本发明涉及中药制剂
技术领域：
，具体涉及一种中药提取物及其制备方法与应用。
背景技术：
：人们皮肤病的主要类型之一是：来自外源或内源的物质，刺激肥大细胞，进而产生组织胺作用于神经末梢，从而产生红斑、丘疹、瘙痒、疼痛、过敏等症状。对此，一方面要抑制组织胺的释放，一方法面要增加皮肤对组织胺的耐受，从而达到抗过敏、抗刺激、止痒的目的，而更深层次的抗敏、抗炎则是对can-nf-at通路的调节。钙调磷酸酶(caleineurin，can)又称蛋白磷酸酶2b(pp2b)，属丝/苏氨酸蛋白磷酸酶家族成员，是迄今发现的唯一受ca2+/钙调素(cam)调节的丝/苏氨酸蛋白磷酸酶。can通过使底物脱磷酸发挥作用。在t细胞中，ca2+内流、细胞内浓度ca2+增加，ca2+同cam与can结合，激活can，活化的can使其底物nf-at脱磷酸，入核，引起il-2等一些列细胞因子的表达。can-nf-at通路在t细胞活化中起着调节枢纽的作用。钙调神经磷酸酶抑制剂目前是临床上最有效的免疫抑制剂药物。用于器官移植，控制移植物排斥反应、自身免疫性疾病的治疗(ra，cd，银屑病)、特别是其近年来用于皮肤过敏、皮肤炎症的治疗(如湿疹)，并取得良好治疗效果。钙调磷酸酶抑制剂(cnis)作为一种免疫抑制剂，分为外源性抑制剂和内源性蛋白质抑制剂。外源性抑制剂主要有环孢素、他克莫司等，内源性蛋白质抑制剂主要有cain、fkbp38等。目前，临床应用最多的是子囊霉素衍生物环孢素a、他克莫司和匹美克莫司，都具有相似的理化性质、作用机制和作用效果，但其毒副作用(如肾毒性，高血糖等)成为该类抑制剂应用的重要障碍。因此，以can-nf-at通路为作用靶标寻找更加安全有效的抑制剂对研发新型皮肤炎症药物具有重要意义。中药为我国的传统用药，在临床上，中药在湿疹等皮肤炎症和自身免疫性疾病的治疗中具有较好的效果。现代研究发现某些中药单体成分能直接与can结合并抑制其活性，如槲皮素、山奈酚、酚醛棉酚等；同时，某些中药有效成分能在细胞水平有效抑制can-nf-at通路的活化，抑制th1和th2型细胞因子的表达，抑制t细胞的活化，如虫草素、杜鹃素、非瑟酮等。中药具有来源广、成本低和毒性低的特点，通过中药的合理的复方配伍，可以达到不亚于西药疗效的治疗皮肤炎症的效果，适合用于舒缓及抗过敏类外用制剂中。技术实现要素：为了解决上述
背景技术：
中存在的问题，本发明提供一种中药提取物，其能够有效阻断can-nf-at通路，为治疗湿疹等皮肤炎症和自身免疫性疾病提供了科学依据，同时为舒缓类化妆品提供了良好的素材，而且该中药提取中原料来源广泛，药效高，毒性低，生物兼容性高；为此，本发明还提供了上述中药提取物的制备方法与应用。为了实现上的目的，本发明采用以下技术方案：本发明的第一方面，提供一种中药提取物，包括如下重量份的原料组分：栀子30-50份、赤芍20-30份、葡萄30-50份；其中，所述中药提取物制备过程中需要对原料中的栀子进行水解处理，并对原料中的赤芍和葡萄进行发酵处理。其中，所述水解方式为酸水解、碱水解中的至少一种方式。其中，所述酸水解中使用的酸液的ph值为1.9-2.1，酸液的加入量为原料中栀子重量的2.8-3.1倍，所述碱水解中使用的碱液的ph值为11.8-12.1，碱液的加入量为原料中栀子重量的2.9-3.2倍。优选地，酸水解中使用的酸液的ph值为2，酸液的加入量为原料中栀子重量的3倍，所述碱水解中使用的碱液的ph值为12，碱液的加入量为原料中栀子重量的3倍。酸液可选用醋酸、硫酸、柠檬酸、磷酸和盐酸中的一种或多种，优选盐酸；碱液可选用三乙醇胺、浓氨水、氢氧化钾、碳酸钠和氢氧化钠中的一种或多种，优选氢氧化钠。其中，所述水解处理过程中，水解时间为4-6h。优选地，水解时间为5h。其中，所述发酵处理过程中采用酵母菌进行发酵，所述酵母菌的添加量为原料投入总量的1-3wt％。酵母菌可选用常规家用酵母。其中，所述发酵处理过程中，发酵温度为25-30℃，发酵时间为18-24h。本发明的第二方面，提供一种上述中药提取物的制备方法，包括以下步骤：s1、称取配方量的栀子、赤芍和葡萄；s2、将栀子粉碎、水解处理，得到水解产物；s3、将赤芍、葡萄混合，经粉碎、发酵处理，得到发酵产物；s4、将步骤s2中得到的水解产物和步骤s3中得到的发酵产物合并，用溶剂提取，过滤并收集滤液；s5、对步骤s4中得到的滤液进行浓缩，即得中药提取物。其中，所述步骤s4中，提取过程中所使用的溶剂为去离子水或体积浓度为10-50％的乙醇，提取温度为50-95℃，提取时间为1-3h。本发明的第三方面，提供一种上述中药提取物在制备can-nf-at通路抑制剂中的应用。本发明的第四方面，提供一种上述中药提取物在制备抗炎、抗过敏、止痒药物或化妆品中的应用。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明中的中药提取中原料来源广泛，药效高，毒性低，生物兼容性高，安全性高，克服了西药制剂安全性的问题；本发明中的中药提取物经葡萄、栀子、赤芍原料的复配，通过水解和发酵工艺后，其效果大幅度提高，各组分之间有明显的协同作用，使作用达到了1+1＞2的效果，达到良好的抑制can-nf-at通路的作用，具有优异的抗炎、抗过敏、止痒作用，为治疗湿疹等皮肤炎症和自身免疫性疾病提供了科学依据，同时为舒缓类化妆品提供了良好的素材。附图说明下面结合附图与具体实施例对本发明作进一步详细说明。图1为本发明中不同剂量的pma和a23187对k562细胞nfat报告基因表达的影响；图2为本发明中各实施例产品对can-nf-at通路的抑制作用；图3为本发明中各实施例产品的相对细胞毒性；图4为本发明中各实施例产品对角质形成细胞湿疹模型il-8浓度的影响；图5为本发明中各实施例产品对角质形成细胞湿疹模型tslp浓度的影响；图6为本发明中各实施例产品的抓挠抑制实验测试图；图7为本发明中各实施例产品的组胺耐受实验测试图。具体实施方式本申请中药提取物的原料中栀子、赤芍选用符合中国药典的中药饮片，葡萄选用产自我国新疆的成熟新鲜葡萄，酵母菌选用常规家用酵母-安琪酵母菌粉，除酸处理和除碱处理可选用本领域常规使用的离子交换法或酸碱中和法，以去除体系中多余的酸或碱使溶液呈中性。实施例1中药提取物的制备方法，包括以下步骤：s1、称取栀子30g、赤芍20g、葡萄50g；s2、将栀子粉碎，加入90gph值为2的盐酸，水解处理5h，得到水解产物；s3、将赤芍加入至60g去离子水中，进行灭菌处理，再将葡萄清洗干净晾干，将两者进行粉碎混合，降温至25℃，向其中加入1g酵母菌，混合均匀，并在25℃下，发酵18h，得到发酵产物；s4、将步骤s2中得到的水解产物和步骤s3中得到的发酵产物合并，加入1500g去离子水，在95℃下提取1h，过滤并收集滤液；s5、对步骤s4中得到的滤液进行除酸处理，然后低温减压浓缩至500g，加入丙二醇定容至1kg，即得中药提取物。实施例2中药提取物的制备方法，包括以下步骤：s1、称取栀子40g、赤芍30g、葡萄30g；s2、将栀子粉碎，加入120gph值为12的氢氧化钠，水解处理5h，得到水解产物；s3、将赤芍加入150g去离子水中，进行灭菌处理，再将葡萄清洗干净晾干，将两者进行混合，降温至30℃，向其中加入3g酵母菌，混合均匀，并在30℃下，发酵24h，得到发酵产物；s4、将步骤s2中得到的水解产物和步骤s3中得到的发酵产物合并，加入2000g体积浓度为50％的乙醇，在50℃下提取3h，过滤并收集滤液；s5、对步骤s4中得到的滤液进行除碱处理，然后低温减压浓缩至100g，加入丁二醇定容至1kg，即得中药提取物。实施例3中药提取物的制备方法，包括以下步骤：s1、称取栀子50g、赤芍26g、葡萄38g；s2、将栀子粉碎，加入150gph值为12的氢氧化钠，水解处理4h，得到水解产物；s3、将赤芍加入100g的去离子水中，进行灭菌处理，再将葡萄清洗干净晾干，将两者进行混合，降温至25℃，向其中加入2g酵母菌，混合均匀，并在30℃下，发酵20h，得到发酵产物；s4、将步骤s2中得到的水解产物和步骤s3中得到的发酵产物合并，加入2000g体积浓度为10％的乙醇，在85℃下提取2h，过滤并收集滤液；s5、对步骤s4中得到的滤液进行除碱，然后低温减压浓缩至350g，加入丙二醇定容至1kg，即得中药提取物。对比实施例1s1、称取100g赤芍，加入600g去离子，进行灭菌处理；s2、然后向其中加入1800g去离子水，在95℃下提取2h，过滤并收集滤液；s3、将滤液浓缩至500g，即得赤芍提取物。对比实施例2s1、称取100g葡萄，清洗干净，晾干；s2、然后向其中加入1800g去离子水，在95℃下提取2h，过滤并收集滤液；s3、将滤液浓缩至500g，即得葡萄提取物。对比实施例3s1、称取100g栀子；s2、然后向其中加入1800g去离子水，在95℃下提取2h，过滤并收集滤液；s3、将滤液浓缩至500g，即得栀子提取物。对比实施例4s1、称取100g栀子，加入300gph值为2的盐酸，水解5h；s2、再向其中加入1800g去离子水，在95℃下提取2h，过滤并收集滤液；s3、将滤液浓缩至500g，即得水解栀子提取物。对比实施例5s1、称取20g赤芍，加入60g去离子，进行灭菌处理，另取50g葡萄，清洗干净晾干，将两者进行混合，降温至25℃；s2、取栀子30g，加入90gph值为2的盐酸，水解处理5h，得到水解产物；s3、将步骤s1中得到的混合物与步骤s2中得到水解产物进行合并，加入1500g去离子水，在95℃下提取1h，过滤并收集滤液；s4、对得到的滤液进行除酸处理，然后低温减压浓缩至500g，即得中药提取物。对比实施例6s1、称取20g赤芍，加入60g去离子，进行灭菌处理，另取50g葡萄，清洗干净晾干，将两者进行混合，降温至25℃，向其中加入1g酵母菌，混合均匀，并在25℃下，发酵18h，得到发酵产物；s2、取栀子30g，与步骤s2中得到的发酵产物合并，加入1500g去离子水，在95℃下提取1h，并收集滤液；s3、将滤液浓缩至500g，即得中药提取物.对比实施例7s1、称取15g赤芍，加入40g去离子，进行灭菌处理，另取60g葡萄，洗干净，清洗干净晾干，将两者进行混合，降温至20℃，向其中加入4g酵母菌，混合均匀，并在31℃下，发酵16h，得到发酵产物；s2、取栀子25g，加入75gph为3的盐酸，水解5h，得到水解产物；s3、合并步骤s1中制得的发酵产物、步骤s2中制得的水解产物，加入1200g去离子水，在100℃下提取0.8h，过滤并收集滤液；s4、对得到的滤液进行除酸处理，然后低温减压浓缩至500g，即得中药提取物。效果实施例1一、检测方法：1.钙调磷酸酶(can)-nf-at通路阻断剂的筛选步骤：1.1待测样品：所有提取物用70％的乙醇溶解，用去离子水稀释成1mg/ml的工作液，检测时取10μl加入测定管，待测提取物的终浓度为0.2mg/ml。1.2can酶活性检测：采用enzolifescienceg公司的can活性检测试剂盒，按试剂盒的说明书进行。取小离心管，加入25μlcam工作液，5μlcan工作液，10μl50um待测化合物工作液，对照管加入10μl0.5％dmso水溶液，混匀，30℃孵育10分钟，每管再加入10ul底物工作液，混匀，30℃下孵育50-60分钟，加入100μl显色剂，混匀，静止20-30分钟，每孔取135μl转移到96孔板，620nm处测定吸光度。1.3刺激剂pma和a23187最适浓度的确定：为了确定刺激can-nf-at通路活化所需要的刺激剂pma和a23187最适浓度，采用pma浓度2.5，5，10，20，40ng/ml；a23187浓度0.125，0.25，0.5，1，2μμ，每个浓度系列设4复孔，刺激18h后，检测各实验组荧光强度lum值。1.4测定方法：采用从美国affimatrix公司购买了稳定转染nfat报告基因的细胞系nfatk562reporterstablecellline，以pma(蛋白激酶cpkc激活剂)和a23187(钙通道激活剂)刺激k562细胞，检测转录因子nfat驱动的荧光素酶基因表达水平，反应钙调磷酸酶(can)通路的活化水平。稳定转染nfat报告基因的k562细胞常规传代培养于含10％胎牛血清的rpmi-1640培养基中，实验采用生长健康、处于对数增长期的细胞，将上述细胞按2×105/孔接种于24孔细胞培养板，保留不加中药提取物的孔为对照组，保留不添加pma和a23187的孔为空白组，其余孔中加入各实施例中的中药提取物，孵育1小时，加入pma(10ng/ml)和a23187(0.5μμ)(通路刺激剂)，刺激18h，收集细胞，采用荧光素酶检测试剂盒按说明书操作，测定荧光强度lum值(反映细胞内钙调磷酸酶通路活化水平)，抑制率计算公式为：抑制率(％)w＝[1-(x-a)/(b-a)]×100，其中，a为空白组lum平均值，b为对照组lum平均值，x为各实施例lum平均值。2.中草药提取物的细胞毒性检测：采用常规的cck8法：(1)在96孔板中配置100μl的k562细胞悬液(1×105/孔)，将96孔板在培养箱预培养24小时(37℃，5％co2)；(2)加入10μl各实施例中的待测物质，并留取6个孔作为空白对照组；(3)将96孔板在培养箱中孵育24小时；(4)向每孔加入10μlcck8溶液；(5)将96孔板在培养箱内孵育4小时；(6)用酶标仪测定在450nm处的吸光度。细胞毒性的计算公式为：相对毒性(％)w＝[(a-x)/a]×100；其中：a为空白对照组吸光度的平均值，x为各实施例吸光度的平均值。二、实验结果：表1不同剂量的pma和a23187对k562细胞nfat报告基因表达的影响由表1和图1中测试结果可知，pma和a23187能够剂量依赖性地刺激报告基因的表达，复孔间的荧光度值差别可以控制在合理范围。上述实验基本建立了确定了钙调磷酸酶通路激活剂的合适剂量为pma10ng/ml,a231870.5μμ。本申请中实施例1-3、对比实施例1-7制备产品对can-nf-at通路的抑制作用及非特异性细胞毒性的测试结果如表2所示。表2各实施例产品对can-nf-at通路的抑制作用及非特异性细胞的毒性由图2可知，葡萄、栀子、赤芍提取物都具有较好的抑制can-nf-at通路的作用，通过三者配伍应用，使作用达到了1+1＞2的效果；并且，通过水解和发酵工艺后，其效果大幅度提高。通过图3可以看出，本申请实施例1-3中通过组分配伍并对栀子进行水解后，能够明显降低其细胞毒性。同时，当各组分的配伍比例及工艺不在本申请所限定内范围时，抑制can-nf-at通路的效果远小于本申请的效果。本发明组方具有较好的can-nf-at通路的抑制作用，可以作为抗湿疹的良好物质。同时，由于采用的是纯天然的中药提取物，克服了西药、激素药较大副作用的隐患，为抗湿疹及舒缓类化妆品提供了物质基础。效果实施例2：对体外湿疹模型的影响一、检测方法通过poly(i:c)与il-4共同诱导角质形成细胞形成湿疹模型，评价样品对湿疹模型的作用；1.1待测样品：取各实施例及对比实施例提取物，作为待测样品。1.2样品对角质形成细胞湿疹模型的影响原代角质形成细胞中加入样品溶液，以加入相同体积的培养基/溶剂作为阴性对照，每个样品设置3个浓度梯度，每个浓度设置3复孔，孵育1小时后，加入100ug/ml的poly(i:c)和100ng/ml的il-4，培养24小时，通过bca蛋白定量法对孔中细胞的蛋白进行定量(参见1.3)，通过elisa法测定培养基上清液中白介素8(il-8)和胸腺基质细胞淋巴生成素(tslp)的含量(参见1.4)。1.3bca法定量细胞蛋白含量细胞孔中每孔加入100ulripa裂解液，-80℃反复冻融使细胞彻底裂解；取20ul细胞裂解液加入新96孔板中，另设置标准孔和空白孔，每孔加入bca工作液200ul，37℃放置20-30分钟，用酶标仪检测各孔在562nm处的吸光度。以bsa蛋白标准品浓度与对应的od值建立标准曲线，通过样品孔的od值计算样品孔中蛋白质的含量。1.4elisa法检测培养基上清中il-8、tslp含量酶标板中设置标准孔、待测样品孔、空白孔，各加入相应标准品、待测样品以及标准品稀释液100ul，酶标板上覆膜，37℃孵育1小时；弃去液体，甩干；每孔加检测溶液a工作液100ul，覆膜，37℃孵育1小时；弃去孔内液体，每孔用300ul洗涤液洗涤3次；每孔加检测溶液b工作液100ul，覆膜，37℃孵育30分钟；弃去孔内液体，每孔用300ul洗涤液洗涤5次；每孔加tmb底物溶液90ul，覆膜，37℃避光显色10-20分钟；每孔加入终止液50ul；用酶标仪检测在450nm波长测量各孔的吸光度。以标准品浓度与对应的od值建立标准曲线，通过样品孔的od值计算样品孔中待测指标的含量，并以bca蛋白定量的结果进行校正，计算单位质量的蛋白质中il-8和tslp的含量。各样品组与诱导组的指标含量进行单尾t检验，显著性水平α为0.05。二、检测结果由图4、图5中的检测结果可以看出，本实验中选择的诱导剂(poly(i:c)[100ug/ml],il-4[100ng/ml])能够极显著提高nhek的il-8、tslp的表达水平，说明角质形成细胞湿疹模型造模成功。由图4可以看出，本申请中各实施例与各对比实施例可以明显降低因诱导剂而升高的il-8水平，说明各实施例及对比实施例对湿疹发生具有抑制效果；实施例1-3与对比实施例1、2、3、4相比，显著降低因诱导剂而升高的il-8水平，说明本申请中复方比单方的效果明显提高，在抑制湿疹模型中il-8的表达上具有明显的协同作用；对比实施例4与对比实施例3相比，明显降低因诱导剂而升高的il-8水平，说明水解后的栀子比不水解的栀子，在抑制湿疹发生的效果上有明显提高；实施例1与对比实施例5、对比实施例6相比，显著降低因诱导剂而升高的il-8水平，说明本发明的发酵、水解技术对本发明提取物在抑制湿疹模型il-8的功效上有显著的正向作用。由图5可以看出，本申请中各实施例与各对比实施例可以明显降低因诱导剂而升高的tslp水平，说明各实施例及对比实施例对湿疹发生具有抑制效果；实施例1-3与对比实施例1、2、3、4相比，显著降低因诱导剂而升高的tslp水平，说明本发明复方比单方的效果明显提高，在抑制湿疹模型中tslp的表达上具有明显的协同作用；对比实施例4与对比实施例3相比，明显降低因诱导剂而升高的tslp水平，说明水解后的栀子比不水解的栀子，在抑制湿疹发生的效果上有明显提高；实施例1与对比实施例5、对比实施例6相比，显著降低因诱导剂而升高的tslp水平，说明本发明的发酵、水解技术对本发明提取物在抑制湿疹模型tslp的功效上有显著的正向作用。效果实施例3：动物止痒实验测试一、测试方法1.1止痒测试将各实施例与各对比实施例中的产品分别用空白凝胶稀释成1％的凝胶剂备用。选体重18-22g的昆明小白鼠1300只雌雄各半，随机分13组，每组100只，每组分10批且每批中雌雄各5只。将小鼠背部毛用剪刀剪掉，再用脱毛膏洗干净使其露出皮肤，然后分别对13组小鼠给药，给药方法：空白对照组、模型组给空白凝胶剂0.2ml/只/次，阳性对照组给复方醋酸地塞米松乳膏0.2ml/只/次，各实施例组和各对比实施例组给相应的1％产品凝胶剂0.2ml/只/次。13组均是涂抹给药，每天各给药1次，连续给药5天，末次给药1h后，空白对照组不做任何处理，其余各组对每只小鼠尾静脉注射0.02％右旋糖酐生理盐水注射液0.2ml，观察小鼠出现以瘙痒、咬尾、挠背等为瘙痒特征的潜伏期以及30min内的搔抓次数，统计每批平均值(注：空白凝胶剂组为模型组)。1.2组胺耐受测试将豚鼠均分成12组，每组分别涂抹空白凝胶(空白对照组)、复方醋酸地塞米松乳膏(阳性对照组)、1％的各实施例及对比实施例产品，每天两次、连续涂抹两天之后，第3日将右后足背部脱毛处皮肤用细砂纸轻轻摩擦使之发红，但以不出血为度，然后再向创面涂抹所试药物0.025ml，40min后轻轻除去所试药物，每隔3min依次由低浓度到高浓度向每只豚鼠足背部涂抹组胺0.03ml，组胺浓度分别为1.0×10-4、1.5×10-4、2.0×10-4、2.5×10-4、3.0×10-4、3.5×10-4、4.0×10-4。当豚鼠出现瘙痒反应时，即舔右后足创面部位(或已涂至最高浓度仍未出现瘙痒反应为止)，此时累积每只豚鼠所给予的组胺量，即为该豚鼠耐受组胺的量，评价药物的止痒作用。二、测试结果从图6(抓挠抑制实验测试图)可以看出，模型组与空白对照组相比，30分钟内抓挠次数明显提高，说明造模成功；各实施例组与阳性对照组及模型组比较，与阳性对照组抓挠次数相当，无明显差异，明显低于模型组，说明各实施例组的产品对小老鼠的瘙痒，有明显的抑制作用；各实施例组与对比实施例组1、2、3、4比较，其抓挠次数明显低于对比实施例组1、2、3、4，说明本发明中组合物明显比单一植物提取物止痒效果好；各实施例组与对比实施例5、6、7比较，其抓挠次数明显低于对比实施例5、6、7，说明在本发明中的制备方法的工艺条件下，制备的组合物止痒效果明显优于通过对比实施例5-7中的工艺所制备的组合物；水解栀子提取物比栀子提取物止痒效果好；发酵、水解可以提高组方的止痒效果。从图7(组胺耐受实验测试图)可以看出，阳性对照组对组胺的耐受浓度明显高于空白对照组，说明造模成功；各实施例组与空白对照组比较，明显高于空白对照组组胺耐受浓度，说明各实施例组中的产品对小老鼠的组胺耐受浓度，有明显的提高作用；各实施例组与对比实施例组1、2、3、4比较，其组胺耐受浓度明显高于对比实施例1、2、3、4，说明在提高皮肤组胺耐受方面，本发明中的组合物明显比单味植物提取物效果好；各实施例组与对比实施例5、6、7比较，其组胺耐受浓度明显高于对比实施例5、6、7，说明在本发明中的制备方法的工艺条件下，制备的组合物在提高皮肤组胺耐受的效果上明显优于通过对比实施例5-7中的工艺所制备的组合物；在提高皮肤耐受方面，水解栀子提取物比栀子提取物效果好；发酵、水解工艺有利于组方提高皮肤耐受效果。综上，本发明中的中药提取物经葡萄、栀子、赤芍原料的复配，通过水解和发酵工艺后，其效果大幅度提高，各组分之间有明显的协同作用，使作用达到了1+1＞2的效果，达到良好的抑制can-nf-at通路的作用，具有优异的抗炎、抗过敏、止痒作用，为治疗湿疹等皮肤炎症和自身免疫性疾病提供了科学依据，同时为舒缓类化妆品提供了良好的素材。以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属
技术领域：
的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。当前第1页12