磷脂酰肌醇聚糖-3特异性修饰的适体及其用途的制作方法

1.本发明涉及磷脂酰肌醇聚糖-3(gpc3)特异性修饰的适体，以及使用该适体预防或治疗肝癌。


背景技术：

2.肝癌统称为原发性恶性肿瘤，其原发性地发生在肝脏中。其中，起源于肝细胞的“肝细胞癌”的比例为约77％，胆管癌的比例为16％，并且其他癌少见，并且因此肝细胞癌(hcc)占肝癌的绝大部分。肝细胞癌的主要原因是慢性乙型肝炎、慢性丙型肝炎、肝硬化和酒精性肝病。
3.由于肝癌的治疗大多不进行外科或活组织检查，因此不容易获取组织样品。需要考虑的临床数据，即伴有慢性肝炎或肝硬化的临床数据，比其他癌症多，并且因此临床研究不容易。出于这个原因，与其他癌症相比，对肝癌的研究相对不足。
4.此外，肝癌由于其生物学特点，即伴有慢性肝炎和肝硬化——其是相关疾病——并且在早期通过侵入周围血管而迅速进展，因此难于治疗。
5.肝细胞癌的治疗包括肝切除或肝移植、局部治疗、经动脉化疗栓塞和其他经动脉疗法、放射疗法、全身疗法等。全身疗法拟用于因诸如淋巴结或肺转移的非肝转移而无法用局部治疗进行治疗的患者，并且组合化疗主要用于此类患者。然而，已知化疗的客观应答率低于10％，并且没有证据表明化疗将导致生存期的延长。
6.此后，已经揭示肝细胞癌是高度血管性肿瘤，并且因此开发了主要靶向血管内皮细胞生长因子受体(vegfr)的靶向疗法，如多吉美(nexavar)(化学名：索拉非尼(sorafenib))和乐卫玛(lenvima)(化学名称：乐伐替尼(lenvatinib))。这些疗法已成为晚期和转移性肝细胞癌的可选治疗。
7.但是，由于在早期症状很少，因此在癌症进展和症状出现后开始治疗。由于肝细胞癌的这种性质，需要对于晚期hcc有效的治疗方法。还需要对现有疗法的补充疗法或新的疗法机制。
8.同时，磷脂酰肌醇聚糖-3(gpc3)——其是控制细胞分裂和生长的糖基-磷脂酰肌醇(gpi)锚定的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(hspg)——属于磷脂酰肌醇聚糖家族。gpc3由n-端亚基和c-端亚基组成，并且已知参与wnt、igf、fgf、和tgf-β2信号传导通路。gpc3是hcc特异性标志物，并且已经研究了许多靶向gpc3的抗癌剂。
9.目前，许多制药公司正在开发针对gpc3的单克隆抗体(mab)、抗体药物缀合物(adc)和嵌合抗原受体t细胞(car-t)，其目前处于临床前或临床阶段。然而，尚未开发出有效的针对hcc的gpc3靶向抗癌剂。
10.[现有技术文件]
[0011]
j korean med assoc 2013年11月；56(11):1001-1011


技术实现要素：

[0012]
技术问题
[0013]
本发明人为开发用于肝细胞癌的新的治疗剂进行了许多努力，并且结果，他们开发了用于肝细胞癌的治疗剂，其通过将药物特异性递送至期望的肝癌细胞而显示出抗癌作用，从而完成了本发明。
[0014]
技术方案
[0015]
本发明的一个目的是提供修饰的适体，其包括与磷脂酰肌醇聚糖-3(gpc3)特异性结合的核酸适体和与该核酸适体结合的抗癌剂。
[0016]
本发明的另一个目的是提供用于预防或治疗肝癌的药物组合物，该药物组合物包含作为活性成分的修饰的适体。
[0017]
本发明的又一个目的是提供核酸适体。
[0018]
本发明的又一个目的是提供用于检测磷脂酰肌醇聚糖-3的组合物，该组合物包含作为活性成分的核酸适体。
[0019]
本发明的又一个目的是提供检测磷脂酰肌醇聚糖-3的方法，该方法包括为了提供肝癌的诊断或预后所需的信息，检测来源于测试的受试者的生物样品中的磷脂酰肌醇聚糖-3的含量；将检测该含量的结果与检测对照样品中磷脂酰肌醇聚糖-3含量的结果进行比较；并且当观察到来自受试者的样品中的含量水平与对照样品相比发生变化时，将受试者与肝癌的诊断或预后相关联。
[0020]
本发明的又一个目的是提供用于诊断肝癌的试剂盒，该试剂盒包括用于检测磷脂酰肌醇聚糖-3的组合物。
[0021]
本发明的又一个目的是提供修饰的适体、核酸适体、药物组合物或组合物用于诊断、预防或治疗肝癌的用途。
[0022]
技术效果
[0023]
本发明的磷脂酰肌醇聚糖-3特异性修饰的适体与磷脂酰肌醇聚糖-3特异性结合而被内化到肝癌细胞中，并且通过与该适体结合的抗癌剂表现抗癌活性，并且因此仅对表达gpc3的肝癌细胞具有选择性抗癌作用而不影响正常肝细胞。
附图说明
[0024]
图1显示gpc3特异性适体文库的蛋白质结合亲和力，其中nt#代表核苷酸的数量(长度)，并且最低的两个浓度从蛋白质浓度排除；
[0025]
图2显示gpc3特异性适体文库中，通过截短2428-12-10序列的部分制备的2428-12-10(40-mer)和12-12(35-mer)的蛋白质结合亲和力；
[0026]
图3显示与吉西他滨结合的12-10修饰的适体的示意图，其中化学取代未在2d预测程序中指示，并且因此由通用碱基指示；
[0027]
图4a和图4b显示与吉西他滨结合的12-10修饰的适体的蛋白质结合亲和力；
[0028]
图5显示与吉西他滨结合的12-10修饰的适体的抗癌功效；
[0029]
图6显示gpc3特异性适体文库中，通过以不同长度截短2428-12-10(12-10)制备的适体文库的细胞结合；
[0030]
图7显示在gpc3特异性适体文库中，通过以不同长度截短2428-12-10(12-10)制备
的适体文库的细胞内化；
[0031]
图8显示与吉西他滨结合的12-12修饰的适体的示意图，其中化学取代未在2d预测程序中指示，并且因此由通用碱基指示；
[0032]
图9显示与吉西他滨结合的12-12修饰的适体的细胞结合，其中12-12代表12-12适体，并且sc代表合成的12-12适体；
[0033]
图10显示与三个吉西他滨结合的修饰的适体(12-12g(3))的细胞内化，其中12-12代表12-12适体，并且sc代表合成的12-12适体；
[0034]
图11显示与三个吉西他滨结合的修饰的适体(12-12g(3))随时间的细胞内化，其中12-12代表12-12适体，并且sc代表合成的12-12适体；
[0035]
图12显示根据与三个吉西他滨结合的修饰的适体(12-12g(3))浓度(10nm至1μm)的抗癌功效，其中12-12代表12-12适体，并且吉西他滨代表单独的吉西他滨；
[0036]
图13显示根据与三个吉西他滨结合的修饰的适体(12-12g(3))浓度(31.75nm至2μm)的抗癌功效，其中12-12代表12-12适体，并且吉西他滨代表单独的吉西他滨；
[0037]
图14显示了根据适体序列和靶标(nap-du、c3 liner、2-f、2-o-me)中碱基取代位置的蛋白质结合亲和力和细胞结合；
[0038]
图15显示了通过考虑蛋白质结合亲和力和细胞结合，来选择化学优化的适体候选物；
[0039]
图16显示了化学优化的适体文库的细胞结合；
[0040]
图17a和17b显示化学优化的适体文库(combi 6至combi 10)的细胞内化；
[0041]
图18显示与吉西他滨结合的化学优化适体文库的蛋白质结合亲和力；
[0042]
图19显示与吉西他滨结合的化学优化适体文库的细胞结合；
[0043]
图20显示化学优化的适体文库(combi 1至combi 3)的细胞内化，其中对照代表未处理的，12-12代表12-12适体，并且sc代表合成的12-12适体；
[0044]
图21显示与三个或五个吉西他滨结合的化学优化适体文库(combi 4)的细胞内化，其中对照代表未处理的，12-12代表12-12适体，并且sc代表合成的12-12适体；
[0045]
图22显示与三个或五个吉西他滨结合的化学优化适体文库(combi 5)的细胞内化，其中对照代表未处理的，12-12代表12-12适体，并且sc代表合成的12-12适体；
[0046]
图23显示与三个或五个吉西他滨结合的化学优化适体文库(combi 4至combi 5)的抗癌功效；
[0047]
图24显示与三个吉西他滨结合的化学优化适体(combi 11 g(3))的抗癌功效；
[0048]
图25a和图25b显示与三个或五个吉西他滨结合的化学优化适体文库(combi 4至combi 5)的hep3b细胞周期分析；
[0049]
图26a和图26b显示与三个或五个吉西他滨结合的化学优化适体文库(combi 4至combi 5)的hepg2细胞周期分析；
[0050]
图27a和图27b显示与三个或五个吉西他滨结合的化学优化适体文库(combi 4至combi 5)的a431细胞周期分析；和
[0051]
图28显示化学优化的适体文库(12-12，combi 5 g(3))的小鼠血清稳定性。
具体实施方式
[0052]
下面将详细描述本公开内容。同时，本公开内容中公开的每个描述和实施方式也可以应用于其他描述和实施方式。也就是说，本公开内容中公开的各种要素的所有组合都落入本公开内容的范围内。进一步，本公开内容的范围不受以下具体描述的限制。
[0053]
为了实现上述目的，本发明的一个方面提供了修饰的适体，其包括与磷脂酰肌醇聚糖-3(gpc3)特异性结合的核酸适体和与该核酸适体结合的抗癌剂。
[0054]
如本文所用，术语“磷脂酰肌醇聚糖-3”是控制细胞分裂和生长的糖基-磷脂酰肌醇(gpi)锚定的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(hspg)，其由n-端亚基和c-端亚基组成，并且已知参与wnt、igf、fgf和tgf-β2信号传导通路。
[0055]
如本文所用，术语“适体”或“核酸适体”——其是“化学抗体”——是指具有短长度(20至80个碱基)并且具有能够以高特异性和亲和力结合从特定化合物到蛋白质的各种靶配体的性质的单链核酸分子。适体可以通过指数富集(selex)的配体的系统进化在体外制备。“核酸适体”可以包括在“适体”中，并且可以与“适体”或“核酸适体”互换使用。
[0056]
适体被认为是寡核苷酸分子，其具有与抗体相似的特性，因为它具有纳摩尔(nm)到飞摩尔(fm)水平的对靶蛋白的高亲和力和选择性。同时，与抗体相比，适体具有以下几个优点：(1)由于其化学合成容易，并且它们是相对小并且简单的分子，因此很容易进行各种必要的修饰，(2)通过selex过程可以最大化选择性和亲和力，(3)由于它们通过化学合成制备，因此它们具有高纯度，(4)可以通过仪器分析来鉴定制备的物质，(5)可以为难以通过注射到动物内产生抗体的毒素开发适体，(6)由于它们对热稳定，因此可以在室温下长期储存，(7)它们几乎不会在体内引起免疫应答(免疫原性)，和(8)一旦分离出特异性结合特定物质的适体，可通过经济的自动寡聚物合成方法以一致性和低成本再生产该适体。
[0057]
适体选择过程通常需要从具有10
14
至10
15
个不同序列即多样性的文库中获得单链核酸库的过程。为此，使用了各种方法，但最常用的是通过不对称pcr仅扩增一条链的方法、或将生物素附连到双链核酸的一条链的末端并且使用链霉亲和素包被珠选择性地仅选择一条链的方法。
[0058]
之后，进行通过将获得的文库与靶分子结合来选择具有高结合能力的适体的选择过程。当靶分子是蛋白质时，通常使用链霉亲和素珠将生物素化蛋白质拉下(pulled down)。在诱导靶蛋白和修饰的核酸文库结合后，使用缓冲液进行洗涤以去除不与靶蛋白结合的修饰的核酸文库。
[0059]
同样，在平板的情况下，在诱导核酸文库和靶蛋白结合后，使用缓冲液进行洗涤以去除不与靶蛋白结合的核酸。通过这些方法，可以获得对配体具有亲和力的适体。通常，通过重复5-15个循环的选择-扩增过程，可以获得具有高亲和力的适体。选择过程完成后，将扩增的核酸克隆，通过测序鉴定单个克隆的序列，并且合成适体以测量相对于靶分子的亲和力和结合能力。
[0060]
如本文所用，术语“靶分子”是指可以被本发明的适体检测的物质。具体地，靶分子存在于分离的样品中，并且可以是选自蛋白质、肽、碳水化合物、多糖、糖蛋白、激素、受体、抗原、抗体、病毒、辅因子、药物、染料、生长因子和受控物质中的一个或多个，捕获适体可以与其结合，但不限于此。对于本发明的目的，靶分子可以是磷脂酰肌醇聚糖-3、其配体或其受体。
[0061]
就本发明的目的而言，与磷脂酰肌醇聚糖-3特异性结合的核酸适体可以由seq id no:1的变体即seq id no:1的核苷酸序列的变体组成，但不限于此。
[0062]
在本发明中，seq id no:1不排除在seq id no:1的核苷酸序列上游或下游添加无意义的序列、或其中天然存在的突变、或其中的沉默突变。显然，只要序列与包括seq id no:1的核苷酸序列的多核苷酸具有相同或对应的活性，则其属于本发明的seq id no:1。例如，本发明的seq id no:1可以是由seq id no:1的核苷酸序列组成的多核苷酸或与其具有80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％或更多的同源性或同一性的核苷酸序列。此外，显然只要该核苷酸序列具有上述同源性或同一性并且表现出与适体相应的功效，具有部分序列缺失、修饰、取代或添加的核苷酸序列的任何多核苷酸也可包括在本公开的seq id no:1的范围内。
[0063]
换言之，尽管在本公开中描述为“由特定seq id no的核苷酸序列组成的多核苷酸”，但显然，只要多核苷酸可以具有与由相应的seq id no的核苷酸序列组成的多核苷酸相同或对应的活性，在本公开中也可以使用在部分序列中具有缺失、修饰、取代或添加的核苷酸序列的任何多核苷酸。例如，显然只要它具有与“由seq id no:1的核苷酸序列组成的多核苷酸”相同或对应的活性，任何多肽都可以属于“由seq id no:1的核苷酸序列组成的多核苷酸”。
[0064]
特定seq id no的变体可以包括其中构成特定seq id no中的任何一个或多个核苷酸被化学或物理修饰的形式。
[0065]
例如，变体可以包括由于选自以下中的任何一种或多种取代的修饰：切割特定seq id no的核苷酸序列中的一个或多个核苷酸；在特定seq id no的核苷酸序列中的一个或多个核苷酸中的碱基结构的嘧啶基团的c5位置处用萘基取代；用不具有糖或碱基的接头取代一个或多个核苷酸；用-甲氧基、-f(氟)或甲氧基乙基中的一个或多个取代一个或多个核苷酸中糖结构的c2位置处的-oh基团；在一个或多个核苷酸中的碱基结构的嘧啶基团的c5位置处用苄基取代。
[0066]
seq id no:1的变体可以包括其中构成seq id no:1的核苷酸中的任何一个或多个被化学或物理修饰的形式。
[0067]
例如，变体可以包括由于选自以下中的任何一个或多个取代的修饰：切割seq id no:1的核苷酸序列中的一个或多个核苷酸；在seq id no:1的核苷酸序列中的一个或多个核苷酸中的碱基结构的嘧啶基团的c5位置处用萘基取代；用不具有糖或碱基的接头取代一个或多个核苷酸；用-甲氧基、-f(氟)或甲氧基乙基中的一种或多种取代一个或多个核苷酸中糖结构的c2位置处的-oh基团；在一个或多个核苷酸的碱基结构的嘧啶基团的c5位置处用苄基取代。
[0068]
萘基可由以下化学式1表示
[0069]
[化学式1]
[0070][0071]
接头可由以下化学式2表示：
[0072]
[化学式2]
[0073][0074]
苄基可由以下化学式3表示：
[0075]
[化学式3]
[0076][0077]
具体地，在一个或多个核苷酸中的碱基结构的嘧啶基团的c5位置处用萘基的取代可以是在嘧啶基团的c5位置处用5-(n-萘甲基羧酰胺)-2
’‑
脱氧尿苷的取代，但不限于此。
[0078]
具体地，“seq id no:1的变体”不限于变异的位点和数量，并且可以是选自seq id no:6、seq id no:6的变体、seq id no:10至seq id no:19及其变体中的任何一个，但不限于此。进一步，由于磷脂酰肌醇聚糖-3特异性核酸适体可以由seq id no:1的变体组成，它可以是选自seq id no:6、seq id no:6的变体、和seq id no:10至seq id no:19中的任何一个，但不限于此。
[0079]
此外，为了增强血清稳定性，可以对磷脂酰肌醇聚糖-3特异性核酸适体或修饰的适体在其5
’‑
端、3
’‑
端或两端进行修饰，以具有增强的血清稳定性。修饰可以包括通过将选自聚乙二醇(peg)、倒置的脱氧胸苷(idt)、锁核酸(lna)、2
’‑
甲氧基核苷、2
’‑
氨基核苷、2
’‑
f-核苷、胺接头、硫醇接头和胆固醇中的一个或多个结合到5
’‑
端、3
’‑
端或其两端的修饰。具体地，idt可以与适体的3’端结合，但不限于此。
[0080]
关于本发明的目的，磷脂酰肌醇聚糖-3特异性核酸适体可以特异性结合磷脂酰肌醇聚糖-3以诱导细胞内化。
[0081]
如本文所用，术语“修饰的适体”是指如此适体，其包括上述核酸适体和抗癌剂。就本发明的目的而言，修饰的适体可以是如此修饰的适体，其包括由seq id no:1的变体组成的核酸适体；由seq id no:6组成的核酸适体；由seq id no:6的变体组成的核酸适体；或由
seq id no:10至seq id no:19中任一项组成的核酸适体和抗癌剂，但不限于此。具体地，修饰的适体可以包括选自seq id no:2至seq id no:5、seq id no:7至seq id no:9、和seq id no:20至seq id no:25中的任何一个，但不限于此。
[0082]
如本文所用，术语“抗癌剂”可包括用于肺癌(例如，非小细胞肺癌、小细胞肺癌、恶性间皮瘤)、间皮瘤、胰腺癌(例如，胰腺导管腺癌、胰腺内分泌肿瘤)、咽癌、喉癌、食道癌、胃癌(例如，乳头状腺癌、粘液腺癌、腺鳞癌)、十二指肠癌、小肠癌、大肠癌(例如，结肠癌、直肠癌、肛门癌、家族性结肠癌、遗传性非息肉病性结直肠癌、胃肠道间质瘤)、乳腺癌(例如，浸润性导管癌、非浸润性导管癌、炎性乳腺癌)、卵巢癌(例如，上皮性卵巢癌、性腺外生殖细胞肿瘤、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低度恶性肿瘤)、睾丸肿瘤、前列腺癌(例如，激素依赖性前列腺癌、激素非依赖性前列腺癌)、肝癌(例如，肝细胞癌、原发性肝癌、肝外胆管癌)、甲状腺癌(例如，甲状腺髓样癌)、肾癌(例如，肾细胞癌、肾盂和输尿管移行细胞癌)、子宫癌(例如，宫颈癌、子宫内膜癌、子宫肉瘤)、脑肿瘤(例如，髓母细胞瘤、神经胶质瘤、松果体星形细胞瘤、毛细胞星形细胞瘤、弥漫性星形细胞瘤、间变性星形细胞瘤、垂体腺瘤)、视网膜母细胞瘤、皮肤癌(例如，基底细胞癌、恶性黑素瘤等)、肉瘤(例如，横纹肌肉瘤、平滑肌肉瘤、软组织肉瘤)、恶性骨肿瘤、膀胱癌、血癌(例如，多发性骨髓瘤、白血病、恶性淋巴瘤、霍奇金病、慢性骨髓增殖性障碍)、作为副作用引起周围神经病变的癌症，如原发不明癌症等。抗癌剂的实例可包括吉西他滨、阿糖胞苷、卡铂(carboplatin(paraplatin))、顺铂(cisplatin(platinol、platinol-aq))、克唑替尼(crizotinib)(赛可瑞(xalkori))、环磷酰胺(癌德星(cytoxan))、neosar)、多西他赛(docetaxel)(泰索帝(taxotere))、多柔比星(阿霉素)、厄洛替尼(erlotinib)(特罗凯(tarceva))、依托泊苷(vepesid)、氟尿嘧啶(5-氟尿嘧啶、5-fu)、甲磺酸伊马替尼(gleevec)、伊立替康(irinotecan)(开普拓(camptosar))、脂质体包封的多柔比星(doxil)、甲氨蝶呤(folex、mexate、amethopterin)、紫杉醇(泰克索(taxol)、注射用紫杉醇(白蛋白结合型)(abraxane))、索拉非尼(sorafinib)(多美吉(nexavar))、舒尼替尼(sunitinib)(索坦(sutent))、拓扑替康(topotecan)(和美新(hycamtin))、曲贝替定(trabectidin)(yondelis)、长春新碱(vincristine)(oncovin、vincasar pfs)、和长春碱(velban)等，但不限于此，并且可以不受限制地使用任何已知的抗癌剂。具体地，抗癌剂可以包括选自吉西他滨、阿糖胞苷、卡铂、顺铂、克唑替尼、环磷酰胺、多西他赛、多柔比星、厄洛替尼、依托泊苷、氟尿嘧啶、甲磺酸伊马替尼、伊立替康、脂质体包封的多柔比星、甲氨蝶呤、紫杉醇、索拉非尼、舒尼替尼、拓扑替康、曲贝替丁、长春新碱和长春碱中的一种或多种，并且更具体地，吉西他滨，但不限于此。
[0083]
抗癌剂中的一种或多种可与核酸适体结合，并且具体地，其两种或更多种，并且更具体地，其三种或更多种可与核酸适体结合，但不限于此。
[0084]
抗癌剂可以经由共价键、离子键、金属键、范德华键和氢键中的任何一个或多个化学键与核酸适体的5
’‑
端、3
’‑
端或两端中的任何一个或多个结合，或者可以通过取代适体的核苷酸序列中的一个或多个碱基而结合，但不限于此。
[0085]
关于本发明的目的，修饰的适体可以通过用抗癌剂取代核酸适体的核苷酸序列中的一个或多个碱基，例如用抗癌剂取代核酸适体的核苷酸序列中的一个或多个胞嘧啶或鸟嘌呤，来结合修饰的适体。
[0086]
具体地，两种或更多种抗癌剂可连续结合在核酸适体的上述末端或适体中的一个
碱基取代位置。当两种或更多种抗癌剂连续结合时，抗癌剂可以经由共价键、离子键、金属键、范德华键和氢键中的一个或多个化学键彼此结合，但不限于此。
[0087]
此外，抗癌剂可以通过取代独立存在于核酸适体的核苷酸序列中的一个或多个碱基、或两个或更多个碱基被结合。
[0088]
当独立存在的两个或更多个碱基被取代时，抗癌剂可以连续或不连续地被取代，并且当抗癌剂被不连续取代时，抗癌剂之间可以不存在化学键，但不限于此。
[0089]
如上所述，其中核酸适体的核苷酸序列中的一个或多个碱基被抗癌剂取代的修饰的适体可以以与核酸适体相同的方式特异性结合磷脂酰肌醇聚糖-3，并且与其中抗癌剂结合核酸适体末端的修饰的适体相比，抗癌剂可在体内稳定地存在，并且在内化到表达磷脂酰肌醇聚糖-3的肝癌细胞中后，适体可被分解以释放表现出癌细胞特异性抗癌作用的抗癌剂。因此，可以防止由抗癌剂引起的不加选择的细胞死亡及其副作用，并且可以实现选择性癌细胞死亡。
[0090]
在本发明中，磷脂酰肌醇聚糖-3特异性核酸适体可以包括选自seq id no:2至seq id no:25中的任何一个核苷酸序列，但不限于此。具体地，磷脂酰肌醇聚糖-3特异性核酸适体可以包括选自seq id no:6和seq id no:10至seq id no:19中的任何一个核苷酸序列，但不限于此。
[0091]
在本发明中，修饰的适体可以包括核酸适体，并且可以包括选自seq id no:2至seq id no:5、seq id no:7至seq id no:9、和seq id no:20至seq id no:25中的任何一个核苷酸序列，但不限于此。
[0092]
本发明的另一方面提供了制备本发明的修饰的适体的方法。
[0093]
此处使用的术语与上述相同。
[0094]
根据本发明的修饰的适体可以通过本领域已知的方法制备，例如通过合成寡核苷酸的一般方法，或核酸适体与抗癌剂反应的方法，但不限于此。
[0095]
具体地，合成寡核苷酸的方法可以是通过在核酸适体的合成期间添加抗癌剂而不是碱基，来制备在适体序列中包括抗癌剂的修饰的适体的方法，但不限于此。
[0096]
具体地，使核酸适体与抗癌剂反应的方法可以包括适体制备步骤，即制备具有与磷脂酰肌醇聚糖-3特异性结合的适体核苷酸序列的核酸适体；以及修饰的适体形成步骤，即通过使核酸适体与抗癌剂反应形成修饰的适体，其中修饰的适体形成步骤例如可以是使核酸适体与抗癌剂和活化剂(溶解在乙腈中)反应数分钟，但不限于此。
[0097]
本发明的又一方面提供用于预防或治疗肝癌的药物组合物，该药物组合物包括作为活性成分的本发明的修饰的适体。
[0098]
此处使用的术语与上述相同。
[0099]
本发明的药物组合物可以对肝癌具有“预防”和/或“治疗”用途。对于预防用途，将本发明的药物组合物施用于已经患有或怀疑患有本文所述的疾病、障碍或状况的个体。换言之，本发明的药物组合物可以施用于有发生肝癌风险的个体。对于治疗用途，本发明的药物组合物以足以治疗或至少部分阻滞本文所述疾病、障碍或状况的症状的量施用于个体，如已经患有本文所述障碍的患者。对此用途有效的量将取决于疾病、障碍或状况的严重程度和病程、先前的治疗、个体的健康状况和对药物的应答、以及医生或兽医的判断。
[0100]
本发明的药物组合物可以进一步包括在制备本发明的药物组合物中常用的适当
的载体、赋形剂或稀释剂。在这点上，组合物中包括的活性成分的含量可以是但不具体限于基于组合物的总重量0.0001重量％至10重量％，优选0.001重量％至1重量％。
[0101]
药物组合物可以具有选自片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、悬浮液、内服液体、乳剂、糖浆、灭菌水溶液、非水溶剂、悬浮液、乳剂、冻干制剂和栓剂中的任何剂型，并且可能具有各种口服或肠胃外剂型。配制时，采用稀释剂或赋形剂配制，如常用的填料、膨胀剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、表面活性剂等。用于口服施用的固体制剂包括片剂、丸剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂等，并且这些固体制剂是通过将一种或多种化合物与至少一种赋形剂例如淀粉、碳酸钙、蔗糖或乳糖、明胶等混合制备的。进一步，除简单的赋形剂外，还使用润滑剂如硬脂酸镁滑石粉等。用于口服施用的液体制剂可包括悬浮液、内服液体、乳剂和糖浆，并且除常用的简单稀释剂水和液体石蜡外，还可包括各种赋形剂如润湿剂、甜味剂、香料和防腐剂。用于肠胃外施用的制剂包括无菌水溶液、非水溶剂、悬浮液、乳剂、冻干制剂和栓剂。作为非水溶剂和悬浮液，可以使用丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油、和注射用酯如油酸乙酯。作为栓剂的基质，可以使用合成脂肪酸酯(witepsol)、聚乙二醇、吐温61、可可脂、甘油三月桂酸酯(laurin butter)、甘油明胶等。
[0102]
本发明的组合物可以以药学有效量施用于个体。
[0103]
如本文所用，术语“药学有效量”意指足以以适用于任何医学治疗的合理收益/风险比治疗疾病的量，并且有效剂量水平可根据包括个体类型和严重程度、年龄、性别、疾病种类、药物活性、对药物的敏感性、施用时间、施用途径、排泄率、治疗期和同时使用的药物的因素，以及医学领域众所周知的其他因素来确定。本发明的组合物可以作为单独的治疗剂或与其他治疗剂组合施用，可以与现有治疗剂连续或同时施用，并且可以以单剂量或多剂量施用。考虑到所有上述因素，重要的是以能够实现最大效果而没有副作用的最小量施用组合物，并且这可以由本领域普通技术人员容易地确定。本发明组合物的优选施用剂量可根据患者的病情和体重、疾病的程度、药物的种类、施用途径和周期而变化，并且施用可以每天一次或分数次剂量进行。只要意在预防或治疗个体的肝癌，组合物可以施用于任何个体而没有特别限制。施用方式不受限制地包括本领域任何常用方法。例如，组合物可以通过口服、直肠或静脉内、肌肉内、皮下、子宫内膜或脑室内注射施用。
[0104]
将本发明的药物组合物施用于已经发生或很可能发生肝癌的个体，从而预防肝癌的发生或降低发生的程度。
[0105]
作为本发明药物组合物中的活性成分的磷脂酰肌醇聚糖-3特异性修饰的适体可以100nm至500nm的浓度包括在药物组合物中。在低于上述浓度范围的浓度下，磷脂酰肌醇聚糖-3对肝癌细胞的选择性抗癌作用可能不足。在高于上述浓度范围的浓度下，可能表现出对表皮癌细胞的细胞毒性。
[0106]
本发明的又一方面提供了预防或治疗肝癌的方法，该方法包括向个体施用包含磷脂酰肌醇聚糖-3特异性适体的组合物。
[0107]
此处使用的术语与上述相同。
[0108]
在本发明中，术语“个体”是指除了人类之外的已经发生或可能发生肝癌的所有动物。通过将本发明的药物组合物施用于怀疑患有肝癌的个体，可以有效地治疗个体。
[0109]
如本文所用，术语“施用”是指，通过任何合适的方法将本发明的药物组合物引入怀疑患有肝癌的个体中，并且可以通过各种途径(口服或肠胃外途径)进行施用，只要它可
能到达靶组织。
[0110]
本发明的药物组合物可以以药学有效量施用，并且药学有效量与上述相同。
[0111]
本发明的药物组合物可以施用于任何个体而没有具体限制，只要意在预防或治疗个体的肝癌。例如可以使用诸如猴、狗、猫、兔、豚鼠、大鼠、小鼠、牛、羊、猪、山羊等的非人类动物、鸟类、鱼类等，并且药物组合物可以经由肠胃外、皮下、腹膜内、肺内或鼻内途径施用，并且对于局部治疗，如果需要，药物组合物可以通过包括病灶内施用在内的任何适当方法施用。本发明的药物组合物的优选剂量可能根据个体的状况和体重、疾病的程度、药物的类型、施用途径和周期而变化，但可由本领域技术人员适当地选择。例如，它可以通过口服、直肠或静脉内、肌肉内、皮下、子宫内膜或脑室内注射施用，但不限于此。
[0112]
本发明的药物组合物的适当每日总用量可由医师在合理的医学判断范围内确定，并且药物组合物的施用量一般可为0.001mg/kg至1000mg/kg、优选地0.05mg/kg至200mg/kg、更优选地0.1mg/kg至100mg/kg，每天一次至数次。
[0113]
本发明的又一方面提供了与磷脂酰肌醇聚糖-3特异性结合的核酸适体，该核酸适体包括选自seq id no:2至seq id no:25中的任何一个核苷酸序列。
[0114]
此处使用的术语与上述相同。
[0115]
本发明的又一方面提供用于检测磷脂酰肌醇聚糖-3的组合物，该组合物包括作为活性成分的本发明的核酸适体。
[0116]
用于检测本发明的磷脂酰肌醇聚糖-3的组合物除了上述核酸适体外，还可以包括本领域已知的载体和/或防腐剂、稳定剂等，用于稳定储存和保存核酸适体。
[0117]
进一步，可检测标记可以附接到核酸适体。通过附接可检测的标记到适体，可以容易地观察和测量适体与靶分子的结合以及结合程度。可检测标记可以是可以通过本领域已知的检测方法检测的部分，并且没有特别限制。可检测标记可以是例如选自显色酶(过氧化物酶、碱性磷酸酶等)、荧光物质(fitc、ritc、罗丹明、德克萨斯红、荧光素、藻红蛋白、量子点)、生色团、花青和放射性同位素(
124
i、
125
i、
111
in、
99
mtc、
32
p、
35
s等)中的至少一种，但不限于此。具体地，cy5可以连接到适体的5’端。
[0118]
用于检测的组合物除了可检测器官、组织或细胞外，还可检测靶分子或包括靶分子的靶物质，并且具体地，可检测与癌细胞或肿瘤相关表达的靶物质，并且更具体地，可检测包括与肝癌相关表达的磷脂酰肌醇聚糖-3的靶物质，但不限于此。
[0119]
换言之，用于检测的组合物可以用于磷脂酰肌醇聚糖-3的成像，但不限于此。
[0120]
进一步，用于检测的组合物可以通过测量细胞内荧光来检测细胞，并且在这点上，细胞可以是表达磷脂酰肌醇聚糖-3的细胞，并且更具体地，可以是表达磷脂酰肌醇聚糖-3的癌细胞。癌细胞可以是例如肝癌细胞，但不限于此。
[0121]
换言之，用于检测的组合物可用于通过磷脂酰肌醇聚糖-3的成像来诊断肝癌，但不限于此。
[0122]
本发明的又一个目的提供检测磷脂酰肌醇聚糖-3的方法，该方法包括为了提供肝癌的诊断或预后所需的信息，检测来源于测试受试者的生物样品中磷脂酰肌醇聚糖-3的含量；将检测该含量的结果与检测对照样品中磷脂酰肌醇聚糖-3含量的结果进行比较；并且当观察到来自受试者的样品中的含量与对照样品相比发生变化时，将受试者与肝癌的诊断或预后相关联。
[0123]
此处使用的术语与上述相同。
[0124]
样品可以包括从个体分离的细胞、血液、体液或组织，并且可以包括磷脂酰肌醇聚糖-3，但不限于此。
[0125]
提供磷脂酰肌醇聚糖-3检测所需信息的方法可以是检测磷脂酰肌醇聚糖-3，并且通过使包含本发明的适体的检测组合物与样品接触，并且检查是否在样品中形成适体和磷脂酰肌醇聚糖-3的复合物，来提供磷脂酰肌醇聚糖-3检测所需的信息，但不限于此。
[0126]
适体和磷脂酰肌醇聚糖-3的复合物形成可以通过本领域已知的方法鉴定，例如比色法、电化学法、荧光法、发光法、颗粒计数法、吸光度测量、光谱法、拉曼光谱法、表面等离子共振法、干涉测量法、目视评估法、闪烁计数法或酶联适体吸附测定法，但不限于此。
[0127]
本发明的又一方面提供了用于诊断肝癌的试剂盒，该试剂盒包括用于检测磷脂酰肌醇聚糖-3的组合物。
[0128]
此处使用的术语与上述相同。
[0129]
本发明的又一个目的是提供包含特异性结合磷脂酰肌醇聚糖-3(gpc3)的核酸适体和抗癌剂的修饰的适体用于诊断、预防或治疗肝癌的用途。
[0130]
此处使用的术语与上述相同。
[0131]
本发明的又一个目的是提供包含特异性结合磷脂酰肌醇聚糖-3(gpc3)的核酸适体和抗癌剂的修饰的适体用于检测磷脂酰肌醇聚糖-3(gpc3)的用途。
[0132]
此处使用的术语与上述相同。
[0133]
本发明的又一个目的是提供特异性结合磷脂酰肌醇聚糖-3的核酸适体用于诊断、预防或治疗肝癌的用途。
[0134]
此处使用的术语与上述相同。
[0135]
本发明的又一个目的是提供特异性结合磷脂酰肌醇聚糖-3的核酸适体用于检测磷脂酰肌醇聚糖-3(gpc3)的用途。
[0136]
此处使用的术语与上述相同。
[0137]
本发明的又一个目的是提供包含核酸适体的组合物用于诊断、预防或治疗肝癌的用途。
[0138]
此处使用的术语与上述相同。
[0139]
本发明的又一个目的是提供包含核酸适体的组合物用于检测磷脂酰肌醇聚糖-3的用途。
[0140]
此处使用的术语与上述相同。
[0141]
实施例
[0142]
在下文中，将参考实施例更详细地描述本发明。然而，对于本发明所属领域的技术人员明显的是，这些实施例仅用于说明目的，并且本发明的范围不受这些实施例的限制。
[0143]
实施例1.gpc3特异性适体的选择
[0144]
1-1.蛋白质结合亲和力分析
[0145]
为了从7个预期对gpc3具有特异性的适体文库[2428-12-09、2428-12-10、2428-12-11、2424-30-01、2424-30-05、2424-30-06、2424-30-07，全部40-mer]中选择对gpc3最具特异性的适体，通过注册进口商(ri)标签进行结合测定。具体地，为了去除每个候选适体序列的寡核苷酸3
’‑
端处的ri标记和未标记的寡核苷酸区域，将0.25μlα-32p、0.25μl dna核
苷酸外切转移酶(nucleotidylexotransferase)(末端转移酶)、1μl 10x neb缓冲液(new england biolabs,usa)、1μl cocl2、7.5μl模板(适体序列)(共10μl)添加至平板，将平板然后用箔密封，并且然后在37℃下孵育30分钟(酶孵育)。在70℃下孵育10分钟(酶孵育)后，将孵育样品中的每个用30μl蒸馏水稀释。去除microspin g-50柱的下部并且在其上放置管。以800rcf旋转1分钟后，去除管。将样品放入树脂中，然后在室温和800rcf下旋转2分钟。
[0146]
去除了ri标记和未标记的寡核苷酸末端的适体用100μl 1x sb18t
0.05
稀释至20,000cpm。适体在95℃下加热5分钟，并且随后在37℃下冷却15分钟。使100nm蛋白质(gpc3)经受4.64倍系列稀释，并且每30μl共8个点添加到每孔。适体中添加200μl 1x sb18t
0.05
，适体的加热和冷却完成后，然后每孔添加30μl，总体积为60μl。将2μl适体作为输入对照滴加到尼龙过滤器上，然后在37℃下孵育30分钟。孵育期间，预先将30μl 1x sb18t
0.05
添加到过滤平板。孵育后，添加5.5μl zorbax树脂，并且允许在1400rpm下反应1分钟。将zorbax-蛋白质-适体添加到过滤平板，抽吸，然后用200μl 1x sb18t
0.05
洗涤。暴露尼龙过滤器，并且过滤平板在磷光成像仪中筛选17小时过夜。对筛选进行分析，并且得到根据各蛋白质浓度的结合度(结合值百分比)。
[0147]
结果，如图1中所示，发现随着蛋白质浓度越高，更多的适体与其结合，并且在候选物中，2428-12-10具有最大结合容量(b
max
)为0.79，并且解离常数(kd)为1.50，以表现出最优异的结合能力。
[0148]
表现最优异结合能力的2428-12-10适体(以下称为12-10，40-mer，seq id no:1)，并且通过截短2428-12-10的部分序列制备的12-12(35-mer)适体通过以下方法检查了结合亲和力。详细地，花青5(cy5)nhs酯(ge healthcare,little chalfont,uk)与gpc3结合，以制备gpc3-cy5。cy5合成以与一般寡核苷酸合成相同的方式进行。在最终合成的粉末中添加了最少量的水(约50μl)并且重新悬浮，然后使100nm的gpc3-cy5经受4.64倍连续稀释，并且得到根据每种蛋白质浓度的结合度。
[0149]
结果，如图2所示，发现随着蛋白质浓度越高，更多的适体与其结合，并且12-10和12-12的kd值彼此相近。
[0150]
1-2.gpc3-特异性适体和修饰的适体的蛋白质结合亲和力分析
[0151]
制备了修饰的适体，其中抗癌剂与12-10(40-mer)适体结合。采用寡核苷酸合成法制备了修饰的适体，并且在寡核苷酸合成过程中，将适体序列中的两个碱基取代为抗癌剂[吉西他滨，(2’,2
’‑
二氟2
’‑
脱氧胞苷)]，以形成修饰的适体。关于吉西他滨取代的位置，位置——预测即使用吉西他滨取代也不影响适体的结构形成——选自核苷酸序列c和g，并且两个吉西他滨分别在3
’‑
端、环、5
’‑
端、或对取代，以制备(seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、seq id no:5)(图3)。适体序列如下表1所示。
[0152]
[表1]
[0153]
[0154][0155]
在该序列中，由“n”表示的碱基是其中在脱氧尿苷的嘧啶基团的c5位置处引入苄基的碱基(bzdu)，并且由化学式3表示。“s”表示的碱基是被吉西他滨取代的碱基。
[0156]
其后，根据实施例1-1的方法分析了制备的12-10g(2)修饰的适体(seq id no:2、seq id no:3、seq id no:4、和seq id no:5)和作为对照组的12-10的蛋白质结合亲和力。
[0157]
结果，如图4所示，发现结合亲和力依据吉西他滨的位置而变化。该结果表明吉西他滨在对或5’端的取代影响与蛋白质的结合能力。
[0158]
1-3.gpc3特异性适体和修饰的适体的抗癌功效分析
[0159]
为了检查100μm的12-10g(2)修饰的适体(seq id no:2，seq id no:3)、作为对照组的未处理组(12-10)和单独使用200nm吉西他滨(其为两倍浓度以匹配吉西他滨数量)处理的吉西他滨处理组是否对肝细胞表现出选择性抗癌功效，分析了细胞毒性。详细地，将huh-7细胞(atcc,rockville,md,usa)以1
×
104/ml的密度接种在96孔板中，并且使用dmem(gibco,grand island,ny,usa)培养基在5％co2和37℃的条件下培养，该培养基含有10％的fbs(gibco,grand island,ny,usa)和1％的抗生素(青霉素/链霉素)。次日，将适体原液(100μm)与5x sb18缓冲液混合以制备成80μm浓度的原液，并且在95℃下加热5分钟，然后在室温下冷却15分钟或更长。从培养的细胞中去除培养基，并向其添加100μl无血清培养基，并且在37℃和5％co2条件下培养1小时。去除无血清培养基，然后用100μl 1x pbs洗涤细胞。添加100μl krph缓冲液，并且在37℃和5％co2条件下培养1小时。将适体用krph缓冲液稀释至期望浓度的2倍，并且以1x浓度添加到96孔板，并且在37℃和5％co2条件下培养4小时。用适体处理后，去除krph缓冲液，然后添加100μl培养基并且在37℃和5％co2条件下培养3天。6天后，向每孔添加10μl cck-8(细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8))试剂盒溶液，然后在37℃和5％co2条件下培养3小时。使用酶标仪在450nm下检查细胞死亡水平。
[0160]
结果，如图5中所示，与3’端和环结合的复合物显示出彼此大致相似的细胞杀伤作用，并且吉西他滨显示出显著的抗癌功效。
[0161]
实施例2.长度优化的gpc3特异性适体的选择
[0162]
2-1.细胞结合分析
[0163]
使12-10适体和通过以不同长度截短12-10适体制备的5个适体文库[12-10(40-mer)、12-12(35-mer)、12-11(29-mer)、12-13(24-mer)、12-14(23-mer)、12-15(18-mer)]经受细胞结合分析。根据实施例1-1的方法，每个适体序列在其5’端用cy5标记。将huh7细胞(atcc,rockville,md,usa)以2
×
106/ml的密度接种在100mm2培养平板中，并且使用dmem培养基(gibco,grand island,ny,usa)在5％co2和37℃的条件下培养，该培养基含有10％fbs(gibco,grandisland,ny,usa)和1％抗生素(青霉素/链霉素)。将5μm的适体原液与5x sb18缓冲液混合，以制备成4μm浓度的适体，并且在95℃加热5分钟，然后在室温下冷却15分钟以上。4μm的适体用浓度为25nm的krph缓冲液(20mm hepes、5mm kh2po4、1mm mgso4、1mm cacl2、136mm nacl、4.7mm kcl，ph7.4)稀释。从培养的细胞中去除培养基，并且向其添加
4ml磷酸盐缓冲盐水(pbs)，之后清洗，然后去除4ml的pbs。添加4ml冷pbs或温pbs，并且用刮刀刮取细胞，并且收集于试管中，然后移液。将细胞分开并且按样品数量添加到荧光激活细胞分选(fac)试管，然后在4℃和2000rpm下离心4分钟。去除上清液后，将各500μl的25nm适体和对照(31-08(40-mer)适体)添加到15ml的krph缓冲液，然后移液。试管覆盖铝箔以阻挡光，然后在4℃下孵育30min。孵育后，在4℃和2000rpm下进行离心4min，并且去除上清液。添加2ml冷的1x pbs，洗涤，在4℃和2000rpm下离心4min，并且去除上清液。这个过程重复了三次。在第三次，去除上清液，然后将所得物放置于1ml至2ml的facs缓冲液(1％bsa，1x pbs)中，并且转移至facs试管，并且放置于冰上。cy5在650nm至670nm下测量。
[0164]
结果，如图6中所示，12-12(35-mer)表现出最优异的细胞结合能力。
[0165]
2-2.细胞内化分析
[0166]
使通过以不同长度截短12-10适体制备的5个适体文库[12-12(35-mer)、12-11(29-mer)、12-13(24-mer)、12-14(23-mer)和12-15(18-mer)]经受细胞内化分析。详细地，准备6孔板，并且在6孔板中放置圆形盖玻片。按照实施例1-3的方法在6孔板中培养huh-7细胞。将5μm的适体原液与5x sb18缓冲液混合，以制备4μm浓度的适体，并且在95℃下加热5分钟，然后在室温下冷却15分钟或更长。次日，从培养的细胞中去除培养基，并且向其添加无血清培养基，并且在37℃和5％co2条件下培养1hr。去除无血清培养基，然后用2ml 1x pbs洗涤细胞。添加krph缓冲液，在37℃和5％co2条件下培养1hr。将4μm适体稀释至25nm，然后在37℃和5％co2条件下培养1hr或4hr。用2ml的1x pbs重复洗涤3次。在室温下在摇床中进行洗涤10min，同时阻挡光。此后，通过用4％多聚甲醛在4℃下处理来固定细胞10min。用2ml的1x pbs重复洗涤3次。添加透化溶液(1x pbs中的0.2％tritonx-100)，然后在室温下孵育15min。用2ml的1x pbs重复洗涤3次。添加封闭液(3％bsa，1x pbs)，然后在37℃和5％co2条件下孵育20min。用2ml的1x pbs进行了洗涤一次。用含有150nm溶菌体荧光探针(lysotracker)的封闭液进行处理，然后在37℃和5％co2条件下孵育1hr。用2ml 1x pbs重复洗涤3次，并且用4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)进行染色。盖玻片被小心地去除并且抛光。
[0167]
结果，如图7中所示。12-12(35-mer)表现出最优异的细胞内化。
[0168]
2-3.gpc3特异性适体和修饰的适体的细胞结合和细胞内化分析
[0169]
经确认具有优异gpc3结合能力、细胞结合和细胞内化的12-12(35-mer)适体根据实施例1-2的方法与抗癌剂结合，以制备12-12g(3)、12-12g(5)、和12-12g(7)适体(seq id no:7、seq id no:8、seq id no:9)，通过取代每个与3、5或7个吉西他滨结合(图8)。每个文库通过将idt附接到其3’端来合成。
[0170]
此后，根据实施例2-1的方法，使12-12g(3)、12-12g(5)和12-12g(7)适体以及作为对照组的未处理组(12-12，其中idt附接到其3
’‑
端，seq id no:6)、12-12-cy5和合成的12-12(合成的35-mer)经受细胞结合分析。适体序列如下表2中所示。
[0171]
[表2]
[0172][0173]
在该序列中，由“n”表示的碱基是其中在脱氧尿苷的嘧啶基团的c5位置处引入苄基的碱基(bzdu)，并且由化学式3表示。“s”表示的碱基是被吉西他滨取代的碱基。
[0174]
结果，如图9中所示，与三个吉西他滨结合的修饰的适体显示出最优异的细胞结合。
[0175]
进一步，根据实施例2-2的方法，使与三个吉西他滨结合的修饰的适体12-12g(3)、作为对照组的12-12适体和合成的12-12(sc)经受细胞内化分析。
[0176]
结果，如图10中所示，与三个吉西他滨结合的修饰的适体12-12g(3)显示出最优异的细胞内化。如图11中所示，在开始内化后1hr、2hr和4hr确认的结果中，与三个吉西他滨结合的修饰的适体12-12g(3)也显示出最优异的细胞内化。
[0177]
本实施例的结果确认了随着吉西他滨的数量增加，细胞结合能力降低。
[0178]
2-4.gpc3特异性适体和修饰的适体的抗癌功效分析
[0179]
为了检查被确认具有优异的蛋白质结合亲和力、细胞结合和细胞内化的修饰的适体12-12g(3)、作为对照组的未处理组、单独的12-12和单独的吉西他滨是否对肝癌和鳞状细胞癌细胞表现出gpc3选择性抗癌功效，分析了细胞毒性。具体地，将hepg2、hep3b和a431细胞(atcc,rockville,md,usa)分别以1
×
104/ml的密度接种在96孔板中，并且使用dmem培养基(gibco,grand island,ny,usa)在5％co2和37℃的条件下培养，该培养基含有10％fbs(gibco,grandisland,ny,usa)和1％抗生素(青霉素/链霉素)。次日，将适体原液(100μm)与5x sb18缓冲液混合，以制备成80μm浓度的原液，并且在95℃下加热5分钟，然后在室温下冷却15分钟或更长。从培养的细胞中去除培养基，并向其添加100μl无血清培养基，并且在37℃和5％co2的条件下培养1小时。去除无血清培养基，然后用100μl 1x pbs洗涤细胞。添加100μl的krph缓冲液，并且在37℃和5％co2的条件下培养1小时。将适体用krph缓冲液稀释至期望浓度的2倍，并以1x浓度添加96孔板，并且在37℃和5％co2的条件下培养4小时。用适体处理后，去除krph缓冲液，然后添加100μl的培养基，并且在37℃和5％co2的条件下培养6天。6天后，向每孔添加10μl的cck-8试剂盒溶液，然后在37℃和5％co2的条件下培养3hr。使用酶标仪在450nm下检测细胞死亡水平。
[0180]
结果，如图12中所示，与10nm至1μm的12-12、或30nm至3μm的吉西他滨相比，与三个吉西他滨结合的10nm至1μm的修饰的适体12-12g(3)显示出优异的hepg2杀伤效果，而显示出对鳞状细胞癌细胞a431没有细胞杀伤作用。
[0181]
此外，如图13中所示，与相同浓度的12-12或吉西他滨相比，与三个吉西他滨结合的31.75nm至2μm修饰的适体12-12g(3)显示出优异的hepg2杀伤效果，而显示出对鳞状细胞癌细胞a431没有细胞杀伤作用。
[0182]
实施例3.化学优化的gpc3特异性适体的选择
[0183]
3-1.碱基取代适体文库的制备
[0184]
为了化学优化12-12(35-mer)适体——该适体被确认具有优异的gpc3结合亲和
力、细胞结合和细胞内化，在适体序列中引入取代。具体地，制备了12个将nap-du引入适体序列中的文库、11个引入c3的文库、7个仅将2-f引入序列中的碱基g中的文库、7个仅将2-f引入序列中的碱基c中的文库、8个仅将2-f引入序列中的碱基a中的文库、7个仅将2-o-me引入序列中的碱基g中的文库、7个仅将2-o-me引入序列中的碱基c中的文库和8个仅将2-o-me引入序列中的碱基a中的文库。通过在其5’端附接cy5和在其3’端附接idt合成了每个文库。
[0185]
3-2.碱基取代适体文库的蛋白结合亲和力分析
[0186]
为了分析实施例3-1的适体文库的蛋白质结合亲和力，使引入了nap-du、2-f或2-o-me的文库经受定量聚合酶链式反应(qpcr)结合测定，并且使引入了c3接头的文库经受微量热泳动仪(mst)测定。详细地，使用qpcr主混合物[基于最终浓度：1x kod缓冲液、0.2mm dntp、0.2μm 5'，3'引物、5mm mgcl2、1x sybr绿色、0.025u/μl kod聚合酶、d.w.(kapa sybr fast qpcr master mix,sigma,madrid,spain)]进行使用qpcr的蛋白质结合测定。5μl的各种适体(20nm)和95μl的1x sb18t
0.05
混合以制备浓度为10fmol(10
10
拷贝)的适体，并且适体在95℃下放置5min，在70℃下放置5min，在48℃下放置5min，然后在37℃下放置以进行加热和冷却。使100nm的gpc3经受4.64倍连续稀释，并且向每孔添加30μl共8个点。将200μl的1x sb18t
0.05
添加到加热和冷却的适体中，然后将其30μl添加到每个孔中，使得每孔的gpc3和适体的总体积为60μl。在37℃下进行孵育30min，以使gpc3与适体结合。孵育后，向每孔添加5.5μl的10mg/ml talon珠(clontech)，在1400rpm下反应5min。将反应后的talon珠-gpc3-适体混合物添加至过滤平板，并且抽吸，然后用200μl 1x sb18t
0.05
洗涤。然后，sb18t
0.05
缓冲液被去除。为了去除过滤平板中剩余的缓冲液，在过滤平板下方放置深孔板，然后在1000rpm下离心1min。向新的深孔板添加20μl的8mm hcl，并且放置离心的过滤平板。向过滤平板添加80μl的20mm nacl，并且使其在1000rpm下反应5min，然后在1000rpm下进行离心2min，以洗脱适体。将洗脱的适体浓度调整为10
10
拷贝，并且使用3.2mm nacl进行10
10
拷贝至108拷贝的10倍稀释，并且将各10μl的每个浓度(10
10
拷贝、109拷贝、和108拷贝)下的适体添加到qpcr平板的第二排孔。向qpcr平板的第一排孔添加各10μl的10
10
拷贝、109拷贝和108拷贝的未与各蛋白结合的纯适体(标准品)。之后，向所有孔添加10μl的qpcr混合物，使得孔中的总体积为20μl，然后进行qpcr。qpcr条件如下：1个循环(在96℃下45sec、在55℃下10sec和在70℃下1hr)，然后40个循环(在96℃下15sec和在70℃下1min)。然后，根据实施例1-1的方法计算b
max
和kd值。
[0187]
为进行mst，将24μl的5μm适体和6μl的5x sb18缓冲液混合，以制备30μl的4μm适体，然后在95℃下加热5min，然后在室温下冷却10min。适体的5’端用cy5标记，并且标记的适体和gpc3用1x sb18t
0.05
缓冲液稀释至浓度分别为4nm和200nm。将10μl的200nm gpc3以20μl的体积分配到新的pcr试管，并且使用1x sb18t
0.05
缓冲液进行1/2系列稀释。向稀释的gpc3中的每个添加10μl的4nm适体至最终体积为20μl。将20μl的gpc3-适体混合物装载到mst毛细管，并且使用起始毛细管扫描(start capillary scan)确定适当的荧光值。然后，测量mst，并且得到kd和kd置信值。
[0188]
结果，如图14所示，鉴定了12-12(35-mer)适体文库的蛋白质结合亲和力。
[0189]
3-3.化学优化适体库的选择
[0190]
通过将实施例3-2的结果与根据实施例2-1的方法分析实施例3-1的适体文库的hepg2细胞结合的结果相结合，并且通过考虑蛋白质结合亲和力和细胞结合，得出适体序列
中的碱基取代位置和靶标(nap du、c3接头、2-f、2-o-me)，并且选择了10个预期表现出优异的蛋白质结合亲和力和细胞结合的适体文库(combi 1至combi 10，seq id no:10至19)(图15)。
[0191]
在选择的适体中，使combi 1至combi 5根据实施例2-1的方法经受细胞结合分析，并且根据实施例2-2的方法经受细胞内化分析。
[0192]
结果，如图16中所示，发现combi 5的hepg2细胞结合与12-12的hepg2细胞结合最相似，并且如图17a中所示，combi 5显示出最高的hep3b细胞内化。combi 4还显示出优异的细胞内化。进一步，如图17b中所示，在combi 6至combi 10中也观察到细胞内化。此外，combi 6至combi 10在表达高水平gpc3的肝癌特异性细胞(hepg2、hep3b)中显示出选择性细胞内化，而在表达低水平gpc3的a431细胞中未显示出细胞内化。其中，combi 8和combi 9显示出最高的细胞内化。
[0193]
实施例4.化学优化的gpc3特异性修饰的适体的选择
[0194]
4-1.蛋白质结合亲和力、细胞结合、细胞内化和抗癌功效的分析
[0195]
根据实施例1-2的方法，抗癌剂与被确认具有优异的蛋白质结合亲和力和细胞内化的适体文库combi 4、combi 5和combi 8结合，以制备修饰的适体。具体地，将三个或五个吉西他滨与combi 4、combi 5和combi 8结合，以制备修饰的适体。进一步，将三个吉西他滨与适体文库(seq id no:20)结合，其中适体序列中的一些碱基被甲氧基乙基(moe)取代，以制备修饰的适体。适体序列如下表3中所示。
[0196]
[表3]
[0197][0198]
在该序列中，由“me”表示的碱基是在c2位置处引入了-me(甲氧基)基团的碱基(2-o-me、2-o-甲氧基-dna)。由“f”表示的碱基是在c2位置处引入-f(氟)基团的碱基(2-f、2-氟-dna)。由“moe”表示的碱基是在c2位置处引入-moe(甲氧基乙基)基团的碱基(2-moe、2-甲氧基乙基-dna)。由“y”表示的碱基是其中在嘧啶基团的c5位置处引入了5-(n-萘基甲基羧酰胺)-2
’‑
脱氧尿苷的碱基(nap-du)，并且由化学式1表示。由“w”表示的碱基是其中在c3位置处引入了接头(c3接头)的碱基(c3接头-dna)，并且由化学式2表示。由“n”表示的碱基是其中在脱氧尿苷的嘧啶基团的c5位置处引入苄基的碱基(bzdu)，并且由化学式3表示。由“s”表示的碱基是被吉西他滨取代的碱基。
[0199]
使制备的修饰的适体经受根据实施例3-2的方法使用mst的蛋白质结合分析，根据实施例2-1的方法的细胞结合分析，和根据实施例2-2的方法的在hepg2和a431细胞中的细胞内化分析。
[0200]
结果，如图18在所示，当三个吉西他滨与combi 4和combi 5结合时，它们的kd值与12-12适体的kd值相似，但是当五个吉西他滨与其结合时，观察到低结合能力。
[0201]
如图19所示，相比与五个吉西他滨结合的combi 4和combi 5(combi 4gem(5)、combi_5gem(5))，与三个吉西他滨结合的combi 4和combi 5(combi 4gem(3)、combi5gem
doc
tm ez系统检查。
[0210]
结果，如图28中所示，12-12适体在人血清中的半衰期维持在6hr，而化学优化的combi5g(3)的半衰期为约64hr，以显示增加的稳定性，这表明与优化前的12-12适体相比，其改善了约10倍或更多。
[0211]
实施例的这些结果确认了根据gpc3的存在或不存在的选择性抗癌作用和吉西他滨数量依赖性细胞杀伤作用。
[0212]
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