一种基于小分子药物的金属有机框架载药纳米系统

1.本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种基于小分子药物的金属有机框架载药纳米系统及其制备方法和应用。


背景技术：

2.公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
3.近年来，每年诊断出超过1000万例新癌症病例，2018年，约有960万例患者死于该疾病。在接下来的二十年中，这一数字预计将增长约70％。肿瘤免疫治疗是在肿瘤免疫学基础上发展起来的一种新的治疗方法，其特征是通过调节机体的免疫防御机制来发挥抗肿瘤效应。当下，肿瘤免疫疗法已经发展为继手术、放疗、化疗之外的第四大支柱。
4.肿瘤化学免疫联合治疗是一种很有潜力的提高抗肿瘤疗效的方法。化疗药物能通过增强肿瘤细胞免疫原性，从而激活抗肿瘤免疫反应。
5.细胞焦亡(pyroptosis)又称细胞炎性坏死，是一种程序性细胞死亡，表现为细胞不断胀大直至细胞膜破裂，导致细胞内容物的释放进而激活强烈的炎症反应。研究表明化疗能引起细胞焦亡，其中关键蛋白gsdme在化疗药物的作用下，通过caspase
‑
3的切割作用获得活性的gsdme
‑
n端结构域。gsdme
‑
n在细胞膜上寡聚并穿膜成孔，最终导致细胞裂解性死亡，诱导强烈的炎症反应，从而更充分地激活淋巴细胞，引起更强烈的抗肿瘤免疫。然而发明人发现在大部分肿瘤细胞中，由于启动子区的dna甲基化，gsdme的表达往往是沉默的。


技术实现要素：

6.为了解决现有技术中存在的启动子区的dna甲基化，导致gsdme的表达沉默的问题，本发明提出一种基于小分子药物的金属有机框架载药纳米系统及其制备方法和应用。将化疗药物以及dna甲基化抑制剂共同包载于金属有机框架纳米系统，一方面通过dna甲基化抑制剂，使肿瘤细胞中gsdme蛋白的表达上调；另一方面通过化疗药物，引起caspase
‑
3对gsdme蛋白的切割，产生gsdme
‑
n端结构域，从而使肿瘤细胞发生细胞焦亡，诱导强烈的炎症反应，促进抗肿瘤免疫反应的形成，实现化疗
‑
免疫联合抗肿瘤治疗。
7.具体地，本发明是通过如下所述的技术方案实现的：
8.本发明第一方面，提供了一种基于小分子药物的金属有机框架载药纳米系统，包括：靶向功能材料、金属有机框架材料及活性药物，活性药物荷载于金属有机框架材料的孔隙内，金属有机框架材料的表面修饰靶向功能材料。
9.本发明第二方面，提供一种基于小分子药物的金属有机框架载药纳米系统的制备方法，将活性药物加入至金属盐溶液中，再将金属盐溶液与配体溶液混合反应，金属离子与配体形成金属有机框架材料，在形成金属有机框架材料过程中活性药物被荷载进入金属有机框架材料的孔隙中形成给药前体材料，将给药前体材料分散至靶向功能材料溶液中混合
均匀，分离获得的固体即为基于小分子药物的金属有机框架载药纳米系统。
10.本发明第三方面，提供一种增强免疫药物或抗肿瘤药物，包括基于小分子药物的金属有机框架载药纳米系统。
11.本发明第四方面，提供一种基于小分子药物的金属有机框架载药纳米系统在制备增强免疫药物或抗肿瘤药物中的应用。
12.本发明一个或多个实施例具有以下有益效果：
13.(1)本发明提供的基于小分子药物的金属有机框架载药纳米系统，不仅解决了小分子药物稳定性低的问题，还解决了小分子药物在发挥协同作用时的同时递送问题。
14.(2)本发明通过靶向修饰，能够使基于小分子药物的金属有机框架载药纳米系统实现特异性主动靶向至靶部位。
15.(3)本发明提供的基于小分子药物的金属有机框架载药纳米系统显示较强的细胞毒性，且对肿瘤细胞的靶向性高，为增强体内抗肿瘤选择性提供可能。
16.(4)本发明提供的基于小分子药物的金属有机框架载药纳米系统利用化疗和免疫治疗联合治疗，增强了化疗药的免疫效应，表现出良好的抗肿瘤效果。
附图说明
17.构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
18.图1为本发明实施例2的(m+h)@zif/ha透射电子显微镜照片；
19.图2为本发明实施例3的(m+h)@zif/ha体外细胞毒性实验表征图；
20.图3为本发明实施例4的(m+h)@zif/ha体内抗肿瘤效应表征图。
具体实施方式
21.下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
22.需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
23.研究表明化疗能引起细胞焦亡，其中关键蛋白gsdme在化疗药物的作用下，通过caspase
‑
3的切割作用获得活性的gsdme
‑
n端结构域。gsdme
‑
n在细胞膜上寡聚并穿膜成孔，最终导致细胞裂解性死亡，诱导强烈的炎症反应，从而更充分地激活淋巴细胞，引起更强烈的抗肿瘤免疫。然而发明人发现在大部分肿瘤细胞中，由于启动子区的dna甲基化，gsdme的表达往往是沉默的。
24.鉴于化疗剂和dna甲基化抑制剂需要同步递送，以发挥协同作用，本发明提出了基于小分子药物的金属有机框架载药纳米系统及其制备方法和应用。
25.本发明第一方面，提供了一种基于小分子药物的金属有机框架载药纳米系统，包
括：靶向功能材料、金属有机框架材料及活性药物，活性药物荷载于金属有机框架材料的孔隙内，金属有机框架材料的表面修饰靶向功能材料。
26.靶向功能材料、金属有机框架材料及活性药物的质量比为0.5
‑
1.5:15
‑
30：3
‑
5，优选为1:20:4。
27.所述活性药物选自化疗剂和dna甲基化抑制剂；
28.化疗剂和dna甲基化抑制剂的质量比为2
‑
6:1，优选为3
‑
4:1，进一步优选为4:1。
29.在本发明一个或多个实施例中，所述化疗剂为米托蒽醌，dna甲基化抑制剂为肼苯哒嗪；
30.米托蒽醌与肼苯哒嗪的质量比为2
‑
6:1，优选为3
‑
4:1，进一步优选为4:1。
31.在本发明一个或多个实施例中，所述靶向功能材料为透明质酸(ha)；
32.在本发明一个或多个实施例中，所述金属有机框架材料为zif
‑
8。
33.金属
‑
有机框架(metal
‑
organic frameworks)，简称mofs，是由有机配体和金属离子通过配位键自组装形成的具有分子内孔隙的有机
‑
无机杂化材料。由于其可控的孔径大小、功能基团以及良好的生物兼容性，制备纳米级的mofs材料可用于活细胞中药物缓释，在生物医学领域具有重要意义。然而，由于不同药物分子结构的特异性，目前已知的可被mof材料包载的药物种类非常有限。
34.透明质酸是一种天然大分子聚合物，能与肿瘤细胞表面过度表达的cd44受体特异性结合，因此被用于修饰药物载体以实现肿瘤主动靶向药物递送。
35.本发明提供的基于小分子药物的金属有机框架载药纳米系统，利用mofs作为药物载体，将活性药物同时荷载于金属有机框架材料的孔隙内，实现活性药物的共同递送，从而发挥协同作用。
36.另外，将活性药物荷载于mofs孔隙中，还能增加活性药物的稳定性，从而增强活性药物的治疗效果。
37.利用透明质酸上的羧基和羟基，与未配位的金属配位点配位结合，以及通过透明质酸与带正电的mofs材料的静电吸附作用，将透明质酸修饰在表面，从而使得活性药物与靶向功能材料结合在一起，实现活性药物的肿瘤靶向高效递送。
38.该系列实施例中，所述化疗剂为米托蒽醌(mit)，dna甲基化抑制剂为肼苯哒嗪(hyd)。本发明通过实验证明，本发明提供的载mit和hyd金属有机框架纳米给药系统，不仅解决了mit和hyd体内稳定性差的缺点，还可以通过共递送mit和hyd，发挥协同作用，引起肿瘤细胞发生细胞焦亡，增强抗肿瘤免疫反应，实现化疗
‑
免疫联合治疗。
39.本发明第二方面，提供一种基于小分子药物的金属有机框架载药纳米系统的制备方法，将活性药物加入至金属盐溶液中，再将金属盐溶液与配体溶液混合反应，金属离子与配体形成金属有机框架材料，在形成金属有机框架材料过程中活性药物被荷载进入金属有机框架材料的孔隙中形成给药前体材料，将给药前体材料分散至靶向功能材料溶液中混合均匀，分离获得的固体即为基于小分子药物的金属有机框架载药纳米系统。
40.金属盐溶液中金属离子浓度为150
‑
250mg/ml，优选为200mg/ml；
41.活性药物总浓度为30
‑
70mg/ml，优选为40mg/ml；
42.配体溶液浓度为0.5
‑
4g/ml，优选为2g/ml；
43.将活性药物加入至金属盐溶液中，室温反应3
‑
10min，优选为5min；
44.将金属盐溶液与配体溶液混合反应，室温反应10
‑
20min，优选为15min；
45.靶向功能材料溶液浓度为5
‑
20mg/ml，优选为10mg/ml。
46.将给药前体材料分散至靶向功能材料溶液中混合均匀，室温搅拌，30
‑
48h，优选为36h。
47.在药前体材料分散至靶向功能材料溶液中，药前体材料浓度为0.5
‑
3mg/ml，优选为2mg/ml。
48.在本发明一个或多个实施例中，所述活性药物为化疗剂、dna甲基化抑制剂，所述靶向功能材料为透明质酸。
49.在本发明一个或多个实施例中，所述金属盐为锌盐；
50.优选地，所述配体为2
‑
甲基咪唑(2
‑
mim)。
51.在本发明一个或多个实施例中，以化疗剂、dna甲基化抑制剂作为活性药物，其步骤包括：
52.将化疗剂、dna甲基化抑制剂的水溶液加入金属盐的水溶液中获得混合液，将混合液在搅拌条件下滴加至配体水溶液中形成混悬液，离心分离，水洗，干燥得到固体，将所述固体均匀分散于透明质酸水溶液中形成混悬液，离心分离，水洗，干燥。
53.在本发明一个或多个实施例中，所述化疗剂为米托蒽醌，dna甲基化抑制剂为肼苯哒嗪。
54.在本发明一个或多个实施例中，以mit、hyd、zif
‑
8金属有机框架为例，制备方法包括：将mit、hyd溶于水中，搅拌条件下滴加至六水合硝酸锌(znno3·
6h2o)水溶液中，将上述混合液在搅拌条件下滴加至2
‑
mim水溶液中；将上述形成的混悬液离心，水洗，干燥得蓝色固体，即(m+h)@zif
‑
8；
55.将(m+h)@zif
‑
8均匀分散于ha的水溶液中，室温搅拌，将形成的混悬液离心，水洗，干燥得到蓝色固体，即基于mit、hyd的具有肿瘤主动靶向功能的金属有机框架药物递送系统(m+h)@zif/ha。
56.本发明第三方面，提供一种增强免疫药物或抗肿瘤药物，包括基于小分子药物的金属有机框架载药纳米系统。
57.在本发明一个或多个实施例中，所述药物为静脉注射剂。
58.本发明第四方面，提供一种基于小分子药物的金属有机框架载药纳米系统在制备增强免疫药物或抗肿瘤药物中的应用。
59.在本发明的的一种或多种实施例中，所述肿瘤选自恶性黑色素瘤、皮肤癌、乳腺癌、卵巢癌、肺癌、结肠癌。
60.增强免疫药物或抗肿瘤药物的作用为增加化疗药的免疫效应，增强肿瘤细胞毒性或提高抗肿瘤效力。
61.下面结合具体的实施例，对本发明做进一步的详细说明，应该指出，所述具体实施例是对本发明的解释而不是限定。
62.实施例1：基于米托蒽醌(mit)、肼苯哒嗪(hyd)的具有肿瘤主动靶向功能的金属有机框架药物递送系统作为静脉制剂制备。
63.分析天平精密称取mit 30mg，hyd 10mg，溶于2ml水中，搅拌条件下滴入200mg/ml znno3·
6h2o水溶液中，再将上述混悬液搅拌条件下滴入2g/ml的2
‑
mim水溶液中，载药zif纳
米粒自发形成，将混悬液离心，水洗，弃去上清，真空干燥得到蓝色固体(m+h)@zif
‑
8。
64.将浓度为2mg/ml的(m+h)@zif
‑
8均匀分散于10mg/ml的透明质酸的水溶液中室温搅拌36h；将形成的混悬液离心，水洗，干燥得到蓝色固体，将其超声均匀分散于水中即得到静脉注射制剂，记为(m+h)@zif/ha纳米聚集体。(m+h)@zif
‑
8的zeta电势为27.1
±
0.7mv，(m+h)@zif/ha的zeta电势为
‑
23.8
±
0.4mv。
65.实施例2：(m+h)@zif/ha纳米聚集体形态观察。
66.吸取20μl(m+h)@zif/ha纳米聚集体混悬液，滴于碳膜铜网上，滤纸吸去多余液体，室温干燥后置于透射电子显微镜下观察(m+h)@zif/ha纳米聚集体形态。电镜照片如图1，结果显示(m+h)@zif/ha可在水中分散成直径约为100～200nm的较为圆整纳米粒结构，形态均匀，分散性良好，纳米粒尺度适用于静脉注射给药，并满足增强渗透与滞留(epr)效应对粒径的要求。纳米粒制备过程不需要加入有机溶剂、表面活性剂，不需要加热，反应更为简单快捷。
67.实施例3：(m+h)@zif/ha体外细胞毒性实验。
68.1.细胞的培养
69.选取4t1细胞作为研究对象。取冻存细胞，用培养基于37℃、5％co2条件下培养，待细胞生长至高密度时传代，按比例转移至培养瓶中继续培养并进行细胞计数。
70.2.细胞毒性实验
71.收集对数生长期的4t1细胞，比较游离药物与纳米粒的细胞毒性。用胰蛋白酶消化处于对数生长期的细胞并将其制成单细胞悬液后，按照每孔6000个细胞的数量将其接种到96孔板中培养过夜。待细胞贴壁后，加入用培养基稀释的一系列不同浓度的hyd，mit，(m+h)@zif/ha各200μl，每个浓度设3个复孔，每块板都设不加细胞的空白对照组和不加药的阳性对照组，置于培养箱中孵育72h。达到孵育时间后，每个孔中加入20μl mtt溶液，继续培养4h，然后吸取上清，每个孔中加入100μl dmso，在酶标仪的570nm波长处测定每个孔吸光度。细胞抑制率按照以下公式计算：
[0072][0073]
其中，a
阳性
表示未经药物处理的细胞的孔的吸光度，a
样品
表示各种样品处理过的细胞的孔的吸光度，a
空白
表示没有接种细胞且没有药物处理的孔的吸光度。
[0074]
不同样品在不同浓度下对4t1细胞抑制率实验结果如图2。由图2可以看出，原料药mit和(m+h)@zif
‑
8/ha对细胞的毒性展现出浓度依赖性。且与原料药mit相比，(m+h)@zif/ha的细胞抑制率更强。这是由于(m+h)@zif/ha中的ha能与4t1表面过表达的cd44受体特异性结合，因此(m+h)@zif/ha的细胞内化能力高于原料药mit，所以(m+h)@zif/ha的细胞抑制作用优于原料药mit。通过细胞抑制率实验，可以得出结论：该(m+h)@zif/ha具有较强的细胞毒性，达到提高肿瘤治疗效果的目的。
[0075]
实施例4：(m+h)@zif/ha体内抗肿瘤实验。
[0076]
balb/c小鼠腋下荷瘤(每只100万个4t1细胞)，等瘤长至100mm3左右，随机分成4组，每组5只，分别静脉注射生理盐水(ns)、hyd、mit与(m+h)@zif/ha。在治疗过程中记录瘤体积的变化。
[0077]
从图3可以看出，由于肿瘤靶向的化疗与免疫治疗的协同作用，(m+h)@zif/ha组老
鼠瘤体积生长较mit组缓慢。由于制剂的epr效应，且由于透明质酸的主动靶向作用，肿瘤部位药物蓄积多，所以(m+h)@zif/ha制剂抑瘤效果明显优于mit。表明该肿瘤靶向的化疗
‑
免疫治疗极大地提高了抗乳腺癌效果。
[0078]
本公开通过简便快速的方法将mit和hyd共同荷载于金属有机框架zif
‑
8的孔隙内制成纳米粒并实现肿瘤细胞主动靶向ha修饰。解决了mit和hyd稳定性差以及mit和hyd共递送的问题。制备方案不仅经济环保，还可批量生产，固体易于保存与运输，为工业生产提供可能。(m+h)@zif
‑
8/ha的静脉注射制剂毒性低，安全性好，且具有较强的肿瘤细胞毒性，实体瘤肿瘤抑制效果明显。
[0079]
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。