一种含有万古霉素、IR780与携氧全氟己烷的脂质体的制备方法

本发明涉及生物医药技术领域，具体为含有万古霉素、ir780与全氟己烷的脂质体的制备方法。

背景技术：

近年来，纳米技术越来越多地被运用于疾病的诊断和治疗，在肿瘤或细菌感染等领域发挥重要作用。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantstaphylococcusaureus，mrsa)是临床上常见的一类“超级细菌”，其表现出不均一耐药性和广谱耐药性，目前临床尚无特效药用于治疗mrsa引起的感染。

万古霉素(vancomycin，van)作为临床上正在使用的一种窄谱抗生素，仅对革兰氏阳性菌有效。mrsa对于van尤为敏感，因此临床上主要将van用于mrsa引起的严重感染，如肺炎，心内膜炎及败血症等。然而，长期或大量使用van将引起听力或肾功能的不可逆损害。有文献报道指出，van分子中七肽骨架可与细菌表面的d-丙氨酰基-d-丙氨酸二肽形成氢键，两者之间具有极强的亲和力(解离常数kd约为1-4μm，ph＝7.2)，从而能够使万古霉素特异性靶向细菌。鉴于此，本发明旨在大幅度减少van的剂量使用的同时将van作为靶向mrsa的配体，实现对mrsa感染部位的精准靶向。

脂质体是一种由磷脂双分子层组成的纳米载体，能够用于药物或成像造影剂的体内递送。有研究报道，mrsa释放的毒素(以a-toxin为主)能特异性的插入到脂质体中，破坏脂质结构。该过程中，毒素不仅被脂质体吸附，同时脂质结构的破坏能促进内部药物的释放。

在体注射光敏剂(如icg，ir780等)，同时联合体外近红外光照实现光热(photothermaltherapy，ptt)或/与光动力治疗(photodynamictherapy，pdt)能够起到局部杀菌作用。然而，ir780等光敏剂在使用过程中遇到以下问题：(1)受其自身疏水性的限制，无法直接应用于体内。(2)在体内易被肝、肾代谢，生物半衰期短。(3)光照时，局部组织无法提供足够的氧气，因此光疗的效率低下。

专利申请号cn202010907422.2中公开了一种采用光控释放硫化钨量子点和万古霉素的脂质体复合材料的制备方法，其中通过羟基的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羟基(dspe-peg-oh)和胆固醇配合二棕榈酰磷脂酰胆碱(dppc)获得脂质薄膜，但是该方案下加入了胆固醇，降低磷脂的毒素中和作用，并且采用的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-羟基(dspe-peg-oh)为羟基，其性质较为稳定，反应效果差。

技术实现要素：

针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种含有万古霉素、ir780与携氧全氟己烷的脂质体的制备方法，van反应效率更高，光动力治疗效率高，毒素中和效果更佳，并且针对厌氧细菌治疗效果更佳。

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种含有万古霉素、ir780与携氧全氟己烷的脂质体的制备方法，该制备方法包括如下步骤：

步骤1：将万古霉素(van)和peg分子(dspe-peg2000-nhs)反应，获得dspe-peg2000-van；

步骤2：鞘磷脂、dspe-peg2000-van、ir780采用薄膜水化法获得脂质体悬液；

步骤3：加入全氟己烷(pfh)并超声乳化pfh；

步骤4：注入氧气获取成品。

方案中采用的peg分子为dspe-peg2000-nhs，其反应的为羧基，相对于现有技术中的羟基来说，具有更强的活跃性，能够提高反应效果和反应效率，并且成分中没有胆固醇，相比现有技术能够提高毒素中和效果。其中pfh具有天然携氧能力，能够提高光敏剂ir780的光动力治疗效率，在激光的光动力治疗时能够为光动力治疗提供所需的氧气，并且能够在释放氧气的同时对抑制厌氧细菌的活性，能够同时处理治疗和抑制，在双重作用下具有更好的治愈效果，并且在该原理下，对于越严重的病症治疗效率越高。

作为优选，步骤2中的薄膜水化法包括如下步骤：

步骤2-1：将磷脂、dspe-peg2000-van、ir780通过有机溶剂介质溶解；

步骤2-2：蒸发有机溶剂介质；

步骤2-3：加入10％蔗糖溶液水化脂质膜，形成脂质体悬液。

利用有机溶剂介质能够让三者相互混合，在蒸发有机溶剂之后，获得脂质薄膜，利用无菌10％蔗糖溶液再将脂质膜水化。

作为优选，所述磷脂选择鞘磷脂。

作为优选，有机溶剂介质至少包括三氯甲烷、甲醇中的一种或者多种。

作为优选，步骤2中磷脂∶dspe-peg2000-van∶全氟己烷∶ir780的摩尔比为7848.9∶1∶1461∶1.744。

在该摩尔比下，ir780的包封率和粒径综合最佳，包裹pfh的脂质体粒径和物料比最优。

作为优选，步骤1中万古霉素(van)和peg分子(dspe-peg2000-nhs)的反应步骤如下：

步骤1-1：称取dspe-peg2000-nhs溶于二甲基甲酰胺(dmf)中，称取van溶于超纯水中，并相互混合；

步骤1-2：10μl三乙胺作为催化剂反应获得dspe-peg2000-van。

作为优选，dspe-peg2000∶万古霉素的摩尔比为1∶4。该方案中dspe-peg2000-van接枝率最高。

作为优选，步骤3中的超声乳化pfh其步骤如下：利用150w探头超声，开启2秒关闭3秒的间隔持续作用5分钟分散pfh，使脂质体包裹pfh。

其中，150w探头超声5分钟的持续时间能够让反应更加充分，间隔的启闭能够避免超声过程中产生过高温度使pfh挥发。

作为优选，三乙胺作为催化剂的反应时长为18小时。18个小时的反应时间能够让反应更加完全。

作为优选，步骤2-2中有机溶剂介质通过旋转蒸发。旋转蒸发能够提高蒸发效率，让制备速度更快，提高整体的制备效率。

作为优选，步骤2-3中加入10％蔗糖溶液后在50℃下水化脂质膜。在该温度下能够提高水化效率。

本发明的有益效果，

1.制备过程中万古霉素(van)和peg分子反应效率和反应效果更好；

2.毒素的中和作用更好；

3.光动力治疗具有足够的氧气，能够提高治疗效果；

4.在治疗时能够释放氧气，抑制厌氧细菌的活性；

5.同时具备高效的光动力治疗和抑制厌氧细菌的活性效果，能够让治疗具备双重效益。

6.相比普通炎症来说，针对越严重的炎症治疗效果越好。

附图说明

图1为本发明dspe-peg2000-van接枝率示意图；

图2为本发明不同ir780和lips比例下ir780的包封率示意图；

图3为本发明不同比例van与dspe-peg2000-nhs反应产物3kda超滤管过滤后1∶2原液和1∶2滤液的vanhplc示意图；

图4为本发明不同比例van与dspe-peg2000-nhs反应产物3kda超滤管过滤后1∶3原液和1∶3的滤液的vanhplc示意图；

图5为本发明不同比例van与dspe-peg2000-nhs反应产物3kda超滤管过滤前1∶4原液和1∶4的滤液的vanhplc示意图；

图6为本发明不同比例van与dspe-peg2000-nhs反应产物3kda超滤管过滤前1∶5原液和1∶5的滤液的vanhplc示意图；

图7为本发明胆固醇含量为0％与50％的磷脂脂质体粒径对比示意图；

图8为本发明胆固醇含量为0％与50％的磷脂脂质体吸附mrsa毒素后对人红细胞溶血的保护效果示意图；

图9为本发明不同ir780和lips比例下脂质体表观和粒径分布示意图；

图10为本发明不同含量pfh(0.5，1，2.5，5，10μl/mg)脂质体的粒径大小示意图；

图11为本发明toxin作用下ir780-pfh-lips的氧气释放曲线示意图；

图12为本发明近红外光照激发ir780-pfh-lips产生单态氧示意图；

图13为本发明对比磷脂制备脂质体对正常细胞的解毒效果示意图；

图14为本发明体外van@ir780-pfh-lips在近红外光照下对mrsa生长的抑制作用示意图；

图15为本发明van@ir780-pfh-lips近红外活体成像示意图；

图16为本发明van@ir780-pfh-lips近红外活体成像离体组织荧光统计结果示意图。

具体实施方式

下面将结合附图所给出的实施例对本发明做进一步的详述。

参照图1-16所示，

实施例一

一种含有万古霉素、ir780与全氟己烷的脂质体的制备方法。该方法提前将万古霉素与一种异功能团的peg分子(dspe-peg2000-nhs)反应得到dspe-peg2000-van。在制备脂质体时，使用薄膜水化法，将鞘磷脂，dspe-peg2000-van，ir780充分溶解于三氯甲烷中，通过旋转蒸发充分除去有机溶剂，随后加入无菌10％蔗糖溶液水化脂质膜。随后，将一定量的pfh加入到脂质体悬液中，利用探头超声乳化pfh。最后，在使用前利用注射器将氧气充入脂质体悬液中。通过处方筛选，各组分的最佳比例为：7848.9∶1∶4∶1461∶1.744(鞘磷脂：dspe-peg2000：万古霉素：全氟己烷：ir780，mol/mol)。

实施例二

dspe-peg2000-van的合成

准确称取dspe-peg2000-nhs溶于dmf中，称取van溶于超纯水中，按照1：2，1：3，1：4，1：5(dspe-peg2000-nhs：van，mol/mol)的投料比混合，加入10μl三乙胺作为催化剂，反应18h。

实施例三

hplc法测定dspe-peg2000-van接枝率

色谱条件：固定相：c18柱

流动相：0.025mol/l磷酸二氢钾缓冲液：乙腈(70％-92％)

流速：1ml/min

柱温：25℃

进样量：30μl

检测波长：230nm

利用超滤管(3000da)离心不同比例反应液，将过滤后的溶液与反应原液上样hplc，比较万古霉素峰高。

经hplc鉴定，不同比例van与dspe-peg2000-nhs接枝率存在明显差异(图1，图3，图4，图5，图6)，1∶2接枝率为，61.129％，1∶3接枝率为83.237％，1∶4接枝率为88.110％，1∶5接枝率为77.873％。其中1∶4的接枝率最高，故选择1∶4(mo1/mol)作为后续实验反应投料比。

实施例四

利用薄膜水化法制备van@ir780-pfh-smlips，将95mg鞘磷脂，5mgdspe-peg2000-van，ir780甲醇溶液充分溶解于三氯甲烷中，通过旋转蒸发充分除去有机溶剂，随后加入无菌10％蔗糖溶液，在50℃条件下水化洗下脂质膜。随后，将一定量的pfh加入到脂质体悬液中，利用探头超声(150w，5min，2s开，3s关)分散pfh，使脂质体完全包裹pfh。将制备得到的van@ir780-pfh-smlips置于4℃保存。使用前利用注射器将氧气缓慢充入脂质体悬液中。

实施例五

胆固醇的含量

分别以胆固醇含量为0％与50％制备上述脂质体。将上述两种脂质体先与mrsa分泌的毒素孵育，再将混合液加入到人红细胞中共同孵育，生理盐水作为阴性对照，纯水作为阳性对照。30min后13800rpm离心5min，收集上清液测540nm处吸光度值，计算毒素中和能力。

图7，图8结果显示含0％胆固醇的鞘磷脂脂质体粒径在80.62±0.68nm，含50％胆固醇的鞘磷脂脂质体粒径在128.64±2.16nm。进一步的溶血实验显示，含0％胆固醇的鞘磷脂脂质体的毒素中和能力要显著高于50％胆固醇的鞘磷脂脂质体。因此选用0％胆固醇的鞘磷脂脂质体作为后续制剂处方。

实施例六

ir780的含量

分别以1∶10，1∶20，1∶50，1∶100，1∶200(ir780∶lips，mol/mol)的比例制备上述脂质体，拍摄脂质体表观照片，并测定脂质体粒径与ir780包封率。ir780包封率测定方法如下：以不同浓度的ir780甲醇溶液(0.6，0.8，1，1.4，1.8μg/ml)作ir780标准曲线。取1mlir780脂质体悬液，加入200μl甲醇溶液，见脂质体溶液变为澄清，取适量体积稀释，利用紫外-可见光光谱扫描仪测定ir780在780nm处紫外吸收值，根据稀释倍数计算ir780的原始浓度，计算ir780的包封率。

图9结果显示，在1∶10(ir780∶lips)比例下可见脂质体溶液底部有明显的沉淀，为未包裹的ir780，其余组别未见明显的沉淀。随着ir780∶lips比例的增大，脂质体的平均粒径逐渐增大，且粒径分布不均匀，当两者比例在1∶50与1∶100时显示出均匀的粒径分布和包封率。

如图2所示，1∶10(ir780∶lips)的包封率为57.34％，1∶20(ir780∶lips)的包封率为48.57％，1∶50(ir780∶lips)的包封率为21.48％，1∶100(ir780∶lips)的包封率为25.91％。综上所述，考虑到脂质体粒径，包封率等各项指标，最终选择1∶100作为ir780与脂质体的比例。

实施例七

分别以0.5，1，2.5，5，10μl/mg脂质体的量加入pfh，超声后测定脂质体的粒径，筛选符合静脉注射脂质体要求的最大pfh装载量。

如图10显示，当pfh的量在5μl/mg以下时，随着pfh的增加，粒径变化不明显(约270nm)。但当pfh含量增大至10μl/mg时，粒径增大至328.53±15.76nm。考虑到后续实验采用尾静脉注射给药，粒径不宜过大，最终选择pfh的投料比为5μl/mg脂质体。

实施例八

mrsa分泌的毒素(toxin)作用下ir780-pfh-lips的氧气释放曲线

取20ml纯水于50ml离心管中，提前插入氧含量探头至管底部。待探头读数稳定，缓慢加入pfh-lips，在180s时加入toxin或tsb(对照培养基)，记录0-900s内氧气含量的变化。

如图11所示，加入toxin后的30s内，氧气含量存在突释效应，证明toxin可破坏脂质体，导致pfh携载的氧气释放至溶液中。

实施例九

近红外光照激发ir780-pfh-lips产生单态氧

将100μl不同样品置于黑色酶标板中，每孔加入等量的dcfh-da(终浓度为10μm)，每孔利用808nm(2w/cm²)近红外激发器光照1min，置于37℃孵育15min，然后利用酶标仪检测荧光，荧光参数为ex＝488nm，em＝525nm。

如图12所示，光照后单态氧较未光照组显著升高，并且ir780-pfh-lips+laser组较ir780-lips+laser组显著升高(p＜0.001)。

实施例十

基于不同成分磷脂制备的脂质体对正常细胞解毒效果的对比

通过前述脂质体制备方法，将不同成分磷脂(大豆软磷脂、蛋黄软磷脂、鞘磷脂)制备成同等磷脂浓度的脂质体。将上述三种脂质体分别加入到人脐静脉内皮细胞(huvecs)和小鼠腹腔巨噬细胞(macrophages)中，立即加入8.0％毒素(toxin)孵育1小时。1小时后，加入pbs清洗除去凋亡细胞，利用mtt方法检测细胞存活率，新鲜培养基组作为阴性对照组，计算不同磷脂脂质体的毒素中和能力。

如图13所示，sm-lips组细胞存活率最高，sm-lips对比soy-lips与pc-lips具有显著性差异(p＜0.001)。

实施例十一

体外van@ir780-pfh-lips对mrsa生长的抑制作用

将等体积的van@ir780-pfh-lips(ir780浓度为25μg/ml)与mrsa(od600＝0.15)孵育，近红外光照(808nm，1w/cm²)5分钟后，将混合液稀释10⁵倍涂板，于37℃孵育24h后观察菌落生长情况。

如图14所示，van@ir780-pfh-lips对mrsa生长具有最强的抑制作用。

实施例十二

van@ir780-pfh-lips体内近红外活体成像

于icr小鼠右侧大腿皮下接种mrsa(od600＝0.15)，24h后尾静脉注射van@ir780-pfh-lips(50μg/ml，0.2ml)，于活体成像下在预先设定的时间点(0，1，8，24，48h)拍摄小鼠活体荧光图片，48h后处死小鼠，取主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)和接种部位皮肤，于活体成像下拍摄图片。ir780-pfh-lips作为对照。

如图15-16所示，24h后，van@ir780-pfh-lips在mrsa接种部位的荧光强度显著高于对照组，离体组织荧光显示相同结果。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。