用靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的嵌合抗原受体治疗癌症的组合物和方法与流程

用靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的嵌合抗原受体治疗癌症的组合物和方法
1.发明背景
技术领域
2.本披露涉及使用嵌合抗原受体t细胞来治疗癌症。


背景技术：

3.1.嵌合抗原受体t细胞疗法
4.嵌合抗原受体(car)t细胞疗法是特定形式的基于细胞的免疫疗法，该免疫疗法使用工程化的t细胞对抗癌症。在car t细胞疗法中，将t细胞从患者血液中收获，离体工程化以表达含有抗原-结合结构域和t细胞-激活结构域的car，扩增至更大的群体并且施用至患者。car t细胞用作结合至癌细胞并引起这些癌细胞的破坏的活的药物。当成功时，car t细胞治疗的作用往往会持续很长时间，如通过在临床缓解后很长时间在患者中检测car t细胞的持久性和扩增所证明的。
5.2.car结构和功能
6.car的抗原-结合结构域是靶向肿瘤细胞上的表面抗原的细胞外区域。合适的靶抗原可以是蛋白质、磷酸化蛋白质、肽-mhc、碳水化合物、或糖脂分子。理想的靶抗原在肿瘤细胞上广泛表达以使得能够靶向高百分比的癌细胞。理想的候选靶抗原也通常在正常组织上最低限度地表达，从而限制了肿瘤外的中靶毒性。car的抗原-结合结构域包含针对靶抗原的靶向部分，如抗体单链可变片段(scfv)。
7.car的t细胞-激活结构域在细胞内，并激活t细胞以响应于与靶抗原相互作用的抗原-结合结构域。t细胞激活结构域可以含有一个或多个共刺激结构域，这些共刺激结构域是已知的激活t细胞受体的细胞内结构域。由于共刺激结构域对car t细胞动力学、细胞毒性功能、和安全性具有不同的影响，因此car构建体内的共刺激结构域的选择和位置会影响car t细胞的功能和命运。
8.car的细胞外抗原-结合结构域和细胞内t细胞-激活结构域通过跨膜结构域、铰链、和任选地间隔子区连接。铰链结构域是提供构象自由度以促进与肿瘤细胞上的靶抗原结合的短肽片段。该铰链结构域可单独或与设计scfv远离t细胞表面的间隔子结构域结合使用。间隔子的最佳长度取决于结合表位与细胞表面的接近度。
9.针对b淋巴细胞抗原cd19的car t疗法(诺华公司(novartis))在小儿急性淋巴细胞性白血病中显示出前景，并且针对b细胞成熟抗原的car t疗法(“bb2121”，和合作)针对复发性/难治性多发性骨髓瘤显示出前景。最近的数据表明，car方法可对实体瘤有效。gd2 car自然杀伤t细胞(nkt)疗法在神经母细胞瘤中显示出活性(heczey a等人invariant nkt cells with chimeric antigen receptor provide a novel platform for safe and effective cancer immunotherapy[具有嵌合抗原受体的恒定nkt细胞为安全且有效的癌症免疫疗法提供新的平台].blood[血液]；124
(18)：2824-33，2014)，并且具有派姆单抗(pembrolizumab)的间皮素car t已证明在间皮瘤中具有抗肿瘤活性。然而，需要用于治疗实体瘤的另外的靶标。
[0010]
3.car t细胞疗法的挑战
[0011]
不幸的是，基于car t细胞的疗法的复杂性可能导致不希望的和不安全的作用。肿瘤外的作用，如神经毒性和急性呼吸窘迫综合征，是car t细胞疗法的潜在不良作用并且可能致命。细胞因子释放综合征(crs)是与car t细胞相关的最常见的急性毒性。当淋巴细胞被高度活化并释放出过量的炎性细胞因子时，发生crs。当测定这些因子时，有时在患有crs的患者中观察到白介素2、白介素6、白介素1β、gm-csf和/或c反应蛋白的血清升高。crs按严重性分级并诊断为1-4级(轻度至重度)之一，其中更严重的病例的临床特征为患者出现高烧、低血压、缺氧和/或多器官毒性。一项研究报道，用抗-cd19 car t细胞疗法治疗的急性淋巴细胞性白血病患者中有92％经历crs，并且50％的这些患者出现了3-4级的症状。
[0012]
因此，需要另外的基于car t细胞的疗法以增强有效癌症治疗的医疗设备。然而，必须设计出有效治疗癌症、同时将发生危险炎症反应(如crs)的风险降至最低的新car t细胞疗法。


技术实现要素：

[0013]
本披露描述了使用car t细胞来治疗癌症的组合物和方法。
[0014]
如下所述，在第一方面，本披露提供了一种编码嵌合抗原受体(car)的分离的核酸序列，其中该car包含对磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(gpc3)具有特异性的抗原结合结构域，其中该抗原结合结构域具有约100纳摩尔(nm)或更少的平衡解离常数(kd)，并且其中该car构建体不诱导表达gpc3的细胞中细胞因子的产生。
[0015]
在第一方面的一些实施例中，car抗原结合结构域包含抗体或其抗原结合片段。
[0016]
在第一方面一些实施例中，抗原结合结构域是fab或单链可变片段(scfv)。
[0017]
在第一方面一些实施例中，抗原结合结构域是包含seq id no：33或seq id no：34的核酸序列的scfv。
[0018]
在第一方面的一些实施例中，分离的核酸进一步编码跨膜结构域、共刺激结构域、和信号结构域。
[0019]
在第一方面的一些实施例中，其中跨膜结构域包含cd28跨膜结构域。
[0020]
在第一方面的一些实施例中，共刺激结构域包含cd28、4-1bb、cd3ζ、ox-40、icos、cd27、gitr、和myd88/cd40共刺激结构域中的一个或多个。
[0021]
在第一方面的一些实施例中，共刺激结构域包含cd28、4-1bb、和cd3ζ共刺激结构域中的一个或多个。
[0022]
在第一方面的一些实施例中，其中信号结构域包含编码csfr2信号肽的序列。
[0023]
在第一方面的一些实施例中，抗gpc3 car进一步包含铰链/间隔子结构域。
[0024]
在第一方面的一些实施例中，铰链/间隔子结构域是igg4p铰链/间隔子。
[0025]
在第一方面的一些实施例中，核酸序列包含seq id no：11、seq id no：12、seq id no：13、seq id no：14、seq id no：15、seq id no：16、seq id no：17、seq id no：18、或seq id no：26。
[0026]
在第二方面，本披露提供了一种包含抗原结合结构域的抗gpc3嵌合抗原受体
(car)，其中该抗原结合结构域包含含有重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)的抗体、fab、或scfv，其中该vh包含含有seq id no：37的氨基酸序列的cdr1、含有seq id no：38的氨基酸序列的cdr2、以及含有seq id no：39的氨基酸序列的cdr3，并且其中该vl包含含有seq id no：40或seq id no：43的氨基酸序列的cdr1、含有seq id no：41或seq id no：44的氨基酸序列的cdr2、以及含有seq id no：42或seq id no：45的氨基酸序列的cdr3。
[0027]
在第二方面的一些实施例中，vh包含seq id no：27或seq id no：29的氨基酸序列。
[0028]
在第二方面的一些实施例中，vl包含seq id no：28或seq id no：30的氨基酸序列。
[0029]
在第二方面的一些实施例中，抗gpc3 car进一步包含跨膜结构域、共刺激结构域、和信号结构域。
[0030]
在第二方面的一些实施例中，抗gpc3 car包含seq id no：3、seq id no：4、seq id no：5、seq id no：6、seq id no：7、seq id no：8、seq id no：9、seq id no：10、或seq id no：25的氨基酸序列。
[0031]
在第三方面，本披露提供了一种载体，该载体包含编码嵌合抗原受体(car)的核酸序列，其中该核酸序列包含seq id no：11、seq id no：12、seq id no：13、seq id no：14、seq id no：15、seq id no：16、seq id no：17、seq id no：18、seq id no：26、seq id no：33、或seq id no：34。
[0032]
在一些实施例中，本披露提供了包含第三方面的载体的细胞。
[0033]
在第四方面，本披露提供了一种细胞，该细胞包含编码嵌合抗原受体(car)的核酸序列，其中该car包含对磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(gpc3)具有特异性的抗原结合结构域，其中该抗原结合结构域具有约100纳摩尔(nm)或更少的平衡解离常数(kd)，并且其中该car构建体不诱导gpc3-细胞中细胞因子的产生。
[0034]
在第四方面的一些实施例中，核酸序列包含seq id no：11、seq id no：12、seq id no：13、seq id no：14、seq id no：15、seq id no：16、seq id no：17、seq id no：18、seq id no：26、seq id no：33、或seq id no：34。
[0035]
在第五方面，本披露提供了一种细胞，该细胞包含含有抗原结合结构域的抗gpc3嵌合抗原受体(car)，其中该抗原结合结构域包含含有重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)的抗体、fab、或scfv，其中该vh包含含有seq id no：37的氨基酸序列的cdr1、含有seq id no：38的氨基酸序列的cdr2、以及含有seq id no：39的氨基酸序列的cdr3，并且其中该vl包含含有seq id no：40或seq id no：43的氨基酸序列的cdr1、含有seq id no：41或seq id no：44的氨基酸序列的cdr2、以及含有seq id no：42或seq id no：45的氨基酸序列的cdr3。
[0036]
在第五方面的一些实施例中，vh包含seq id no：27或seq id no：29的氨基酸序列。
[0037]
在第五方面的一些实施例中，vl包含seq id no：28或seq id no：30的氨基酸序列。
[0038]
在第五方面的一些实施例中，car进一步包含跨膜结构域、共刺激结构域、和信号结构域。
[0039]
在第五方面的一些实施例中，car包含seq id no：3、seq id no：4、seq id no：5、
seq id no：6、seq id no：7、seq id no：8、seq id no：9、seq id no：10、或seq id no：25的氨基酸序列。
[0040]
在第五方面的一些实施例中，该细胞选自由以下组成的组：t细胞、自然杀伤(nk)细胞、细胞毒性t淋巴细胞(ctl)、和调节性t细胞。
[0041]
在第五方面的一些实施例中，该细胞在与表达gpc3的肿瘤细胞接触后表现出抗肿瘤免疫。
[0042]
在第六方面，本披露提供了一种治疗癌症的方法，该方法包括：向有需要的受试者施用有效量的细胞，该细胞包含含有抗原结合结构域的抗gpc3嵌合抗原受体(car)，其中该抗原结合结构域包含含有重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)的抗体、fab、或scfv，其中该vh包含含有seq id no：37的氨基酸序列的cdr1、含有seq id no：38的氨基酸序列的cdr2、以及含有seq id no：39的氨基酸序列的cdr3，并且其中该vl包含含有seq id no：40或seq id no：43的氨基酸序列的cdr1、含有seq id no：41或seq id no：44的氨基酸序列的cdr2、以及含有seq id no：42或seq id no：45的氨基酸序列的cdr3。
[0043]
在第六方面的一些实施例中，该方法进一步包括抑制肿瘤生长、诱导肿瘤消退、和/或延长受试者的存活。
[0044]
在第六方面的一些实施例中，该细胞是自体细胞。
[0045]
在第六方面的一些实施例中，自体细胞选自由以下组成的组：t细胞、自然杀伤(nk)细胞、细胞毒性t淋巴细胞(ctl)、和调节性t细胞。
[0046]
在第六方面的一些实施例中，癌症是实体瘤。
[0047]
在第六方面的一些实施例中，癌症是肝细胞癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、和/或鳞状细胞肺癌。
[0048]
在第六方面的一些实施例中，癌症是肝细胞癌。
[0049]
在第六方面的一些实施例中，该方法进一步包括向受试者施用有效量的抗tnfα抗体。
[0050]
根据以下的详细描述以及所附权利要求，将更全面地理解本发明的这些和其他特征以及优点。应注意权利要求的范围由其中的叙述定义，而不是由本说明书中阐述的特征和优点的具体讨论定义。
附图说明
[0051]
包括附图以提供对本披露的方法和组合物的进一步理解。附图展示了本披露的一个或多个实施例，并且与说明书一起用于解释本披露的原理和操作。
[0052]
图1a和1b.在癌症和正常组织中的gpc3表达。1a.肝细胞癌(hcc)、非小细胞肺癌(nsclc)、和卵巢癌中的抗gpc3抗体染色结果。1b.人结肠神经节组织的免疫组织化学(ihc)结果。
[0053]
图2.单链可变片段(scfv)的重可变区和轻可变区的比较。显示了gpc3-1和gpc3-2。
[0054]
图3a.结合至可溶性gpc3蛋白质的细胞表面gpc3 car。显示了kd值(用实线显示拟合)。
[0055]
图3b和3c.抗gpc3 scfv-fcs与可溶性gpc3蛋白质结合的表面等离子体共振。报告
了两种相互作用的ka、kd、和kd的平均值(用实线显示拟合)。
[0056]
图4a和4b.嵌合抗原受体(car)构建体体外施用至具有和不具有靶抗原的细胞后细胞因子的产生。gpc3 car t使抗原特异性细胞因子产生。将图例中按从上到下的顺序所列的每个构建体的细胞系从左到右显示。4a.显示了三种细胞因子的结果。ut，未转导的t细胞，是被激活和扩增但未被car转基因转导的供体t细胞。4b.显示了构建体子集的干扰素γ(ifn-γ)的结果。右侧图例显示了细胞类型(除hepg2之外均为阴性)。
[0057]
图5.car在hcc细胞系中的细胞毒性。右侧图例显示了所使用的构建体。e∶t比率，效应子∶靶标比率。ut，未转导的t细胞。
[0058]
图6.gpc3-1在表达低水平的gpc3的hcc细胞系中的细胞毒性。6a.通过流式细胞术评估gpc3在指定细胞系上的表达。6b.指定细胞系上的受体密度。6c.在3∶1(上图)和0.3∶1(下图)的效应子∶靶标比率下，gpc3-1对图例中指定的细胞系的细胞毒性。6d.在两个不同的效应子∶靶标比率下，gpc3-1对指定细胞系的kt50(至杀死50％靶标的时间)。
[0059]
图7.gpc3-2和gpc3-1 car t构建体的多功能性研究。scfv在每行的左侧示出，并且共刺激结构域在每个图表的顶部示出。
[0060]
图8a和8b.8a.嵌合抗原受体t细胞(car t)移植对体重的影响。右侧图例显示了所使用的构建体。bw，体重。act，过继性t细胞疗法。ut，未转导的t细胞。pbs，磷酸盐缓冲盐水。7b.ihc描绘了在gpc3 car-t处理的小鼠的肺组织中的car-t累积。
[0061]
图9.car t的施用对肿瘤体积的影响。右侧图例显示了所使用的构建体。act，过继性t细胞疗法。ut，未转导的t细胞。pbs，磷酸盐缓冲盐水。
[0062]
图10.car t的施用对存活的影响。右侧图例显示了所使用的构建体。act，过继性t细胞疗法。ut，未转导的t细胞。pbs，磷酸盐缓冲盐水。
[0063]
图11a-11d.使用不同共刺激结构域对gpc3-1 car t细胞分化和耗竭进行的荧光活化细胞分选(facs)研究。显示了脾(11a和11b)和肿瘤细胞(11c和11d)的结果。点图显示针对每种构建体，浸润每个器官的cd3+t细胞的频率(11a和11c)。在体内，具有4-1bb/cd3ζ(bz)信号传导结构域的gpc3 car-t具有比cd28/cd3ζ(28z)更多的中央记忆和更少的耗竭。使用的共刺激结构域在每个分图的顶部示出。x和y轴上显示了经测定的标志物。fsc，前向散射。em，效应记忆。cm，中央记忆。tn，初始t。
[0064]
图12.gpc3-1 car t在hep3b和hepg2肿瘤中的持久性。右侧图例显示了所使用的构建体。示出了cd3的百分比。act，过继性t细胞疗法。ut，未转导的t细胞。
[0065]
图13.gpc3-1bz处理对非荷瘤小鼠和荷瘤小鼠体重的影响。底部图例显示了所使用的构建体。bw，体重。act，过继性t细胞疗法。tz是gpc3-1 tz。ut，未转导的t细胞。pbs，磷酸盐缓冲盐水。
[0066]
图14.针对gpc3-1 bz和gpc3-1 tz细胞因子分析的肿瘤体积和出血时间。箭头表示随后的细胞因子响应研究的出血点。右侧图例显示了所使用的构建体。act，过继性t细胞疗法。ut，未转导的t细胞。pbs，磷酸盐缓冲盐水。
[0067]
图15.最大全身性细胞因子响应(ifn-γ)gpc3-1 car t处理。显示了第8天出血的数据，在第8天观察到最大细胞因子响应。ut，未转导的t细胞。pbs，磷酸盐缓冲盐水。
[0068]
图16.nod scidγ(nsg)免疫缺陷小鼠中的hep3b肿瘤组织的组织学。上，未处理的对照。下，用gpc3-1 bz car t细胞处理的动物。图像以20倍显示。
harper collins dictionary of biology[哈珀科林斯生物学词典](1991)。除非另外指明，否则如本文所用的以下术语具有以下赋予它们的含义。
[0081]
如本文所用的，术语“包含(comprise)”和“包括(include)”及其变体(例如，“包含(comprises/comprising)”、“包括(includes/including)”)应理解为表示包括陈述的组分、特征、元素或步骤，或一组组分、特征、元素或步骤，但不排除任何其他组分、特征、元素或步骤，或一组组分、特征、元素或步骤。术语“包含”、“基本上由......组成”和“由......组成”中的任何一个可以用其他两个术语中的任一个替换，同时保留其普通含义。
[0082]
除非上下文另有明确指明，否则如本文所用的单数形式“一个/种(a/an)”和“该”包括复数指示物。
[0083]
本文披露的百分比可以与披露的值相差
±
10％、20％或30％的量，并且仍在预期披露的范围内。
[0084]
除非另作说明或另外从上下文和本领域的普通技术人员所理解的明显可见，在本披露的不同实施例中表示为范围的本文的值可以采取所陈述范围内的任何具体值或子范围，至该范围的下限单位的十分之一，除非上下文另外明确指明。
[0085]
如本文所用的，范围和量可表示为“约”某个特定值或范围。术语“约”还包括该精确量。例如，“约5％”意指“约5％”并且也指“5％”。术语“约”还可以指给定值或值的范围的
±
10％。因此，例如，约5％也指4.5％-5.5％。除非另外从上下文显而易见，本文提供的所有数值被该术语“约”修饰。
[0086]
如本文所用的，术语“或”和“和/或”可描述彼此组合或排斥的多个组分。例如，“x、y、和/或z”可指单独的“x”、单独的“y”、单独的“z”、“x、y、和z”、“(x和y)或z”、“x或(y和z)”、或“x或y或z”。
[0087]
如本文所用的，术语“多肽”是指由通过酰胺键(也称为肽键)线性连接的单体(氨基酸)构成的分子。术语“多肽”指两个或更多个氨基酸的任何一条链或多条链。因此，肽、二肽、三肽、寡肽、“蛋白质”、“氨基酸链”或用于指具有两个或更多个氨基酸的一条链或多条链的任何其他术语被包括在“多肽”的定义中，并且术语“多肽”可以代替这些术语中的任何一个、或可与其互换使用。
[0088]
如本文使用的，“蛋白质”可指单个多肽，即，如上所定义的单个氨基酸链，而且还可以指相关联的两个或更多个多肽，例如，通过二硫键、氢键、或疏水相互作用来产生多聚体蛋白。
[0089]“分离的”物质，例如分离的核酸，是不在其天然环境中的物质，尽管该分离的物质不一定是纯化的。例如，分离的核酸是不会产生于或位于其天然或自然环境(如细胞)中的核酸。分离的物质可以通过任何合适的技术分离、分级、或至少部分纯化。
[0090]
如本文所用的，术语“抗体”和“其抗原结合片段”指能够结合至抗体靶向的指定抗原的抗体的至少最小部分，例如在由b细胞产生的典型抗体的情况下，重链(vh)的可变结构域和轻链(vl)的可变结构域的至少一些互补决定区(cdr)。抗体或其抗原-结合片段可以是或源自多克隆抗体、单克隆抗体、人抗体、人源化抗体、或嵌合抗体，单链抗体，表位结合片段，例如，fab、fab
′
和f(ab
′
)2、fd、fv、单链fv(scfv)、单链抗体、二硫键连接的fv(sdfv)、包含单独的或与相反结构域的一部分结合的vl或vh结构域(例如，整个vl结构域以及具有一个、两个或三个cdr的部分vh结构域)的片段、以及通过fab表达文库产生的片段。scfv分子
在本领域是已知的，并且描述于例如美国专利号5,892,019中。本披露涵盖的抗体分子可以是或源自免疫球蛋白分子的任何类型(例如，igg、ige、igm、igd、iga以及igy)、类别(例如，igg1、igg2、igg3、igg4、iga1以及iga2)或子类。
[0091]
如本文所用的，术语“多核苷酸”包括单个核酸以及多个核酸，并且指分离的核酸分子或构建体，例如信使rna(mrna)或质粒dna(pdna)。术语“核酸”包括任何核酸类型，如dna或rna。
[0092]
如本文所用的，术语“载体”可指引入宿主细胞的核酸分子，从而产生转化的宿主细胞。载体可包括允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，如复制起点。载体还可以包括一种或多种可选择的标记基因和本领域已知的其他遗传元件。此处设想的特定类型的载体可以与病毒缔合或掺入病毒中，以促进细胞转化。
[0093]“转化的”细胞或“宿主”细胞是已经通过分子生物学技术将核酸分子引入的细胞。本文考虑了可将核酸分子引入这样的细胞的所有技术，这些技术包括用病毒载体转染，用质粒载体转化，以及通过电穿孔、脂转染、和粒子枪加速引入裸dna。
[0094]
如本文所用的，术语“亲和力(affinity)”指抗原或靶标(如表位)与其同源结合结构域(如互补位)的结合强度的量度。如本文所用的，术语“亲合力(avidity)”指表位与互补位(即抗原与抗原结合结构域)的群体之间的复合物的总体稳定性。
[0095]
如本文所用的，当在治疗癌症的上下文中使用时，术语“治疗(treat/treatment/treatment of)”指减轻疾病病理、减轻或消除疾病症状、促进存活率提高、和/或减轻不适。例如，治疗可以是指当向受试者施用疗法时该疗法减少疾病症状、体征或病因的能力。治疗还指缓和或减少至少一种临床症状和/或抑制或延迟病症的进展和/或预防或延迟疾病或疾患的发作。
[0096]
如本文所用的，术语“受试者”、“个体”或“患者”指希望诊断、预后或治疗的任何受试者，尤其是哺乳动物受试者。哺乳动物受试者包括例如人、非人灵长类动物、狗、猫、豚鼠、兔子、大鼠、小鼠、马、牛、熊等。
[0097]
如本文所用的，术语施用的治疗性物质(如car t细胞)的“有效量”或“治疗有效量”是足以进行特别说明或预期目的，如治疗癌症的量。“有效量”可以根据所述目的凭经验以常规方式确定。
[0098]
2.综述
[0099]
本披露涉及使用嵌合抗原受体(car)细胞疗法来治疗癌症的组合物和方法。更具体地，本披露涉及car细胞疗法，其中转化的细胞(如t细胞)表达靶向磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(gpc3)的car。更进一步，本文披露的car构建体、表达这些构建体的转化的细胞、以及利用这些转化的细胞的疗法可提供稳健的癌症治疗，该癌症治疗具有细胞因子释放综合征(crs)或在非gpc3表达细胞中不加选择的细胞因子释放的最小化的风险。
[0100]
不希望受理论的束缚，gpc3被认为是以多种形态可行的癌症靶标，这些形态包括双特异性t细胞接合子、car细胞、以及单克隆抗体和抗体-药物缀合物(adc)。gpc3是一种癌胚抗原，是gpi连接的硫酸肝素蛋白聚糖。gpc3稳定wnt-fzd相互作用，从而刺激wnt信号传导。gpc3与patched竞争对hh的结合，这缓解了smoothened抑制并诱导gpc3降解。这两种途径均显示刺激肝细胞癌(hcc)生长。并且，gpc3表达水平显示与hcc的分期和分级相关。
[0101]
此外，据信gpc3是car细胞疗法的有希望的靶标。因此，已经如本文所述开发了抗
体和源自这些抗体的car构建体。
[0102]
3.car构建体设计
[0103]
本披露的car构建体可具有几种组分，其中许多组分可以基于所得car构建体的希望的或精确的功能来选择。除了抗原结合结构域，car构建体还可具有间隔子结构域、铰链结构域、信号肽结构域、跨膜结构域、以及一种或多种共刺激结构域。选择一种组分而不是另一种(即选择来自一种受体的特定共刺激结构域，相对于来自不同受体的共刺激结构域)可影响临床疗效和安全性。
[0104]
4.抗原结合结构域
[0105]
本文预期的抗原结合结构域可包括抗体或其一个或多个抗原-结合片段。一种预期的靶向gpc3的car构建体包含单链可变片段(scfv)，该scfv含有来自对gpc3具有特异性的一种或多种抗体的轻链和重链可变区，这些可变区直接连接在一起或经柔性接头(例如，具有1、2、3或更多个重复序列的ggggs的重复序列)连接在一起。
[0106]
如本文披露的靶向gpc3的car的抗原结合结构域对gpc3蛋白质的结合亲和力可以变化。如与抗体(通常希望这些抗体具有更高亲和力)相比，在car的情况下，结合亲和力与疗效之间的关系可能更细微。例如，当与低亲和力的变体相比时，对源自高亲和力scfv(具有0.56nm的解离常数)的受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ror1)-car的临床前研究导致治疗指数增加。相反地，已经报道了其他实例，其中，针对较低亲和力而工程化scfv改善了具有不同抗原密度的细胞之间的区别。这对改善可用于提高肿瘤组织与正常组织上差异表达的抗原的治疗特异性。
[0107]
可以使用多种方法确定抗原结合结构域的结合亲和力。在一些实施例中，可以使用排除亲合力效应的方法。亲合力效应涉及与多个靶表位同时相互作用的多个抗原-结合位点，通常涉及多聚结构。因此，亲合力在功能上代表多种相互作用的累积强度。排除亲合力效应的方法的一个实例是其中相互作用蛋白质的一种或两种是单体的/单价的任何方法，因为如果一个或两个配偶体仅含有单个相互作用位点，则多个同时相互作用是不可能的。
[0108]
5.间隔子结构域
[0109]
本披露的car构建体可具有间隔子结构域，以提供构象自由度，从而促进与靶细胞上的靶抗原结合。间隔子结构域的最佳长度可以取决于结合表位与靶细胞表面的接近度。例如，近端表位可能需要较长的间隔子，而远端表位可能需要较短的间隔子。除了促进car与靶抗原的结合以外，实现car细胞与癌细胞之间的最佳距离还可以有助于空间上阻塞大抑制分子进入car细胞和靶癌细胞之间形成的免疫突触。靶向gpc3的car可具有长间隔子、中等间隔子和短间隔子。长间隔子可包括免疫球蛋白g1(igg1)或igg4(天然的，或具有治疗性抗体中常见的修饰，如s228p突变)的ch2ch3结构域(约220个氨基酸)，而ch3区可单独用于构建中等间隔子(约120个氨基酸)。短间隔子可源自cd28、cd8α、cd3或cd4的区段(＜60个氨基酸)。短间隔子也可源自igg分子的铰链区。这些铰链区可源自任何igg同种型，并且可以含有或可以不含有在治疗性抗体中常见的突变，如以上提及的s228p突变。
[0110]
6.铰链结构域
[0111]
靶向gpc3的car也可具有铰链结构域。柔性铰链结构域是提供构象自由度以促进与肿瘤细胞上的靶抗原结合的短肽片段。其可单独使用或与间隔子序列结合使用。术语“铰
链”和“间隔子”经常可互换使用-例如，可将igg4序列视为“铰链”序列和“间隔子”序列(即，铰链/间隔子序列)。
[0112]
靶向gpc3的car可进一步包括包含信号肽的序列。信号肽的功能是促进细胞将car转移至细胞膜。实例包括igg1重链信号多肽、igκ或λ轻链信号肽、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体2(gm-csfr2或csfr2)信号肽、cd8a信号多肽、或cd33信号肽。
[0113]
7.跨膜结构域
[0114]
靶向gpc3的car可进一步包括包含跨膜结构域的序列。跨膜结构域可包括跨细胞膜的疏水α螺旋。跨膜结构域的特性没有如car构建体的其他方面一样经过细致地研究，但其可潜在地影响car表达并且与内源性膜蛋白的缔合。跨膜结构域可源自例如cd4、cd8α、或cd28。
[0115]
8.共刺激结构域
[0116]
靶向gpc3的car可进一步包括形成共刺激结构域的一个或多个序列。共刺激结构域是能够增强或调节免疫效应细胞的应答的结构域。共刺激结构域可包括例如来自cd3ζ(或cd3z)、cd28、4-1bb、ox-40、icos、cd27、gitr、cd2、il-2rβ和myd88/cd40中的一种或多种的序列。共刺激结构域的选择影响car细胞的表型和代谢特征。例如，cd28共刺激产生具有高水平的细胞溶解能力、白介素2(il-2)分泌和糖酵解的有效的、但短暂的效应子样表型。相比之下，用携带4-1bb共刺激结构域的car修饰的t细胞往往在体内扩增和持续更长时间，具有增加的氧化代谢，不易耗竭，并且具有增加的产生中央记忆性t细胞的能力。
[0117]
9.细胞
[0118]
基于car细胞的疗法可与多种细胞类型(如淋巴细胞)一起使用。可使用的特定细胞类型包括t细胞、自然杀伤(nk)细胞、自然杀伤t(nkt)细胞、恒定自然杀伤t(inkt)细胞、αβt细胞、γδt细胞、病毒特异性t(vst)细胞、细胞毒性t淋巴细胞(ctl)、和调节性t细胞(treg)。在一个实施例中，用于治疗受试者的car细胞是自体的。在其他实施例中，car细胞可来自遗传相似但不相同的供体(同种异体)。
[0119]
10.car细胞产生
[0120]
本披露的car构建体可包括本文所述的模块组分的一些组合。例如，在本披露的一些实施例中，car构建体包含gpc3-1 scfv抗原结合结构域。在一些实施例中，car包含gpc3-2 scfv抗原结合结构域。在本披露的一些实施例中，car构建体包含csfr2信号肽。在一些实施例中，car构建体包含携带s228p突变的igg4p铰链/间隔子结构域。在一些实施例中，car构建体包含cd28跨膜。
[0121]
可以使用的不同共刺激结构域是本披露的car构建体。在一些实施例中，car构建体包含来自cd3z的细胞内结构域的共刺激结构域。在一些实施例中，car构建体包含cd28共刺激结构域。在一些实施例中，car构建体包含4-1bb共刺激结构域。在一些实施例中，car构建体包含来自cd3z和cd28的共刺激结构域。在一些实施例中，car构建体包含来自cd3z和4-1bb的共刺激结构域。在一些实施例中，car构建体包含来自所有cd3z、cd28、和4-1bb的共刺激结构域。在一些实施例中，car构建体包含来自icos、ox-40、和/或gitr的共刺激结构域。
[0122]
11.car构建体评估
[0123]
基于安全性以及持久性和中央记忆的建立，比较和评估本披露的构建体。由于其改进的安全性，有利地评估了低亲和力(高解离率)的scfv gpc3-1。基于其改善的持久性和
有利的体内表型(更多的中央记忆)的贡献，有利地评估了4-1bb和cd3z共刺激结构域(两者在同一构建体中)。本披露的gpc3-1和gpc3-2 car与基于公开的靶向gpc3的car的构建体相比是有利的。评估的细节可见于实例中。
[0124]
12.实施例
[0125]
在一些实施例中，本披露提供了一种编码嵌合抗原受体(car)的分离的核酸序列。car包含对磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(gpc3)具有特异性的抗原结合结构域。抗原结合结构域具有约100纳摩尔(nm)或更少的平衡解离常数(kd)，并且car构建体不诱导gpc3-细胞中细胞因子的产生。在一些实施例中，抗原结合结构域包括抗体或其抗原结合片段。抗原结合结构域可以是fab或单链可变片段(scfv)。在一些实施例中，抗原结合结构域是包含seq id no：33或seq id no：34的核酸序列的scfv。
[0126]
在一些实施例中，car进一步包括跨膜结构域、共刺激结构域、和信号结构域。跨膜结构域可以是cd28跨膜结构域。共刺激结构域可以是cd28、4-1bb、cd3ζ、ox-40、icos、cd27、gitr、和myd88/cd40共刺激结构域中的一个或多个。在一个具体的实施例中，共刺激结构域是cd28、4-1bb、和cd3ζ共刺激结构域中的一个或多个。信号结构域可以是编码csfr2信号肽的序列。
[0127]
在一些实施例中，分离的核酸序列可包括铰链/间隔子结构域。铰链/间隔子结构域可以是igg4p铰链/间隔子。
[0128]
在一些具体的实施例中，编码嵌合抗原受体(car)的分离的核酸序列可具有seq id no：11、seq id no：12、seq id no：13、seq id no：14、seq id no：15、seq id no：16、seq id no：17、seq id no：18、或seq id no：26的序列。
[0129]
在其他实施例中，本披露提供了一种包括抗原结合结构域的抗gpc3嵌合抗原受体(car)。抗原结合结构域可以是包含重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)的抗体、fab、或scfv。在一些实施例中，vh可具有含有seq id no：37的氨基酸序列的cdr1、含有seq id no：38的氨基酸序列的cdr2、以及含有seq id no：39的氨基酸序列的cdr3。在一些实施例中，vl可具有含有seq id no：40或seq id no：43的氨基酸序列的cdr1、含有seq id no：41或seq id no：44的氨基酸序列的cdr2、以及含有seq id no：42或seq id no：45的氨基酸序列的cdr3。
[0130]
在一些实施例中，vh可以是seq id no：27或seq id no：29的氨基酸序列，并且vl可以是seq id no：28或seq id no：30的氨基酸序列。在一些实施例中，car可进一步具有跨膜结构域、共刺激结构域、和信号结构域。
[0131]
在一些具体的实施例中，抗gpc3 car可具有seq id no：3、seq id no：4、seq id no：5、seq id no：6、seq id no：7、seq id no：8、seq id no：9、seq id no：10、或seq id no：25的氨基酸序列。
[0132]
在其他实施例中，本披露提供了一种包含编码嵌合抗原受体(car)的核酸序列的载体。核酸序列可以是seq id no：11、seq id no：12、seq id no：13、seq id no：14、seq id no：15、seq id no：16、seq id no：17、seq id no：18、seq id no：26、seq id no：33、或seq id no：34。
[0133]
在其他实施例中，本披露提供了一种包含载体的细胞，该载体具有seq id no：11、seq id no：12、seq id no：13、seq id no：14、seq id no：15、seq id no：16、seq id no：
carcinoma)。
[0141]
在一个实施例中，此处预期用于治疗的癌症包括在癌细胞的细胞表面上表达gpc3的任何癌症。在一个具体实例中，预期用于本文的治疗的癌症包括肝细胞癌、非小细胞肺癌、卵巢癌和鳞状细胞肺癌。
[0142]
14.治疗方法
[0143]
本发明的car修饰的细胞(如car t细胞)可单独施用或作为具有稀释剂和/或与细胞因子或细胞群体缔合的其他组分的药物组合物施用。简言之，本发明的药物组合物可包括例如如本文所述的cart细胞、以及一种或多种药学上或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。此类组合物可以包含缓冲液，如中性缓冲盐水、缓冲盐水等；硫酸盐；碳水化合物，如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或右旋糖酐、甘露醇；蛋白质、多肽或氨基酸，如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，如edta或谷胱甘肽；辅助剂(例如氢氧化铝)；以及防腐剂。本发明的药物组合物可适于治疗(或预防)。
[0144]
还可以将car修饰的细胞与一种或多种另外的疗法一起施用。在一个实施例中，另外的疗法可包括抗细胞因子抗体。例如，一种或多种抗tnfα可被用于在较高的car t剂量(其可能与crs样症状和体重减轻相关)下减弱毒性并促进抗肿瘤活性。
[0145]
在一个特定实施例中，预期的治疗方案可包括一种或多种生物组分，如car t细胞和抗癌症抗体和/或化学治疗组分。例如，预期治疗方案可另外包括免疫检查点抑制剂(ici)，如靶向pd-1/pd-l1轴(pdx)的免疫检查点抑制剂，以及其他免疫肿瘤学(io)治疗，如免疫系统激动剂。
[0146]
预期的抗体包括抗pd-l1抗体(如度伐鲁单抗(durvalumab)(medi4736)、阿维鲁单抗(avelumab)、阿特珠单抗(atezolizumab)、kno35)，抗pd-1抗体(如纳武单抗(nivolumab)、派姆单抗、regn2810、shr1210、ibi308、pdr001、抗pd-1、bgb-a317、bcd-100、和js001)，以及抗ctla4抗体(如曲美木单抗(tremelimumab)或伊匹单抗(ipilimumab))。本文还预期了另外的抗体。本文还预期了任何治疗有效的抗体子部分。
[0147]
关于用于本文提供的方法中的度伐鲁单抗(或其片段)的信息可以见于美国专利号8,779,108；9,493,565；和10,400,039中，将这些专利的披露内容通过引用以其全文并入本文。在一个特定方面中，用于本文提供的方法中的度伐鲁单抗或其抗原结合片段包含如在前述美国专利中披露的2.14h9opt抗体的可变重链和可变轻链cdr序列。
[0148]
关于用于本文提供的方法中的曲美木单抗(或其抗原结合片段)的信息可以见于美国专利号6,682,736(其中曲美木单抗被称为11.2.1)中，将该专利的披露内容通过引用以其全文并入本文。
[0149]
本文预期的另外的治疗剂(化疗剂或生物制剂)包括但不限于顺铂/吉西他滨(gemcitabine)或甲氨蝶呤(methotrexate)、长春花碱(vinblastine)、adriamycin
tm
(阿霉素(doxorubicin))、顺铂(mvac)、基于卡铂的方案、或单剂紫杉烷(taxane)或吉西他滨、替莫唑胺(temozolomide)、或达卡巴嗪(dacarbazine)、长春氟宁(vinflunine)、多西他赛(docetaxel)、紫杉醇(paclitaxel)、白蛋白结合紫杉醇(nab-paclitaxel)、维莫非尼(vemurafenib)、厄洛替尼(erlotinib)、阿法替尼(afatinib)、西妥昔单抗(cetuximab)、贝伐单抗(bevacizumab)、厄洛替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、和/或培美曲塞(pemetrexed)。另外的实例包括靶向dna损伤修复系统的药物，如聚(adp-核糖)聚合酶1
(parp1)抑制剂以及抑制wee1蛋白激酶活性、atr蛋白激酶活性、atm蛋白激酶活性、极光蛋白激酶b活性、和dna-pk活性的治疗剂。
[0150]
可以将本文预期的任何治疗性组合物或方法与本文提供的任何其他治疗性组合物和方法中的一种或多种进行组合。
[0151]
在一些实施例中，本披露提供了一种治疗癌症的方法，该方法包括向有需要的受试者施用有效量的包含含有抗原结合结构域的抗gpc3嵌合抗原受体(car)的细胞。抗原结合结构域可以是包含重链可变区(vh)和轻链可变区(vl)的抗体、fab、或scfv。vh可包括含有seq id no：37的氨基酸序列的cdr1、含有seq id no：38的氨基酸序列的cdr2、以及含有seq id no：39的氨基酸序列的cdr3。vl可包括含有seq id no：40或seq id no：43的氨基酸序列的cdr1、含有seq id no：41或seq id no：44的氨基酸序列的cdr2、以及含有seq id no：42或seq id no：45的氨基酸序列的cdr3。在一些实施例中，该方法进一步抑制肿瘤生长、诱导肿瘤消退、和/或延长受试者的存活。
[0152]
在一些实施例中，该细胞是自体细胞。例如，自体细胞可以选自由以下组成的组：t细胞、自然杀伤(nk)细胞、细胞毒性t淋巴细胞(ctl)、和调节性t细胞。
[0153]
在一些实施例中，通过该方法治疗的癌症是实体瘤。例如，癌症可以是肝细胞癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、和/或鳞状细胞肺癌。在一个具体的实施例中，癌症是肝细胞癌。
[0154]
本披露提供了一种治疗癌症的方法，该方法包括向有需要的受试者施用有效量的包含抗gpc3嵌合抗原受体(car)的细胞和有效量的抗tnfα抗体。
[0155]
应理解，本文所述的说明书的特定方面不限于呈现的具体实施例，并且可以变化。还应理解的是，本文使用的术语仅用于描述特定方面的目的，并且并不旨在进行限制，除非本文特别定义。此外，如技术人员将认识到的，本文披露的特定实施例可与本文披露的其他实施例结合而不受限制。
[0156]
实例
[0157]
以下实例说明了本披露内容的具体实施例及其各种用途。阐述它们仅出于解释目的并且不应以任何方式解释为限制本披露内容的范围。表1提供了术语的描述。
[0158]
表1.术语的描述
[0159]
[0160][0161]
实例1：gpc3的表达
[0162]
方法
[0163]
gpc3 ihc使用了小鼠单克隆抗人gpc3抗体gc33(文塔纳公司(ventana))。使用抗小鼠hrp进行二次染色。将表示肝细胞癌(hcc)、非小细胞肺癌(nsclc)和卵巢癌、或人结肠神经节组织的人组织微阵列(tma，美国贝曼姿公司(biomax))针对gpc3表达进行染色，并且通过显微镜检查来确定染色强度和模式。
[0164]
结果
[0165]
gpc3在80％hcc、30％鳞状肺癌、和47％卵巢透明细胞癌中过表达。然而，gpc3不能通过免疫组织化学在正常肝组织(包括肝硬化和增生样品)中检测到，并且在正常组织(例如，肺)中具有低表达。参见图1a和1b。
[0166]
实例2：scfv的开发和亲和力研究。
[0167]
概要
[0168]
在本实例中，开发了抗gpc3 scfv并确定了其对gpc3的相对亲和力。
[0169]
方法
[0170]
gpc3-1(seq id no：1)和gpc3-2(seq id no：2)具有几乎相同的vh结构域(seq id no：27和29)，但具有不同的v
l
结构域(seq id no：28和30；参见图2)。gpc3-2具有完整种系框架，而gpc3-1没有。
[0171]
通过可溶性重组gpc3蛋白质与jurkat细胞表面上表达的gpc3-1和gpc3-2 car的细胞表面结合来确定表观结合亲和力。使用慢病毒载体在jurkat细胞的表面上表达car构建体。用不同浓度的重组his标记的gpc3蛋白质(r&d系统公司(r&d systems))染色细胞。通过用荧光缀合的抗his-标记第二抗体染色来可视化结合的gpc3，并且通过流式细胞术分析细胞。将结合曲线拟合至简单的单位点结合模型以确定表观kd。
[0172]
使用biacore表面等离子体共振系统以及gpc3-1和gpc3-2scfv-fc融合蛋白确定结合亲和力的替代量度。将gpc3-1和gpc3-2的纯化的scfv-fc融合分子共价偶联至胺反应性spr传感器芯片(cm5，ge医疗集团(ge healthcare))。对于gpc-1，可溶性gpc3蛋白质(r&d系统公司)以14、28、57、114、和228nm的浓度以30μl/min的速率流过芯片表面，并监测相互
作用。对于gpc3-2，以4、7、14、28、和57nm的浓度以相同的流速流过芯片表面。使用bia评价软件(ge医疗集团)和简单的1∶1朗缪尔结合模型拟合数据，其中全局拟合r
max
并且局部拟合ka、kd和kd。
[0173]
结果
[0174]
在评估可溶性gpc3与jurkat细胞表面上表达的gpc3-1和gpc3-2 car的结合的实验中，对于gpc3-1，kd值为约15nm并且对于gpc3-2，kd值为约5nm(参见图3a)。在使用与基于细胞的结合相同的gpc3蛋白质和纯化的gpc3-1/gpc3-2 scfv-fc融合蛋白的表面等离子体共振实验中，对于gpc3-1和gpc3-2，kd值分别为约73nm和11nm。参见表1以及图3b和3c。
[0175]
表1.单价结合值。
[0176][0177]
表2显示了四种scfv的报告的kd值。
[0178]
表2.解离常数(kd)。
[0179]
scfvkd(nm)gpc3-173gpc3-211gpc3-30.5gpc3-412
[0180]
实例3.car构建体的开发和体外研究。
[0181]
概要
[0182]
在本实例中，开发了抗gpc3 car构建体并测试了所得细胞因子活性和多功能性。
[0183]
方法
[0184]
car的结构。对于所有car构建体，使用csfr2信号肽(在许多临床阶段car t构建体中使用)。igg4p(s228p突变)铰链结构域用作scfv和膜之间的“间隔子”，并且使用cd28跨膜结构域。在细胞内，测试不同的共刺激结构域(包括cd28、4-1bb、和cd3ζ共刺激结构域的不同组合)。还尝试了使用来自诱导型t细胞共刺激物(icos)、ox40、和糖皮质激素诱导型tnfr家族相关基因(gitr)的共刺激结构域的构建体。seq id no：3-10中显示了gpc3-1和gpc3-2 car构建体的序列，seq id no：11-18中显示了相应的核酸序列。
[0185]
构建针对gpc3的其他已知car(基于gpc3-3和gpc3-4scfv)，以与gpc3-1和gpc3-2 car构建体进行比较。gpc3-3 car含有短的igg1铰链、cd28跨膜结构域、4-1bb共刺激结构域、和cd3ζ细胞内结构域。还开发了另一种具有cd28和4-1bb共刺激结构域两者的gpc3-3 car构建体。gpc3-4 car构建体包含igg4p铰链、cd28跨膜结构域、和4-1bb共刺激结构域。seq id no：19-21中显示了gpc3-3 car和gpc3-4 car的序列，seq id no：22-24中显示了相
应的核酸序列。
[0186]
car t细胞产生。将纯化的人t细胞以0.2x106个细胞/ml+il-2(300iu/ml)的浓度接种在含有5％人血清和1％青霉素-链霉素的aim-v培养基中。将t细胞用抗cd3/抗cd28 dynabead(英杰公司(invitrogen))激活，并且在24小时后，通过旋转接种(spinoculation)来进行转导。将慢病毒添加至孔(m.o.i.100)中，并且将板在2000rpm、37℃下离心2小时并且放置在37℃、5％co2培养箱中。必要时，将细胞分开以维持约0.5-1x106个细胞/ml的细胞密度。在转导后7天才对car-t细胞进行免疫分型，并在转导后约11天在体外和体内功能测定中评估car-t细胞。
[0187]
测试的细胞系。用具有不同car构建体的car t细胞处理多种细胞类型。对于所有细胞因子研究，将5x104个car-t细胞与靶细胞以1∶1比率在rpmi 10％fcs中共培养。24小时后，收集上清液。通过meso scale discovery 4-plex试剂盒分析细胞因子以检测ifn-γ、il-2、tnf-α、和il-10。确定细胞因子的浓度(皮克/毫升)。
[0188]
使用细胞阻抗监测技术(xcelligence)进行细胞毒性研究。铺板3x104个靶细胞，并在24小时后，以3、1或0.3的效应子与靶标(e∶t)比率添加car-t细胞。确定用多种car构建体处理后的hep3b、huh7和snu-182细胞的归一化细胞指数。hep3b表达高的gpc3(14k/细胞)，huh7表达中/低的gpc3(7k/细胞)，snu-182对gpc3(0/细胞)是阴性的。
[0189]
在car构建体上还进行了多功能性研究。此处，在golgi stop和针对脱颗粒标志物cd107a的荧光团标记的抗体存在下，将gpc3-1 bz或指定的car-t细胞与hep3b或a375共培养6小时。靶标接合诱导car-t脱颗粒，并且随后结合培养基中存在的荧光标记的抗cd107。通过流式细胞术检测的cd107积累与脱颗粒的程度成正比，并且该积累表明了靶细胞的裂解。由于细胞是在golgi stop存在下孵育的，效应细胞因子(ifn-γ、il-2、tnf-α)的产生也可通过细胞内染色评估。用flowtop生成结合每种功能(cd107a、ifn-γ、il-2、和tnf-α)的布尔(boolean)门控，并且用spice分析软件生成结果的饼形图。
[0190]
结果
[0191]
观察到相比于gpc3-1，gpc3-2和gpc3-3构建体的总体上更高程度的tnfα和il-2输出。用具有gpc3-1和gpc3-2 car构建体的car t细胞进行处理产生了抗原-特异性细胞因子。在另一方面，即使在gpc3阴性的细胞类型中，gpc3-4 bz构建体也诱导细胞因子。在不存在靶标的情况下，gpc3-1和gpc3-2构建体不产生细胞因子。细胞因子产生似乎是抗原-密度和亲和力依赖性的。参见图4a和4b。
[0192]
gpc3-1和gpc3-2构建体仅对表达gpc3的细胞具有细胞毒性，而gpc3-4构建体对gpc3阳性细胞(hep3b和huh7)和gpc3阴性细胞(snu-182)两者都具有细胞毒性。较低亲和力的car(gpc3-1 bz)显示与高亲和力的(gpc3-2 bz)car相等的细胞毒性。参见图5。
[0193]
gpc3-1 bz显示针对表达低水平gpc3的hcc细胞系的细胞毒性。测试的所有靶细胞均易受3∶1和0.3∶1的e∶t比率下的gpc3-1杀伤，其中仅在0.3∶1e∶t比率下具有较低gpc3表达的细胞系之一中观察到杀伤减少。然而，用我们的同基因对gpc3高和低hep3b细胞系观察到的完全可比的杀灭率表明，降低的抗原密度本身并不是限制car-t介导的细胞溶解的关键因素。参见图6。
[0194]
gpc3-2和gpc3-1 car t细胞两者均是多功能的，与使用的细胞内结构域无关。gpc3-1 bz car t细胞是多功能的，其中大部分细胞显示2+功能。而且，相比具有4-1bb细胞
内结构域的car t细胞，具有cd28的car t细胞在体外的多功能性更低。参见图7。
[0195]
结论
[0196]
用gpc3-1进行处理导致测试的car的最低总体细胞因子产生。gpc3-1和gpc3-2两者均是多功能的并且对表达gpc3的细胞具有特异性细胞毒性。
[0197]
实例4：多个car构建体在肝细胞癌动物模型中的体内研究
[0198]
概要
[0199]
在本实例中，体内测试抗gpc3 car构建体，并且比较其对体重、肿瘤、和存活的影响。
[0200]
方法
[0201]
将5x106个hep3b细胞植入nsg小鼠(10只小鼠/组)的侧腹。当肿瘤达到150mm3的平均体积时，向小鼠给予400万个gpc3-2 bz或gpc3-1 bz。监测体重、肿瘤体积(2x/周)和存活。向重量下降至80％与90％之间的动物给予食物补充；对重量下降至低于80％的动物执行安乐死。通过大于1500mm3的肿瘤大小确定存活事件(死亡)。每个实验进行两次。
[0202]
结果
[0203]
使用高亲和力的gpc3-2构建体(而不是较低亲和力的gpc3-1构建体)观察到体重减轻，这表明较低亲和力的结合剂在体内毒性较小。基于gpc3-2的car t细胞在与基于gpc3-1的car t的体内剂量相等的剂量下是不耐受的。gpc3-2 bz的更大程度的毒性与正常小鼠肺中car t细胞的广泛浸润有关。在用gpc3-1 bz处理的小鼠的肺中，仅发现了中等水平的浸润。参见图8a和8b。
[0204]
gpc3 car t诱导nsg小鼠中的hep3b肿瘤消退。gpc3-1 bz显示比gpc3-3 bz和gpc3-4 bz优越的抗肿瘤活性。参见图9。
[0205]
gpc3-1和gpc3-2 car t将荷瘤nsg小鼠的存活延长至比gpc3-3或gpc3-4 car t更大的程度；p＜0.01，相对于gpc3-3 bz；kaplan-meier w/mantel cox对数秩。参见图10。类似地，在体外或体内，确定wpre的缺失对gpc3-1 bz细胞无负面功能影响。
[0206]
结论
[0207]
在测试的car中，gpc3-1 bz和gpc3-2 bz显示最大的抗肿瘤活性并且提供最大的存活益处。gpc3-1 bz显示比gpc3-2 bz更少的毒性和向正常组织的浸润。
[0208]
实例5：gpc3-1 car构建体的体内比较
[0209]
概要
[0210]
在本实例中，在体内测试并比较了包含不同信号传导结构域的多个gpc3-1 car构建体。
[0211]
方法
[0212]
分化和耗竭分析。研究了多个gpc3-1 car构建体的分化和耗竭。用具有不同信号传导结构域(tz＝gpc3-1 tz；bz＝gpc3-1 bz；28z＝gpc3-1 28z)的car-t细胞处理具有hep3b肿瘤的小鼠，并且在细胞注射7天后通过流式细胞术分析脾和肿瘤。使用检测脾细胞和肿瘤细胞中的多种标志物的facs来测定分化和耗竭。通过cd62l和cd45ro的联合表达来分析t细胞的分化状态(cd62l+/cd45ro-＝初始；cd62l+/cd45ro+＝中央记忆；cd62l-/cd45ro+＝效应记忆；cd62l-/cd45ro-＝再表达cd45ra的效应记忆细胞(emra))。cd3％被用作持久性和扩增的量度。
[0213]
给小鼠注射5x106个hep3b细胞以建立平均大小为150mm3的肿瘤。向非荷瘤小鼠或具有hep3b肿瘤的小鼠给予400万个gpc3-1 bz或gpc3-1 tz t细胞。测量荷瘤小鼠和非荷瘤小鼠两者的体重影响，直到处理后35天。还每周两次测定肿瘤体积。在处理后定期给动物放血以分析血液中的ifn-γ和tnf-α。在car-t给予后8天，在血清中分析细胞因子。每个实验进行两次。
[0214]
为研究在gpc3+荷瘤(hep3b hcc系)和非荷瘤nsg小鼠中周围神经毒性的可能性，向动物施用人抗gpc3 car-t细胞。对具有用gpc3-1 bz处理的hep3b肿瘤的动物的肿瘤和肠道神经组织进行组织学检查。
[0215]
表3.研究设计
[0216][0217]acar-t应答峰后，但存在可收获的肿瘤；*经选择以完全消退hep3b肿瘤的剂量；**gpc3-1 tz含有功能性结合部分，而不具有信号传导结构域；**gpc3-1 bz含有功能性结合和信号传导结构域。
[0218]
结果
[0219]
在体内，具有4-1bb/cd3ζ(bz)信号传导结构域的gpc3 car t显示比cd28/cd3ζ(28z)更多的中央记忆和更少的耗竭。结果显示，脾中的gpc3-1bz car t细胞的分化程度低于gpc3-128z car t细胞，同时保留了在存在该抗原的肿瘤中完全激活和分化的能力。参见图11a-11d。
[0220]
gpc3-1 bz表现出持久性。激活/耗竭标志物lag3和pd1的表达证实，gpc3-1 bz car t细胞在外周中维持较少的激活/耗竭细胞。参见图12。
[0221]
在肿瘤消退剂量下，gpc3-1 bz不在荷瘤小鼠或非荷瘤小鼠中引起体重减轻。参见图13。
[0222]
仅对于gpc3-1 bz car t细胞处理的小鼠观察到完全的肿瘤消退。参见图14。
[0223]
检测到了最低限度的全身性细胞因子(在第8天，输注后7天测量的瞬时升高的ifn-γ和tnf-α)。在有效的car t剂量下，检测到最低限度和瞬时的全身性细胞因子，并且未观察到体重减轻。消退剂量的car治疗后，人ifn-γ和tnf-α是在血清中以升高水平瞬时检测到的唯一细胞因子。另外的人或小鼠细胞因子(包括hil-2、mil-10、mil-6、mtnfα和mifnγ)的水平低于可检测限(bdl)。参见图15。
[0224]
肿瘤消退伴随着肿瘤中广泛的t细胞浸润和扩增。肿瘤变小(由于赘生性细胞减
少)，并且坏死并被单核细胞浸润。使用的小鼠缺乏淋巴细胞；因此，假设任何单核细胞浸润均为人car-t细胞。参见图16。仅表达低水平gpc3的肠道神经系统未受影响。参见图17。在肺和肝中观察到最低限度的单核细胞浸润(数据未显示)。
[0225]
结论
[0226]
如与具有其他信号传导结构域的构建体相比，gpc3-1 bz构建体具有持久性，促进中央记忆应答，并且显示出增加的抗肿瘤活性。此外，处理仅引起一些细胞因子的短暂升高但不引起体重减轻。处理后，肿瘤被t细胞浸润并变得坏死，而正常组织不受影响。
[0227]
实例6：gpc3-1 bz car t细胞的进一步表征
[0228]
概要
[0229]
在本实例中，gpc3-1 bz car t细胞在多种肿瘤类型和具有不同gpc3表达水平的细胞的处理方面被进一步表征。分析细胞因子响应。
[0230]
方法
[0231]
在具有各种gpc3表达水平的肿瘤类型中研究了响应于gpc3-1 bz car t细胞处理的细胞因子水平。还对代表性hep3b和huh7肿瘤异种移植物进行了免疫组织化学。
[0232]
还对肿瘤类型内的细胞进行了gpc3表达分析。染色强度以1-4的等级分级，其中1是最低强度，4是最高强度。染色强度2指示低/中等强度。通过facs确定gpc3的相对表达。通过用荧光团标记的抗gpc3抗体进行表面染色和随后进行流式细胞术分析来确定gpc3在hep3b细胞上的表达。基于gpc3表达，将hep3b细胞门控为低、中或高表达，并且绘制每个门控中gpc3的频率。
[0233]
通过elisa确定细胞因子水平。将细胞系与gpc3-1 bz car t细胞以1∶1的比率在rpmi 10％fcs中共培养。24小时后，收集上清液，并且通过meso scale discovery 4-plex试剂盒分析细胞因子以检测ifn-γ、il-2、tnf-α、和il-10。在细胞因子分析前，将细胞暴露于gpc3-1 bz t细胞24小时。在gpc3-1 bz处理后，测试不同细胞类型中的细胞因子水平。
[0234]
结果
[0235]
在表达gpc3的细胞系中，gpc3-1 bz car t细胞诱导的细胞因子输出与表面gpc3表达成比例。参见图18-22。
[0236]
gpc3-1 bz car t细胞未在gpc3阴性或正常组织中引起细胞因子响应。参见图23和24。
[0237]
结论
[0238]
gpc3-1 bz car t细胞诱导细胞因子输出，以与所处理细胞的gpc3表达成比例的水平。
[0239]
实例7：用gpc3-1 car t细胞构建体和抗细胞因子抗体处理
[0240]
概要
[0241]
在本实例中，尝试将gpc3-1 car t细胞疗法与抗细胞因子抗体结合。
[0242]
方法
[0243]
用gpc3-1 car t细胞疗法和抗细胞因子抗体的不同组合处理肿瘤。在100μg抗人tnfα(戈利木单抗(golimumab)，杨森公司(janssen))或抗小鼠il-6(bio x cell公司)存在或不存在下，将具有hep3b肿瘤的小鼠(10只小鼠/组)用500万个gpc3-1 bz或gpc3-1 tz转导的细胞(tz＝截短的cd3ζ，非信号传导阴性对照)处理。
[0244]
hcc的抗药性模型，即huh7，被用于测试高剂量(1e7-3e7)的gpc3-1 car t结合两个不同时间的抗tnf-α施用。将具有huh7肿瘤的小鼠(10只小鼠/组)用指定剂量的gpc3-1 bz t细胞(1000或3000万个细胞)处理，并且在car t处理的同一天(第0天)、或开始处理后两天(第2天)给予100μg抗tnfα。
[0245]
结果
[0246]
阻断tnf-α但不阻断il-6消除了gpc3-1 bz的疗效。参见图25。
[0247]
需要更高的car t细胞剂量来引起抗药性hcc模型huh7中的肿瘤生长抑制，但更高的剂量也与crs样症状和体重减轻相关。使用延迟给药，逆转了体重减轻，以用抗tnfα实现肿瘤生长抑制。参见图26a-26c。
[0248]
结论
[0249]
抗tnfα治疗与gpc3-1 bz疗法的结合使用可减轻高剂量car t细胞疗法的体重减轻影响。
[0250]
本文描述的实施例可以在不存在本文未具体披露的任何一个或多个元素、一个或多个限制的情况下实践。将已经采用的术语和表达用作描述性术语，而不是限制性的，并且不意图在使用这样的术语和表达时排除所示出和描述的特征或其部分的任何等同物，但是应当认识到，在所要求保护的实施例的范围内可以进行各种修改。因此，应当理解，尽管已经通过实施例、任选特征具体披露了本发明，但是本领域技术人员可以对本文披露的概念进行修改和变化，并且认为这样的修改和变化可以处于由说明书和所附权利要求书限定的这些实施例的范围内。尽管本披露内容的一些方面可被视为特别有利，但是预期本披露不限于本披露的这些特定方面。
[0251]
如果组的一个、多于一个或全部成员存在于、使用于或以其他方式相关于给出的产品或方法，则在该组的一个或多个成员之间包括“或”的权利要求或说明书被认为是满意的，除非有相反的指明或另外从上下文明显可见。本披露包括实施例，在这些实施例中，组中的恰好一个成员存在于、使用于或以其他方式相关于给出的产品或方法。本披露包括实施例，在这些实施例中，组中的多于一个或全部成员存在于、使用于或以其他方式相关于给出的产品或方法。
[0252]
此外，本披露涵盖其中将来自一个或多个所列权利要求的一个或多个限制、元素、条款和说明性术语引入另一权利要求中的所有变化、组合和排列。例如，可以对附属于另一权利要求的任何权利要求加以修改，以使其包括一个或多个在附属于同一基础权利要求的任何其他权利要求中所见的限制。在元素以列表(例如以马库什组(markush group)形式)呈现的情况下，还披露了元素的每个亚组，并且可以从该组中去除任何元素。
[0253]
应当理解，通常，在本披露或本披露的方面被称作包含特定元素和/或特征的情况下，本披露或本披露的方面的某些实施例由此类元素和/或特征组成或基本上由其组成。出于简洁目的，这些实施例没有在本文以文字具体地陈述。
[0254]
本说明书中提及的全部专利和出版物通过引用以相同的程度并入本文，如同每份单独的专利和出版物具体地且个别地指出通过引用并入。在本技术的任何部分中的任何参考文献的引用或标识不应被解释为承认这样的参考文献可用作针对本发明的现有技术。
[0255]
表3.实例中使用的序列。
[0256]
[0257][0258]
表4.序列
[0259]
[0260]
[0261]
[0262]
[0263]
[0264]
[0265]
[0266]
[0267]
[0268]
[0269]