胆汁酸复合菌剂在用于制备防治宠物泪痕的制剂中的应用的制作方法

本发明属于宠物养殖领域，具体涉及胆汁酸复合菌剂在用于制备防治宠物泪痕的制剂中的应用。

背景技术：

宠物泪痕又名泪溢，是一种宠物眼部过度流泪的现象。泪痕一般位于宠物眼睛下方，是一条红褐色的痕迹，在浅色毛发的宠物身上尤为明显。泪痕的产生因素包括倒睫、泪腺粗大、眼部疾病、眼部感染、营养不良、鼻泪管堵塞等外因造成，也可能是肝脏功能不全、免疫力弱、胆汁酸分泌不足、卟啉代谢异常等内部原因造成的。泪痕不仅会影响宠物的颜值，还会影响宠物的健康，因此宠物出现的泪痕问题应当被重视。

目前，针对于宠物泪痕问题多是采用补充营养、外部擦拭、修剪毛发、使用银胶或泪痕粉等外部药物处理外，并没有一种十分有效并彻底解决宠物泪痕的方法，且泪痕问题容易复发。

技术实现要素：

为了解决现有技术的缺点和不足，本发明提供了胆汁酸复合菌剂在用于制备防治宠物泪痕的制剂中的应用。所述的胆汁酸复合菌剂经过科学的配比，能够有效的预防和治疗宠物犬或猫出现泪痕问题。

为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：

本发明提供了胆汁酸复合菌剂在用于制备防治宠物泪痕的制剂中的应用。

进一步的，所述胆汁酸复合菌剂是由狄氏副拟杆菌菌悬液和胆汁酸制备而成的。

进一步的，所述狄氏副拟杆菌菌悬液与胆汁酸的体积质量比为8-10:1。

进一步的，所述胆汁酸复合菌剂的菌含量不少于5×10⁸cfu/ml。

进一步的，所述狄氏副拟杆菌菌悬液是由保藏编号为cgmccno.20820的狄氏副拟杆菌lcg-06培养发酵获得的。

进一步的，所述狄氏副拟杆菌lcg-06为厌氧菌。

进一步的，所述胆汁酸复合菌剂的制备步骤具体如下：

（1）将所述狄氏副拟杆菌lcg-06于营养液体培养基中，37℃厌氧环境下活化40-48h；在活化菌液中加入质量浓度为20%蔗糖溶液，混合均匀后离心，沉淀物中添加质量浓度为10%的蔗糖溶液，重悬均匀后得到狄氏副拟杆菌lcg-06菌悬液；

（2）将所述狄氏副拟杆菌lcg-06菌悬液与胆汁酸混合均匀，得到胆汁酸复合菌剂。

进一步的，所述胆汁酸包括不少于78%的猪胆酸和猪去氧胆酸以及不少于18%的鹅去氧胆酸。

进一步的，所述狄氏副拟杆菌lcg-06菌悬液的菌含量不少于2×10⁹cfu/ml。

进一步的，所述宠物泪痕是由营养不良、免疫力弱、肝脏功能受损、胆汁酸分泌不足或卟啉代谢异常引起的宠物泪痕。

进一步的，在防治由营养不良、免疫力弱引起的宠物泪痕时，所述胆汁酸复合菌剂的使用方法为：将胆汁酸复合菌剂以4-6g/d的用量直接给予宠物口服，连续服用5-10天。

进一步的，在防治由肝脏功能受损、胆汁酸分泌不足或卟啉代谢异常引起的宠物泪痕时，所述胆汁酸复合菌剂的使用方法为：将胆汁酸复合菌剂以4-6g/d的用量混于宠物粮食中给宠物食用，每日1-2次，连续使用5-7天后，再继续以1-3g/d的用量混于宠物粮食中给宠物食用，每日1次，连续使用7-21天。

最优的，在防治由肝脏功能受损、胆汁酸分泌不足或卟啉代谢异常引起的宠物泪痕时，所述胆汁酸复合菌剂的使用方法为：10kg及以下宠物：将胆汁酸复合菌剂以4g/d的用量混于宠物粮食中给宠物食用，每日1次，连续使用7天后，再继续以2g/d的用量混于宠物粮食中给宠物食用，每日1次，连续使用21天；10kg以上宠物：前7天宠物每增加10kg，所述胆汁酸复合菌剂的每日用量增长2g，7天后，每日用量增长1g。

进一步的，所述宠物包括宠物犬和宠物猫。

进一步的，所述宠物犬包括泰迪、比熊、贵宾、博美、金毛、边牧。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：

本发明筛选出一株不会对动物人体造成伤害的狄氏副拟杆菌lcg-06，并且利用蔗糖溶液将狄氏副拟杆菌lcg-06制备成菌悬液，再与胆汁酸以优化的比例复配制备得到复合菌剂，该胆汁酸复合菌剂成分天然，无毒副作用，能够显著减轻、改善和预防宠物由多种原因导致的泪痕，减轻动物溢泪现象，并且能够为宠物补充胆汁酸，同时加快胆汁酸的分解，促进泪水中卟啉的代谢，使泪水不再泛红；另外，该胆汁酸复合菌剂对宠物的肝脏起到保护作用，减少肝损伤或肝部疾病的发生，提高宠物对营养物质的转化和吸收，提高宠物的胃肠道功能和免疫力，因此具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为狄氏副拟杆菌lcg-06在tsa培养基上的菌落图片。

图2为胆汁酸复合菌剂对泰迪犬顽固性泪痕的影响；a为使用胆汁酸复合菌剂前的泰迪犬，b为使用胆汁酸复合菌剂后的泰迪犬。

图3为胆汁酸复合菌剂对比熊犬泪痕的影响；a为使用胆汁酸复合菌剂前的比熊犬，b为使用胆汁酸复合菌剂后的比熊犬。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：

一、狄氏副拟杆菌lcg-06的筛选和鉴定

1、狄氏副拟杆菌lcg-06的筛选

从猪肠道内取肠内粪便，将10g粪便和100ml无菌水混匀，过滤去除杂质后制成粪便稀释液，然后继续向稀释液中添加无菌水，制备成10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5稀释液；再分别取10^-2、10^-3、10^-4、10^-5稀释液涂布至大豆酪蛋白琼脂培养基（tsa）上，在含有80%n2、10%co2和10%h2的厌氧环境下，37℃培养4d，选取明显的菌落进行多次纯化后得到单菌落，并将其命名为lcg-06，然后置于大豆酪蛋白琼脂斜面培养基中冷藏保存。所述的tsa培养基的配方为：

胰蛋白胨15.0g，大豆胨5.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，无菌水1000ml，ph7.3±0.2。

如图1所示，所述菌株lcg-06在tsa培养基的菌落生物学特征为：圆形或类圆形，乳白色或米白色，扁平，直径0.2-1.8mm，表面光滑无光泽，半透明，边缘较整齐。

2、狄氏副拟杆菌lcg-06的鉴定

提取所述菌株lcg-06的基因组dna，并以此为模板，使用16srrna通用引物进行pcr扩增，获得16srrna扩增序列后测序，然后将该序列进行blast比对，结果显示菌株lcg-06与genbank基因库中的狄氏副拟杆菌parabacteroidesdistasonis同源性最高，因此判定菌株lcg-06为狄氏副拟杆菌。

将筛选到的狄氏副拟杆菌lcg-06进行菌种保藏，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（cgmcc）；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2020年09月25日；狄氏副拟杆菌parabacteroidesdistasonis的保藏编号为cgmccno.20820。

3、狄氏副拟杆菌lcg-06菌悬液的制备

（1）将保存的狄氏副拟杆菌lcg-06挑取至营养液体培养基（配方为胰蛋白胨15.0g，大豆胨5.0g，氯化钠5.0g，无菌水1000ml，ph7.4）中，37℃厌氧环境下活化培养48h，得到狄氏副拟杆菌lcg-06菌液；

（2）在菌液中以1:1的体积比加入质量浓度为20%的蔗糖溶液，混合均匀后10000rpm/min离心5min，得到菌株沉淀物；

（3）用质量浓度为10%的蔗糖溶液重新溶解上述菌株沉淀物，而蔗糖溶液的体积与菌株沉淀物的质量的比例为2:1，混匀后得到狄氏副拟杆菌lcg-06菌悬液，该菌悬液的菌含量不少于2×10⁹cfu/ml。

二、胆汁酸的制备

所述胆汁酸的制备工艺步骤如下：

（1）皂化：将粉碎过40目筛的1kg猪胆粉加入反应釜中，再加入质量浓度为10%的氢氧化钠溶液10l，加热搅拌至沸腾，并保持沸腾状态搅拌14h，然后将反应生成的皂化液冷却至固液分层，去除上清液，剩余固体即为胆汁酸皂化品；

（2）脱色：向胆汁酸皂化品中加6l水，加热至80℃使胆汁酸皂化品完全溶解，然后将其打入脱色罐中，加入300ml双氧水搅拌均匀后，常温反应24h，然后将反应溶液过滤至酸化槽中，得到滤液；

（3）酸化：将滤液冷却至室温，缓慢加入10%盐酸溶液，边加入边搅拌，待溶液ph值在3时停止加酸，离心过滤得到白色固形物；

（4）纯化：将白色固形物不断加水冲洗，将附着在白色固形物表面的水溶性杂质去除，待滤出的水检测呈中性后结束水洗；将离心过滤后的白色固形物放入烘箱中，100℃干燥至水分少于10%，得胆汁酸粗品；

（5）重结晶：将胆汁酸粗品投入萃取罐中，加入胆汁酸粗品重量10倍体积的乙酸乙酯搅拌至完全溶解，再加入0.08g无水硫酸钠脱水，过滤收集过滤液，将过滤液进行减压浓缩并回收乙酸乙酯，得到液体胆汁酸；

（6）干燥：将液体胆汁酸放入烘箱，在100℃下干燥至水分不超过1%时，得到成品胆汁酸。

成品胆汁酸中包含了78.6%的猪胆酸和猪去氧胆酸以及20.0%的鹅去氧胆酸。

三、胆汁酸复合菌剂的制备

将上述制得的成品胆汁酸以1:10（g/ml）的比例与狄氏副拟杆菌lcg-06菌悬液混合均匀，即可得到胆汁酸复合菌剂，该复合菌剂中的菌含量不少于5×10⁸cfu/ml。

实施例2

四川乐山一宠物医院收治一只5岁龄的雄性泰迪犬，该患犬出现顽固性铁锈红泪痕（图2a），时间长达2年，一直未愈。兽医体检结果显示，泰迪犬无头面部问题（鼻泪管堵塞、睫毛内翻、牙结石、耳道炎症等），且日常饮食也没有问题，因此兽医初步判断该患犬为免疫低下导致的顽固性泪痕。

确诊后，给予泰迪犬实施例1制备的胆汁酸复合菌剂口服治疗7天，每日口服一次，每次4g，定期观察并及时复诊。7天后，该患犬到宠物医院复诊，泪痕基本消失（图2b），说明本发明的胆汁酸复合菌剂能够有效的治疗和解决宠物犬的顽固性泪痕，为宠物补充胆汁酸的同时，还可以加快胆汁酸的分解，促进泪水中卟啉的代谢，提高宠物对营养物质的转化和吸收，提高宠物犬的胃肠道功能和免疫力。

实施例3

山东青岛某宠物医院收治一只5岁半的雄性比熊犬，体重7.5kg，该患犬泪痕严重，为铁锈红色泪痕，同时伴有干咳、发烧，生化检测中alt、tp指标明显升高（图3a）。

经兽医诊断后，先给予患犬输液治疗3天，使其退烧，与此同时，将4g实施例1制备的胆汁酸复合菌剂混于狗粮中让患犬一同食用，每日1次，3天后患犬退烧，仍继续服用胆汁酸复合菌剂，每日1-2次，4g/d，连续服用10天，10天后复诊，发现患犬的泪痕明显减轻，且alt、tp指标基本恢复正常（图3b）。复诊后，继续让患犬服用胆汁酸复合菌剂，每日1次，每次2g，连续服用20天后，再次复诊，患犬溢泪现象完全消失，生化检测各项指标恢复正常。由此说明本发明的胆汁酸复合菌剂能够有效改善并治疗宠物犬的泪痕问题，减轻动物溢泪现象，促进泪水中卟啉代谢，泪水不再泛红；并对患犬的肝脏起到保护作用，减少alt升高而引起的肝损伤或肝部疾病的发生可能性。

本发明的胆汁酸复合菌剂在使用时，还需要根据宠物的体重进行调整，10kg以上的宠物每增加10kg就需要增加胆汁酸复合菌剂的每日用量2g，巩固效果时期，则每日用量增长1g即可。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。