超小型纳米颗粒及其制备、使用和分析方法

超小型纳米颗粒及其制备、使用和分析方法
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2019年11月4日提交的美国临时申请第62/930,539号的优先权，所述美国临时申请的公开内容通过引用并入本文。
3.关于联邦政府资助的研究或开发的声明
4.本发明是根据美国国立卫生研究院(national institutes of health)授予的授权号ca199081和gm122575在政府支持下进行的。该政府在本发明中享有某些权利。


背景技术：

5.二氧化硅纳米颗粒(snp)因其大比表面积、惰性和高生物相容性而在潜在治疗/诊断应用中引起了的关注。然而，大多数snp的尺寸均》10nm。
6.纳米颗粒合成在从能源到医疗保健的许多研究领域中十分普遍，并且为获得如量子点或聚合物、金属和氧化物纳米颗粒等各种各样的材料提供了途径。成功的纳米颗粒制备方法的关键特性是批次间的再现性以及对尺寸、亮度和表面化学等性质的控制。在过去五到十年中，越来越关注超小型(直径《10nm)纳米颗粒的合成。除了在此尺度下出现的独特性质外，其小尺寸使得能够使用高效液相色谱法(hplc)来定量地分析颗粒表面化学性质。虽然hplc在具有精确定义的分子材料(如小分子、大分子结构(如树状物和蛋白质))的领域中十分普遍，但hplc在无机核-有机壳(核-壳)纳米颗粒中的成功应用是最近的发展。由于hplc在合成产物质量控制方面具有公认的多功能性，这为分析纳米颗粒增添了一个新颖且有趣的维度，例如进一步调整其表面化学性质以用于生物应用。在单个合成批次中，hplc允许将纳米颗粒的表面化学性质的变化映射到色谱图中的不同峰上。此类对颗粒表面化学性质的不均匀程度的定量评估与通常例如通过ζ电位或光谱测量揭示的平均颗粒表面性质形成鲜明对比。此外，与凝胶渗透色谱法(gpc)等其它分析技术相组合，hplc能够实现多维相关性分析。例如，在联用的gpc-hplc运行的情况下，这允许将表面化学不均匀性映射到粒径分散性上。这进而为回答颗粒批次不均匀性如何调节生物应答的问题打开了大门，由于缺乏适当的定量表征技术，这是迄今为止一个很大程度上尚未探索的领域。
7.用此种类型的分析技术进行深入研究的一个特别感兴趣的系统是cornell'点(c'点)，这是一类超小型(直径《10nm)荧光核-壳二氧化硅纳米颗粒，目前正在进行多个临床试验以测试诊断和治疗临床潜力[用于转移性黑色素瘤(nct01266096，nct03465618)和恶性脑肿瘤(nct02106598)的靶向pet和/或光学检测]。c'点由荧光染料构成，所述荧光染料共价包封在二氧化硅核内，所述二氧化硅核通过溶胶-凝胶化学生长并且用如聚(乙二醇)-硅烷(peg-硅烷)壳等刷状物共价涂覆。包封的荧光染料可以基于应用而变化，但通常使用如cy5和cy5.5等染料，因为其近红外(nir)吸收和发射曲线有利于生物应用。这些染料的基本化学结构是极度疏水性的。因此，为了增加其亲水性并促进其在水性介质中的用途，通常在染料外围引入磺酸根基团。
[0008]
在基于水的c'点合成的早期迭代中，cy5和cy5.5染料的磺化类似物通常通过马来酰亚胺-硫醇偶联反应与硅烷部分缀合。然后通过溶胶-凝胶过程将所得染料-硅烷缀合物
共价包封到二氧化硅基质中并且随后进行peg化，从而相对于水中的游离染料，所得核-壳点的光物理性质增强并且亲水性显著增加。然而，最近采用hplc阐明此类c'点的表面化学性质的工作揭示，使用带负电荷的磺化cy5是导致表面化学不均匀性显著的原因。此类颗粒的hplc色谱图表现出多个峰(参见下图2a)。最短洗脱时间处的第一个峰对应于具有所期望的纯peg化纳米颗粒表面的c'点，其中cy5染料被完全包封或完全不存在。随后的峰可以分别归属于二氧化硅纳米颗粒表面上的一个、两个或三个cy5染料，二氧化硅纳米颗粒表面上的所述染料导致peg链之间出现疏水性区块，这进而使得在hplc色谱中观察到向更长的洗脱时间偏移。这些结果得到了其他技术的证实，如脉冲后校正荧光相关光谱法(fcs)、单颗粒光漂白和分子动力学模拟。发现是染料电荷在将特定染料成功包封到二氧化硅基质中发挥了关键作用，而不是将其共价连接到二氧化硅纳米颗粒核表面上。
[0009]
对用于产生具有所期望的特征的无机纳米颗粒的方法存在持续且未满足的需求。


技术实现要素：

[0010]
本公开提供了分析和/或纯化无机纳米颗粒(例如，核或核-壳纳米颗粒)的方法。所述无机纳米颗粒在本文中也称为超小型纳米颗粒。本公开还提供了制备无机纳米颗粒和包含无机纳米颗粒的组合物的方法。
[0011]
在各个实例中，本公开提供了：
[0012]
(1)高效液相色谱(hplc)方法的应用，所述高效液相色谱方法能够发现无机纳米颗粒(例如，荧光核-壳二氧化硅纳米颗粒)中迄今为止未知的表面化学不均匀性。
[0013]
(2)用于克服所观察到的固有纳米颗粒不均匀性的设计标准的鉴定。
[0014]
(3)对荧光染料电荷是控制表面化学不均匀性的关键参数的发现。
[0015]
(4)在一些实施例中使用如atto647n、mb2、所有花青基染料(例如，cy5、cy5.5、cy7等)等带正电荷的染料来合成具有高度均匀的表面化学性质的c'点，所述c'点在hplc分析中仅显示一个单峰。
[0016]
(5)这些均匀的c'点对化学降解表现出极高的稳定性。
[0017]
(6)当与先前报道的材料相比时，这些均匀的c'点表现出极高的光稳定性。
[0018]
在某些实例中，本公开提供了：
[0019]
(1)构建具有完全均匀的表面化学性质的超小型(小于10nm)纳米颗粒。
[0020]
(2)降低染料对溶剂环境的敏感性，如atto647n等疏水性染料通常不能可靠地用于基于水的应用中。
[0021]
(3)用于临床相关的诊断成像的用途。
[0022]
(4)用于改善纳米颗粒诊断和治疗的生物分布的用途。
[0023]
(5)用于临床转化过程中的其它纳米颗粒的用途。
[0024]
(6)可用于分析直到现在还不易于表征的peg化材料的表面化学工程。
[0025]
在一方面，本公开提供了通过液相色谱法分析和/或纯化无机纳米颗粒。可以使用hplc和/或gpc进行合成、分析和/或纯化。还提供了用于使染料完全包封在纳米颗粒中的合成途径。
[0026]
包含各种染料基团的无机纳米颗粒可以适用于分析和/或纯化。所述染料基团可以位于无机纳米颗粒上和/或中(由所述无机纳米颗粒包封(完全包封)或部分包封(完全包
封)，或者包封或部分包封在所述无机纳米颗粒中)的各种位置。所述染料基团可以安置或部分安置在无机纳米颗粒的表面上，包封(完全包封)或部分包封在无机纳米颗粒中/由无机纳米颗粒包封(完全包封)或部分包封，或其组合。安置或部分安置在无机纳米颗粒的表面上的染料基团可以是指作为安置或部分安置在无机纳米颗粒的表面上的peg基团的一部分的染料基团。
[0027]
无机纳米颗粒可以通过高效液相色谱法(hplc)进行分析。hplc可以用于确定一个或多个染料基团在无机纳米颗粒上和/或中的位置(例如，由所述无机纳米颗粒包封)。此类方法可以包括对多个无机纳米颗粒进行hplc分析。
[0028]
可以使用液相色谱法纯化包含多个无机纳米颗粒的组合物。在一个实例中，所述液相色谱法是gpc或制备级hplc(例如，制备级rp-hplc)。
[0029]
纯化和/或分析方法可以产生含有无机纳米颗粒中的所纯化、所分析和/或选定部分的洗脱液。所述无机纳米颗粒中的所纯化、所分析和/或选定部分可以被称为级分。可以将所述级分组合以产生包含理想的无机纳米颗粒组合的各种组合物。例如，含有多个无机纳米颗粒(其中单个无机纳米颗粒包封一个或多个阴离子染料基团)的级分可以与含有多个无机纳米颗粒(其中单个无机纳米颗粒具有一个安置或部分安置在所述单个无机纳米颗粒的外表面上的阴离子染料基团)的级分组合。
[0030]
在一方面，本公开提供了一种制备无机纳米颗粒(例如，超小型纳米颗粒)的方法。所述方法基于使用水性反应介质(例如，水)。所述纳米颗粒表面可以用聚乙二醇基团(例如，peg化)和/或各种染料基团官能化。安置或部分安置在无机纳米颗粒的表面上的染料基团可以是指作为安置或部分安置在无机纳米颗粒的表面上的peg基团的一部分的染料基团。
[0031]
在一方面，本公开提供了包含本公开的无机纳米颗粒的组合物。所述组合物可以包括一种或多种类型(例如，具有不同的平均尺寸和/或一种或多种不同的组成特征)。
[0032]
在一方面，本公开提供了本公开的无机纳米颗粒和组合物的用途。例如，无机纳米颗粒或包含无机纳米颗粒的组合物用于递送和/或成像方法。
[0033]
本公开提供了一种用于对如细胞、细胞外组分或组织等生物材料进行成像的方法，所述方法包括：使所述生物材料与包含一种或多种带正电荷的染料的无机纳米颗粒或包含所述纳米颗粒的组合物接触；将激发电磁(e/m)辐射(例如光)引导到所述组织或细胞上，由此激发所述带正电荷的染料分子；检测由所激发的带正电荷的染料分子发出的e/m辐射；以及捕获并处理所检测到的e/m辐射以提供所述生物材料的一个或多个图像。这些步骤中的一个或多个步骤可以在体外或体内进行。例如，所述细胞或组织可以存在于个体中或者可以存在于培养物中。将细胞或组织暴露于e/m辐射可以在体外(例如，在培养条件下)实行或者可以在体内实行。为了将e/m辐射引导到个体或个体身体的任何部分内不易接触到的细胞、细胞外材料、组织、器官等，可以使用光纤仪器。
附图说明
[0034]
为了更全面地理解本公开的本质和目的，应参考以下结合附图的详细描述。
[0035]
图1示出了磺化和非磺化cy5和cy5.5马来酰亚胺衍生物的结构。磺化cy5在水溶液中的净电荷为-1，而cy5-马来酰亚胺和cy5.5-马来酰亚胺两者的未磺化衍生物在水溶液中
的净电荷为+1。cy5.5-马来酰亚胺的磺化形式的净电荷为-3以抵消此染料结构的显著疏水性。
[0036]
图2示出了(a)peg-磺基-cy5-c'点和peg-cy5(+)-c'点的hplc色谱图，以及在每个峰中洗脱的纳米颗粒类型的示意图，并且强调了peg-cy5(+)-c'点峰与和peg-磺基-cy5-c'点样品中的纯peg化颗粒相对应的峰完全重叠。(b)peg-磺基-cy5.5-c'点和peg-cy5.5(+)-c'点的hplc色谱图，再次强调了peg-cy5.5-c'点与peg-磺基-cy5.5-c'点样品中的纯peg化颗粒的完全重叠。(c)peg-磺基-cy5-c'点和peg-磺基-cy5.5-c'点的hplc色谱图，强调了后者明显更具疏水性的行为。(d)peg-cy5(+)-c'点和peg-cy5.5(+)-c'点的hplc色谱图。
[0037]
图3示出了(a-c)用6mm的起始氨浓度制备的peg-cy5(+)-c'点的gpc(左行)、hplc(中行)和fcs(右行)。(d
–
f)用5mm的起始氨浓度制备的peg-cy5(+)-c'点的gpc、hplc和fcs。(g
–
i)用2mm的起始氨浓度制备的peg-cy5(+)-c'点的gpc、hplc和fcs。(j
–
l)用1mm的起始氨浓度制备的peg-cy5(+)-c'点的gpc、hplc和fcs。
[0038]
图4示出了通过在带正电荷的染料周围聚集初级二氧化硅簇来实现的二氧化硅纳米颗粒生长的示意图。二氧化硅簇周围的晕象征着净负簇电荷随着更高的ph条件而增加。
[0039]
图5示出了(a-c)用5mm的起始氨浓度制备的peg-cy5.5(+)-c'点的gpc(左行)、hplc(中行)和fcs(右行)。(d
–
f)用2mm的起始氨浓度制备的peg-cy5.5(+)-c'点的gpc、hplc和fcs。(g
–
i)用1.5mm的起始氨浓度制备的peg-cy5.5(+)-c'点的gpc、hplc和fcs。(j
–
l)用1mm的起始氨浓度制备的peg-cy5.5(+)-c'点的gpc、hplc和fcs。
[0040]
图6示出了(a)在1mm的起始氨浓度下合成的peg-cy5.5-c'点的hplc色谱图。(b)在1mm的起始氨浓度下合成的peg-cy5.5-c'点的gpc，阴影区域强调了曲线下的区域，将所述区域分级和组合以用于c-e中样品的gpc-hplc。(c-e)gpc分级的peg-cy5.5-c'点的hplc色谱图，(c)是最大纳米颗粒，(d)是平均尺寸的纳米颗粒，并且(e)是来自gpc分级的最小纳米颗粒。
[0041]
图7示出了(a)使用硝酸铁(iii)在完全培养基(三角形)和缺乏氨基酸(aa)的培养基(正方形)中对mda-mb-468细胞进行的细胞死亡实验。(b)在缺乏aa的培养基中对mda-mb-468细胞进行的细胞死亡实验，所述实验比较了在存在无毒量的铁(1μm)的情况下peg-cy5(+)-c'点和peg-磺基cy5-c'点的功效。
具体实施方式
[0042]
尽管将根据某些实例来描述要求保护的主题，但包括不提供本文所阐述的所有益处和特征的实例在内的其它实例也在本公开的范围内。在不脱离本公开的范围的情况下，可以进行各种结构、逻辑和方法步骤改变。
[0043]
本公开提供了分析和/或纯化无机纳米颗粒(例如，核或核-壳纳米颗粒)的方法。所述无机纳米颗粒在本文中也称为超小型纳米颗粒。本公开还提供了制备无机纳米颗粒和包含无机纳米颗粒的组合物的方法。
[0044]
除非另有说明，否则本文所提供的所有范围包括落入小数点后十位范围内的所有值。
[0045]
在各个实例中，本公开提供了：
[0046]
(1)高效液相色谱(hplc)方法的应用，所述高效液相色谱方法能够发现无机纳米
颗粒(例如，荧光核-壳二氧化硅纳米颗粒)中迄今为止未知的表面化学不均匀性。
[0047]
(2)用于克服所观察到的固有纳米颗粒不均匀性的设计标准的鉴定。
[0048]
(3)对荧光染料电荷是控制表面化学不均匀性的关键参数的发现。
[0049]
(4)在一些实施例中，使用如atto647n和mb2等带正电荷的染料来合成有高度均匀的表面化学性质的c'点,所述c’点在hplc分析中仅显示一个单峰。
[0050]
(5)这些均匀的c'点对化学降解表现出极高的稳定性。
[0051]
(6)当与先前报道的材料相比时，这些均匀的c'点表现出极高的光稳定性。
[0052]
在某些实例中，本公开提供了：
[0053]
(1)构建具有完全均匀的表面化学性质的超小型(小于10nm)纳米颗粒。
[0054]
(2)降低染料对溶剂环境的敏感性，如atto647n等疏水性染料通常不能可靠地用于基于水的应用中。
[0055]
(3)用于临床相关的诊断成像的用途。
[0056]
(4)用于改善纳米颗粒诊断和治疗的生物分布的用途。
[0057]
(5)用于临床转化过程中的其它纳米颗粒的用途。
[0058]
(6)可用于分析直到现在还不易于表征的peg化材料的表面化学工程。
[0059]
在一方面，本公开提供了通过液相色谱法分析和/或纯化无机纳米颗粒。可以使用hplc和/或gpc进行所述分析和/或纯化。
[0060]
包含各种染料基团的无机纳米颗粒可以适用于分析和/或纯化。染料基团可以以各种位置位于无机纳米颗粒上和/或中(由所述无机纳米颗粒包封或部分包封)。染料基团可以安置或部分安置在无机纳米颗粒的表面上，由无机纳米颗粒包封或部分包封，或其组合。安置或部分安置在无机纳米颗粒的表面上的染料基团可以是指作为安置或部分安置在无机纳米颗粒的表面上的peg基团的一部分的染料基团。
[0061]
无机纳米颗粒可以通过高效液相色谱法(hplc)进行分析。hplc可以用于确定一个或多个染料基团在无机纳米颗粒上和/或中的位置(例如，由所述无机纳米颗粒包封)。此类方法可以包括对多个无机纳米颗粒进行hplc分析。
[0062]
一种分析无机纳米颗粒的方法可以包括：(i)将无机纳米颗粒沉积在hplc柱中，所述hplc柱包括输入端，所述输入端与固定相流体连通，所述固定相与输出端流体连通，所述输出端与检测器流体连通；(ii)使流动相通过hplc柱，使得无机纳米颗粒从柱中洗脱并进入检测器，使得检测器产生信号，其中所述信号指示一个或多个染料基团在纳米颗粒和/或核-壳纳米颗粒上和/或中的位置；以及(iii)分析所述信号以确定一个或多个染料基团在无机纳米颗粒上和/或中的位置。所述信号包括与无机纳米颗粒上和/或中(例如，由所述无机纳米颗粒包封或由所述无机纳米颗粒部分包封)的一个或多个染料基团的位置相关的保留时间。在具体保留时间下的峰还可以与安置和/或部分安置在无机颗粒的外表面上的染料基团的数量或染料基团是否在无机纳米颗粒中(例如，是由所述无机纳米颗粒包封还是由所述无机纳米颗粒部分包封)相关。本公开的hplc分析方法可以是可再现的。
[0063]
在一个实例中，每当包含无机纳米颗粒的洗脱液通过检测器时，所述检测器均会产生强度大于基线的信号。在柱中注入包含多个无机纳米颗粒的样品之后出现信号的相对时间决定了所述多个无机纳米颗粒中的一部分无机纳米颗粒的洗脱时间。洗脱时间与无机纳米颗粒中从柱中洗脱的一部分无机纳米颗粒相关，其中颗粒更具疏水性，则其洗脱时间
更迟。在不打算受任何特定理论束缚的情况下，预计安置在无机纳米颗粒表面上的疏水性染料基团数量增加会增加无机纳米颗粒的洗脱时间。作为说明性实例，具有两个安置或部分安置在表面上的疏水性染料基团的无机纳米颗粒比仅具有一个安置或部分安置在表面上的染料的无机纳米颗粒洗脱得晚。
[0064]
各种检测器均适用于通过hplc分析无机纳米颗粒的方法。合适的检测器的实例包括但不限于uv检测器(例如，可调谐uv检测器)、蒸发光散射检测器、带电气溶胶检测器、基于荧光的检测器(例如，荧光计)、光电二极管阵列检测器等，和其组合。
[0065]
各种hplc柱均适用于通过hplc分析无机纳米颗粒的方法。hplc柱可以是反相hplc柱(rp-hplc柱)。rp-hplc柱可以包括c4固定相到c8固定相或其它合适的中等亲水性固定相(例如，c4固定相、c5固定相、c6固定相、c7固定相或c8固定相)。rp-hplc柱可以具有各种长度。例如，合适的rp-hplc柱长为100到300mm，包括每个整数mm值及其之间的范围(例如，长度为150-250mm，例如，长度为150mm)。rp-hplc柱可以具有各种孔隙尺寸。例如，合适的rp-hplc柱的孔隙尺寸为200到400，包括每个整数值及其之间的范围(例如，250到350，例如，)。rp-hplc柱可以具有各种粒径。例如，合适的rp-hplc柱的粒径为2到6μm，包括每隔0.1μm的值及其之间的范围(例如，3.5到5μm)。rp-hplc柱可以具有各种内径。例如，rp-hplc的内径可以为4.6mm。流动相可以以不同的速率通过rp-hplc柱。例如，流动相以0.1到2.0毫升/分钟的流速通过柱，包括每隔0.1毫升/分钟的值及其之间的范围(例如，0.5到1毫升/分钟)。rp-hplc柱可以保持在不同的温度下。例如，合适的rp-hplc柱保持在15到30℃下，包括每隔0.1℃的值及其之间的范围(例如，18到25℃)。在一个实例中，rp-hplc柱不是c18rp-hplc柱。
[0066]
各种流动相均适用于通过hplc分析无机纳米颗粒的方法。流动相是水性流动相，例如，水和乙腈混合物或水和异丙醇和/或甲醇混合物。流动相可以进一步包含酸，例如浓度为0.01到1体积％的三氟乙酸(tfa)或甲酸。其它合适的流动相是本领域已知的。
[0067]
流动相可以以阶梯状梯度通过柱。例如，包含极性部分和非极性部分的流动相，其中极性部分超过非极性部分(例如，90:10的水:乙腈)，可以以例如1毫升/分钟的流速通过hplc柱。这些条件可以维持一定时间段(例如，20分钟)以允许分析物(例如，无机纳米颗粒)与固定相的平衡。在所述一定时间段(例如，20分钟)后，可以使流速降低(例如，降到0.5毫升/分钟)并允许hplc柱达到平衡。然后可以改变流动相组成，使得非极性部分以阶梯状方式略微超过极性部分(例如，45:55的水:乙腈)，并且可以允许基线再次平衡。最后，可以使用非极性部分进一步增加的组成梯度(例如，45:55到5:95的水:乙腈)持续一定时间段(例如，20分钟)，在此期间分析物(例如，无机纳米颗粒中的选定部分)从柱中洗脱。
[0068]
可以使用液相色谱法纯化包含多个无机纳米颗粒的组合物。在一个实例中，所述液相色谱法是gpc或制备级hplc(例如，制备级rp-hplc)。
[0069]
无机纳米颗粒可以使用凝胶渗透色谱法(gpc)纯化。gpc可以用于纯化无机纳米颗粒和/或基于尺寸确定无机纳米颗粒的单独批次。
[0070]
一种纯化无机纳米颗粒的方法可以包括：(i)将多个无机纳米颗粒沉积在色谱柱中，所述色谱柱包括输入端，所述输入端与固定相流体连通，所述固定相与输出端流体连通，所述输出端与检测器流体连通；(ii)使流动相通过所述色谱柱，使得所述多个无机纳米颗粒从所述柱中洗脱；以及(iii)收集包含所述多个无机纳米颗粒中的选定部分的洗脱液。
[0071]
色谱柱可以是具有多孔凝胶固定相的gpc柱。其它合适的固定相是本领域已知的。在一个实例中，所述流动相可以是水性流动相，例如水、nacl水溶液(例如，0.9wt％nacl水溶液)。其它合适的流动相是本领域已知的。
[0072]
无机纳米颗粒可以通过荧光相关光谱法(fcs)与其它方法相组合来进一步分析，所述其它方法包括例如uv/vis光学光谱法以及单颗粒染料漂白实验。fcs分析可以用于确定纳米颗粒的流体动力学尺寸和/或单位溶液体积的无机纳米颗粒的数量(即，无机纳米颗粒浓度)。fcs可以使用激光器来执行。可以基于被分析的染料基团来使用各种激光器。合适的激光器包括但不限于488nm固态激光器(其可以适用于rhg荧光团)、543hene激光器(其可以适用于tmr荧光团)、633nm固态激光器(其可以适用于cy5和cy5.5荧光团)、785nm固态激光器(其可以适用于如cw800和cy7.5等染料)。fcs还可以与uv/vis光学光谱法以及单颗粒光漂白实验组合使用以确定每个颗粒的染料数量。
[0073]
各种纯化和/或分析方法可以组合并以任何顺序执行。例如，多个无机纳米颗粒可以首先通过gpc纯化，通过fcs分析，并且然后通过hplc分析。在各个实例中，可以使用制备级hplc、分析级hplc、gpc等和其组合来执行纯化和分析。
[0074]
纯化和/或分析方法可以产生含有无机纳米颗粒中的所纯化、所分析和/或选定部分的洗脱液。所述无机纳米颗粒中的所纯化、所分析和/或选定部分可以被称为级分。可以将所述级分组合以产生包含理想的无机纳米颗粒组合的各种组合物。例如，含有多个无机纳米颗粒(其中单个无机纳米颗粒包封一个或多个阳离子干燥基团和/或阴离子染料基团)的级分可以与含有多个无机纳米颗粒(其中单个无机纳米颗粒具有一个安置或部分安置在所述单个无机纳米颗粒的外表面上的阴离子染料基团)的级分组合。
[0075]
在一方面，本公开提供了一种制备无机纳米颗粒(例如，超小型纳米颗粒)的方法。所述方法基于使用水性反应介质(例如，水)。所述纳米颗粒表面可以用聚乙二醇基团(例如，peg化)和/或各种染料基团官能化。安置或部分安置在无机纳米颗粒的表面上的一个或多个染料基团可以是指安置在peg基团上的一个或多个染料基团和/或安置在无机纳米颗粒上的peg基团的一部分。
[0076]
本文所描述的方法可以线性扩大(例如，从10ml反应到1000ml或更大)，而产物质量没有任何显著变化。这种可扩展性对于纳米颗粒的大规模制造可能很重要。
[0077]
所述方法可以在水性反应介质(例如，水)中进行。例如，水性介质包括水。某些反应物可以作为极性非质子溶剂(例如，dmso或dmf)中的溶液的形式添加到各种反应混合物中。在各个实例中，水性介质不含10％或更高、20％或更高、或30％或更高的除极性非质子溶剂以外的有机溶剂(例如，醇，如c1到c6醇)。在一个实例中，水性介质不含1％或更高、2％或更高、3％或更高、4％或更高或5％或更高的醇。在一个实例中，水性介质不含任何可检测的醇。例如，本文所公开任一方法中的任一步骤的反应介质基本上由水和任选的极性非质子溶剂组成。
[0078]
本公开的方法包括形成包含水、染料前体、tmos、碱和peg-硅烷的反应混合物。可以使用染料前体、tmos、碱和peg-硅烷的各种摩尔比。在各个实例中，染料前体、tmos、碱和peg-硅烷的摩尔比为0.0090-0.032:11-46:0.5-1.5:5-20，包括所有整数摩尔比值及其之间的范围(染料前体:tmos:碱:peg-硅烷)。例如，如果cy5用作染料前体，则cy5:tmos:碱:peg-硅烷的摩尔比范围为0.0091-0.028:11.4-34:0.5-1.5:5-15，包括所有摩尔比值及其
之间的范围(例如，0.01835:10:1:10或0.009175:11.425:0.5:5或0.02725:34.275:1.5)。例如，如果cy5.5用作染料前体，则cy5.5:tmos:碱:peg-硅烷的摩尔比范围为0.01058-0.03176:15.2-45.7:0.5-1.5:6.6-20，包括所有摩尔比值及其之间的范围(例如，0.021173:30:46:1:13.3或0.01058:15.23:0.5:6.66或0.03176:45.7:1.5:20)。
[0079]
在本公开的方法中的各个阶段，可以将ph调节到所期望的值或所期望的范围内。反应混合物的ph可以通过添加碱来增加。合适的碱的实例包括氢氧化铵和含氨的乙醇溶液。碱的另外的非限制性实例包括能够形成季胺的碱(例如，三乙胺等)、单价阳离子的氢氧化盐(例如，naoh、koh等)和碱性氨基酸(例如，精氨酸、赖氨酸等)。在不打算受任何特定理论束缚的情况下，据知二价阳离子的氢氧化盐不是用于本公开的方法的合适的碱。
[0080]
反应混合物中的碱(例如，氢氧化铵或氨)的浓度可以是0.001mm到60mm，包括每隔0.001mm的值及其之间的范围(例如，0.01mm到10mm、0.01mm到20mm、0.01mm到30mm、0.01mm到40mm、0.01mm到50mm、0.01mm到60mm、0.001mm到10mm、0.001mm到20mm、0.001mm到30mm、0.001mm到40mm、0.001mm到50mm、0.001mm到60mm)。在各个实例中，碱是氢氧化铵并且其浓度为0.001mm到60mm，包括每隔0.001mm的值及其之间的范围(例如，0.01mm到60mm)。在各个实例中，氢氧化铵的浓度为0.001mm到1mm、0.001mm到2mm、0.001mm到2.5mm、0.001mm到3mm、0.001mm到4mm、0.001mm到5mm、0.001mm到10mm、0.01mm到1mm、0.01mm到2mm、0.01mm到2.5mm、0.01mm到3mm、0.01mm到4mm、0.01mm到5mm、0.01mm到10mm、0.1mm到1mm、0.1mm到2mm、0.1mm到2.5mm、0.1mm到3mm、0.1mm到4mm、0.1mm到5mm、0.1mm到10mm。在各个实例中，碱是含氨的乙醇并且其浓度为0.01mm到60mm，包括每隔0.001mm的值及其之间的范围。在各个实例中，含氨的乙醇的浓度为0.01mm到1mm、0.01mm到2mm、0.01mm到2.5mm、0.01mm到3mm、0.01mm到4mm、0.01mm到5mm、0.01mm到10mm、0.1mm到1mm、0.1mm到2mm、0.1mm到2.5mm、0.1mm到3mm、0.1mm到4mm、0.1mm到5mm、0.1mm到10mm。
[0081]
在各个实例中，当使用cy5作为染料前体时，反应混合物包含0.367μmol cy5、457μmol tmos、200μmol peg-硅烷和20μmol碱(例如，氢氧化铵)以及10ml水。在各个实例中，当使用cy5.5作为染料前体时，反应混合物包含0.3176μmol、457μmol tmos、200μmol peg-硅烷和15μmol碱以及10ml水。
[0082]
在不受任何特定理论束缚的情况下，据知碱浓度(例如，氢氧化铵浓度)是控制表面化学不均匀性的参数。据知，碱(例如，氢氧化铵)控制水解、缩合的速率和所形成的二氧化硅簇的表面电荷。例如，如果氢氧化铵浓度太低，则初级二氧化硅簇将易于聚集，并且由于二氧化硅簇的不受控制的聚集，尺寸会增大。例如，如果氢氧化铵浓度太高，则一种染料或多种染料将不会被完全包封。
[0083]
在各个实例中，碱(例如，氢氧化铵)的浓度针对所使用的特定染料进行了优化。
[0084]
例如，一种制备用聚乙二醇基团(即，peg化无机纳米颗粒)和染料分子官能化的无机纳米颗粒的方法包括：a)在室温下(例如，15℃到25℃，取决于位置)形成包含水、二氧化硅核形成单体(例如，tmos)(例如，浓度为11mm到270mm)和一种或多种染料基团前体的反应混合物，其中所述反应混合物的ph(所述ph可以使用碱，例如氢氧化铵来调节)为6到11(这使得形成平均尺寸(例如，最长尺寸)为例如1nm到2nm的核前体纳米颗粒)(例如，ph为6到9)；b)i)在时间(t1)和温度(t1)下保持所述反应混合物(例如，在室温到95℃(t1)下保持(t1)0.5小时到7天(例如，0.5天到7天)，并且在各个实例中，t1为0.5小时到2小时)，由此形
成平均尺寸(例如，最长尺寸)为2到15nm的纳米颗粒(核纳米颗粒)，或ii)如有必要，将所述反应混合物冷却至室温，并且向来自a)的所述反应混合物中添加壳形成单体(例如，不同于tmos的原硅酸四乙酯，例如，teos或tpos)(进行所述添加以使所述壳形成单体的浓度低于二次成核的阈值)，由此形成平均尺寸(例如，最长尺寸)为2到50nm(例如，2到15nm)的无机纳米颗粒；c)如有必要，将所述反应混合物的ph调节至6到10的ph，所述反应混合物包含分别来自b)i)或b)ii)的所述无机纳米颗粒；以及d)任选地(通过以下方式将所述无机纳米颗粒peg化)在室温下向包含分别来自b)i)或b)ii)的所述无机纳米颗粒的所述反应混合物中添加peg-硅烷缀合物(包含共价结合到硅烷部分的peg部分)(例如，浓度为10mm到60mm)(例如，溶解在极性非质子溶剂，例如dmso或dmf中的peg-硅烷缀合物)，并且在时间(t2)和温度(t2)下保持所得反应混合物(例如，在室温(t2)下保持(t2)0.5分钟到24小时)(由此至少一部分peg-硅烷缀合物分子吸附在来自b)的所述核纳米颗粒或核-壳纳米颗粒的表面的至少一部分上)；e)在时间(t3)和温度(t3)下加热来自d)的所述混合物(例如，在40℃到100℃(t3)下加热(t3)1小时到24小时)，由此形成用一个或多个染料基团官能化和表面用聚乙二醇基团官能化的无机纳米颗粒；以及f)通过液相色谱法纯化含有所述用一个或多个染料基团官能化和表面用聚乙二醇基团官能化的无机纳米颗粒的反应混合物，其中染料前体、tmos、碱和peg-硅烷的摩尔比为0.0090
–
0.032:11-46:0.5-1.5:5-20，包括所有整数摩尔比值及其之间的范围(染料前体:tmos:碱:peg-硅烷)。在各个实例中，所述核用约一小时(例如，一小时)形成。
[0085]
所述无机纳米颗粒可以经受合成后处理步骤。例如，在合成之后(例如，在上述实例中e)之后)将溶液冷却至室温，然后转移到透析膜管(例如，截留分子量为10,000的透析膜管，其可商购获得(例如，可从pierce商购获得))中。将透析管中的溶液在di水中透析(水的体积是反应体积的200倍，例如，10ml反应用2000ml水)，并且每天换水，持续一到六天以洗掉剩余的试剂，例如，氢氧化铵和游离硅烷分子。然后通过200nm注射器式过滤器(fisher品牌)过滤颗粒以去除聚集体或灰尘。如果需要，可以对纳米颗粒应用另外的纯化过程，包括凝胶渗透色谱法和高效液相色谱法，以进一步确保合成颗粒的高纯度(例如，1％或更少的未反应试剂或聚集体)。在任何纯化过程之后，如果在所述另外的过程中使用了其它溶剂，则可以将经纯化的纳米颗粒转移回去离子水中。
[0086]
所述核可以是二氧化硅核。用于二氧化硅核形成的反应混合物可以包含作为唯一的二氧化硅核形成单体的tmos。
[0087]
所述核可以是铝硅酸盐核。用于铝硅酸盐核形成的反应混合物可以包含作为唯一的二氧化硅核形成单体的tmos和一种或多种氧化铝核形成单体(例如，烷醇铝，例如仲丁醇铝或烷醇铝的组合)。
[0088]
在铝硅酸盐核合成的情况下，在添加氧化铝核形成单体之前，将反应混合物的ph调节至1到2的ph。在铝硅酸盐核形成之后，将溶液的ph调节至7到9的ph，并且任选地，在将反应混合物的ph调节至7到9的ph之前，将分子量介于100g/mol与1,000g/mol之间，包括所有整数值及其之间的范围，浓度为10mm到75mm，包括所有整数mm值及其之间的范围的peg添加到反应混合物中。
[0089]
用于形成无机纳米颗粒的反应混合物还可以包含染料前体(例如，带正电荷的染料前体)。在此情况下，所得核或核-壳纳米颗粒具有包封或结合在其中的一个或多个染料
分子(例如，带正电荷的染料分子)。例如，核纳米颗粒具有包封在其中的1个、2个、3个、4个、5个、6个或7个带正电荷的染料分子。可以使用染料前体的混合物。染料前体(例如，带正电荷的染料前体)可以是与硅烷缀合的染料(例如，带正电荷的染料)。例如，具有马来酰亚胺官能度的带正电荷的染料与硫醇官能化的硅烷缀合。在另一个实例中，具有nhs酯官能度的带正电荷的染料与胺官能化的硅烷缀合。合适的硅烷和缀合化学的实例是本领域已知的。染料可以具有400nm(蓝色)到900nm(近红外)的发射(例如，荧光)波长。例如，染料是近红外(nir)染料。合适的染料的实例包括但不限于罗丹明绿(rhg)、四甲基罗丹明(tmr)、花青5(cy5)、花青5.5(cy5.5)、花青7(cy7)、atto425、atto647n、atto647、atto680、dyomics dy800、dyomics dy782和irdye800cw，并且表面用聚乙二醇基团官能化的无机纳米颗粒可以具有包封在其中的一个或多个带正电荷的荧光染料分子。染料的实例包括：带负电荷的染料，例如，磺基-cy5.5、磺基-cy5、磺基-cy3、alexa fluor 532、alexa fluor 430、atto430ls、atto488、atto490ls、atto532、atto594等，和其组合；净中性染料，例如，四甲基罗丹明(tmr)、atto390、atto425、atto565、atto590、atto647、atto650、atto655、atto680、atto700等，和其组合；以及带正电荷的染料，例如，cy5.5、cy5、cy3、atto647n、亚甲基蓝、atto663、atto620、atto665、atto465、atto495、atto520、attorho6g、attorho3b、attorho11、attorho12、attothio12、atto580q、attorho101、attorho13、atto610、atto612q、atto647n、attorho14、attooxa12、atto725、atto740、attomb2等，和其组合。染料可以具有适用于缀合化学的官能团，例如，羧酸、nhs酯等，并且可以如此提及。在说明性实例中，cy5-nhs酯是cy5的nhs酯。染料基团可以共价结合到无机纳米颗粒的二氧化硅基质或铝硅酸盐基质和/或共价结合到无机纳米颗粒的外表面和/或是peg基团的一部分。
[0090]
可以在核纳米颗粒上形成二氧化硅壳。例如，在完成核形成之后形成二氧化硅壳。二氧化硅壳形成前体的实例包括原硅酸四烷基酯，例如，teos和tpos。可以使用二氧化硅壳形成前体的混合物。tmos不是二氧化硅壳形成前体。二氧化硅壳形成前体可以作为极性非质子溶剂中的溶液的形式添加到反应混合物中。合适的极性非质子溶剂的实例包括dmso和dmf。
[0091]
需要以单独的等分试样添加二氧化硅壳形成前体。例如，以单独的等分试样(例如，40到500个等分试样，包括每个整数等分试样值及其之间的范围)添加壳形成单体。等分试样可以包含一种或多种壳形成前体(例如，teos和/或tpos)和极性非质子溶剂(例如，dmso)。每个等分试样可以具有1到20微摩尔的壳形成单体，包括每隔0.1微摩尔的值及其之间的范围。等分试样添加之间的间隔可以是1到60分钟，包括所有整数秒值及其之间的范围。在二氧化硅壳形成过程期间，反应混合物的ph可以变化。需要调节ph以保持ph为7-8。
[0092]
在无机纳米颗粒形成后，无机纳米颗粒可以与一种或多种peg-硅烷缀合物反应。各种peg-硅烷缀合物可以一起或以各种顺序添加。此过程在本文中也称为peg化。peg-硅烷的转化百分比介于5％与40％之间，并且聚乙二醇表面密度为1.3到2.1个聚乙二醇分子/nm2。配体官能化的peg-硅烷的转化百分比为40％到100％，并且与每个颗粒反应的配体官能化的peg-硅烷前体的数量为3到90。
[0093]
peg化可以在不同的时间和温度下进行。例如，在无机纳米颗粒的情况下，peg化可以通过在室温下与纳米颗粒接触0.5分钟到24小时(例如，过夜)来进行。例如，在铝硅酸盐纳米颗粒(例如，铝硅酸盐核纳米颗粒或无机纳米颗粒)的情况下，温度为80℃过夜。
[0094]
peg-硅烷的peg部分的链长(即，peg部分的分子量)可以被调整为从3到24个乙二醇单体(例如，3到6个、3到9个、6到9个、8到12个或8到24个乙二醇单体)。可以选择peg-硅烷的peg链长以调整颗粒周围peg层的厚度以及peg化颗粒的药代动力学(pk)和生物分布曲线。配体官能化的peg-硅烷的peg链长可以用于调整颗粒的peg层表面上的配体基团的可及性，从而产生不同的结合和靶向性能。
[0095]
peg-硅烷缀合物可以包含配体。所述配体共价结合到peg-硅烷缀合物的peg部分。所述配体可以与peg部分的末端缀合，所述末端与所述peg部分与硅烷部分缀合的末端相对。peg-硅烷缀合物可以使用异双官能peg化合物(例如，马来酰亚胺官能化的异双官能peg、nhs酯官能化的异双官能peg、胺官能化的异双官能peg、硫醇官能化的异双官能peg等)形成。合适的配体的实例包括但不限于肽(天然或合成的)、环肽、包含放射性标记的配体(例如，
124
i、
131
i、
225
ac或
177
lu)、抗体、抗体片段、dna、rna、单糖、低聚糖、药物分子(例如，小分子抑制剂、有毒药物)，以及包含反应性基团(例如，可以与如药物分子、吉非替尼(gefitinib)等分子缀合的反应性基团)的配体。
[0096]
对于另外的颗粒官能化(例如，以产生多官能纳米颗粒)，可以将胺官能化的硅烷分子和/或硫醇官能化的硅烷分子插入到peg链之间并且插入到无机纳米颗粒(例如，c'点)的二氧化硅表面上，随后可以将另外的官能配体(例如，传感器染料分子、用于放射性金属的另外的螯合剂或用于添加药物化合物的另外的官能团)连接到其上。这种通过插入进行peg化后表面修饰(ppsmi)的方法仅需要在基于水的一锅式合成中在纳米颗粒(例如，c'点)peg化与纯化之间插入几个额外的步骤，而不会减少高质量np的产生。所得的具有另外官能度的纳米颗粒(例如，c'点)表现出接近于临床转化的纳米颗粒(例如，c点)的物理化学性质(例如其尺寸和peg密度)，从而为其临床应用的多样化打开了大门。纳米颗粒合成(例如，c'点合成)的修饰能够实现，例如，每个颗粒具有大量的靶向肽，并且实现了一个简便且通用的光谱方法，所述光谱方法通过将吸收光谱去卷积为单独组分来定量评估不同表面配体的具体数量。
[0097]
例如，除了peg-硅烷(例如，在上述实例中的d)中)之外，还添加了包含配体的peg-硅烷缀合物。在此情况下，形成了表面用聚乙二醇基团和包含配体的聚乙烯基团官能化的无机纳米颗粒。配体官能化的或反应性基团官能化的peg-硅烷的转化百分比为40％到100％，并且与每个颗粒反应的配体官能化的peg-硅烷前体的数量为3到600。
[0098]
例如，在添加peg-硅烷缀合物(例如，在上述实例中的d)中)之前或之后(例如，在所述添加之前或之后的20秒到5分钟)，将包含配体的peg-硅烷缀合物(例如，浓度介于0.05mm与2.5mm之间)在室温下添加到包含无机纳米颗粒(例如，分别来自上述实例中的b)i)或b)ii))的反应混合物中。在时间(t4)和温度(t4)下保持所得反应混合物(例如，在室温(t4)下保持(t4)0.5分钟到24小时)，其中至少一部分peg-硅烷缀合物分子吸附在核纳米颗粒或核-壳纳米颗粒(例如，来自上述实例中的b))的表面的至少一部分上。随后，在时间(t5)和温度(t5)下加热反应混合物(例如，在40℃到100℃(t5)下加热(t5)1小时到24小时)，其中形成了表面用包含配体的聚乙二醇基团官能化的无机纳米颗粒。任选地，随后在室温下添加到所得反应混合物中，所述反应混合物包含表面用包含配体的聚乙二醇基团和peg-硅烷缀合物(不含配体的peg-硅烷的浓度介于10mm与75mm之间)(例如，peg-硅烷缀合物溶解在极性非质子溶剂，例如dmso或dmf中)官能化的无机纳米颗粒；将在时间(t6)和温度(t6)
下保持所得反应混合物(例如，在室温(t6)下保持(t6)0.5分钟到24小时)(由此至少一部分peg-硅烷缀合物分子吸附在表面用包含配体的聚乙二醇基团官能化的无机纳米颗粒的表面的至少一部分上)；并且在时间(t7)和温度(t7)下加热所得混合物(例如，在40℃到100℃(t7)下加热(t7)1小时到24小时)，由此形成表面用包含配体的聚乙二醇基团官能化的无机纳米颗粒。
[0099]
在另一个实例中，至少一部分或全部的peg-硅烷在peg部分的末端上具有反应性基团，所述末端与peg-硅烷缀合物(由异双官能peg化合物形成)中的所述peg部分和硅烷部分缀合的末端相对，并且在形成表面用具有反应性基团的聚乙二醇基团并且任选地，聚乙二醇基团官能化的无机纳米颗粒之后。任选地，聚乙二醇基团与表面用第二反应性基团(其可以与用聚乙二醇基团和包含配体的聚乙二醇基团官能化的无机纳米颗粒的反应性基团相同或不同)官能化的第二配体(其可以与表面用聚乙二醇基团和包含配体的聚乙二醇基团官能化的无机纳米颗粒的配体相同或不同)反应，由此形成表面用以第二配体官能化的聚乙烯基团和任选地聚乙二醇基团官能化的无机纳米颗粒。
[0100]
在另一个实例中，至少一部分或全部的peg-硅烷在peg部分的末端上具有反应性基团，所述末端与peg-硅烷缀合物(由异双官能peg化合物形成)中的所述peg部分和硅烷部分缀合的末端相对，并且在形成表面用聚乙二醇基团以及任选地具有反应性基团的聚乙二醇基团官能化的无机纳米颗粒之后，任选地，聚乙二醇基团与表面用第二反应性基团(其可以与用聚乙二醇基团和包含配体的聚乙二醇基团官能化的无机纳米颗粒的反应性基团相同或不同)官能化的第二配体(其可以与表面用聚乙二醇基团和包含配体的聚乙二醇基团官能化的无机纳米颗粒的配体相同或不同)反应，由此形成表面用以第二配体官能化的聚乙烯基团和任选地聚乙二醇基团官能化的无机纳米颗粒，其中至少一部分peg-硅烷在peg部分的末端上具有反应性基团，所述末端与所述peg部分和peg-硅烷缀合物(由异双官能peg化合物形成)的硅烷部分缀合的末端相对，并且在形成表面用具有反应性基团的聚乙二醇基团官能化的无机纳米颗粒、表面用具有反应性基团的聚乙二醇基团和包含配体的聚乙二醇基团官能化的无机纳米颗粒之后，所述反应性基团与用反应性基团官能化的第二配体(其可以与表面用聚乙二醇基团和包含配体的聚乙二醇基团官能化的无机纳米颗粒的配体相同或不同)反应，由此形成表面用聚乙二醇基团和用第二配体官能化的聚乙烯基团官能化的无机纳米颗粒或用包含表面用第二配体官能化的配体的聚乙二醇基团官能化的无机纳米颗粒。
[0101]
具有用反应性基团官能化的peg基团的无机纳米颗粒可以进一步用一种或多种配体官能化。例如，官能化配体可以与peg基团的反应性基团反应。纳米颗粒合成后官能化的合适的反应化学和条件的实例是本领域已知的。
[0102]
无机纳米颗粒可以具有窄的尺寸分布。在各个实例中，不包括如未反应试剂、灰尘颗粒/聚集体等无关材料的纳米颗粒尺寸分布(在peg化之前或之后)是平均粒径(例如，最长尺寸)的+/-5％、10％、15％或20％。粒径可以通过本领域已知的方法确定。例如，粒径通过tem、gps或dls确定。dls含有系统偏差，并且因此dls尺寸分布可能与通过tem或gps确定的尺寸分布不相关。
[0103]
在一方面，本公开提供了包含本公开的无机纳米颗粒的组合物。所述组合物可以包括一种或多种类型(例如，具有不同的平均尺寸和/或一种或多种不同的组成特征)。
[0104]
例如，组合物包含多个无机纳米颗粒(例如，二氧化硅核纳米颗粒、二氧化硅核-壳纳米颗粒、铝硅酸盐核纳米颗粒、铝硅酸盐核-壳纳米颗粒)。所述无机纳米颗粒中的任何无机纳米颗粒表面可以用一种或多种类型的聚乙二醇基团(例如，聚乙二醇基团、官能化的(例如，用一种或多种配体和/或反应性基团官能化)聚乙二醇基团或其组合)官能化。所述无机纳米颗粒中的任何无机纳米颗粒可以具有包封在其中的染料基团或染料基团的组合(例如，nir染料，例如，带正电荷的nir染料)。染料基团与无机纳米颗粒共价结合。无机纳米颗粒可以通过本公开的方法制备。例如，染料在无机纳米颗粒中和/或上的位置可以通过染料的电荷来确定。染料基团可以是带正电荷的、带负电荷的或者是净中性的。
[0105]
完全包封在无机纳米颗粒中的染料基团保持包封在无机纳米颗粒中，使得没有游离染料渗入到使纳米颗粒悬浮的水性介质中。染料基团在至多6个月到2年(例如，6个月、9个月、12个月、18个月或24个月)的时间段内保持包封状态。例如，包含具有带正电荷的染料的无机纳米颗粒的水性(例如，水)组合物在至多6个月到2年(例如，6个月、9个月、12个月、18个月或24个月)的时间段内是稳定的，并且在此时间段期间在水性介质(例如，水)中未表现出可观察到的游离染料。例如，所述组合物在此时间段期间在水性介质(例如，水)中未表现出通过hplc(例如，本文所描述的hplc方法)可观察到的游离染料。
[0106]
组合物中的无机纳米颗粒可以具有多种尺寸。无机纳米颗粒的核尺寸可以为2nm到50nm(例如，2nm到10nm或2nm到5nm)，包括所有0.1nm的值及其之间范围。在各个实例中，无机纳米颗粒的核尺寸为2nm、2.5nm、3nm、3.5nm、4nm、4.5nm、5nm、5.5nm、6nm、6.5nm、7nm、7.5nm、8nm、8.5nm、9nm、9.5nm、9.99nm、10nm、10.5nm、11nm、11.5nm、12nm、12.5nm、13nm、13.5nm、14nm、14.5nm或15nm。在各个实例中，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％的无机纳米颗粒的尺寸(例如，最长尺寸)为2nm到50nm(例如，2nm到10nm或2nm到5nm)。在各个实例中，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％的无机纳米颗粒的尺寸(例如，最长尺寸)为2nm到50nm。对于示例性尺寸分布，所述组合物可以不经受任何粒径鉴别(粒径选择/去除)过程(例如，过滤、透析、色谱法(例如，gpc)、离心等)。例如，本公开的无机纳米颗粒是所述组合物中唯一的无机纳米颗粒。在一个实例中，无机纳米颗粒可以具有0-4个壳(例如，0个、1个、2个、3个或4个)。
[0107]
组合物中的无机纳米颗粒可以具有多种尺寸。无机纳米颗粒的核尺寸可以为2nm到15nm(例如，2nm到10nm或2nm到9.99nm)，包括所有0.1nm的值及其之间范围。
[0108]
在各个实例中，无机纳米颗粒的核尺寸为2nm、2.5nm、3nm、3.5nm、4nm、4.5nm、5nm、5.5nm、6nm、6.5nm、7nm、7.5nm、8nm、8.5nm、9nm、9.5nm、9.99nm、10nm、10.5nm、11nm、11.5nm、12nm、12.5nm、13nm、13.5nm、14nm、14.5nm或15nm。在各个实例中，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％的无机纳米颗粒的尺寸(例如，最长尺寸)为2nm到15nm(例如，2nm到10nm或2nm到9.99nm)。在各个实例中，至少90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％的核-壳纳米颗粒的尺寸(例如，最长尺寸)为2nm到50nm。对于示例性尺寸分布，所述组合物可以不经受任何粒径鉴别(粒径选择/去除)过程(例如，过滤、透析、色谱法(例如，gpc)、离心等)。例如，本公开的无机纳米颗粒是所述组合物中唯一的无机纳米颗粒。在一个实例中，无机纳米颗粒可以具有0-4个壳(例如，0个、1个、2个、3个或4个)。
[0109]
所述组合物可以包含另外的组分。例如，所述组合物还可以包含适合施用于个体
(例如，哺乳动物，例如，人)的缓冲液。所述缓冲液可以是药学上可接受的载体。
[0110]
所述组合物在合成时和在任何合成后加工/处理之前可以具有无机纳米颗粒、颗粒(2-15nm，例如，2-10nm，例如，2nm到10nm或2nm到5nm)、灰尘颗粒/聚集体(》20nm)、未反应试剂(《2nm)。
[0111]
在各个实例中，合成产生的纳米颗粒不经受任何合成后纯化过程(例如，除了从反应混合物中分离之外)。纯化过程的非限制性实例包括色谱法(例如，尺寸排阻色谱法(sec)等)、再沉淀、盐交换、溶剂萃取等，和其组合。在各个实例中，纯化包括分离一种或多种不期望的材料、组分、所述方法的产物等，或其组合。
[0112]
一种组合物可以包含多个无机纳米颗粒，其中所述多个无机纳米颗粒中的单个无机纳米颗粒包含1-7个带正电荷的染料基团，其中：i)没有一个所述带正电荷的染料基团安置或部分安置在所述无机纳米颗粒的表面上；或ii)大多数(例如，超过50％)的所述无机纳米颗粒具有至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或其组合)安置或部分安置在所述无机纳米颗粒的表面上的带正电荷的染料基团；或iii)所有所述带正电荷的染料基团安置或部分安置在所述无机纳米颗粒的表面上。
[0113]
在一个实例中，包含多个无机纳米颗粒的组合物可以基本上由具有0个、1个、2个、3个、4个、5个、6个或7个完全包封在无机纳米颗粒中的染料基团的单个无机纳米颗粒组成，其中所述多个无机纳米颗粒中的单个无机纳米颗粒包含1-7个带正电荷的染料基团。
[0114]
一种组合物可以包含多个无机纳米颗粒，其中所述多个无机纳米颗粒中的单个无机纳米颗粒包含1-7个净中性染料基团，其中：i)没有一个所述净中性染料基团安置或部分安置在所述无机纳米颗粒的表面上；或ii)大多数(例如，超过50％)的所述无机纳米颗粒具有至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或其组合)安置或部分安置在所述无机纳米颗粒的表面上的净中性染料基团；或iii)所有所述净中性染料基团安置或部分安置在所述无机纳米颗粒的表面上。
[0115]
在一个实例中，包含多个无机纳米颗粒的组合物可以基本上由具有0个、1个、2个、3个、4个、5个、6个或7个完全包封在无机纳米颗粒中的染料基团的单个无机纳米颗粒组成，其中所述多个无机纳米颗粒中的单个无机纳米颗粒包含1-7个净中性染料基团。
[0116]
一种组合物，其包含多个无机纳米颗粒，其中所述多个无机纳米颗粒中的单个无机纳米颗粒包含1-7个带负电荷的染料基团，其中：i)没有一个所述带负电荷的染料基团安置或部分安置在所述无机纳米颗粒的表面上；或ii)大多数(例如，超过50％)的所述无机纳米颗粒没有一个安置或部分安置在所述无机纳米颗粒的表面上的带负电荷的染料基团；或iii)大多数的所述无机纳米颗粒具有1个、2个、3个、4个、5个、6个或7个安置或部分安置在所述无机纳米颗粒的表面上的带负电荷的染料基团。
[0117]
在一个实例中，包含多个无机纳米颗粒的组合物可以基本上由具有0个、1个、2个、3个、4个、5个、6个或7个完全包封在无机纳米颗粒中的带负电荷的染料基团的单个无机纳米颗粒组成，其中所述多个无机纳米颗粒中的单个无机纳米颗粒包含1-7个带负电荷的染料基团。
[0118]
在一个实例中，其中一个或多个染料基团是带正电荷的或具有净中性电荷，并且所述多个无机纳米颗粒未表现出依赖尺寸的表面不均匀性，其中所述依赖尺寸的表面不均匀性是通过hplc确定的。
[0119]
在一方面，本公开提供了本公开的无机纳米颗粒和组合物的用途。例如，无机纳米颗粒或包含无机纳米颗粒的组合物用于递送和/或成像方法。
[0120]
无机纳米颗粒携带的配体可以包括诊断剂和/或治疗剂(例如，药物)。治疗剂的实例包括但不限于化疗剂、抗生素、抗真菌剂、抗寄生虫剂、抗病毒剂和其组合。亲和配体也可以与纳米颗粒缀合以允许纳米颗粒的靶向递送。例如，无机纳米颗粒可以与配体缀合，所述配体能够结合到与具体细胞类型相关的细胞组分(例如，在细胞膜上或者在细胞内隔室中)。靶向分子可以是肿瘤标志物或信号传导通路中的分子。配体可以对某些细胞类型，例如肿瘤细胞具有特异性结合亲和力。在某些实例中，配体可以用于将纳米颗粒引导到具体区域，例如肝脏、脾脏、脑等。成像可以用于确定纳米颗粒在个体中的位置。
[0121]
无机纳米颗粒或包含无机纳米粒子的组合物可以例如在药学上可接受的载体中施用于个体，所述药学上可接受的载体有助于将无机纳米颗粒从身体的一个器官或部分运输到身体的另一个器官或部分。个体的实例包括动物，如人和非人类动物。个体的实例还包括哺乳动物。
[0122]
药学上可接受的载体通常是基于水的。可以用于药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉状黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石粉；赋形剂，如可可脂和栓剂蜡；油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，如丙二醇；多元醇，如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液(ringer's solution)；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；以及在药物调配物中采用的其它无毒相容的物质。(参见《雷明顿药物科学(remington's pharm.sci.)》,第22版(伊斯顿的麦克出版公司(mack publ.co.,easton)(2012))。
[0123]
包含本发明无机纳米颗粒的组合物可以通过任何合适的途径-单独或与其它药剂组合施用于个体。施用可以通过任何方式完成，例如，通过肠胃外、粘膜、肺部、局部、基于导管或口服递送方式。肠胃外递送可以包括例如，皮下递送、静脉内递送、肌肉内递送、动脉内递送和注射到器官组织中递送。粘膜递送可以包括例如鼻内递送。肺部递送可以包括吸入药剂。基于导管的递送可以包括基于离子电渗导管的递送。口服递送可以包括肠溶包衣的药丸的递送或通过口腔的液体施用。经皮递送可以包括通过使用皮肤贴剂递送。
[0124]
在施用包含本发明的无机纳米颗粒的组合物后，无机纳米颗粒的路径、位置和清除均可以使用一种或多种成像技术进行监测。合适的成像技术的实例包括artemis荧光摄像系统。
[0125]
本公开提供了一种用于对如细胞、细胞外组分或组织等生物材料进行成像的方法，所述方法包括：使所述生物材料与包含一种或多种带正电荷的染料的无机纳米颗粒或包含所述纳米颗粒的组合物接触；将激发电磁(e/m)辐射(例如光)引导到所述组织或细胞上，由此激发所述带正电荷的染料分子；检测由所激发的带正电荷的染料分子发出的e/m辐射；以及捕获并处理所检测到的e/m辐射以提供所述生物材料的一个或多个图像。这些步骤中的一个或多个步骤可以在体外或体内进行。例如，所述细胞或组织可以存在于个体中或者可以存在于培养物中。将细胞或组织暴露于e/m辐射可以在体外(例如，在培养条件下)实行或者可以在体内实行。为了将e/m辐射引导到个体或个体身体的任何部分内不易接触到
的细胞、细胞外材料、组织、器官等，可以使用光纤仪器。
[0126]
例如，用于对个体内的区域进行成像的方法包括：(a)向所述个体施用包含一种或多种带正电荷的染料分子的本公开的无机纳米颗粒或组合物；(b)将激发光引导到受试者中，由此激发所述一种或多种带正电荷的染料分子中的至少一种；(c)检测所激发的光，所检测到的光由于所述激发光的激发而已经由所述个体中的所述带正电荷的染料分子发出；以及(d)处理与所检测到的光相对应的信号以提供所述受试者内的所述区域的一幅或多幅图像(例如，实时视频流)。
[0127]
由于荧光颗粒比游离染料更亮，因此荧光颗粒可以用于组织成像，以及转移肿瘤的成像。另外地或可替代地，放射性同位素可以进一步与配体官能化的颗粒的配体基团(例如，酪氨酸残基或螯合剂)连接或者在没有具体配体官能化的情况下与peg化颗粒的二氧化硅基质连接，以用于光诱导电子转移成像。如果所选择的放射性同位素具有治疗性，如
225
ac或
177
lu，这进而会使得颗粒具有另外的放射治疗性质。
[0128]
例如，药物-接头缀合物可以共价连接到颗粒上的官能配体以用于药物递送，其中接头基团可以在肿瘤中被酶或酸性条件特异性地切割以用于释放药物。例如，在马来酰亚胺-peg-颗粒合成后，药物-接头-硫醇缀合物可以通过硫醇-马来酰亚胺-缀合反应与马来酰亚胺-peg-颗粒连接。另外，药物-接头缀合物和癌症靶向肽均可以连接到颗粒表面以用于将药物特异性地递送到肿瘤。
[0129]
在本文所公开的各个实施方式和实施例中所描述的方法的步骤足以实行所述方法并产生本公开的组合物。因此，在一个实施方式中，所述方法基本上由本文所公开的方法的步骤的组合组成。在另一个实施方式中，所述方法由此类步骤组成。
[0130]
以下声明描述了本公开的各个实施方式。
[0131]
声明1.一种用于合成包含一种或多种染料且表面用聚乙二醇(peg)基团官能化的无机纳米颗粒的方法，所述方法包括：a)在室温下形成包含水、tmos和染料前体的反应混合物，其中所述反应混合物的ph为6到11(例如，6到9)；b)i)在时间(t1)和温度(t1)下保持所述反应混合物，由此形成平均尺寸为2nm到15nm的无机纳米颗粒，或者ii)如有必要，将所述反应混合物冷却至室温，并且将壳形成单体添加到来自a)的所述反应混合物中，由此形成核尺寸为2nm到15nm和/或平均尺寸为2nm到50nm的无机纳米颗粒；c)如有必要，将包含来自b)i)或b)ii)的所述无机纳米颗粒的所述反应混合物的ph调节至6到10的ph；d)在室温下向包含分别来自b)i)或b)ii)的所述无机纳米颗粒的所述反应混合物中添加peg-硅烷缀合物，并且在时间(t2)和温度(t2)下保持所得反应混合物；e)在时间(t3)和温度(t3)下加热来自d)的所述混合物，由此形成表面用peg基团官能化的无机纳米颗粒；f)通过液相色谱法将所述反应混合物纯化。在其它实例中，一种用于合成包含一种或多种染料和表面用聚乙二醇(peg)基团官能化的无机纳米颗粒的方法包括：a)在室温下形成包含水、tmos、碱和染料前体的反应混合物；b)i)在时间(t1)和温度(t1)下保持所述反应混合物，由此形成平均尺寸为2nm到15nm的无机纳米颗粒，或者ii)如有必要，将所述反应混合物冷却至室温，并且将壳形成单体添加到来自a)的所述反应混合物中，由此形成核尺寸为2nm到15nm和/或平均尺寸为2nm到50nm的无机纳米颗粒；c)如有必要，将包含来自b)i)或b)ii)的所述无机纳米颗粒的所述反应混合物的ph调节至6到10的ph；d)在室温下向包含来自b)i)或b)ii)的所述无机纳米颗粒的所述反应混合物中添加peg-硅烷缀合物，并且在时间(t2)和温度(t2)下保持所得
反应混合物；e)在时间(t3)和温度(t3)下加热来自d)的所述混合物，由此形成表面用peg基团官能化的所述无机纳米颗粒；f)通过液相色谱法将所述反应混合物纯化，其中所述染料前体、所述tmos、所述碱和所述peg-硅烷的摩尔比为0.0090
–
0.032:11-46:0.5-1.5:5-20，并且所述方法产生所述的包含一种或多种染料且表面用聚乙二醇(peg)基团官能化的所述无机纳米颗粒。所述一种或多种染料完全包封在所述无机纳米颗粒中。
[0132]
声明2.根据声明1所述的方法，其中所述碱选自氢氧化铵、含氨的乙醇、三乙胺、氢氧化钠、氢氧化钾等和其组合。
[0133]
声明3.根据声明1或声明2所述的方法，其中所述碱具有某一浓度并且所述浓度为0.001mm到60mm，包括每隔0.001mm的值及其之间的范围(0.01mm到1mm、0.01mm到2mm、0.01mm到2.5mm、0.01mm到3mm、0.01mm到4mm、0.01mm到5mm、0.01到10mm、0.1mm到1mm、0.1mm到2mm、0.1mm到2.5mm、0.1mm到3mm、0.1mm到4mm、0.1mm到5mm、0.1到10mm、0.001mm到1mm、0.001mm到2mm、0.001mm到2.5mm、0.001mm到3mm、0.001mm到4mm、0.001mm到5mm、0.001到10mm)。
[0134]
声明4.根据前述声明中任一项所述的方法，其中所述纯化包括从所述反应混合物中分离多个无机纳米颗粒中的选定部分。
[0135]
声明5.根据前述声明中任一项所述的方法，其进一步包括通过gpc分析所述多个无机纳米颗粒中的所述选定部分。
[0136]
声明6.根据前述声明中任一项所述的方法，其进一步包括通过hplc分析所述多个无机纳米颗粒中的所述选定部分。
[0137]
声明7.根据前述声明中任一项所述的方法，其中所述纯化步骤包括：将多个无机纳米颗粒沉积在色谱柱中，所述色谱柱包括输入端，所述输入端与固定相流体连通，所述固定相与输出端流体连通，所述输出端与检测器流体连通；使流动相通过所述色谱柱，使得所述多个无机纳米颗粒从所述柱中洗脱；以及收集包含所述多个无机纳米颗粒中的所述选定部分的洗脱液。
[0138]
声明8.根据声明6所述的方法，其包括：将所述多个无机纳米颗粒中的所述选定部分沉积在hplc柱中，所述hplc柱包括输入端，所述输入端与固定相流体连通，所述固定相与输出端流体连通，所述输出端与检测器流体连通；使流动相通过所述hplc柱，使得所述多个无机纳米颗粒中的所述选定部分从所述柱中洗脱并进入所述检测器，使得所述检测器产生信号，其中所述信号指示所述一种或多种染料在所述多个无机纳米颗粒中的所述选定部分中的各个无机纳米颗粒上和/或中的所述位置；分析所述信号以确定所述一种或多种染料在所述多个无机纳米颗粒中的所述选定部分中的各个无机纳米颗粒上和/或中的位置；以及任选地，收集所述洗脱液的一个或多个级分。
[0139]
声明9.根据前述声明中任一项所述的方法，其中所述反应混合物进一步包含氧化铝或铝硅酸盐核单体，并且在添加所述氧化铝或铝硅酸盐核形成单体之前将所述反应混合物的ph调节至1到2的ph，并且任选地，在将ph调节至7到9的ph之前将peg添加到所述反应混合物中，并且所述核是铝硅酸盐核。
[0140]
声明10.根据前述声明中任一项所述的方法，其中所述染料前体是带正电荷的染料前体、带负电荷的染料前体或净中性染料前体。
[0141]
声明11.根据声明10所述的方法，其中所述带正电荷的染料前体由选自以下的带
正电荷的染料形成：cy5.5、cy5、cy3、atto647n、亚甲基蓝、atto663、atto620、atto665、atto465、atto495、atto520、attorho6g、attorho3b、attorho11、attorho12、attothio12、atto580q、attorho101、attorho13、atto610、atto612q、atto647n、attorho14、attooxa12、atto725、atto740、attomb2等和其组合。
[0142]
声明12.根据权利要求10所述的方法，其中所述带负电荷的染料前体由选自以下的带负电荷的染料形成：磺基-cy5.5、磺基-cy5、磺基-cy3、alexa fluor 532、alexa fluor 430、atto430ls、atto488、atto490ls、atto532、atto594等和其组合。
[0143]
声明13.根据声明10所述的方法，其中所述净中性染料前体由选自以下的净中性染料形成：四甲基罗丹明(tmr)、atto390、atto425、atto565、atto590、atto647、atto650、atto655、atto680、atto700等和其组合。
[0144]
声明14.一种组合物，其包含多个无机纳米颗粒，其中所述多个无机纳米颗粒中的各个无机纳米颗粒包含1-7个染料基团，其中：i)没有一个所述染料基团安置或部分安置在所述无机纳米颗粒的表面上；或ii)大多数(例如，超过50％)的所述无机纳米颗粒具有至少一个(例如，一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个或其组合)安置或部分安置在所述无机纳米颗粒的表面上的染料基团；或iii)所有所述染料基团均安置或部分安置在所述无机纳米颗粒的表面上，其中所述染料基团是带正电荷的、带负电荷的或具有净中性电荷。
[0145]
声明15.根据声明14所述的组合物，其中所述多个无机纳米颗粒基本上由各个具有0个、1个、2个、3个、4个、5个、6个或7个染料基团的无机纳米颗粒组成，所述染料基团包封(例如，完全包封)在所述无机纳米颗粒中。
[0146]
声明16.根据声明14所述的组合物，其中所述一个或多个染料基团是带正电荷的或者具有净中性电荷，并且所述多个无机纳米颗粒未表现出依赖尺寸的表面不均匀性。
[0147]
声明17.根据声明16所述的组合物，其中依赖尺寸的表面不均匀性是通过hplc确定的。
[0148]
呈现以下实施例以说明本公开。但并不意图在任何情况下进行限制。
[0149]
实施例
[0150]
以下以本公开的纳米颗粒的合成和表征为例。
[0151]
暴露在颗粒表面上的染料具有更大的化学降解或潜在水解的倾向，并且因此可能对这些类型的纳米颗粒在如人体等复杂的生物环境中的行为产生重大影响。已经鉴定了一种用于定量评估这些表面化学不均匀性及其主要驱动因素(即，染料电荷)的方法，现在进行系统研究以便深入了解最初在溶胶-凝胶二氧化硅合成中形成的～2nm大小的二氧化硅簇与荧光染料之间的相互作用中控制最佳染料包封的因素。
[0152]
本文介绍了对控制共价荧光染料完全包封在被称为cornell'点(c'点)的经聚(乙二醇)涂覆的核-壳二氧化硅纳米颗粒的二氧化硅核内的物理参数的新见解。采用高效液相色谱法(hplc)、凝胶渗透色谱法(gpc)和荧光相关光谱法(fcs)相结合的方法用于监测在由带负电荷和带正电荷的近红外染料cy5和cy5.5合成c'点过程中氨的浓度结果。具体地，hplc允许区分染料完全与部分包封在二氧化硅颗粒核中的情况，所述部分包封导致疏水性表面区块形式的表面化学不均匀性，这进而调节了铁死亡性细胞死亡实验中的生物应答。这些结果表明，染料-染料相互作用与染料-最初在溶胶-凝胶合成中形成的二氧化硅簇相互作用之间存在复杂的相互影响，从而控制最佳的染料包封。预计减少的表面化学不均匀
性将使所得纳米颗粒对生物学和医学中的许多应用具有吸引力。
[0153]
本文描述了与纳米医学应用相关的nir染料cy5和cy5.5的带负电荷和带正电荷的变体。将hplc与凝胶渗透色谱法(gpc)和fcs组合，使得针对两种染料实现了在合成条件下将染料完全包封到二氧化硅核中，从而使得从单独的合成批次中获得的颗粒表面化学性质的不均匀性最小。具体地，示出对于不同的染料，成功的包封需要仔细调整氢氧化铵在水溶液中的起始浓度。这直接影响二氧化硅前体的水解和缩合速率，以及在溶胶-凝胶过程中最初形成的所得二氧化硅簇的表面电荷，这进而控制了对成功形成颗粒至关重要的簇-染料和簇-簇相互作用的静电。最后，使用最近发现的c点诱导的铁死亡(一种铁依赖性细胞死亡程序)作为试验台，证明了基于不同程度的染料包封的颗粒不均匀性如何调节生物应答。
[0154]
方法。
[0155]
化学品和试剂。uhplc级乙腈购自bdh。superdex 200树脂购自通用电气医疗生命科技公司(ge healthcare life sciences)。vivaspin 30k mwco自旋过滤器购自通用电气医疗生命科技公司。含5m nacl的水溶液购自圣克鲁兹生物技术公司(santa cruz biotechnology)。二甲基亚砜(dmso)、原硅酸四甲酯(tmos)、(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷(mptms)、硝酸铁(iii)和含2.0m氨的乙醇均购自西格玛-奥德里奇公司(sigma aldrich)。甲氧基-peg(6-9)-硅烷(～500g/mol)购自gelest公司。磺基-cy5-马来酰亚胺和磺基-cy5.5-马来酰亚胺购自通用电气公司(ge)。cy5-马来酰亚胺和cy5.5-马来酰亚胺购自lumiprobe公司。使用millipore iq7000系统(18.2mω
·
cm)产生di水。xbridge protein beh c4柱(3.5μm，4.6mm x 150mm，10k-500k)购自沃特世技术公司(waters technologies corporation)。mda-mb-468细胞获自atcc，并且在解冻后3个月内使用。rpmi-1640、胎牛血清(fbs)和透析的fbc均来自gibco公司。不含氨基酸的rpmi-1640来自美国生物公司(united states biological)。glutamax、pen/strep和prestoblue试剂来自英杰公司(invitrogen)。所有化学品原样使用而不进一步纯化。
[0156]
颗粒合成和纯化。c'点的合成如前所述。简而言之，对于10ml批次，将0.367μmol单官能马来酰亚胺衍生的染料溶解在dmso中、在手套箱中过夜。将23倍过量的巯基丙基-三甲氧基硅烷(mptms)添加到溶解的染料中，并使其在手套箱中反应过夜。第二天，准备含有去离子水的烧瓶，使用0.5ml到2.5ml的0.02m氢氧化铵(通过将100μl的含2.0m氨的乙醇溶液混合到10ml去离子水中制备氢氧化铵)调整ph，并剧烈搅拌。对于磺化染色的c'点合成，将1ml的0.02m氢氧化铵添加到9ml去离子水中。将68μl原硅酸四甲酯(tmos)和制备的染料-硅烷缀合物逐滴添加到烧瓶中，并使其反应过夜。第二天，将100μl的mpeg(6-9)-硅烷逐滴添加到烧瓶中，并使其反应过夜。第二天停止搅拌溶液并将烧瓶加热至80℃持续24小时。在此加热步骤之后，使用10k mwco纤维素透析管对颗粒进行广泛透析，随后用200nm膜进行注射器式过滤，用30k mwco pes膜旋转过滤器进行旋转过滤，并且最后通过bio-rad fplc上的superdex 200树脂进行gpc纯化。然后在自制装置上使用荧光相关光谱法(fcs)和在cary 5000光谱仪上使用uv/vis光谱对颗粒进行表征。
[0157]
高效液相色谱法(hplc)。所有注射均以8μl的标准注射体积和30μm的浓度进行。在通过fcs进行分析之前，确定注射样品的浓度。使用的柱是孔隙尺寸为并且粒径为3.5μm的150mm waters xbridge beh c4蛋白质分离柱。使用的分离方法如下：将样品首先在90:10的水:乙腈流中以0.75毫升/分钟的流速注入到柱上，并且将所述方法的此等度段保
持20分钟。然后以阶梯状方式将流动相组成更改为45:55的水:乙腈，并允许基线平衡5分钟。最后，在20分钟的过程中运行45:55到5:95的水:乙腈的组成梯度。在此期间，将分析物从柱中洗脱。
[0158]
凝胶渗透色谱法(gpc)。在配备有设置为275nm的uv检测器的bio-rad fplc上进行制备级凝胶渗透色谱法。将颗粒在等度条件下使用含0.9wt.％nacl的去离子水纯化。在纳米颗粒纯化之前，通过用去离子水(从millipore iq7000获得的18.2mω)稀释0.2μm膜过滤的含5m nacl的水(圣克鲁兹生物技术公司)直接制备洗脱液。使用的柱是尺寸为20mm
×
300mm的标准玻璃bio-rad柱，并且手工填充有superdex 200。将所述柱以2.0毫升/分钟的速度操作，并且在样品纯化之前使其与流动相平衡至少30分钟。在注射之前，将所有样品在通用电气生命科学30kda mwco vivaspin过滤器中浓缩。每次运行的总注射体积小于1ml。颗粒在15分钟左右被洗脱并且总运行持续30分钟。
[0159]
荧光相关光谱法(fcs)。使用635nm固态激光器和连续波激光器在自制装置上进行fcs测量。这是用于最大吸光度为约650nm的荧光染料的标准激光器装置。连续波激光器聚焦在水浸显微镜物镜(zeiss plan-neofluar 63x na 1.2)的像平面上。发出的荧光发生斯托克斯位移(stokes-shifted)并且因此在其通过同一物镜返回后，所述荧光可以成功地通过二向色镜，之后将其通过50μm针孔进行空间滤波，并且最后在通过雪崩光电二极管检测器(spcm-aqr-14，珀金埃尔默公司(perkinlemer))进行检测之前将其通过光谱滤波的长通滤波器(et665lp，chroma)。信号通过数字相关器(flex03lq，correlator.com)与15纳秒的滞后时间分辨率自相关。将自相关曲线与解释了快速光物理过程和平移扩散的等式(1)拟合。
[0160][0161]
其中nm是在任何给定时间通过焦点容积扩散的荧光颗粒数，τd是通过焦点容积扩散的荧光材料的平均平移扩散时间，τ
p
是快速光物理过程的特征松弛时间，κ是根据径向和轴向半径计算的焦点容积结构因子(κ＝ωz/ω
xy
)，并且p是实验期间经历快速光物理过程的荧光颗粒的级分。所有自相关曲线均根据等式(2)进行归一化：
[0162]
g(τ)＝(g(τ)-1)nmꢀꢀ
(2)
[0163]
uv/vis光谱法。c'点样品的吸光度光谱在varian cary 5000分光光度计上在具有10mm光路的3ml石英比色皿(豪玛分析(hellmaanalytics))中的di水中以1nm的增量从200nm到800nm进行测量。所有光谱均使用具有di水的比色皿作为参比室进行基线校正。染料吸收波长处的最大吸收保持在0.01与0.06之间。
[0164]
细胞工作。将mda-mb-468细胞在37摄氏度、5％co2下保持在完全培养基(补充有10％fbs的rpmi-1640)中。将细胞以每孔2
×
104个细胞的浓度接种在96孔板中并且使其沉降过夜。然后去除培养基，并用补充有10％透析的fbs、1x glutamax和1x pen/strep以及指示量的硝酸铁(iii)或c'点的不含氨基酸的rpmi-1640替换。在具有c'点的实验中，所有条件还包括1μm硝酸铁(iii)。将细胞温育6天。然后将培养基用完全培养基替换，并且按照制造商的说明用prestoblue试剂评估细胞活力。在tecan safire仪器上在吸光度模式下读取数据。
[0165]
结果和讨论。
[0166]
带正电荷的染料化学极大地改善了颗粒表面化学均匀性。图1示出了净电荷为-1的磺化cy5(顶行，左侧)。如在引言中所讨论和在图2a中示出的，由于在微碱性合成条件下与带负电荷的二氧化硅发生排斥的库仑相互作用，所以此净负电荷会引起大量的纳米颗粒表面化学不均匀性，如在hplc色谱图中出现三个显著峰和一个弱峰所表现的。如图2a的插图所指示，这些峰对应于具有与二氧化硅表面共价连接的0种、1种、2种或3种染料的颗粒(图2a)。通过切换到cy5的未磺化衍生物(图1，顶行，右侧)，溶液中的染料电荷从-1变为+1，如在图2a中示出的，由于现在是有吸引力的染料-二氧化硅相互作用，这促进了完全包封。如hplc色谱图示出的，阳性染料包封颗粒全部同时洗脱，从而产生反映出高颗粒表面均匀性的单峰。
[0167]
虽然已经通过hplc研究了由具有净-1电荷的染料包封引起的c'点的表面化学不均匀性，并且现在已经了解了这一点，但具有更高净负电荷的染料对颗粒表面不均匀性的影响仍然是一个悬而未决的问题。这与如cy5.5(abs./em.:675/695nm)等近红外(nir)染料特别相关，其大于cy5(abs./em.:650/670nm)以便在nir中进一步发射，并且因此显著地更疏水。可商购获得的cy5.5的磺化类似物携带四个磺酸根基团并且净电荷为-3(图1，底行，左侧)，以便在水溶液中提供良好的溶解度，尽管其具有较大的疏水性分子框架。由于最初在c'点的溶胶-凝胶合成中形成的高度带负电荷的初级二氧化硅簇与带负电荷的染料之间的强烈排斥相互作用，这对包封到超小型荧光核-壳二氧化硅纳米颗粒中构成了重大挑战。在通常进行c'点合成的ph范围内，初级簇的负电荷随着其聚集并且随着通过tmos的水解产生更多的硅酸而减弱。根据先前的分子动力学模拟，正是这种随着合成的进行，簇表面电荷的减少最终允许带负电荷的染料缩合到正在形成的c'点的表面上。用磺基-cy5.5合成的c'点的hplc色谱图在图2b中示出。与磺基-cy5衍生的颗粒的不均匀性相比(图2c)，其显示出显著增加的不均匀性，如表现在至少五个峰延长到更长的洗脱时间，从而指示颗粒显著地更疏水。从此数据可以清楚地看出，基于cy5.5的c'点合成中的大多数染料最终都出现在颗粒表面。
[0168]
初级簇电荷是关键的控制参数。虽然从阴离子染料切换到阳离子染料类似物通常会显著提高纳米颗粒的均匀性，但合成参数必须随着单独的染料化学性质进行调整，以确保最佳的纳米颗粒表面化学性质。切换到如cy5和cy5.5等染料的带正电荷的未磺化类似物允许染料充当由带负电荷的初级二氧化硅簇形成的纳米颗粒的成核位点，这是在c'点生长时完全包封到二氧化硅中的原由。进而，对于完全优化的合成条件(参见下文)，这会产生高度的表面化学均匀性，如在分别针对cy5和cy5.5的图2a和b中示出的hplc色谱图中的单峰所证明的。然而，染料化学的这种切换并非没有挑战，因为带正电荷的nir染料不具有磺化染料类似物的所增加的水溶性的益处，并且因此容易在水中聚集。为了优化nir c'点合成条件，致力于凝胶渗透色谱法(gpc)、高效液相色谱法(hplc)和荧光相关光谱法(fcs)的组合。用共价包封的阳离子nir染料优化超小型荧光核-壳二氧化硅纳米颗粒比从带负电荷的染料直接转移到带正电荷的染料更精细，但为了确保均匀的peg化纳米颗粒表面，这是同等重要的。此过程必须考虑三个主要的相互作用：染料-染料相互作用、染料-初级簇相互作用和簇-簇相互作用。染料-染料相互作用对于未磺化的带正电荷的染料更为重要，因为所述染料更具疏水性并且易于聚集。必须小心控制染料的浓度，以免造成过多的染料聚集和沉
淀，这将阻碍有效的染料包封，同时保持足够高的游离染料浓度以提供足够高的合成产率。
[0169]
带正电荷的cy5和cy5.5染料可能充当带负电荷的～2nm初级二氧化硅簇的成核位点，当将二氧化硅前体tmos添加到水性反应溶液中时，会形成所述初级二氧化硅簇。这促进了纳米颗粒的生长和随后的染料包封，参见上文。当初级簇聚集在带正电荷的染料周围时，正电荷开始被静电屏蔽，并且随着颗粒通过生长达到静电稳定，正在生长的纳米颗粒对另外的簇缔合变得更加排斥。如果合成溶液中的氨浓度足够高，则高度带负电荷的簇之间的这些排斥性簇-簇相互作用可能会在染料完全包封在二氧化硅初级簇内之前就使进一步的簇添加停止。这将导致总体上更小的纳米颗粒和表面上更多数量的疏水性染料区块。
[0170]
nir染料cy5(+)的共价包封的表面化学性质优化。这是在利用带正电荷的cy5[cy5(+)]进行的c'点合成实验中观察到的：对于增加的氨浓度，gpc中的主要纳米颗粒峰向右移动(图3a、3d、3g、3j)，从而指示颗粒较小，如fcs所证实的(图3c、3f、3i、3l；表1)；对应的hplc迹线(图3b、3e、3h、3k)通过在较高的洗脱时间下的另外的峰示出了增强的不均匀性。为了防止具有仅部分包封的染料的纳米颗粒的形成，必须通过调节溶液中氢氧化铵的浓度来仔细地控制形成c'点核的初级二氧化硅簇的表面电荷。氢氧化铵是c'点合成中用于二氧化硅的碱性水解和缩合的催化剂。所述氢氧化铵不仅控制水解和缩合的速率，而且还控制在溶胶-凝胶合成开始时形成的初级二氧化硅簇的表面电荷。同时，如果氢氧化铵浓度过低，则初级二氧化硅簇将明显更容易聚集。虽然这些纳米颗粒将完全包封染料，但由于初级二氧化硅簇的不受控制的聚集，尺寸会显著增加。如在图3j中示出的，这导致gpc中的初级纳米颗粒峰和纳米颗粒聚集峰变得不可分离。如先前所证明的，即使通过gpc分级进行非常仔细的纯化，纳米颗粒峰仍将始终含有一些无法分离出去的聚集体。如在图3g-i中展示的，当使用阳离子cy5-硅烷时，10ml批次(参见方法)在1.0ml(0.02氨溶液)的浓度下达到了最佳起始初级簇表面电荷。较高的起始氨浓度使得染料不能被完全包封，而较低的氨浓度使得簇由于非常低的表面电荷而聚集太多。图4展示了这种平衡初级二氧化硅簇电荷和染料电荷的原理以及所得的包封效果。
[0171]
nir染料cy5.5(+)的共价包封的表面化学性质优化。接下来，应用此原理以优化由带正电荷的cy5.5[cy5.5(+)]合成nir c'点(c'点的第二个临床相关变体)。根据对基于cy5(+)的c'点所讨论的内容对cy5.5 c'点合成的评估揭示了由于不同的染料化学性质，cy5.5(+)的最佳合成条件不同。带正电荷的cy5.5比cy5(+)显著更大并且更具疏水性，并且因此，必须对合成方案进行调整。比较合成中不同氨浓度的gpc、hplc和fcs结果(图5)，对于10ml批次，cy5.5 c'点的最佳氨浓度现在为约0.75ml(0.02m氨溶液)，而不是cy5(+)的约1ml，参见图5g-i。
[0172]
cy5.5 c'点的优化强调了，对于给定的染料，为了获得完全的染料包封，初级二氧化硅簇具有最佳的表面电荷。在反应开始时简单地降低氨浓度并不是一个简单的解决方案。由于tmos水解和硅酸形成(参见上文)，合成开始时的ph降低，带正电荷的染料的溶解度增加，这导致染料更倾向于缩合到正在生长的纳米颗粒表面上。如借助于图5j-l中的gpc、hplc和fcs结果所证明的，当在反应中使用0.5ml的氨溶液时，相对于1ml的结果，粒径进一步增加。但此次颗粒的表面不均匀性也增加(参见图5k)。相比之下，即使低于最佳氢氧化铵浓度，cy5(+)-c'点也具有均匀的表面化学性质(将图3k与5k进行比较)。
[0173]
gpc-hplc阐明了低去质子化条件下的另外的不均匀性。cy5.5(+)的实例强调了针
对每种单独的染料正确优化合成溶液的氢氧化铵浓度的重要性。为了进一步了解在低初级二氧化硅簇表面电荷的状态下发生的不均匀性的起源，对peg-cy5.5(+)-c'点的样品进行gpc分级，示出了在合成中在0.5ml的0.02m氢氧化铵下重复出现表面不均匀性(图6a、6b)，这低于cy5.5(+)染料的最佳氨浓度(0.75ml)。然后用hplc分析三个gpc级分(图6c-e)，示出了反映较大的粒径的早期时间级分的表面不均匀性增加，从而表明额外的cy5.5染料在纳米颗粒表面上缩合，并且在纳米颗粒peg化步骤之前产生额外的疏水性区块。有趣的是，反映粒径分布的gpc迹线仍然可以很好地与单个高斯函数拟合(图6b)，而cy5(+)合成的情况并非如此，其中在低于1ml氢氧化铵条件下，gpc峰是拖尾的(比较图3j和5j中的拟合质量)。这表明在0.5ml氨合成条件下，在染料介导的初始染料-簇缀合物形成之后，cy5(+)-c'点的颗粒生长机制主要基于将初级二氧化硅簇持续添加到正在生长的纳米颗粒中，而在cy5.5(+)-dot合成中，持续添加初级二氧化硅簇伴随着额外的染料缩合到纳米颗粒表面上。这些结果共同表明，在c'点合成期间同时控制染料-染料和染料-二氧化硅相互作用是非常重要的，并且必须仔细针对任何新的染料候选物调整合成条件以实现形成具有最小的表面化学不均匀性的最佳荧光核-壳二氧化硅纳米颗粒。
[0174]
不同程度的表面化学不均匀性调节生物应答。确定了来自非包封的nir染料的疏水性表面区块形式的纳米颗粒不均匀性是否对生物应答有任何影响。为了所述目的，在癌细胞群的营养缺乏条件下观察到c'点诱导的铁介导的细胞死亡程序铁死亡，其中由于二氧化硅核的微孔，核-壳二氧化硅纳米颗粒螯合来自溶液的铁并且将所述铁携带到被选为试验台的癌细胞中。评估了mda-mb-468三阴性乳腺癌细胞在氨基酸(aa)饥饿条件下对硝酸铁(iii)处理的敏感性。如在图7a中示出的，所述细胞对1μm铁不敏感，但与全培养基对照相比，6μm铁引起了几乎全部的细胞死亡。为了确定c'点可以调节此生物应答的程度，在同时存在无毒量的铁(1μm)的情况下用各种浓度的c'点处理细胞。如在图7b中展示的，用带正电荷的cy5染料制备的颗粒能够引起比单独的1μm铁大得到的细胞死亡应答，特别是在10μm左右及以上的颗粒浓度，而用带负电荷的磺基-cy5染料制备的颗粒只能引起相对较小的细胞死亡应答。因此，带正电荷的cy5染料包封颗粒似乎更擅长将铁引入到癌细胞中并诱导铁死亡细胞死亡，这可能是由于这些颗粒的疏水性表面区块减少以及相关地促进进入二氧化硅核的微孔。
[0175]
结论。阐明了确定表面化学颗粒不均匀性性的荧光染料包封核-壳二氧化硅纳米颗粒合成中的控制参数。本公开强调，根据所使用的染料，合成条件中的微小变化，这里是溶胶-凝胶反应中作为催化剂的氨的浓度，可以导致由于染料与二氧化硅核表面缀合，而不是被完全包封而产生的疏水性表面区块形式的表面化学性质的显著变化。为了有效地控制最终纳米颗粒的表面化学性质，了解染料-染料相互作用和染料-二氧化硅簇相互作用的复杂相互影响是至关重要的。颗粒表面化学性质/不均匀性的变化进而调节了对纳米颗粒的生物应答，如通过用由带负电荷和带正电荷的cy5染料获得的c'点进行的铁死亡细胞死亡实验所证明的。在不受任何特定理论束缚的情况下，认为这些对在水溶液中制备的荧光核-壳二氧化硅纳米颗粒的成核和生长的综合见解将对此类纳米颗粒在生物成像和纳米医学中的应用产生影响。
[0176]
表1：图3和4中示出的样品的fcs分析的列表结果。
[0177][0178]
尽管已经针对一个或多个特定实施方式和/或实施例描述了本公开，但应当理解，在不脱离本公开的范围的情况下，可以制作本公开的其它实施方式和/或实施例。