯化：biotage系统中安装了150l kp-sil滤芯。将乙酸乙酯(15.5kg)和石油醚(16.5kg)装入50l反应器，充分混合，
然后转移到两个biotage溶剂储存器中。溶剂储存器内容物通过柱洗脱以调节柱。将洗脱液收集在20l油桶中并丢弃。将碗内容物装入biotage样品注入模块(sim)，然后用乙酸乙酯/石油醚如下洗脱：
[0243]
将乙酸乙酯(6.2kg)和石油醚(6.6kg)装入50l反应器中，充分混合，然后转移到biotage溶剂储存器中。柱流出物收集在20l油桶中。
[0244]
将乙酸乙酯(19.5kg)和石油醚(19.2kg)装入50l反应器中，充分混合，转移到两个biotage溶剂储存器中，然后通过柱洗脱。柱流出物收集在20l油桶中。
[0245]
将乙酸乙酯(13.6kg)和石油醚(12.3kg)装入50l反应器中，充分混合，转移到两个biotage溶剂储存器中，然后通过柱洗脱。柱流出物收集在20l油桶中。
[0246]
将乙酸乙酯(14.2kg)和石油醚(11.9kg)装入50l反应器中，充分混合，转移到两个biotage溶剂储存器中，然后通过柱洗脱。柱流出物收集在20l油桶中。
[0247]
将乙酸乙酯(29.7kg)和石油醚(22.9kg)装入biotage溶剂储存器，然后通过柱洗脱。柱流出物收集在20l油桶中，直到级分11，然后收集在5l hdpe油桶中。
[0248]
将乙酸乙酯(15.5kg)和石油醚(11.0kg)装入biotage溶剂储存器，然后通过柱洗脱。柱流出物收集在5l hdpe油桶中。
[0249]
将乙酸乙酯(29.7kg)和石油醚(13.2kg)装入biotage溶剂储存器，然后通过柱洗脱。柱流出物收集在5l hdpe油桶中。
[0250]
将乙酸乙酯(15.5kg)装入biotage溶剂储存器中，然后通过柱洗脱。柱流出物收集在5l hdpe油桶中。
[0251]
将来自所有三个柱的已接受柱级分合并在b
ü
chi碗中，并使用温度为40℃
±
10℃的水浴在真空下进行蒸发，直到不再蒸馏出溶剂。对碗的内容物取样以进行分析和保留。将碗密封并转移到≤-15℃的储存环境中。预期产量：440-540kg(52-64％产率)。
[0252]
化合物11的合成
[0253]
将二氯甲烷装入具有化合物10(635g，0.345mol)(pn0699)的b
ü
chi碗中，并在30
±
10℃下加热直至溶解。将甲醇(3.2kg)装入碗中。将碗的内容物调节到0
±
3℃。将二氯甲烷(660g)中的乙酰氯(54.1g，2当量)装入碗中，同时将内容物温度保持在0
±
10℃。将碗内容物调节至20
±
3℃，并将混合物搅拌40-48小时。对碗内容物取样以进行反应完成ipc(hplc，通过)。将碗内容物调节至0
±
3℃。将n-甲基吗啉(139g，4当量)装入碗中并充分混合。对碗内容物取样以进行淬灭完成ipc(ph试纸，通过≤ph7)。用35
±
10℃的水浴在真空下浓缩碗内容物。将乙酸乙酯(4.8kg)和水(5.5kg)装入b
ü
chi碗中并旋转以溶解碗内容物。将碗内容物转移到50l反应器中并充分混合。将底层排入hdpe油桶中。将顶层转移到配备有旋转蒸发器的b
ü
chi碗中，并在35
±
10℃的水浴中真空浓缩内容物。将hdpe油桶的底层装入具有乙酸乙酯(1.5kg)的50l反应器中，并充分混合。将底层排至hdpe油桶中并保持直到确认产量。将顶层转移到配备有旋转蒸发器的b
ü
chi碗中，并在35
±
10℃的水浴中真空浓缩内容物。对碗的内容物取样以进行分析和保留。将碗密封并转移到≤-15℃的储存环境中。预期产量：518-633kg(90-110％产率)。
[0254]
化合物12的合成
[0255]
试剂制备如下：将两份n-碘代琥珀酰亚胺(143g，3.90eq.)在设置为30℃的真空烘箱中在真空下干燥24小时。在5l实验室瓶中制备氯化钠(450g)在水(1850g)中的溶液，并分
配成2个大致相等的部分。在5l实验室瓶中制备硫代硫酸钠(230g)在水(2080g)中的溶液，并分配成4个大致相等的部分。
[0256]
将化合物9(504g，1.30eq.)装入到具有化合物11(607g，0.327mol)的50l b
ü
chi碗中，然后装入甲苯(1500g)，并在40
±
5℃加热直至溶解。使用35
±
10℃的水浴温度在真空下进行蒸发，直至不再蒸馏出溶剂。将甲苯(1500g)装入b
ü
chi碗中。使用35
±
10℃的水浴温度在真空下进行蒸发，直至不再蒸馏出溶剂。将无水dcm(2400g)装入b
ü
chi碗中。旋转碗直到固体溶解并将一半溶液转移到夹套温度为20℃
±
5℃的5l反应器中。将另一半溶液转移到5l实验室瓶中。将无水dcm(710g)装入b
ü
chi碗中。旋转碗以冲洗碗表面，并将一半溶液转移到5l反应器中。将另一半装入上面的5l实验室瓶中，并在氮气下储存以用于第二批。在氮气气氛下将一部分干燥的n-碘代琥珀酰亚胺装入反应器中。将反应器内容物调节到-40℃
±
3℃。经15分钟将无水二氯甲烷(90g)中的三甲基甲硅烷基三氟甲磺酸酯(9.09g，0.25有效当量)装入反应器中，同时将内容物温度保持在-40℃
±
5℃。将反应混合物在-40℃
±
3℃搅拌30
±
5分钟，然后调节至-30℃
±
3℃并搅拌150分钟。对反应器内容物取样以测量反应完成情况。将n-甲基吗啉(33.1g，2有效当量)装入反应器并充分混合。将上述制备的硫代硫酸钠溶液的一部分装入5l反应器中并充分混合。将底层排放到5l实验室瓶中。将dcm(400g)装入5l反应器中并充分混合。底层与之前的底层在5l实验室瓶中合并。将合并的有机相装入到5l反应器中，然后装入另一部分硫代硫酸钠并充分混合。将底层排放到5l实验室瓶中。将来自上文的一部分氯化钠溶液装入反应器，然后装入前一个实验室瓶中的内容物。将反应器中的底层装入b
ü
chi并使用40
±
10℃的水浴温度在真空下蒸发，直到不再蒸馏出溶剂。清洁和干燥反应器。
[0257]
将第二部分化合物9和化合物11装入反应器并与第一批相同地处理。在对第二批进行有机萃取之后，反应混合物在反应器中合并。将一部分氯化钠溶液装入反应器并充分混合。将硅胶(1700g)装入b
ü
chi碗中并安装到旋转蒸发器上。将反应器中的底层装入b
ü
chi并使用40
±
10℃的水浴温度在真空下蒸发，直到不再蒸馏出溶剂。将碗内容物分成两部分单独在硅胶上纯化。在biotage系统中安装了150l kp-sil滤芯(可从美国弗吉尼亚州夏洛茨维尔的dyax corporation的一个子公司biotage购得)。将乙酸乙酯(7.7kg)和石油醚(22.0kg)装入50l反应器，充分混合，然后转移到两个biotage溶剂储存器中。溶剂储存器内容物通过柱洗脱以调节柱。将洗脱液收集在20l油桶中并丢弃。将来自上文的一部分干负载二氧化硅装入biotage样品注入模块(sim)，然后如下用乙酸乙酯/石油醚洗脱：
[0258]
将乙酸乙酯(1.5kg)和石油醚(4.4kg)装入hdpe油桶中，充分混合，然后转移到biotage溶剂储存器中。柱流出物收集在20l油桶中。
[0259]
将乙酸乙酯(18.6kg)和石油醚(8.8kg)装入50l反应器中，充分混合，转移到两个biotage溶剂储存器中，然后通过柱洗脱。柱流出物收集在20l油桶中。
[0260]
将乙酸乙酯(19.2kg)和石油醚(8.4kg)装入50l反应器中，充分混合，转移到两个biotage溶剂储存器中，然后通过柱洗脱。柱流出物收集在20l油桶中。
[0261]
将乙酸乙酯(29.7kg)和石油醚(11.9kg)装入50l反应器中，充分混合，转移到两个biotage溶剂储存器中，然后通过柱洗脱。柱流出物收集在20l油桶中。
[0262]
将乙酸乙酯(15.5kg)装入biotage溶剂储存器中，然后通过柱洗脱。柱流出物收集在5l玻璃实验室瓶中。
[0263]
对柱级分进行取样以测定产品纯度(tlc用于鉴定具有产品的级分)。将前两个柱中化合物12面积为75-95％的级分合并到装有硅胶(400g)的b
ü
chi碗中，并在真空下使用40
±
10℃的水浴温度进行蒸发，直到不再蒸馏出溶剂。将乙酸乙酯(7.7kg)和石油醚(22.0kg)装入50l反应器，充分混合，然后转移到两个biotage溶剂储存器中。溶剂储存器内容物通过柱洗脱以调节柱。将洗脱液收集在20l油桶中并丢弃。包含不纯产品的干载二氧化硅被加载到biotage样品注入模块(sim)，然后洗脱如下：
[0264]
将乙酸乙酯(1.5kg)和石油醚(4.4kg)装入50l反应器，充分混合，然后转移到biotage溶剂储存器中。柱流出物收集在20l油桶中。
[0265]
将乙酸乙酯(19.2kg)和石油醚(8.4kg)装入50l反应器中，充分混合，转移到两个biotage溶剂储存器中，然后通过柱洗脱。柱流出物收集在20l油桶中。
[0266]
将乙酸乙酯(18.6kg)和石油醚(8.8kg)装入50l反应器中，充分混合，转移到两个biotage溶剂储存器中，然后通过柱洗脱。柱流出物收集在20l油桶中。
[0267]
将乙酸乙酯(29.7kg)和石油醚(11.9kg)装入50l反应器中，充分混合，转移到两个biotage溶剂储存器中，然后通过柱洗脱。柱流出物收集在20l油桶中。
[0268]
将乙酸乙酯(15.5kg)装入biotage溶剂储存器中，然后通过柱洗脱。柱流出物收集在5l玻璃实验室瓶中。
[0269]
对柱级分取样以分析产品纯度(tlc用于鉴定具有产品的级分，hplc通过标准≥95％化合物12且没有单一杂质＞2.5％)。将来自所有三个柱的已接受柱级分合并在b
ü
chi碗中，并使用40
±
10℃的水浴温度在真空下进行蒸发，直到不再蒸馏出溶剂。对碗的内容物取样以进行分析和保留。将碗密封并转移到≤-15℃的储存环境中。预期产量：494-584kg(52-64％产率)。
[0270]
化合物13的合成
[0271]
在合适的容器中合并冰乙酸(7.5kg)和乙酸乙酯(6.5kg)，并标记为“gaa/ea溶液”。将碳酸氢钠(0.5kg)溶于ro水(10kg)，并标记为“5％w/w碳酸氢钠溶液”。活性炭载钯(100g，特别是johnson matthey,aliso viejo,california,usa，产品编号a402028-10)和gaa/ea溶液(335g)以该顺序装入到反应容器中。将化合物12(270g)溶于gaa/ea溶液(1840g)，并转移到50l反应容器中。通过用氮气加压到10bar，然后释放，清除溶液中的氧气。再重复两次。在氢气下将反应器内容物加压到10bar，然后释放。将反应混合物在20bar h2中氢化1.5天。然后释放压力，并通过用氮气加压到10bar，然后释放，清除溶液中的氢气。这个操作重复一次。将反应混合物通过celite垫(300g)过滤。用gaa/ea溶液(2x5.5kg)洗涤celite滤饼。将滤液合并并在真空下蒸发(浴温40
±
5℃)。残留物与乙酸乙酯(2.3kg)分为两部分共蒸发。粗产物的预期重量为约316g。biotage系统配备了150m kp-sil滤芯，带有5l样品注入模块(sim)。将乙酸乙酯(10.6kg)和冰乙酸(1.4kg)装入50l反应器中，充分混合，然后转移到biotage溶剂储存器中。溶剂储存器的内容物通过柱洗脱以调节柱。弃去洗脱液。将粗产物溶解在乙酸乙酯(422g)和冰乙酸(55g)中。
[0272]
将所得溶液装入sim并送到柱上。如下对反应混合物进行色谱分离：
[0273]
将乙酸乙酯(13.8kg)和冰乙酸(1.8kg)装入50l反应器中，充分混合，然后转移到biotage溶剂储存器中。
[0274]
溶剂储存器的内容物通过sim洗脱到柱上，并且洗脱液收集在20l油桶中。
[0275]
将乙酸乙酯(10.3kg)、冰乙酸(1.3kg)和甲醇(206g)装入50l反应器中，充分混合，然后转移到biotage溶剂储存器中。
[0276]
溶剂储存器的内容物通过柱洗脱，并且洗脱液收集在5l油桶中。
[0277]
将乙酸乙酯(6.6kg)、冰乙酸(0.9kg)和甲醇(340g)装入50l反应器中，充分混合，然后转移到biotage溶剂储存器中。
[0278]
溶剂储存器的内容物通过柱洗脱，并且洗脱液作为约2.5l级分收集在5l油桶中。
[0279]
将乙酸乙酯(31.4kg)、冰乙酸(4.1kg)和甲醇(3.4kg)装入50l反应器中，充分混合，然后转移到biotage溶剂储存器中。
[0280]
溶剂储存器的内容物通过柱洗脱，并且洗脱液收集在5l油桶中。
[0281]
合并含有化合物13的级分并在真空下蒸发(浴温40
±
5℃)。将残留物溶解在乙酸乙酯(3.1kg)中并用5％w/w碳酸氢钠溶液(9.3kg)洗涤，确保水性介质的ph值≥8。在真空下蒸发乙酸乙酯相(浴温40
±
5℃)。对碗的内容物取样以进行分析和保留。预期产量：182-207g(71-81％)。
[0282]
化合物16的合成
[0283]
将无水二氯甲烷(2.5kg)装入具有化合物13(211g，76.5mmol，1.00eq.)的b
ü
chi碗中并在不加热的情况下旋转直到溶解。将(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)4-乙酰硫烷基丁酸酯(25.8g，99.4mmol，1.30当量)在无水二氯甲烷(200g)中的溶液加入到b
ü
chi碗中。将碗在环境温度下旋转1小时，然后在40
±
5℃的水浴温度下真空浓缩。将甲苯(0.8kg)加入到碗中，并在40
±
5℃的水浴温度下真空去除两次。向残留物中加入甲苯(0.8kg)以溶解。将硅胶(557g)装入反应容器中，并在40
±
5℃的水浴温度下真空去除溶剂。biotage系统配备了150mkp-sil滤芯，带有5l样品注入模块(sim)。将甲苯(10.1kg)和丙酮(1.0kg)装入50l反应器中，充分混合，然后转移到biotage溶剂储存器(溶剂a)中。
[0284]
如下纯化反应混合物：
[0285]
溶剂a通过柱洗脱以调节柱。弃去洗脱液。
[0286]
将干加载的硅胶转移到sim上。
[0287]
将甲苯(9.6kg)和丙酮(1.5kg)装入50l反应器中，充分混合，然后转移到biotage溶剂储存器(溶剂b)中。
[0288]
溶剂b通过柱洗脱，并且洗脱液收集在5l油桶中。
[0289]
将甲苯(53.6kg)和丙酮(12.2kg)装入50l反应器中，充分混合，然后转移到biotage溶剂储存器(溶剂c)中。
[0290]
溶剂c通过柱洗脱，并且洗脱液收集在5l油桶中。
[0291]
将甲苯(8.4kg)和丙酮(2.6kg)装入50l反应器中，充分混合，然后转移到biotage溶剂储存器(溶剂d)中。
[0292]
溶剂d通过柱洗脱，并且洗脱液收集在5l油桶中。
[0293]
将甲苯(23.4kg)和丙酮(9.2kg)装入50l反应器中，充分混合，然后转移到biotage溶剂储存器(溶剂e)中。
[0294]
溶剂e通过柱洗脱，并且洗脱液收集在5l油桶中。
[0295]
将含有化合物16的级分(通过标准≥90％化合物16且没有单一杂质》2.5％)合并并在真空(浴温40
±
5℃)下蒸发。将残留物溶解在四氢呋喃(4.4kg)中并在40
±
5℃的水浴
温度下真空浓缩。对碗的内容物取样以进行分析和保留。预期产量：169-192g(76-86％)。
[0296]
化合物17的合成
[0297]
反应器在启动前在2.5l、3.5l和3.9l水平作上标记，并配备真空控制器。将二氯甲烷装入具有140g化合物16的b
ü
chi碗中并转移到reactor ready容器中。使用dcm(333g)的两次冲洗将b
ü
chi碗的内容物转移到reactor ready容器中。将乙醇(2.50kg)加入准备好的反应器中。将反应混合物浓缩至2.5l标记(目标真空250mbar)。将乙醇(1.58kg)加入准备好的反应器中并浓缩至3.5l标记。用乙醇将反应稀释至3.9l标记。通过施加部分真空并用氮气释放将反应器内容物置于惰性气体下。在反应过程中保持缓慢的氮气流。在氮气气氛下将一水合肼(1.13kg，1.11l)装入5l reactor ready容器中。温度斜坡设置为：初始温度20℃，最终温度60℃，线性温度斜坡历经50分钟(0.8度/分钟)，并主动控制反应器的内容物。容器温度在60℃下保持45分钟。冷却斜坡温度设置为：-2度/分钟，最终温度为20℃。将内容物排放到合适的hdpe罐中并测定重量。等量转移到8个带有fep封装密封盖的聚丙烯离心容器中。向每个离心容器中装入乙醇(750g)并在环境下搅拌30分钟。将容器离心(5300rcf，15℃，30分钟)。通过在从通风橱中取出之前先用丙酮后用水冲洗瓶子的外部来去除容器外部的残留肼。慢慢倒出离心容器中的上清液，并将残留沉淀溶解在低内毒素水(le water)(1960g)中，并转移到5l reactor ready容器中。以中等速度搅拌内容物，同时每1.5小时使用分散管将空气鼓泡通过溶液大约15-20分钟。然后将反应在密闭容器中于20℃搅拌过夜。一旦ipc表明游离五聚体组成低于3％(占报告总数的面积％)，该反应被认为是完全的。如果反应混合物中存在任何不溶性材料，则需要过滤(使用p3烧结玻璃漏斗和5l buchner烧瓶)。在2个lyoguard托盘中冷冻干燥反应器的内容物。将搁板温度设置为-0.5℃持续16-20小时，然后设置为20℃下直至干燥。将冷冻干燥产物溶于le水(840g)，并在6个离心瓶之间平均分配。将丙酮(630g)加入到每个容器中并搅拌15分钟。将异丙醇(每个容器630g)加入到每个容器中，并继续搅拌20分钟。将内容物在15℃下以5300rcf离心1小时。弃去上清液，并通过向每个容器中加入le水(140g)，然后使用轨道摇床在环境下搅拌混合物直至沉淀溶解，从而将每个沉淀溶解在水中。将丙酮(630g)加入到每个容器中并搅拌15分钟。将异丙醇(每个容器630g)加入到每个容器中，并继续搅拌20分钟。将内容物在15℃下以5300rcf离心1小时。将上清液丢弃，并通过加入le水(100g)，然后在环境下搅拌，从而将每个沉淀溶解在水中。将溶液转移到lyoguard托盘中，并用更多的le水冲洗瓶(每个瓶66g)，然后将冲洗液转移到同一托盘上。通过将搁板温度设置为-0.5℃持续16-20小时，然后设置为20℃直至干燥，将产品冷冻干燥。对冷冻干燥产品取样以进行分析和保留。lyoguard托盘采用双袋包装，贴上标签并储存在冰箱中(≤-15℃)。使用qhnmr确定冷冻干燥产品的效力。此程序提供了粗五(二聚体)(penta dimer)17。预期产量：26.1-35.5g(61-83％)。
[0298]
使用500mhz仪器，通过1h和
13
c nmr确定化合物17的身份。在d2o中以25mg/ml制备叔丁醇的参考溶液。在d2o中以13mg/ml制备样品，并将参考溶液加入到样品中。最终测试样品的组成为10mg/ml的五(二聚体)和5mg/ml的叔丁醇。获取1h和
13
c光谱并进行积分。通过与理论位移进行比较，分配了所得的化学位移。1h nmr和
13
c nmr光谱分别显示在图1和图2中。
[0299]
实施例5-将粗五(二聚体)转化为游离碱形式
[0300]
将amberlite fpa91(1.46kg；40g/g粗五(二聚体)-校正效力)装入大型柱中。通过将naoh(320g)加入到10l schott瓶中的le水(8.00kg)中来制备8l的1.0m naoh溶液。该溶
液经1小时的时间通过amberlite树脂。将le水(40.0kg)通过amberlite树脂。用额外的le水(约10kg等分试样)冲洗树脂，直到流过液中的ph值达到《8.0。使储存在lyoguard托盘中的粗五(二聚体)(49g，pn0704)升温至环境温度。将le水(400g)加入到具有粗五(二聚体)(49g)的lyoguard托盘中，并使其完全溶解，然后转移到1l schott瓶中。用另外加入的le水(200g)冲洗托盘，并将这些洗涤液加入到schott瓶内容物中。将粗五(二聚体)溶液小心地倒在树脂顶部。用le水(200g)冲洗1l schott瓶并将其装载到树脂上。打开amberlite龙头，使粗五(二聚体)溶液在约5分钟内缓慢移动到树脂中。停止龙头，并且材料留在树脂上约10分钟。将le水倒在树脂顶部。打开龙头并用le水洗脱，收集大约16个500ml的级分。通过tlc炭化(10％h2so4在etoh中)分析每个级分。合并所有含碳水化合物的级分，并通过使用0.2μm尼龙滤膜的millipore过滤器过滤。将溶液平均分配在5-6个lyoguard托盘之间。过滤容器用le水(100g)冲洗并在托盘之间分配。材料在托盘中冷冻干燥。将搁板温度设置为-10℃持续16-20小时，然后设置为+10℃直至材料干燥。将le水(150g)装入到除一个lyoguard托盘之外的所有托盘中，并将其转移到剩余的一个具有干燥材料的托盘中。每个空托盘用另外加入的le水(100g)冲洗，并将该冲洗体积加入到最后一个lyoguard托盘中。将最后一个lyoguard托盘冷冻干燥。将搁板温度设置为-10℃持续16-20小时，然后设置为+10℃直至材料干燥。对产物取样以进行分析和保留。将干燥的材料转移到hdpe或pp容器中并在≤-15℃下储存。预期产量：31-34g(86-94％)。
[0301]
二聚体中二硫键的tcep还原是快速且接近化学计量的。使用tcep进行化学计量还原得到大约2当量的葡糖胺五糖单体。具体而言，将五糖二聚体溶解在含有1摩尔当量tcep的反应缓冲液(50mm hepes缓冲液(ph 8.0))中。在环境温度下1小时后，通过具有cad检测的hplc分析反应。在这些条件下，向五葡糖胺单体的转化(峰值在约10分钟时出现)几乎完成(五葡糖胺二聚体峰在约11.5分钟时出现)——见图4。其余未注释的峰来自样品基质。基于平衡的化学方程式，加入的tcep大部分转化为tcep氧化物，并且任何残留的tcep在加入到缀合反应之前都会抑制其被空气氧化回到二聚体。为简单起见，可基于输入二聚体并假设在这些条件下转化为单体＞95％来加入葡糖胺五糖。
[0302]
五(二聚体)的身份由1h和
13
c nmr使用500mhz仪器确定。在d2o中以25mg/ml制备叔丁醇的参考溶液。在d2o中以13mg/ml制备样品，并将参考溶液加入到样品中。最终测试样品的组成为10mg/ml的五(二聚体)和5mg/ml的叔丁醇。获取1h和
13
c光谱并进行积分。通过与理论位移进行比较，分配了所得的化学位移。1h和
13
c nmr光谱分别显示在图1和图2中。
[0303]
实施例5-用实施例2的tt-接头转化实施例4的五糖单体以提供本发明的疫苗(化合物18)
[0304]
实施例2的tt单体-接头中间体在环境温度下与浓度增加的4-70五聚葡糖胺摩尔当量(2-35五糖二聚体摩尔当量)反应4小时。通过分配通过30kda mwco膜来纯化来自每个滴定点的粗缀合物。通过sec-mals分析每个纯化的缀合物样品的蛋白质含量、有效载荷密度和通过sec hplc分析单体/聚集体含量。数据显示在≥50五聚葡糖胺当量时有效载荷密度饱和。基于sec hplc分析，聚集体含量随着五糖单体负载的增加而增加，并且从30五聚葡糖胺当量开始，似乎达到了大约4％增加的稳态水平。基于这些结果，为随后的缀合反应选择的五糖二聚体负载为25摩尔当量，对应于50摩尔当量的五聚葡糖胺的理论负载。
[0305]
按照上述制备一系列三个试验合成，然后是化合物18的gmp合成。评估每种所得产
物的效力(通过elisa测定)和有效载荷密度(五聚葡糖胺与破伤风类毒素的摩尔比)。下表提供了结果。
[0306][0307]
这些结果证明本发明化合物的负载因子非常高。上述描述仅用于说明本发明，并不意味着限制。由于本领域技术人员可以想到结合本发明的精神和实质的所述实施方案的修改，因此本发明应被广义地解释为包括在权利要求及其等价物范围内的所有变化。
[0308]
实施例6-通过尺寸排阻色谱法纯化破伤风类毒素
[0309]
浓缩破伤风类毒素的等分试样在用10mm nahco3/150mm nacl(ph 9.0)以2.0ml/分钟的速度洗脱的ge healthcare 2.6x60cm superdex 200柱上进行色谱纯化。基于分析sec-hplc测试合并个体级分(4.0ml)。基于在这些条件(2.0ml样品/0.6％床体积)下获得的tt单体制剂的纯度，superdex 200进料体积成功增加了2倍(4.0ml样品/1.2％床体积)，同时对分辨率不造成重大变化。这种变化有效地减少了纯化所需的色谱循环次数。使用amicon ultra-15 ultracel 30kda再生纤维素离心过滤器对含有所需质量的tt单体的sec池进行浓缩/缓冲液更换。对纯化的tt进行缓冲液更换，更换成50mm hepes(ph 8.0)缓冲液用于缀合研究。