一种中药制剂潜在的味效关键质量属性辨识方法

本发明属于药物、食品领域，具体涉及一种中药制剂潜在的味效关键质量属性辨识方法及其在中药饮片制剂、中药制剂、保健品、功能食品中的应用。

背景技术：

课题组研究及调研过程中发现，关键质量属性是贯穿产品研发、制造过程的关键内容，是其质量控制的前提基础，是实现其产品智能制造的关键切入点。在中药制造过程质量控制体系，关键质量属性选择在考虑中药药效物质基础的同时，更应将“药性”物质基础纳入控制指标，这对于保证中药制剂临床功效具有重要的现实意义。味效是中药药理活性与功效表达的桥梁，味效关联关键质量属性研究是中药制造过程质量控制新的切入点，是中药产业高质量发展亟待攻克难题。

网络药理学从系统层面，将药物作用与生物效应机制融合，从多成分、多靶点角度阐明中药作用机制，具有良好的整体性，与中医治疗疾病的整体观相吻合，已成为研究药物与疾病关系的重要方法之一。本发明采用网络药理学方法，提供了一种潜在的味效关键质量属性辨识方法，通过中医药理论指导，将中药、中药制剂所含药味等进行味效模块拆分，对不同味效模块的潜在关键作用靶点进行解析，并回馈至味效模块的药味及其对应的关键质量属性，解析其潜在的味效关键质量属性，为其质量控制提供重要参考。

技术实现要素：

本发明的目的之一在于提供一种潜在味效关键质量属性辨识方法。

本发明的另一目的在于提供所述潜在味效关键质量属性辨识方法在中药饮片制剂、中药制剂、保健品、功能食品味效关键质量属性辨识中的应用。

为实现上述目的，本发明首先提供了一种潜在味效关键质量属性辨识方法，所述方法的具体步骤包括：

步骤1：以中医药理论为指导，将中药制剂所含药味按味效划分成酸、苦、甘、辛、咸和寒、热、温、凉多个味效模块；

步骤2：采用数据库及文献调研收集并整理各味效模块的中药药味化学成分及其对应作用靶点；

步骤3：采用数据库及文献调研收集并整理中药制剂主治的疾病靶点；

步骤4：整理(2)和(3)中的交集靶点，分别作为酸、苦、甘、辛、咸各味效模块所治病症的作用靶点；

步骤5：分别构建(4)中各味效模块交集靶点的蛋白互作网络，筛选中药制剂成分对应各味效模块的潜在关键作用靶点；

步骤6：依据(5)中各味效模块的潜在关键作用靶点，反向预测其对应的中药制剂化学成分，构建“味效模块-化学成分-潜在关键靶点”网络，辨识中药制剂潜在的味效关键质量属性。

根据本发明的一些具体实施方案，中药制剂药味按功效划分成多个味效模块，包括酸、苦、甘、辛、咸。

根据本发明的一些具体实施方案，收集中药制剂各功效模块的中药药味及其对应作用靶点的在线数据库主要包括tcmsp数据库、batman-tcm数据库、tcmid数据库、tcmdatabase@taiwan数据库、etcm数据库、中药与化学成分数据库、化源网、yatcm数据库、symmap数据库、chembl数据库、stitch数据库、pubchem数据库、pharmmapper数据库、swisstargetprediction数据库、中医传承辅助平台等相关数据库及中国知网、万方数据库、pubmed文献检索平台。

根据本发明的一些具体实施方案，收集中药制剂主治的疾病靶点的在线数据库主要包括omim数据库、genecards数据库、ttd数据库、ctd数据库、disgenet数据库、etcm数据库、drugbank数据库、pubchem数据库、chembl数据库等数据库、tcga/geo获取疾病的靶点信息或者疾病中差异表达的基因、及中国知网、万方数据库、pubmed文献检索平台。根据本发明的具体实施方案，潜在关键作用靶点的筛选原则为由bisogenet、string数据库等构建作用靶点蛋白相互作用网络，经由mcode模块筛选、degree、betweenness、closeness、bottleneck、clusteringcoefficient、dmnc、eccentricity、epc、mcc、mnc、radiality、stress、averageshortestpathlength、betweennesscentrality、closenesscentrality、neighborhoodconnectivity、numberofdirectededges、topologicalcoefficient等其中一种或多种指标筛选网络中不小于中位数、平均数或排名靠前、分值高的潜在关键作用靶点。进一步反向预测活性化学成分作为同仁牛黄清心丸的潜在味效关键质量属性。

根据本发明的具体实施方案，“味效模块-化学成分-潜在关键靶点”网络，通过不同味效模块包含的潜在关键作用靶点反向预测对应中药中的化学成分，作为中药制剂潜在味效关键质量属性。

本发明进一步提供了一种中药制剂潜在的味效关键质量属性辨识方法在同仁牛黄清心丸味效关联关键质量属性中的应用，具体实施步骤及结果如下：

(1)同仁牛黄清心丸所含药味的味效模块包括苦、甘、辛、咸四个味效模块；

(2)通过tcmsp、batman-tcm、tcmid数据库及文献收集同仁牛黄清心丸四个味效模块包含化学成分信息，swisstargetprediction数据库预测四个味效模块所对应化学成分的作用靶点；

(3)采用omim数据库、genecards数据库、ttd数据库、ctd数据库收集中风疾病靶点；

(4)将不同味效模块的化学成分作用靶点与中风疾病靶点取交集，得到不同味效模块的潜在关键作用靶点；

(5)以苦、甘、辛三个味效模块为代表，构建潜在作用靶点蛋白相互作用网络，采用mcode方法筛选四个味效模块中分值最高的模块，其包含的作用靶点作为辛、苦、甘四个味效模块的潜在关键作用靶点；

(6)通过辛、苦、甘三个味效模块的中包含的潜在关键作用靶点反向预测对应味效中药中的活性化学成分，作为同仁牛黄清心丸治疗中风疾病潜在味效关键质量属性。

根据本发明的具体实施方案，进一步优选了两个筛选方法，具体如下：

方法一：通过不同味效模块包含的潜在作用靶点反向预测对应中药中的化学成分，进一步构建同仁牛黄清心辛、苦、甘三个味效模块的“味效模块-化学成分-潜在关键作用靶点”网络图。由degree、betweenness、closeness、bottleneck、clusteringcoefficient、dmnc、eccentricity、epc、mcc、mnc、radiality、stress、averageshortestpathlength、betweennesscentrality、closenesscentrality、neighborhoodconnectivity、numberofdirectededges、topologicalcoefficient等其中一种或多种指标筛选网络中不小于中位数、平均数或排名靠前、分值高的活性化学成分作为同仁牛黄清心丸的潜在味效关键质量属性。

方法二：通过bisogenet、string数据库等构建作用靶点蛋白相互作用网络，经由mcode模块筛选、degree、betweenness、closeness、bottleneck、clusteringcoefficient、dmnc、eccentricity、epc、mcc、mnc、radiality、stress、averageshortestpathlength、betweennesscentrality、closenesscentrality、neighborhoodconnectivity、numberofdirectededges、topologicalcoefficient等其中一种或多种指标筛选网络中不小于中位数、平均数或排名靠前、分值高的潜在关键作用靶点。进一步以筛选出的潜在关键作用靶点反向预测同仁牛黄清心丸的潜在味效关键质量属性。

附图说明

图1同仁牛黄清心丸四个味效模块潜在作用靶点韦恩图。

图2辛、苦、甘三种味效模块潜在作用靶点蛋白相互作用(ppi)网络(a：辛；b：苦；c：甘)。

图3同仁牛黄清心丸辛、苦、甘三种味效模块作用靶点kegg通路富集分析结果(a：辛；b：苦；c：甘)。

图4同仁牛黄清心丸辛、苦、甘三种味效模块作用靶点go富集分析结果(a：辛；b：苦；c：甘)。

图5辛味模块“味效模块-关键质量属性-关键作用靶点”网络图。

图6苦味模块“味效模块-关键质量属性-关键作用靶点”网络图。

图7甘味模块“味效模块-关键质量属性-关键作用靶点”网络图。

具体实施方式

实施例1一种中药制剂潜在的味效关键质量属性辨识方法

一种中药制剂潜在的味效关键质量属性辨识方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)以中医药理论为指导，将中药制剂药味按味效划分成多个功能模块；

(2)采用在线数据库及文献调研，收集并整理中药制剂各味效模块的中药药味及其对应作用靶点；

(3)采用在线数据库及文献调研，收集并整理中药制剂主治的疾病靶点；

(4)整理步骤(2)和(3)中的交集靶点，作为中药制剂各味效模块所治病症的作用靶点；

(5)构建步骤(4)中交集靶点的蛋白互作网络，筛选中药制剂成分对应各味效模块的潜在作用关键靶点；

(6)以(5)中潜在关键作用靶点及其反向预测化学成分为载体，构建“味效模块-化学成分-潜在关键靶点”网络，辨识中药制剂味效关联的潜在关键质量属性。

实施例2一种中药制剂潜在的味效关键质量属性辨识方法在同仁牛黄清心丸潜在味效关键质量属性辨识中的应用

(1)对同仁牛黄清心丸全方及27个中药进行了调研，考察了包括《证类本草》、《本草纲目》等古籍和cnki相关文献。基于中医基础理论和组方规律，将同仁牛黄清心丸27味中药按主要味效差异划分成“苦、甘、辛、咸”四个味效模块，其中辛组包括川芎、肉桂、干姜、人工麝香、冰片、柴胡、防风；苦组包括白芍、桔梗、黄芩、白术、蒲黄、水牛角、白蔹、苦杏仁，甘组包括人工牛黄、当归、人参、大枣、甘草、山药、阿胶、麦冬、茯苓、大豆黄卷、六神曲；咸组包括羚羊角。

(2)通过tcmsp(http://tcmspw.com/tcmsp.php)、batman-tcm(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)数据库，查询同仁牛黄清心丸“苦、甘、辛、咸”四个味效模块中所含27味中药的化学成分。人工牛黄、人工麝香等未查询到化学成分的中药，通过查询tcmid数据库(http//www.megabionet.org/tcmid/)和相关文献进行补充。tcmsp数据库中以口服生物利用度(oralbioavailability，ob)≥30％、类药性(druglikeness，dl)≥0.18为筛选条件，检索活性化学成分。其他化学成分通过swissadme在线平台(http://swissadme.ch/)进行筛选，设定条件：肠胃吸收(giabsorption)为“high”，5种类药性(lipinski、ghose、veber、egan、muegge)预测结果有2个及2个以上为“yes”，通过tcmsp、batman-tcm、tcmid数据库及文献收集同仁牛黄清心丸四个味效模块包含化学成分信息，swisstargetprediction数据库预测化学成分作用靶点；

采用swisstargetprediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)在线平台，限定物种为“homosapiens”，进行靶点预测。删除可能性为“0”的靶点，得到同仁牛黄清心丸“苦、甘、辛、咸”四个味效模块中所含27味中药的作用靶点。采用uniprot数据库(http://www.uniprot.org/)中uniprotkb功能，限定物种为人，将所有靶点转换为官方名称(officialsymbol)；

结果筛选得到同仁牛黄清心丸670个活性化学成分，并预测获取1418个作用靶点。

(3)通过genecards(http://www.genecards.org/)、ctd(http://ctdbase.org/)、omim(http://www.omin.org/)、ttd(http://db.idrblab.net/ttd/)四个疾病数据库，以中风为疾病关键词，获取相关靶点。为提高结果准确性，其中genecards数据库中筛选打分值≥10分的靶点，筛选得到456个中风疾病靶点。

(4)将同仁牛黄清心丸“苦、甘、辛、咸”四个味效模块中药包含的化学成分和作用靶点分类汇总，分别与456个中风疾病靶点进行映射，得到辛组132个、苦组116个、甘组143个、咸组8个潜在作用靶点，四个味效模块潜在作用靶点分布情况如图1所示。结果表明同仁牛黄清心丸不同味效模块潜在作用靶点之间存在交集，不同味效中药在发挥各自功效的基础上存在协同作用。

以辛、苦、甘三个味效模块为研究对象，使用string数据库和cytoscape3.7.1软件构建三个味效模块潜在作用靶点蛋白相互作用(ppi)网络。进一步使用mcode插件筛选其中打分值最高的聚类模块，预测潜在关键作用靶点。以k-core≥2、score≥2为筛选条件，得到辛组7个、苦组6个、甘组9个作用靶点模块。筛选潜在作用靶点中连接最紧密、作用更显著的聚类模块，即打分值最高的cluster1包含的作用靶点作为三个味效模块发挥各自功效的潜在关键作用靶点，结果见图2。

(5)通过metascape数据库，设置pvaluecutoff为0.01，对辛、苦、甘三个味效模块潜在关键作用靶点进行go生物过程和kegg通路分析(图3和图4)。由图可知，除作用脂多糖的调节(responsetolipopolysaccharide)、细胞迁移的正调控(positiveregulationofcellmigration)、抗氧化反应(responsetooxidativestress)、血液循环(bloodcirculation)等相同的生物过程和age-rage信号通路(age-ragesignalingpathwayindiabeticcomplications)、tnf信号通路(tnfsignalingpathway)等通路外，

辛组可调控肽酶活性的调节(regulationofpeptidaseactivity)、神经胶质细胞分化(glialcelldifferentiation)、肽-酪氨酸磷酸化的调控(regulationofpeptidyl-tyrosinephosphorylation)等生物过程，egfr酪氨酸激酶抑制通路(egfrtyrosinekinaseinhibitorresistance)、hif-1信号通路(hif-1signalingpathway)等通路发挥疗效。

苦组可调控炎症反应的调节(regulationofinflammatoryresponse)、炎症反应的正向调节(positiveregulationofinflammatoryresponse)、神经炎症反应(neuroinflammatoryresponse)等生物过程，肿瘤中的蛋白多糖(proteoglycansincancer)钙离子信号通路(calciumsignalingpathway)等通路发挥疗效。

甘组可调控细胞死亡的正调控(positiveregulationofcelldeath)、细胞增殖的负调控(negativeregulationofcellproliferation)、丝氨酸/苏氨酸激酶活性的调控(positiveregulationofproteinserine/threoninekinaseactivity)等生物过程，mapk信号通路(mapksignalingpathway)白细胞跨内皮迁移通路(leukocytetransendothelialmigration)精氨酸和脯氨酸代谢(arginineandprolinemetabolism)等通路发挥疗效。

(6)采用cytoscape3.7.1软件，分别构建同仁牛黄清心丸辛、苦、甘三个味效模块治疗中风疾病的“功效模块-化学成分-潜在关键作用靶点”网络，使用“networkanalyzer”插件分析网络。其中辛组包含165学成分，其中13化学成分来源于两个以上中药。苦组包含114学成分，其中8个化学成分来源于两个以上中药。甘组包含320学成分，其中27化学成分来源于两个以上中药。

进一步以每个模块中靶点mcodescore为筛选指标，筛选三个味效模块潜在关键作用靶点排名前5的靶点，选取分值排名前五的作用靶点进一步反向预测潜在关键质量属性。其中甘、苦组筛选出5个靶点，辛组筛选出12个靶点(有9个靶点打分值相同)。辛、苦、甘三个味效模块预测的潜在关键质量属性及其对应的中药和潜在关键作用靶点见图5-图7。

实验结果表明：辛组筛选得到114个潜在关键质量属性，主要来源于川芎、柴胡。包括川芎中的ferulicacid(阿魏酸)、ligustilide(藁本内酯)，柴胡中的arcapillin(茵陈黄酮)、isorhamnetin(异鼠李素)，干姜中的gingerenonea(姜烯酮a)、6-gingerol(6-姜酚)、人工麝香中的dehydroepiandrosterone(去氢表雄酮)、muscone(麝香酮)，冰片中的dipterocarpol(龙脑香醇酮)、dryobalanone(龙脑香二醇酮)，防风中的cimifugin(升麻素)、5-o-methylvisammioside(5-o-甲基维斯阿米醇苷),肉桂中的cinnamicacid(肉桂酸)、cinnamaldehyde(桂皮醛)等成分。

苦组筛选得到60个潜在关键质量属性，主要来源于黄芩、白芍。包括黄芩中的wogonin(汉黄芩素)、baicalein(黄芩素)，桔梗中的luteolin(木犀草素)、polygalacicacid(远志酸)，白芍中的albiflorin(芍药内酯苷)paeoniflorin(芍药苷)，苦杏仁中的prunasin(野黑樱苷)、amygdalin(苦杏仁苷)，白术中的atractylenolideii(白术内酯ii)，水牛角中的lysine(赖氨酸)等成分。

甘组筛选得到51个潜在关键质量属性，主要来源于人参、当归。包括人参中的ginsenosiderb1(人参皂苷rb1)、ginsenosiderg1(人参皂苷rg1)，当归中的ferulicacid(阿魏酸)、ligustilide(藁本内酯)，甘草中的glycyrrhizicacid(甘草酸)、glycycoumarin(甘草香豆素)，麦冬中的ophiopogonind(麦冬皂苷d)、ophiopogonina(麦冬皂苷a)，茯苓中的猪苓酸c(polyporenicacidc)、人工牛黄中的bilirubin(胆红素)等成分。