利用微针贴片的微创特应性皮炎检查方法及包括微针贴片的微创特应性检查试剂盒与流程

1.本发明涉及利用微针贴片的微创特应性皮炎检查方法及包括微针贴片的微创特应性检查试剂盒。


背景技术：

2.虽然开发了用于治疗疾病的许多药物及生理活性物质等，但在将药物及生理活性物质传递到身体内的过程中，生物屏障(biological barrier，例如皮肤、口腔粘膜及脑血管屏障等)通过问题及药物传递的效率问题仍然需要改善。
3.虽然药物及生理活性物质通常以片剂剂型或胶囊剂型口服给药，但很多药物因在胃肠道中被消化或吸收或利用肝脏的机制消失等原因而仅通过如上所述的给药方法则无法有效传递。而且，几种药物无法通过肠的粘膜有效扩散。例如，对于需要以特定时间间隔服用药物或无法服药的重病患者等而言，患者的依从性同样成为问题。
4.在传递药物及生理活性物质的过程中，另一种通常的技术利用常规的注射针头(needle)。该方法相比于口服给药更有效，然而存在引起注射部位上的疼痛伴随及皮肤的局部损伤、出血及注射部位上的疾病感染等的问题。
5.为了解决上述口服给药及皮下注射的问题，利用通过贴片剂的经皮给药方法。使用贴片剂的经皮给药，其副作用少，患者的依从性高，容易规定地维持药物的血中浓度。
6.为了解决如上所述的多个问题，开发包括微针(microneedle)的多种微结构体。作为微针的材质，使用金属及多种高分子物质。最近，作为微针的材质，生物降解性高分子物质备受关注。
7.用于制作生物降解性材质的微结构体的方法中代表性的方式为利用模具的方式。当应用半导体制造工序首先制作通过阴刻呈所要形成的微结构体的形态的模具，在这种模具中倒入微结构体材料使其凝固之后取下时，形成微结构体，即微针。
8.作为可代替这种成型方式的微结构体制作方法的新的制作方法，本技术人曾就送风拉伸方式的制造方法获得国内外的多个专利权。简单说明送风拉伸方式，其为如下方法：将具有粘性的生物亲和性高分子物质定位在位于基板上的贴片的底层或与贴片相结合之前的底层之后，将相同的生物亲和性高分子物质定位在位于另一基板上的贴片的底层或与贴片相结合之前的底层或将其省略，使上述另一基板反转，使其向上述定位的生物亲和性高分子物质处接近，最终相接触，之后隔开两个基板之间的相对距离，使相接触的具有粘性的生物亲和性高分子物质拉伸，这种拉伸工序结束之后，实施送风，在拉伸的状态下固定形态，切割中间部分，在两个不同的基板上分别形成相同的微结构体。
9.以上，作为药物及生理活性物质传递单元，简要说明微结构体的技术含义和用于制作该微结构体的方法等。本技术人提议为了实现本发明而将微结构体用于新目的，而非药物及生理活性物质的传递。其将微结构体，即包括微针的贴片利用于微创特应性皮炎(atopic der matitis)检查中。
10.特应性皮炎为伴有瘙痒的炎症性皮肤疾病，是与过敏性鼻炎、支气管哮喘一同最为代表性的过敏性疾病，儿童患病率为10-30％，多发生在幼儿和少儿中，但最近增加很多成人的特应性皮炎。特应性皮炎的主要病理机制涉及皮肤屏障的异常、免疫学异常、遗传因素、环境因素等。皮肤屏障的异常是因为丝聚蛋白(filaggrin)等的皮肤角质形成细胞分化相关的很多生物学因子和作为皮肤屏障脂质的重要因素的神经酰胺的合成被减少，引起皮肤屏障的异常，由此引起皮肤干燥症及瘙痒症。免疫学异常是因为利用树突状细胞、t细胞、其他先天免疫细胞(肥大细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜中性粒细胞)之类的多个细胞的先天性、适应性免疫反应起到综合作用，tslp、il-4、il-13之类的多种细胞因子(cytokines)及趋化因子(ch emokines)之类的多种炎症反应物质被分泌而引起免疫反应，其中对病因最核心的细胞因子中的一种为il-4和il-13，最近开发将该标记物作为靶的很多生物药剂，广泛用作顽固性特应性皮炎的新治疗剂，呈现非常优秀的效果。
11.观察如上所述的特应性皮炎的发病机制相关的很多生物学物质的变化与新的治疗药物的开发有关。为了发掘这种特应性皮炎的新的发病机制，判定治疗效果，预后预测检查，发掘新的治疗剂等，最普遍的是，将特应性皮炎的病变部位进行活检，分析与组织内特应性皮炎有关的生物学因子等的方法。图1表示这种活检。但是，活检需要主刀的熟练技术。并且，存在伴随患者的痛苦而产生反感，试验之后活检部位留有疤痕的缺点。由于这种理由等，实际很难针对人体逐一检测这种因子，成为新技术或新药开发的障碍。为了改善这种缺点，提出利用在病变部位附着/取下胶带而分析粘在胶带的皮肤检验物的胶带的无创剥离方法。但是，存在粘在胶带的物质局限于角质层的缺点。相反，特应性皮炎为角质层、表皮、真皮层中的免疫系统异常导致的皮肤疾病，因而如同活检均在表皮和真皮中采集组织尤为重要。因此胶带剥离方法可用作用于特应性皮炎的新药开发或发病机制的研究的一部分辅助方法，但难以得到完整的结果。对此，(多名)本发明人利用皮肤活检、胶带剥离及多种微结构体贴片获得皮肤检验物，通过利用胶带或微结构体贴片的剥离确认是否获得可代替皮肤活检的程度的皮肤检验物，确认可代替皮肤活检的采集方法的有用性。
12.用于这种研究的微结构体贴片共有三种，作为微结构体贴片的对照组的无微结构体的空白贴片和空心微结构体贴片以及溶解性微结构体贴片。作为对照组的空白贴片通常仅由主要用于伤口愈合的水胶体贴片构成。空心微结构体贴片具有可通过微结构体内部的具有微小尺寸的截面积的孔将疼痛和感染危险性最小化，同时可传递药物的优点。在溶解性微结构体贴片中，在水胶体贴片上形成医药品等级的透明质酸成分微针。微结构体贴片的制造方法中有上述的模具方式和拉伸方式等，不分制造方法，在贴片上形成透明质酸成分的微针即可。当在皮肤上适用这种微结构体贴片时，如图2所示，微结构体透过角质层进入至皮肤内部。(多名)本发明人在位于表皮、真皮层的多个因子可吸附于进入至皮肤内部的微结构体的充分的时间内附着贴片，之后从取下的贴片中获得皮肤检验物。之后，(多名)本发明人通过组织活检、胶带剥离、三种微结构体贴片方法之间的比较分析提出可代替组织活检的新的微创特应性皮炎检查方法，其用于检测对病因重要的生物标志物或测定表达量。


技术实现要素：

13.技术问题
14.本发明的目的在于，用于解决现有的组织活检、胶带剥离方式的特应性皮炎检查方法的问题。
15.现有的组织活检存在需要主刀的熟练技术，因患者伴随着痛苦而产生反感，试验之后活检部位留有疤痕的缺点。
16.现有的胶带剥离存在粘在胶带的物质局限于角质层，只可用作辅助检查方法，无法提供完整的结果的缺点。
17.本发明的目的在于，提供相比于现有组织活检，几乎无痛苦，不留疤痕，可提高患者的使用方便性的同时采集角质层内部的皮肤因子，可提高现有的胶带剥离对比分析结果的可靠性的新的微创特应性皮炎检查方法及微创特应性皮炎检查试剂盒。
18.解决问题的方案
19.本发明一实施例的微创特应性皮炎检查方法包括：将微针贴片适用于对象体的皮肤的步骤，上述微针贴片包括由生物降解性高分子透明质酸形成且实心结构的多个微针和成为形成所述多个微针的基底的底层；在将上述微针贴片附着于对象体的皮肤的状态下，维持规定时间的步骤；经过上述规定时间之后，从对象体的皮肤中分离上述微针贴片并投入于定量检查的步骤；在上述定量检查步骤中读取吸附于上述微针贴片的微针表面的白细胞介素-4及白细胞介素-13的量的步骤；基于读取上述白细胞介素-4及白细胞介素-13的量测定根据治疗的特应性皮炎的活度的步骤。
20.本发明一实施例的微创特应性皮炎检查试剂盒包括：设备，能够定量分析从对象体的皮肤中提取的蛋白质的量；微针贴片，包括由生物降解性高分子透明质酸形成且实心结构的多个微针和成为形成所述多个微针的基底的底层。上述微针贴片适用于对象体的皮肤，利用上述设备，对维持规定时间之后分离的状态下吸附于上述微针贴片的微针表面的对象体的蛋白质进行定量分析。上述设备读取吸附于上述微针贴片的微针表面的白细胞介素-4及白细胞介素-13的量。基于读取上述白细胞介素-4及白细胞介素-13的量评价特应性皮炎的活度。
21.此外，还可将追加结构提供至本发明的微创特应性皮炎检查方法或微创特应性皮炎检查试剂盒法。
22.发明的效果
23.根据本发明，可解决现有的组织活检、胶带剥离方式的特应性皮炎检查方法的问题。
24.现有的组织活检存在需要主刀的熟练技术，因患者伴随着痛苦而产生反感，试验之后活检部位留有疤痕的缺点。
25.现有的胶带剥离存在粘在胶带的物质局限于角质层，只可用作辅助检查方法，无法提供完整的结果的缺点。
26.根据本发明，可提供相比于现有组织活检，几乎无痛苦，不留疤痕，可提高患者的使用方便性的同时采集角质层内部的皮肤因子，可提高现有的胶带剥离对比分析结果的可靠性的新的微创特应性皮炎检查方法及微创特应性皮炎检查试剂盒。
附图说明
27.图1为表示现有技术的皮肤活检方法的图。
28.图2为概念性地表示本发明的皮肤活检方法的图。
29.图3为表示在特应性皮炎的检查方法相关临床试验之前针对与本发明的概念密切相关的微创皮肤活检方法由(多名)本发明人执行的实验(以下，称为“基础实验1”)中的四种对照组的图，表示1)未形成微针的空白贴片、2)金属材质的实心(solid)微针、3)低分子量透明质酸微针贴片、4)高分子量透明质酸微针贴片。
30.图4为表示使用基础实验1的四种对照组针对30多岁患者组和60多岁患者组进行前胶原蛋白(pro-collagen)1检测试验的结果的表。
31.图5为表示基础实验1的四种对照组中低分子量透明质酸微针贴片和高分子量透明质酸微针贴片的活检适用前后的长度变化测定结果的表。
32.图6为表示另一基础实验(以下，称为“基础实验2”)的结果的表，其中使用的对照组为1)未形成微针的空白贴片、2)低分子量透明质酸微针贴片、3)高分子量透明质酸微针贴片，在各个对照组中，对20多岁患者组和60多岁患者组的皮肤适用5秒钟和60秒钟之后取下，测定前胶原蛋白(pro-collagen)1检测结果。
33.图7为表示在基础实验2的对照组中分别对20多岁患者组和60多岁患者组的皮肤适用10秒钟和30秒钟之后取下，测定前胶原蛋白(pr o-collagen)1检测结果的结果的表。
34.图8为表示另一基础实验(以下，称为“基础实验3”)的结果的表，其中使用的对照组为1)低分子量的壳聚糖微针贴片、2)高分子量的壳聚糖微针贴片，在各个对照组中，对皮肤适用5秒钟、60秒钟及300秒钟之后取下，测定前胶原蛋白(pro-collagen)1检测结果。
35.图9为拍摄用于验证本发明的效果的临床试验中使用的三种贴片的多个图。
36.图10为表示临床试验推进日程的表。
37.图11为整理临床试验对象相关信息的表。
38.图12为表示附着于胶带、空白贴片、ha微针、空心针这四种皮肤试料获得单元的蛋白质的量的表。
39.图13和图14为表示使用胶带和微针分别确认il-13和ifn-γ(gamma)的表达量的结果的图表。
40.图15为通过酶联免疫吸附测定(elisa)试验测定利用ha微针从多名临床试验对象中获得的皮肤检验物内il-4的表达的表。
41.图16为通过酶联免疫吸附测定(elisa)试验测定利用ha微针从多名临床试验对象中获得的皮肤检验物内il-13的表达的表。
42.图17为通过酶联免疫吸附测定(elisa)试验测定利用ha微针从多名临床试验对象中获得的皮肤检验物内ifn-γ(gamma)的表达的表。
43.图18表示通过统计分析(spss)确认利用ha微针从多名临床试验对象中获得的皮肤检验物内il-4的表达和与特应性皮炎临床经过的相关关系的结果。
44.图19表示通过统计分析(spss)确认利用ha微针从多名临床试验对象中获得的皮肤检验物内il-13的表达和与特应性皮炎临床经过的相关关系的结果。
45.图20表示通过统计分析(spss)确认利用ha微针从多名临床试验对象中获得的皮肤检验物内ifn-γ(gamma)的表达和与特应性皮炎临床经过的相关关系的结果。
具体实施方式
46.后述的本发明的详细说明参照将可实施本发明的特定实施例作为示例而表示的附图。详细说明这种实施例，以使本发明所属技术领域的普通技术人员可充分实施本发明。应当理解的是，本发明的多种实施例虽然不同，但无需相互排斥。后述的详细的说明并非以局限的含义进行，本发明的范围包括权利要求书的多个权利要求中所请求的范围及与其等同的所有范围。
47.以下，为了可使本发明所属技术领域的普通技术人员容易实施本发明，参照附图详细说明本发明的多种优选实施例。
48.微创皮肤活检方法相关基础实验结果
49.图2为概念性地表示本发明的皮肤活检方法的图。
50.图2的左上段中表示产品名称为“therapass”的市场销售中的微针贴片。该产品为本技术人公司上市而销售中的产品，是分子量为1000kda的高分子量透明质酸微针贴片。图2的左下段中表示这种微针贴片适用于皮肤的状态，更具体地，表示贴片的微针渗透至皮肤的真皮层的状态。图2的右侧部分中概念性地表示对皮炎患者适用微针贴片之后，利用沾在贴片的微针的皮肤内蛋白质实施活体检查的本发明的代表性技术思想。作为在此表示的术语的生物采矿(bio-mining)以为了活体检查而开采对象体皮肤内的蛋白质的含义使用。
51.图3表示(多名)本发明人在特应性皮炎的检查方法相关临床试验之前，针对与本发明的概念密切相关的微创皮肤活检方法执行的基础实验1的四种对照组。这四种对照组中第一组为未形成微针的空白贴片。第二组为金属材质的实心(solid)微针。第三组为低分子量透明质酸微针贴片。用于低分子量透明质酸微针贴片的透明质酸分子量为110kda。第四组为高分子量透明质酸微针贴片。用于高分子量透明质酸微针贴片的透明质酸分子量为1000kda。
52.图4为表示使用上述的四种对照组针对30多岁患者组和60多岁患者组进行前胶原蛋白(pro-collagen)1检测试验的结果的表。
53.图4的x轴中表示空白贴片、低分子量透明质酸贴片和高分子量透明质酸贴片。y轴中检测到的前胶原蛋白(pro-collagen)1的每单位体积质量由每毫升皮克的单位表示。未表示四种对照组中金属材质的实心(solid)微针。这是因为根本未进行蛋白质定量本身。图4所示的“酶联免疫吸附测定(elisa)”为对抗体或抗原标记酶，测定酶的活性，定量测定抗原-抗体反应的强度和其量的方法，是指现代生命工程中所利用的方法。该方法用于本发明的整个实验中。
54.图4的表中需要仔细观察的是是否具有与作为第一对照组的空白贴片的实质性的差别性。这是因为空白贴片为本发明的申请之前存在的现有技术，当检测结果与空白贴片无实质性的差别化时，本发明无助于提高生物检测效果。察看图4的结果，低分子量(110kda)透明质酸贴片中的前胶原蛋白(pro-collagen)1检测量与空白贴片的情况无实质性的差别化。但是，可知高分子量(1000kda)透明质酸贴片中的前胶原蛋白(pro-collagen)1检测量相比于空白贴片及低分子量透明质酸贴片的情况，显著增加。
55.本发明人对如何根据成为微针贴片的成分的透明质酸的分子量呈现如此显著的结果的差别性这一问题持续实验，分析其原因，找出其原因为根据分子量的差异的向皮肤内的溶解速度。当前商用化的微针贴片的微针成分为生物相容性且生物降解性高分子物
质，这是大势所趋。“生物相容性物质”意味着对人体无毒性且化学惰性的物质。并且，“生物降解性物质”意味着在生物体内可利用体液、酶或微生物等分解的物质。并且，被熟知的是在多种生物降解性物质中具有分子量越小，向生物体内的溶解速度变快，分子量越大，向生物体内的溶解速度变慢的倾向性。另一方面，被熟知的作为生物相容性高分子(biocompatible polymer)的物质如下。
56.透明质酸(hyaluronicacid，ha)、明胶(gelatin)、壳聚糖(chitosan)、胶原蛋白(collagen)、海藻酸、果胶、卡拉胶、硫酸软骨素、硫酸葡聚糖、聚赖氨酸(polylysine)、羧甲基几丁质、纤维蛋白、琼脂糖、普鲁兰多糖、纤维素、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、聚乙二醇(peg)、聚乙烯醇(pva)、羟丙基纤维素(hpc)、羟乙基纤维素(hec)、羟丙基甲基纤维素(hpmc)、羧甲基纤维素钠、多元醇、阿拉伯胶、藻酸盐、环糊精、糊精、葡萄糖、果糖、淀粉、海藻糖、右旋糖、麦芽糖、乳糖、乳果糖、左旋糖、松二糖、蜜三糖、松三糖、葡聚糖、山梨糖醇、木糖醇、帕拉金石、聚乳酸(polylactic acid)、聚乙醇酸(polyglycolic acid)、聚环氧乙烷、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酸、聚马来酸、聚乙二醇-聚酯共聚物(poly(ethyleneglycol)/polyester)、壳聚糖-磷酸甘油(chitosan/glycerol phosphate)、聚磷腈(polyphosphazene)、聚己内酯(polycaprolactone)、聚碳酸酯(polycarbonate)、聚乙二醇-聚丙二醇(poly(ethylene glycol)/poly(propylene glycol))、聚氰基丙烯酸酯(polycyanoacrylate)、聚原酸酯(polyorthoester)、聚羟乙基甲基丙烯酰胺-乳酸(poly(n-(2-hydroxyethyl)methacrylamide-lactate))、聚丙烯磷酸盐(poly(propylene phosphate))等。
57.当将微针贴片附着于皮肤时，在贴片的微针进入至皮肤的真皮层的过程中，并且，在进入之后维持的过程中，蛋白质可粘在生物相容性微针结构而被提取。但是，对于低分子量的透明质酸微针而言，即使生物体的蛋白质粘在其表面，溶解速度相对快，当长时间附着于皮肤时，随着其本身溶解，附着于表面的蛋白质有可能流失。分析到以这种原因得到图4的实验结果。将支持其的结果示于图6中。
58.图5为表示上述的四种对照组中低分子量透明质酸微针贴片和高分子量透明质酸微针贴片的活检适用前后的长度变化测定结果的表。
59.根据图5的结果，110kda的低分子量透明质酸微针贴片的微针在附着于人体的皮肤期间呈现大致30％的长度减少。另一方面，1000kda的高分子量透明质酸微针贴片的微针在附着于皮肤期间仅呈现大致10％的长度减少。低分子量的透明质酸微针即使在其表面粘有生物体的蛋白质，溶解速度相对快，当长时间附着于皮肤时，随着其本身溶解，粘在表面的蛋白质有可能流失，这是图4所示的实验结果的原因，这种实验结果支持这一点。图4至图5所示的第一实施例的实验中各个对照组的皮肤附着时间为5分钟。对此，多名本发明人发现需要将向皮肤的附着时间缩短到小于5分钟，在分别不同时间长度期间执行实验，计划与上述的基础实验(实验1)不同的实验(实验2)。
60.图6为表示与上述的基础实验1不同的基础实验2的结果的表，其中使用的对照组为1)未形成微针的空白贴片、2)低分子量透明质酸微针贴片、3)高分子量透明质酸微针贴片，在各个对照组中，对20多岁患者组和60多岁患者组的皮肤适用5秒钟和60秒钟之后取下，测定前胶原蛋白(pro-collagen)1检测结果。低分子量透明质酸的分子量及高分子量透明质酸的分子量与基础实验1的情况相同。作为低分子量透明质酸微针贴片，使用本技术人
市场销售中的美容用途的微针贴片，作为高分子量透明质酸微针贴片，使用本技术人市场销售中的医疗设备用途的微针贴片(商品名称：“therapass”)。根据基础实验1的实验结果，金属材质的实心微针的生物体蛋白质提取性能远远不足，因而本实施例中未用作对照组。
61.从图6的实验结果中可知如下的事实。第一，在5秒钟的附着时间，无法期待相比于微针贴片的空白贴片的有意义的结果的提高。第二，在60秒钟的附着时间，多个微针贴片(低分子量及高分子量)相比于空白贴片呈现显著突出的生物体蛋白质提取性能。第三，在60秒钟的附着时间，高分子量微针贴片的生物体蛋白质提取性能也比低分子量微针贴片的生物体蛋白质提取性能突出。多名本发明人为了基于图6的实验结果针对附着时间大于5秒钟且短于60秒钟的时间段得到追加的结果而追加进行图7的实验。
62.图7为表示在基础实验2的对照组中分别对20多岁患者组和60多岁患者组的皮肤适用10秒钟和30秒钟之后取下，测定前胶原蛋白(pro-collagen)1检测结果的结果的表。
63.对于空白贴片而言，无论是附着10秒钟时或附着30秒钟时无结果的有意义的变化，图7的表中仅标记附着30秒钟时的结果。从图7的结果中可知的事实如下。第一，只用10秒钟的附着时间，也可确认相比于空白贴片大幅提高的多个微针贴片(低分子量及高分子量)的生物体蛋白质提取性能。第二，在10秒钟的附着时间，低分子量微针贴片和高分子量微针贴片的蛋白质提取性能大同小异。第三，在30秒钟的附着时间，高分子量微针贴片的蛋白质提取性能远远超过低分子量微针贴片的蛋白质提取性能。
64.确认到当维持10秒钟以上的附着时间时，微针贴片的活检性能可有意义地发挥，在经过低分子量微针溶解于皮肤的程度的时间之前，即10秒钟左右的附着时间内低分子量微针贴片呈现与高分子量微针贴片大同小异的活检性能，评价为对此具有图7的实验的技术意义。
65.最后，多名本发明人为了了解除了透明质酸之外由其他生物相容性高分子物质形成的微针贴片是否适合用于活检用途，使用壳聚糖材质的微针贴片进行图9的实验(基础实验3)。壳聚糖与透明质酸相同，是生物相容性高分子物质，但并非是生物降解性。被熟知的是壳聚糖为将包含在甲壳类的甲壳素加工成易吸收于人体的物质，其具有将变得衰老的细胞活性化来抑制老化，增强免疫力的效果。在皮肤细胞的活性化方面，也证明其效果，广泛用作化妆品成分物质，也用作皮肤美容目的的微针贴片的成分。
66.图8为表示基础实验3的结果的表，其中使用的对照组为1)低分子量的壳聚糖微针贴片、2)高分子量的壳聚糖微针贴片，在各个对照组中，对皮肤适用5秒钟、60秒钟及300秒钟之后取下，测定前胶原蛋白(pro-collagen)1检测结果。
67.在图8的实验中，低分子量壳聚糖1的分子量为50kda至100kda。高分子量壳聚糖2的分子量为250kda至350kda。对20多岁患者组附着5秒钟、1分钟、5分钟之后，确认到前胶原蛋白(pro-collagen)i的表达。从图8所示的实施例3的实验结果中，多名本发明人确认到作为生物相容性高分子物质中的一种的壳聚糖也与透明质酸相同可发挥用于活检的蛋白质提取功能。除了本说明书中例示的透明质酸和壳聚糖之外的多种其他生物相容性高分子物质也充分有可能成为用于微创皮肤活检的微针贴片材质的候选组。
68.新的特应性皮炎检查方法相关研究结果(临床试验的执行)
69.首先，图9为拍摄用于验证本发明的效果的临床试验中使用的三种贴片的多个图。
70.图9的左侧的空白贴片仅由水胶体材质贴片构成，其上未形成针状结构。中间的空
心贴片为incyto公司商业上市场销售中的微针，是在细长的金属材质针的中央形成具有微小尺寸的截面积的孔的结构。作为右侧的透明质酸(ha)微针贴片，表示产品名称为“therapass”的市场销售中的微针贴片。该产品为本技术人公司上市并销售中的产品，是分子量为1000kda的高分子量透明质酸微针贴片。
71.本临床试验的目标对象数为20名特应性皮炎患者(前臂部)。研究期间为irb批准之后5个月。研究方法为如下。
72.1)第0周
[0073]-组织检查：3mm组织检查
[0074]-胶带剥离：利用d-squame盘(disk)胶带剥离15次
[0075]-蛋白质提取：利用十二烷基硫酸钠(sds)提取胶带或微针贴片的蛋白质
[0076]
2)第2周
[0077]-三种微针贴片检查：将三种微针贴片附着5分钟之后取下
[0078]-蛋白质提取：利用sds提取胶带或微针贴片的蛋白质
[0079]
像这样，在第0周和第2周分别检查对象，比较其检查结果和临床经过，确认到检查方法的临床有用性。在这种确认中，蛋白质定量以通过bca assay的蛋白质定量实施，实施酶联免疫吸附测定(elisa)测定来实施il-4、il-13、ifn-γ(gamma)的定量化。作为统计分析技术，使用spss。
[0080]
图10为表示临床试验推进日程的表。如上所述，irb之后临床试验5个月。招募试验对象之后，在访问第0周将组织活检、d-squame胶带剥离(tape stripping)、空白贴片、ha微针、空心针贴片适用于多个对象中，分别从检测单元中分离蛋白质。在访问第2周将空白贴片、ha微针、空心针贴片适用于多个对象中，分别从检测单元中分离蛋白质。最终，实现对分离的蛋白质量的定量，对il-4、il-13、ifn-γ(gamma)进行酶联免疫吸附测定(elisa)，分析数据。
[0081]
图11为整理临床试验对象相关信息的表。图11的表显示参与本临床试验的试验对象的性别、年龄、2周之后症状的经过(关于10号患者的经过，表上标记的“略有改善(sl improved)”意味着有轻微改善(slightly improved)，即稍微好转的经过)。除了失败(fail)之外，共20名试验对象被登记并进行研究。图11的表中以可与其他多个对象区别的方式表示的4号、5号、7号、16号、20号及26号对象拒绝第二次附着/取下贴片，从试验对象中排除。
[0082]
在第0周利用前臂部组织活检、胶带剥离及三种微针贴片获得皮肤检验物，在第2周利用三种微针贴片获得皮肤检验物。获得的检验物装入60mm碟(dish)中，立即在研究室中利用sds溶液提取蛋白质，在零下80摄氏度中保存。
[0083]
图12为表示附着于胶带、空白贴片、ha微针、空心针这四种皮肤试料获得单元的蛋白质的量的表。获得的皮肤检验物通过bcaassay进行蛋白质定量。在第0周胶带、空白贴片、透明质酸微针、空心针全部适用于多名患者中。2周之后除了胶带之外将空白贴片、透明质酸微针及空心针提供给多名患者。对于正常人，除了空心针之外适用胶带、空白贴片、透明质酸微针。
[0084]
定量的蛋白质量可在图12的图表中确认(正常人不包括在irb中)。图12的图表中作为y轴的net光密度(od)(吸光度)值以“通过皮肤检验物获得的蛋白质的od值
“‑”
各个贴
片的空白(blank)状态下的od值”求得。通过蛋白质定量结果，确认到在空白贴片或空心针贴片中相比于胶带或透明质酸微针贴片，几乎未提取蛋白质。由此确认到利用无创方法的靶因子检测中不适合空白贴片或空心针。
[0085]
在从正常人和特应性皮炎患者中以组织活检、胶带和微针获得的检验物中确认到il-4、il-13和ifn-γ(gamma)的表达量。在组织活检中，采集核糖核酸(rna)通过实时荧光定量pcr(qrt-pcr)试验确认到il-4、il-13和ifn-γ(gamma)的表达量，与特应性皮炎患者的样品不同，正常人中未确认到上述多个靶的表达。然后，在胶带和微针中，采集蛋白质通过酶联免疫吸附测定(elisa)试验确认到il-13和ifn-γ(gamma)的表达量。如图13和图14所示，在利用胶带的检验物中，在正常人和特应性皮炎患者中均未确认到上述多个靶的表达，但在利用微针贴片的检验物中相比于正常人特应性皮炎患者中确认到il-13和ifn-γ(gamma)的高的表达量。
[0086]
获得的检验物内il-4、il-13、ifn-γ(gamma)的表达通过酶联免疫吸附测定(elisa)试验测定。将其结果示于图15至图17中。图15为通过酶联免疫吸附测定(elisa)试验测定利用ha微针从多名临床试验对象中获得的皮肤检验物内il-4的表达的表。图16为通过酶联免疫吸附测定(elisa)试验测定利用ha微针从多名临床试验对象中获得的皮肤检验物内il-13的表达的表。图17为通过酶联免疫吸附测定(elisa)试验测定利用ha微针从多名临床试验对象中获得的皮肤检验物内ifn-γ(gamma)的表达的表。
[0087]
通过图15至图17的测定结果确认到当在第0周和第2周访问特应性皮炎患者时利用透明质酸微针贴片获得的皮肤检验物内靶蛋白质量的变化。
[0088]
更具体地，以下说明图15的测定结果。
[0089]
1号患者第0周il-4的od数值为0.021。第2周il-4的od数值为0.044。
[0090]
2号患者第0周il-4的od数值为0.029。第2周il-4的od数值为0.012。
[0091]
3号患者第0周il-4的od数值为0.026。第2周il-4的od数值为0.017。
[0092]
6号患者第0周il-4的od数值为0.053。第2周il-4的od数值为0.043。
[0093]
8号患者第0周il-4的od数值为0.025。第2周il-4的od数值为0.021。
[0094]
9号患者第0周il-4的od数值为0.072。第2周il-4的od数值为0.141。
[0095]
10号患者第0周il-4的od数值为0.065。第2周il-4的od数值为0.093。
[0096]
11号患者第0周il-4的od数值为0.012。第2周il-4的od数值为0.098。
[0097]
12号患者第0周il-4的od数值为0.053。第2周il-4的od数值为0.095。
[0098]
13号患者第0周il-4的od数值为0.026。第2周il-4的od数值为0.022。
[0099]
14号患者第0周il-4的od数值为0.029。第2周il-4的od数值为0.027。
[0100]
15号患者第0周il-4的od数值为0.034。第2周il-4的od数值为0.025。
[0101]
17号患者第0周il-4的od数值为0.036。第2周il-4的od数值为0.027。
[0102]
18号患者第0周il-4的od数值为0.038。第2周il-4的od数值为0.025。
[0103]
19号患者第0周il-4的od数值为0.023。第2周il-4的od数值为0.021。
[0104]
21号患者第0周il-4的od数值为0.026。第2周il-4的od数值为0.052。
[0105]
22号患者第0周il-4的od数值为0.012。第2周il-4的od数值为0.038。
[0106]
23号患者第0周il-4的od数值为0.031。第2周il-4的od数值为0.017。
[0107]
24号患者第0周il-4的od数值为0.035。第2周il-4的od数值为0.028。
[0108]
25号患者第0周il-4的od数值为0.025。第2周il-4的od数值为0.024。
[0109]
更具体地，以下说明图16的测定结果。
[0110]
1号患者第0周il-13的net od数值为0.0027。第2周il-13的net od数值为0.0017。
[0111]
2号患者第0周il-13的net od数值为0.0072。第2周il-13的net od数值为0.0002。
[0112]
3号患者第0周il-13的net od数值为0.0072。第2周il-13的net od数值为0.0017。
[0113]
6号患者第0周il-13的net od数值为0.0132。第2周il-13的net od数值为0.0077。
[0114]
8号患者第0周il-13的net od数值为0.0062。第2周il-13的net od数值为0.0059。
[0115]
9号患者第0周il-13的net od数值为0.0059。第2周il-13的net od数值为0.0069。
[0116]
10号患者第0周il-13的net od数值为0.0052。第2周il-13的net od数值为0.0059。
[0117]
11号患者第0周il-13的net od数值为0.0052。第2周il-13的net od数值为0.0052。
[0118]
12号患者第0周il-13的net od数值为0.0022。第2周il-13的net od数值为0.0062。
[0119]
13号患者第0周il-13的net od数值为0.0132。第2周il-13的net od数值为0.0067。
[0120]
14号患者第0周il-13的net od数值为0.0072。第2周il-13的net od数值为0.0069。
[0121]
15号患者第0周il-13的net od数值为0.0037。第2周il-13的net od数值为0.0042。
[0122]
17号患者第0周il-13的net od数值为0.0042。第2周il-13的net od数值为0.0037。
[0123]
18号患者第0周il-13的net od数值为0.0027。第2周il-13的net od数值为0.0032。
[0124]
19号患者第0周il-13的net od数值为0.0059。第2周il-13的net od数值为0.0049。
[0125]
21号患者第0周il-13的net od数值为0.0065。第2周il-13的net od数值为0.0082。
[0126]
22号患者第0周il-13的net od数值为0.0102。第2周il-13的net od数值为0.0102。
[0127]
23号患者第0周il-13的net od数值为0.0079。第2周il-13的net od数值为0.0079。
[0128]
24号患者第0周il-13的net od数值为0.0137。第2周il-13的net od数值为0.0092。
[0129]
25号患者第0周il-13的net od数值为0.0502。第2周il-13的net od数值为0.0082。
[0130]
更具体地，以下说明图17的测定结果。
[0131]
1号患者第0周ifn-γ(gamma)的net od数值为0.0220。第2周ifn-γ(gamma)的net od数值为0.0380。
[0132]
2号患者第0周ifn-γ(gamma)的net od数值为-0.0005。第2周ifn-γ(gamma)的net od数值为0.0410。
[0133]
3号患者第0周ifn-γ(gamma)的net od数值为0.0015。第2周ifn-γ(gamma)的net od数值为-0.0045。
[0134]
6号患者第0周ifn-γ(gamma)的net od数值为0.0350。第2周ifn-γ(gamma)的net od数值为0.0140。
[0135]
8号患者第0周ifn-γ(gamma)的net od数值为0.0395。第2周ifn-γ(gamma)的net od数值为0.0340。
[0136]
9号患者第0周ifn-γ(gamma)的net od数值为0.0345。第2周ifn-γ(gamma)的net od数值为0.0640。
[0137]
10号患者第0周ifn-γ(gamma)的net od数值为0.0145。第2周ifn-γ(gamma)的net od数值为0.0320。
[0138]
11号患者第0周ifn-γ(gamma)的net od数值为0.0515。第2周ifn-γ(gamma)的net od数值为0.0465。
[0139]
12号患者第0周ifn-γ(gamma)的net od数值为0.0295。第2周ifn-γ(gamma)的net od数值为0.0340。
[0140]
13号患者第0周ifn-γ(gamma)的net od数值为0.0410。第2周ifn-γ(gamma)的net od数值为0.0340。
[0141]
14号患者第0周ifn-γ(gamma)的net od数值为0.0380。第2周ifn-γ(gamma)的net od数值为0.0615。
[0142]
15号患者第0周ifn-γ(gamma)的net od数值为0.0455。第2周ifn-γ(gamma)的net od数值为0.0560。
[0143]
17号患者第0周ifn-γ(gamma)的net od数值为0.0310。第2周ifn-γ(gamma)的net od数值为0.0390。
[0144]
18号患者第0周ifn-γ(gamma)的net od数值为0.0405。第2周ifn-γ(gamma)的net od数值为0.0275。
[0145]
19号患者第0周ifn-γ(gamma)的net od数值为0.0510。第2周ifn-γ(gamma)的net od数值为0.0415。
[0146]
21号患者第0周ifn-γ(gamma)的net od数值为0.0285。第2周ifn-γ(gamma)的net od数值为0.0000。
[0147]
22号患者第0周ifn-γ(gamma)的net od数值为0.0160。第2周ifn-γ(gamma)的net od数值为0.0255。
[0148]
23号患者第0周ifn-γ(gamma)的net od数值为0.0140。第2周ifn-γ(gamma)的net od数值为0.0260。
[0149]
24号患者第0周ifn-γ(gamma)的net od数值为0.0230。第2周ifn-γ(gamma)的net od数值为0.0320。
[0150]
25号患者第0周ifn-γ(gamma)的net od数值为0.0365。第2周ifn-γ(gamma)的net od数值为0.0285。
[0151]
(多名)本发明人通过统计分析(spss)确认到利用透明质酸微针贴片获得的皮肤
检验物内靶蛋白质的表达和与特应性皮炎临床经过的相关关系。将其结果示于图18至图20中。
[0152]
为了上述相关关系的统计分析，(多名)本发明人根据病变的临床经过赋予具有差别性的分数。对于临床判断为症状明显恶化或有所恶化的12号和15号患者赋予-1分，对于除了15号之外的所有患者赋予1分。察看图11的表的最右侧中表示的2周之后临床经过，则12号患者表示为“不好不坏(so so)+荨麻疹”症状，临床判断为症状有所恶化。15号患者表示为“加重(aggravated)”，临床判断为症状明显恶化。剩余患者临床判断为维持症状或好转。
[0153]
图18至图20的上部中所示的图表的x轴表示临床经过。这几种图表的y轴分别表示il-4、il-13及ifn-γ(gamma)的变化量(“第2周中的靶表达量
“‑”
第0周中的靶表达量”)。根据统计分析结果，确认到特应性皮炎临床经过il-4及il-13的变化量之间的显著的相关关系(p《0.05)。并且，根据统计分析结果，确认到特应性皮炎临床经过和ifn-γ(gamma)的变化量之间无相关关系。由此验证利用无创方法(透明质酸微针贴片的适用)的靶因子检测的临床有用性。通过整理，确认到特应性症状缓解的患者中白细胞介素-4和白细胞介素-13的检测量减少，特应性症状恶化的患者中白细胞介素-4和白细胞介素-13的检测量增加的事实，由此在无组织活检之类的有创手术的情况下，将生物降解性高分子透明质酸微针附着于人体并取下之后，通过测定对病因重要的生物标志物的表达量变化，在不介入包括医生在内的医护人员的临床判断的情况下，也可测定具有可靠性的特应性皮炎的活度。
[0154]
而且，当利用以由生物降解性高分子透明质酸形成的微针贴片和可实现从人体的皮肤中得到的蛋白质的定量分析的设备构成的本发明一实施例的微创特应性皮炎检查试剂盒时，在不依赖于医务人员的医学知识或经验的情况下，通过简单比较预先确定的数值和利用定量分析设备得到的白细胞介素-4及白细胞介素-13的量相关数值，可容易且准确地评价特应性皮炎的活度。上述的特应性皮炎的活度评价可通过本发明一实施例的特应性皮炎检查试剂盒中可包括的功能部自动执行。这种情况下，上述功能部可包括：存储部，存储成为与从定量分析设备中得到的白细胞介素-4及白细胞介素-13的量相关数据的比较对象的这些和特应性皮炎活度的相关关系相关数据；接口部，从定量分析设备中传输数据；比较判断部，比较判断存储于上述存储部的数据和从上述定量分析设备中传输的数据，生成特应性皮炎活度相关信息；显示部，显示上述比较判断部中生成的信息。
[0155]
以上，利用具体的结构要素等之类的多个特定事项和受限的实施例及图说明本发明，但其仅为了有助于更加整体理解本发明而提供，本发明不局限于多个上述实施例，只要是本发明所属技术领域的普通技术人员，就可从这种记载中实现多种修改及变形。
[0156]
因此，本发明的思想不应局限于上述说明的实施例而定，不仅是所附的权利要求书，而且与该权利要求书等同或等价变形的所有内容应当要属于本发明的思想的范畴。