身体功能恢复促进剂的制作方法

1.本发明涉及一种身体功能恢复促进剂，其促进身体运动(使脑和末梢神经两者协调给予刺激)的效果，所述身体运动是针对受试者(处于身体功能不可逆地下降状态)的身体功能实施的。


背景技术：

2.中枢神经和末梢神经不是单独活动的神经，即使在障碍时也相互取得紧密的联系，彼此影响。例如，对于脊髓损伤者而言，脑神经细胞发出欲使下肢活动的信号，但是没有返回下肢已活动的反馈，因此脑神经细胞学习为“下肢不活动”。另外，末梢神经由于没有来自脑的刺激，因此学习为“不需要活动下肢”，相互的不良影响累积
·
固定，身体功能不可逆地下降，产生后遗症(疾病/受伤等急性期症状治愈后，也残留功能障碍等症状、伤痕)。即，可以说脊髓损伤的后遗症处于缺乏交互式生物反馈(interactive bio-feedback)机制的状态。交互式生物反馈是指人的脑和神经系统与骨骼肌和末梢神经系统之间产生的“双向的生物体反馈”。针对脊髓损伤的后遗症，正表现出通过促使缺损的交互式生物反馈来改善患者的神精功能。例如，对于使用被称为hal(hybrid assistive limb，混合辅助肢体)的电子用具的控制治疗(cybernic treatment)，由hal感知与来自脑神经细胞的极微弱的下肢运动有关的神经活动，并机械地活动下肢。hal几乎不在脊髓损伤急性期使用，但是通过对具有后遗症的脊髓损伤患者使用hal，脑神经细胞学习为“下肢活动”，末梢神经学习为“需要活动下肢”。即，在中枢神经与末梢神经之间促使交互式生物反馈，有助于神经功能的恢复。hal医疗用下肢型(医疗用hal)被制造为生物体信号反应式运动功能改善装置，在2015年11月被批准为医疗器械，通过基于hal医疗用下肢型的步行运动治疗，确认对als、肌肉萎缩等有24％左右的运动能力的改善效果，证明基于交互式生物反馈理论(interactive biofeedback theory)的治疗对神经
·
肌肉疾患有效。但是，基于交互式生物反馈的身体运动的神经功能恢复作用仅如此是不够的，迫切需要使其进一步提高且持续的并用治疗。例如，作为具有促进基于交互式生物反馈理论的身体运动的神经功能恢复作用的可能性的药剂，可以举出nusinersen，能够期待因与基于交互式生物反馈理论的身体运动的并用而起到的神经功能恢复作用。
3.在脑梗塞的后遗症治疗中，也期待基于交互式生物反馈理论的身体运动的神经功能恢复。针对脑梗塞的后遗症通常进行的处置被称为功能维持康复训练，为了通过防止功能下降来维持
·
继续家庭生活、社会生活而实施。即，对于功能维持康复训练而言，目标是维持已经下降的神经功能的现状，因此重点仅放在活动身体上，不是基于交互式生物反馈理论(其促使伴随活动身体的神经传递的强化)的运动。
4.在因急性期脑梗塞而产生阻碍的神经组织的再生中，已明确使用造血干细胞的细胞治疗是有效的。在非专利文献1中，记载了一种急性期的脑梗塞治疗，其向患者的静脉内施用来自自体骨髓的单核细胞。在该非专利文献1中记载有以下治疗：将为重症的心源性脑栓塞症病例且在脑梗塞发病10日以内神经功能恢复不充分的患者群作为对象，在局部身体
麻醉下进行骨髓细胞的采集，使用比重离心法进行单核细胞级分的分离，然后向静脉内施用。但是，在与造血干细胞施用的治疗时期有关的研究中，虽然对脑梗塞后2、4、7、10日和14日后的急性期和亚急性期表现出治疗效果，但是对脑梗塞的后遗症没有治疗效果(非专利文献2)。另外，在非专利文献3中报告了在发病18日后(平均)对脑梗塞患者实施了通过施用造血干细胞进行的细胞治疗，还并用通常的康复训练，但是完全没有其治疗效果。这样用于使因脑梗塞而失去的功能恢复的治疗法仅限于急性期，不存在针对后遗症的治疗法。因此，期待实现一种身体功能恢复促进剂，其针对脑梗塞患者的后遗症促进基于交互式生物反馈理论的身体运动的神经功能恢复作用。
5.现有技术文献
6.非专利文献1：taguchi a et al.intravenous autologous bone marrow mononuclear cell transplantation for stroke:phase1/2a clinical trial in ahomogeneous group of stroke patients.stem cells dev.2015oct 1；24(19):2207-18
7.非专利文献2：uemura m,et al.cell-based therapy to promote angiogenesis in the brain following ischemic damage.curr vasc pharmacol.2012may；10(3):285-8.
8.非专利文献3：prasad k et al.intravenous autologous bone marrow mononuclear stem cell therapy for ischemic stroke:a multicentric,randomized trial.stroke.2014dec；45(12):3618-24.


技术实现要素：

9.发明所要解决的技术问题
10.本发明是鉴于上述问题点而作出的，其目的在于提供一种身体功能恢复促进剂，该身体功能恢复促进剂促进对脑和末梢神经两者给予刺激的身体运动的效果，所述身体运动是针对处于身体功能不可逆地下降的状态的受试者的身体功能所实施的。
11.用于解决技术问题的技术手段
12.本发明的身体功能恢复促进剂的特征在于，所述身体功能恢复促进剂促进使中枢和末梢协调的身体运动的效果，用于恢复处于身体功能下降的状态的受试者的身体功能，所述身体功能为运动功能、认知功能和/或感觉功能，所述身体功能恢复促进剂具有骨髓单核细胞、cd34阳性细胞、cd133阳性细胞或干细胞。
13.本发明的身体功能恢复促进剂的特征在于，所述身体功能恢复促进剂促进使中枢和末梢协调的身体运动的效果，用于恢复因脑梗塞的后遗症而处于身体功能(即，运动功能、认知功能和/或感觉功能)下降的状态的受试者的身体功能，所述身体功能恢复促进剂具有骨髓单核细胞。
14.本发明的身体功能恢复促进剂的特征在于，所述身体功能恢复促进剂促进身体运动的效果，用于恢复因脑梗塞的后遗症而处于身体功能(即，运动功能、认知功能和/或感觉功能)下降的状态的受试者的身体功能，所述身体功能恢复促进剂具有cd34阳性细胞。
附图说明
15.图1是示出骨髓单核细胞施用时的被动回避试验的结果的图。
16.图2是示出骨髓单核细胞施用时的悬丝试验的结果的图。
17.图3是示出cd34阳性细胞施用时的悬丝试验的结果的图。
18.图4是示出骨髓单核细胞施用时的水迷宫试验的结果的图。
19.图5是示出cd34阳性细胞施用时的水迷宫试验的结果的图。
20.图6是示出骨髓单核细胞施用时的转棒疲劳实验(rotarod)的结果的图。
具体实施方式
21.以下，参照附图对本发明的实施方式进行具体说明，该实施方式是为了容易理解本发明的原理而完成的，本发明的范围不限于下述实施方式，本领域技术人员适当置换以下的实施方式的构成而得到的其他实施方式也包含于本发明的范围。
22.本发明的身体功能恢复促进剂具有骨髓单核细胞、cd34阳性细胞、cd133阳性细胞或干细胞，在用于恢复受试者(其处于身体功能下降的状态)的身体功能的身体运动开始的前后向受试者施用。本发明的身体功能恢复促进剂是具有骨髓单核细胞、cd34阳性细胞、cd133阳性细胞或干细胞的细胞制剂，其解决课题是促进使中枢和末梢协调的身体运动(其用于恢复处于身体功能下降的状态的受试者的身体功能)的效果，作为细胞制剂的解决课题而言是新的。进而，本发明的细胞制剂在身体运动开始的前后向受试者施用这样的使用方式也是新的。本发明细胞制剂中的细胞能够以分离细胞或培养细胞的任意形式使用。
23.身体功能是运动功能、认知功能和/或感觉功能。
24.运动功能是指人的关于肌力、持久力、敏捷性、平衡性、瞬发力和/或柔软性的功能。
25.认知功能是指人的关于理解力、判断力、计算力、思考力、定向力、记忆和/或学习的功能。
26.感觉功能是指人的关于视觉
·
听觉
·
嗅觉
·
味觉和/或触觉的功能。
27.对于本发明的身体功能恢复促进方法，其特征在于，具有：(i)在使中枢和末梢协调的身体运动的开始时为止的期间，施用骨髓单核细胞、cd34阳性细胞、cd133阳性细胞或干细胞的任意者的工序；和(ii)进行使中枢和末梢协调的身体运动的工序。
28.中枢与末梢关联。作为新见解本发明人发现：在处于身体功能下降的状态的受试者进行用于恢复身体功能的身体运动时，向受试者施用骨髓单核细胞、cd34阳性细胞、cd133阳性细胞或干细胞，由此使其显著地提高并维持身体功能。进而，基于上述事实完成了本发明。在对处于身体功能下降的状态的受试者进行基于交互式生物反馈理论的身体运动时，也对受试者施用骨髓单核细胞、cd34阳性细胞、cd133阳性细胞或干细胞，由此能够显著地提高基于交互式生物反馈理论的身体运动的效果。
29.在本发明中，虽然没有特别限定，但是骨髓单核细胞优选经静脉施用。另外，虽然没有特别限定，但是cd34阳性细胞、cd133阳性细胞优选经颈总动脉、颈内动脉、大脑前动脉、大脑中动脉、大脑后动脉或椎动脉施用，其中优选经颈总动脉或椎动脉施用。
30.对受试者施用的cd34阳性细胞或cd133阳性细胞没有特别限定，能够采用脐带血来源细胞、人骨髓来源细胞、人末梢血来源细胞、胎儿肝脏来源等，优选人脐带血来源细胞或人末梢血来源细胞。
31.对受试者施用的骨髓单核细胞、cd34阳性细胞、cd133阳性细胞或干细胞的浓度没
有特别限定，例如可以为5
×
104个/kg～1
×
107个/kg，优选为1
×
105个/kg～1
×
106个/kg，特别优选为5
×
105个/kg。例如，对于静脉内施用骨髓单核细胞的情况，优选为5
×
106个/kg，对于动脉内施用cd34阳性细胞的情况，优选为5
×
105个/kg，对于动脉内施用cd133阳性细胞的情况，优选为5
×
105个/kg，对于动脉内施用脐带血单核细胞的情况，优选为5
×
106个/kg。
32.干细胞没有特别限定，例如为es细胞、ec细胞、eg细胞、ips细胞、造血干细胞、间充质干细胞、肝干细胞、胰干细胞、皮肤干细胞、脐带血干细胞、骨髓干细胞、肌干细胞、生殖干细胞、脂肪干细胞、牙髓干细胞或muse细胞。
33.受试者所进行的用于恢复身体功能的身体运动是以体力的提高为目的而有计划、有意图地实施且具有持续性的身体活动，优选为基于交互式生物反馈理论的身体运动。
34.受试者的身体功能的下降例如是因缺血性疾病引起的。
35.缺血性疾病没有特别限定，例如为选自心肌梗塞、不稳定心绞痛、冠状动脉旁路术后的移植物闭塞、经皮冠状动脉成形术后的冠状动脉闭塞、血管再造术后的血管闭塞、闭塞性动脉硬化症、血栓闭塞性脉管炎、特发性血小板增多症(essential thrombocythemia)、血栓性血小板减少性紫癜、抗磷脂抗体综合征及川崎病中的任意疾病。缺血性疾病例如为脑性麻痹。脑性麻痹例如因新生儿低氧缺血性脑病、早产儿胆红素脑病等而引起。缺血性疾病优选为脑梗塞的后遗症。认为在脑梗塞的情况下从发病起例如6个月后症状固定，捕捉从发病起经过例如6个月后残存的神经功能障碍作为脑梗塞的后遗症。另一方面认为：对于小鼠而言，脑梗塞模型制作后例如4周相当于与人的脑梗塞发病6个月后相同的时期。该时期是症状大致被固定而实施维持康复训练并且以预防复发为中心的时期，是观察到细胞坏死、组织的瘢痕化的病态。即使施用造血干细胞作为脑梗塞的后遗症治疗，仅靠细胞施用的治疗效果也低。另外，对脑梗塞后遗症进行的康复训练是用于维持功能的训练，无法期待恢复已失去的功能。但是，当向具有脑梗塞后遗症的患者施用骨髓单核细胞、cd34阳性细胞、cd133阳性细胞或干细胞时，能够促进针对脑梗塞的后遗症而使末梢与中枢协调的身体运动的效果。所施用的细胞优选为骨髓单核细胞或cd34阳性细胞。骨髓单核细胞优选经静脉施用，cd34阳性细胞优选经颈总动脉或颈内动脉施用。
36.本发明的身体功能恢复促进剂是针对脑梗塞后遗症而在身体运动的开始前、开始时或开始后向受试者施用，例如，该施用时期为从身体运动的开始时的6周前、4周前、2周前、1周前、3天前、开始时、3天后、1周后或2周后的时间点中选择任意2个点的期间内，优选为从身体运动开始时的4周前到身体运动的开始时为止的期间。
37.成为对象的脑梗塞即使在腔隙性脑梗塞、动脉粥样血栓性脑梗塞、或心源性脑栓塞中的任意情况下也适合使用。
38.另外，受试者的身体功能的下降例如是由神经疑难病引起的。
39.神经疑难病没有特别限定，例如为肌萎缩性侧索硬化症(als)、帕金森病、多系统萎缩症、脊髓小脑变性症、进行性核上性麻痹、多发性硬化症、脊髓空洞症、格林-巴利综合征(guillain
–
barre syndrome)、脊髓性肌萎缩症或重症肌无力的任意者。
40.另外，受试者的身体功能的下降例如是由痴呆症引起的。
41.痴呆症没有特别限定，例如为阿尔茨海默型痴呆症、路易体痴呆症、额颞型痴呆症、皮质基底核变性症、脑血管性痴呆症、唐氏症或亨廷顿病。
42.另外，受试者的身体功能的下降例如是由自闭症引起的。
43.另外，受试者的身体功能的下降例如是由发育障碍或行动障碍引起的。
44.另外，受试者的身体功能的下降例如是由脊髓损伤引起的。
45.另外，受试者的身体功能的下降不是因疾患而引起的，也适用于受试者为高龄者的情况下由老化引起的身体功能的下降状态的改善。高龄者没有特别限定，例如为60岁以上，优选为70岁以上，更优选为75岁以上且95岁以下。
46.在本发明中，身体功能恢复促进剂还能够含有神经营养因子。神经营养因子没有特别限定，例如可以使用vegf、血管生长素(angiopoietin)、pdgf、tgf-β、fgf、pigf、基质金属蛋白酶、纤溶酶原激活剂等。需要说明的是，期望避开施用具有在末梢血中动员造血干细胞的作用的药剂(粒细胞集落刺激因子[granulocyte-colony stimulating factor：g-csf])。这是因为在g-csf的施用中有时伴随着来自骨髓的粒细胞动员而引起脑萎缩、神经功能的下降。
[0047]
在将本发明的身体功能恢复促进剂制成注射用制剂的情况下，可以适当使用在本技术领域中通常使用的添加剂。作为添加剂，例如可以举出等渗剂、稳定剂、缓冲剂、防腐剂(preservative)、螯合剂、抗氧化剂或助溶剂等。作为等渗剂，例如可以举出葡萄糖、山梨醇、甘露醇等糖类、氯化钠、甘油、丙二醇、聚乙二醇等。作为稳定剂，例如可以举出亚硫酸钠等。作为缓冲剂，例如可以举出硼酸缓冲剂、磷酸缓冲剂、柠檬酸缓冲剂、酒石酸缓冲剂、醋酸缓冲剂等。作为防腐剂，例如可以举出对羟基苯甲酸酯、苯甲醇、氯甲酚、苯乙醇、苄索氯铵等。作为螫合剂，例如可以举出依地酸钠、柠檬酸钠等。作为抗氧化剂，例如可以举出亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、抗坏血酸钠、硫代硫酸钠等。作为助溶剂，例如可以举出葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、苯甲酸钠、乙二胺、水杨酰胺、烟酰胺、聚氧乙烯氢化蓖麻油衍生物等。
[0048]
实施例
[0049]
1-1.脑梗塞后遗症模型小鼠的制作
[0050]
脑梗塞模型(日本专利第4481706号)通过下述方法制成。利用异氟烷麻醉对7周龄的重症复合免疫不全小鼠(scid小鼠；c.b-17/icr-scid/icidjcl)进行全身麻醉，在颅底进行了1.5mm左右的穿孔以便能够从左颊骨部接近从而直达至左大脑中动脉。使用双极型电手术刀使刚通过嗅束后(嗅束交叉部的远位侧)的左大脑中动脉凝固，并进行凝固后切断，由此制作使左大脑中动脉永久闭塞、且局限于左大脑中动脉区域皮质的脑梗塞模型。本模型小鼠在从脑梗塞制作起4周后的相当于慢性期的期间也残留有神经功能障碍，因此用作脑梗塞的后遗症模型小鼠。需要说明的是，脑梗塞制作后每1个笼子饲养5只，维持轻度但相互始终给予一定的神经刺激的状态。由此，预防肌肉的废用性肌萎缩等，在认为所有的小鼠接受了一般的功能维持康复训练治疗的状态下进行饲养。
[0051]
1-2.施用细胞的准备
[0052]
施用细胞的准备通过以下的方法进行。关于骨髓单核细胞，从小鼠大腿骨和胫骨采取骨髓液，使骨髓细胞悬浊液重叠于作为比重离心液的ficoll液，使用摆动转子(swing-rotor)式离心机以600g离心20分钟。用移液管(pipette)采取在比重离心液层的正上方观察到的单核球细胞级分。关于cd34阳性细胞，从stem express公司购买gcsf动员人末梢血，使用了用clinimacs system分离得到的cd34阳性细胞。
[0053]
1-3.细胞施用
[0054]
关于骨髓单核细胞，从尾静脉向上述的脑梗塞后遗症模型小鼠施用1
×
105个来自小鼠的骨髓单核细胞(细胞治疗组，6只)。另外，作为比较例，使用了从尾静脉施用了pbs的脑梗塞后遗症模型小鼠(pbs组，6只)。关于cd34阳性细胞，从颈动脉向脑梗塞后遗症模型小鼠施用1
×
104个人末梢血cd34阳性细胞(细胞治疗组，9只)。作为比较例，使用了从尾静脉对脑梗塞后遗症模型小鼠施用了pbs的组(pbs组，8只)。
[0055]
1-4.对脑和末梢神经两者给予刺激的身体运动、以及脑神经功能试验
[0056]
在脑神经功能试验中，将对脑梗塞后遗症模型小鼠静脉施用骨髓细胞的细胞治疗组与向脑梗塞后遗症模型小鼠静脉施用pbs的pbs组、还有无处置组(no surgery组，6只)进行了比较。另外，体现交互式生物反馈理论的hal电子用具仅存在人用的用具，不存在能够安装于小鼠的用具，因此使用使脑和末梢神经两者协调给予刺激的身体运动。
[0057]
1-4-1.被动回避试验
[0058]
作为脑神经功能试验，进行了被动回避试验(passive avoidance test)。在被动回避试验中，改良melquest公司的tms-2装置，作为被动回避实验装置进行使用。该装置是明室与暗室相连的装置，明室尺寸和暗室尺寸均为120(w)
×
120(d)
×
135(h)。这是用于如下试验(被动性回避试验)的装置，该试验通过在动物从明室进入暗室时给予电刺激而将向暗室的进入与惊吓的恐惧相关联地记忆。将小鼠放入装置的明室侧，在10秒后打开门，能够向暗室移动，在小鼠移动至暗室后关闭门，在10秒后施加电刺激(20ma，3秒)。使向暗室的侵入与因电刺激引起的疼痛即恐惧相关联地记忆，取得动物对厌恶刺激(电刺激)的记忆。在24小时后再次放入明室，并确认留在明室的时间(秒)。
[0059]
如图1所示，在no surgery小鼠中，平均为100秒。另外，向脑梗塞制作后4周的脑梗塞后遗症模型小鼠静脉施用pbs，之后不进行悬丝试验和水迷宫试验所记载的对脑和末梢神经两者给予刺激的身体运动，在静脉施用后2周的时间点进行得分测量，结果平均为38秒(在图1中标记为mcao)。pbs组与no surgery组相比，确认到记忆学习能力明显下降。向脑梗塞制作后4周的脑梗塞后遗症模型小鼠静脉施用骨髓单核细胞，之后不进行试验运动，在静脉施用后2周的时间点测量得分，结果平均为75秒(在图1中标记为mcao+bm)。细胞施用组与pbs组相比，没有统计学上的显著差异。
[0060]
根据以上的结果表明，向脑梗塞制作后4周的脑梗塞后遗症模型小鼠静脉施用骨髓单核细胞的、静脉施用后2周的时间点的得分与向脑梗塞后遗症模型小鼠静脉施用pbs的组的、施用后2周的时间点的得分之间没有显著差异。即，即使施用骨髓单核细胞，在没有进行对脑和末梢神经两者给予刺激的身体运动的情况下，在脑梗塞后遗症模型小鼠中也没有脑神经功能提高效果。
[0061]
1-4-2.悬丝试验
[0062]
作为脑神经功能试验，进行了悬丝试验(wire hang test)。在悬丝试验中，将小鼠放在具有1cm宽的网眼的30cm
×
30cm的金属网的中心。将金属网倒置翻转，放置在支承台上，该支承台设置在距离开放式笼子(加深了地板垫)约40cm的高度处。测量直至小鼠从金属网落下的时间，在不落下而保持抓紧的情况下将180秒作为测定值。该试验通过对脑给予与落下的恐惧有关的刺激，并使其与对金属网的抓紧运动紧密关联，从而对脑和末梢神经两者同时给予刺激。
[0063]
向脑梗塞制作后4周的脑梗塞后遗症模型小鼠静脉施用pbs，之后继续试验运动，
在静脉施用后2周和8周的时间点进行得分测量(在图2中标记为mcao)。另外，向脑梗塞制作后4周的脑梗塞后遗症模型小鼠静脉施用骨髓单核细胞，之后继续试验运动，在静脉施用后2周和8周的时间点进行得分测量(在图2中标记为mcao+bm)。
[0064]
如图2所示，在施用前的时间点，细胞治疗组、pbs施用组与no surgery组相比均显示显著的差异。在静脉施用后2周的时间点，确认到pbs组与no surgery组相比运动功能的显著下降。但是，细胞施用组与pbs组相比观察到运动功能的恢复。在成为第三次试验的静脉施用后8周的结果中，细胞施用组显示出功能恢复至与no surgery组相比相同的水平，细胞施用组与pbs组相比显示出统计学上的显著差异。另外的pbs组与no surgery组相比确认到运动功能的明显下降。
[0065]
根据以上结果表明，在向脑梗塞制作后4周的脑梗塞后遗症模型小鼠静脉施用骨髓单核细胞的组中，通过反复进行使脑和末梢神经两者协调给予刺激的身体运动，从而显示脑梗塞后遗症模型小鼠中的脑神经功能提高效果。
[0066]
对于cd34阳性细胞，向脑梗塞制作后4周的脑梗塞后遗症模型小鼠动脉内施用cd34阳性细胞。之后继续试验运动，并在施用后2周和8周的时间点进行得分测量，并与向脑梗塞制作后4周的脑梗塞后遗症模型小鼠施用了pbs的组进行比较(在图3中，pbs施用组标记为mcao+pbs，cd34阳性细胞施用组标记为mcao+cd34 ia)。如图3所示，在静脉施用后2周的时间点，cd34阳性细胞施用组与pbs组相比没有观察到显著差异，但是确认到得分的上升。在施用后8周，确认到与pbs组之间具有显著的差异。
[0067]
测量了施用后8周的相较于施用前的变化量，结果cd34阳性细胞施用组的平均值为33.16，pbs组为2.28，cd34阳性细胞施用组相较于施用前显著地增加(p＝0.0136)。
[0068]
根据以上结果表明，对于向脑梗塞制作后4周的脑梗塞后遗症模型小鼠进行动脉内施用cd34阳性细胞的组，通过反复进行使脑和末梢神经两者协调给予刺激的身体运动，从而显示脑梗塞后遗症中的脑神经功能提高效果。
[0069]
1-4-3.水迷宫试验
[0070]
试验1
[0071]
作为脑神经功能试验，进行了水迷宫试验(water maze test)。水迷宫试验通过以下方式来进行，即，向圆形的池中浇水，在水面下1cm左右的场所制作能够供小鼠避难的脚手架，测定直至小鼠到达避难场所为止的时间(秒)。在该试验中，通过对脑给予与溺水有关的刺激，并使之与空间认知和游泳运动紧密关联，从而对脑和末梢神经两者同时给予刺激。
[0072]
如图4所示，向脑梗塞制作后4周的脑梗塞后遗症模型小鼠静脉施用pbs，之后不进行对脑和末梢神经两者给予刺激的身体运动而在静脉施用后4周的时间点进行得分测量，结果pbs组第一天(身体运动前)的平均值为53秒(在图4中标记为mcao+pbs)。向脑梗塞制作后4周的脑梗塞后遗症模型小鼠静脉施用骨髓单核细胞，之后不进行试验运动而在静脉施用后4周的时间点进行得分测量，结果细胞治疗组第一天(身体运动前)的平均值为49秒(在图4中标记为mcao+bm)。在no surgery组中，第一天(身体运动前)的平均为22秒(在图4中标记为no surgery)。
[0073]
统计分析的结果，细胞治疗组与pbs组之间的差异的p值为0.65，无显著差异。另外，细胞治疗组与no surgery组之间的差异的p值为0.002，有显著差异。另外，pbs组与no surgery组之间的差异的p值为0.0004，有显著差异。即，表明了即使施用骨髓单核细胞，在
没有对脑和末梢神经两者给予刺激的身体运动的情况下，也没有对脑梗塞后遗症的脑神经功能提高效果。
[0074]
向脑梗塞制作后4周的脑梗塞后遗症模型小鼠动脉内施用pbs，之后不进行试验运动而在动脉施用后4周的时间点进行得分测量(图5)。pbs组第一天(运动前)的平均值为50.9秒(在图5中标记为mcao+pbs)。向脑梗塞制作后4周的脑梗塞后遗症模型小鼠动脉施用cd34阳性细胞，在动脉施用后4周的时间点进行得分测量，结果细胞治疗组第一天(运动前)的平均值为47.6秒(在图5中标记为mcao+cd34 ia)。
[0075]
统计分析的结果，在细胞治疗组与pbs组之间无显著差异。即，表明了即使动脉内施用cd34阳性细胞，在没有对脑和末梢神经两者给予刺激的身体运动的情况下，对脑梗塞后遗症也没有脑神经功能提高效果。
[0076]
试验2
[0077]
针对脑梗塞后遗症模型小鼠，进行了对脑和末梢神经两者给予刺激的身体运动的效果的研究。即，使用水迷宫试验装置在加有水的圆形池中每天进行水迷宫试验，并在第二、三、四天进行使脑和末梢神经两者协调给予刺激(即，提高因脑梗塞导致障碍的运动功能和记忆力)的身体运动。
[0078]
针对向脑梗塞后遗症模型施用pbs或骨髓单核细胞的小鼠，进行了使脑和末梢神经两者协调给予刺激的身体运动效果的研究。
[0079]
在pbs组中，第五天(运动后)的平均值为35秒。进行与第一天(运动前)的比较的统计分析，判定是否有基于训练的治疗效果。其结果表明，p值为0.11，训练之前和之后无显著差异，在pbs施用组中使脑梗塞后遗症中的脑和末梢神经两者协调给予刺激的身体运动无法提高脑神经功能。
[0080]
在骨髓单核细胞组中，第五天(运动后)的平均值为8秒。进行与第一天(运动前)的比较的统计分析，判定是否有基于训练的治疗效果。其结果表明，p值为0.00025，在训练之前和之后观察到显著差异的缩短，在骨髓单核细胞组中对脑梗塞后遗症中的脑和末梢神经两者给予刺激的身体运动明显地提高且维持脑神经功能(图4)。
[0081]
接下来，进行第五天(运动后)的各组的比较研究。其结果，细胞治疗组与pbs组之间的差异的p值为0.04，观察到统计学上显著的脑神经功能的提高。另外，细胞治疗组与no surgery组之间的差异的p值为0.95，没有观察到显著的差异。另外，pbs组与no surgery组之间的差异的p值为0.02，有显著差异(图4)。
[0082]
针对向脑梗塞后遗症模型小鼠施用pbs的组和向脑梗塞后遗症模型小鼠施用骨髓单核细胞的组，进行了使脑和末梢神经两者协调给予刺激的身体运动的效果的研究。
[0083]
对于cd34阳性细胞，在进行训练(以对脑和末梢神经两者给予刺激的身体运动为目的)中，显示出到终点的到达时间逐渐变短的倾向(图5)。因此表明，对于cd34阳性细胞的动脉内施用，对脑梗塞后遗症模型小鼠中的脑和末梢神经两者给予刺激的身体运动显著提高脑神经功能。
[0084]
根据试验1和试验2的结果表明：(i)在脑梗塞后遗症模型小鼠中仅施用骨髓单核细胞或cd34阳性细胞时在给予一般的身体运动的状态下，没有脑神经功能改善效果；(ii)在脑梗塞后遗症模型小鼠中仅通过对脑和末梢神经两者给予刺激的身体运动，没有脑神经功能改善效果；(iii)在脑梗塞后遗症模型小鼠中通过骨髓单核细胞施用或cd34阳性细胞
施用，从而显现出使脑梗塞后遗症模型小鼠的脑和末梢神经两者协调给予刺激的身体运动的治疗效果。即，表明骨髓单核细胞施用或cd34阳性细胞施用会促进对脑梗塞后遗症中的脑和末梢神经两者给予刺激的身体运动的效果。
[0085]
1-4-4.转棒疲劳试验
[0086]
试验1
[0087]
作为脑神经功能试验，采用了转棒疲劳测试(旋转棒测试：rotarod test)。转棒疲劳测试是用于测定小鼠的协调运动和平衡感觉的测试。装置使用mk630a(室町机器株式会社)。以在300秒内使杆的旋转加速至4rpm～40rpm的方式对装置进行编程，记录从将小鼠放置于装置的旋转棒到落下为止的时间(秒)。
[0088]
如下述图6所述，向脑梗塞制作后4周的脑梗塞后遗症模型小鼠静脉施用骨髓单核细胞，在静脉施用后8周的时间点进行得分测量，结果细胞治疗组(在图6中标记为mcao+bm)的第一天(运动前)的平均显示为170秒，pbs施用组(在图6中标记为mcao+pbs)的第一天(运动前)的平均显示为148秒，no surgery组的第一天(运动前)的平均显示为198秒。在细胞施用组和pbs组的比较中，无统计学上的显著差异。即，表明：即使施用骨髓单核细胞，在没有使脑和末梢神经两者协调给予刺激的身体运动的情况下，也没有脑梗塞后遗症中的脑神经功能提高效果。
[0089]
试验2
[0090]
作为使脑梗塞后遗症中的脑和末梢神经两者协调给予刺激的身体运动，在第二天、第三天、第四天，在所有的组中使用转棒疲劳测试所使用的的装置实施每天5分钟的运动训练。即，将小鼠放置于旋转棒上，从旋转棒上落下后也再次放回到旋转棒，由此对脑给予落下的恐惧和厌恶感，并使之与协调运动和平衡感觉的功能提高紧密关联，由此实施三天使脑和末梢神经协调给予刺激的运动。
[0091]
关于第五天(运动后)的转棒疲劳测试的得分，在细胞治疗组中平均为223秒，在pbs组中平均为176秒。统计分析的结果得分差的p值为0.01，有显著差异。
[0092]
根据试验1和试验2的结果表明：(i)在脑梗塞后遗症中，仅施用骨髓单核细胞、或仅给予一般的身体运动，均没有对脑神经功能的改善效果；(ii)通过在脑梗塞后遗症中进行骨髓单核细胞施用，从而显现出使脑梗塞后遗症中的脑和末梢神经两者协调给予刺激的运动的治疗效果。即，表明骨髓单核细胞施用会促进对脑梗塞后遗症中的脑和末梢神经两者同时给予刺激的运动效果。
[0093]
以上，表明通过骨髓单核细胞的施用能够促进对脑梗塞后遗症中的脑和末梢神经两者同时给予刺激的运动的效果。
[0094]
产业上的可利用性
[0095]
能够在促进身体运动(对脑和末梢神经两者给予刺激、使中枢和末梢协调)的效果的治疗中进行利用。