一种利用桦褐孔菌液体深层发酵杜仲叶提高活性成分产量的方法

本发明涉及发酵工程技术领域，特别涉及一种利用桦褐孔菌液体深层发酵杜仲叶提高活性成分产量的方法。

背景技术：

杜仲(eucommiaulmoidesoliver)属杜仲科植物，本科仅一属一种。杜仲是我国珍稀濒危二类保护树种，具有特殊的价值。杜仲用药，古已有之。中国第一部药书《神农本草经》就记载了杜仲的药效，李时珍在《本草纲目》中指出：“昔有杜仲，服此得道，因此名之。”现代研究也发现杜仲含有大量有效成分，杜仲中的活性成分有80余种，其主要为木脂素类、苯丙素类、环烯醚萜类、黄酮类化合物，还有酚类、三萜类、多糖、有机酸，此外还含有丰富的营养成分，如氨基酸、脂肪和微量元素等。具有抗氧化、抗炎、降脂、抗糖尿病、抗肿瘤、增强免疫力等药理作用。

然而目前杜仲有效成分的提取往往需要用到大量碱性试剂和有机溶剂，不利于环境友好发展，也增加了生产成本。温和稳定的提取方法对于杜仲价值的实现具有极大促进作用。酶作为催化剂，凭借其高效、专一、反应条件温和的特点，纤维素酶对纤维素的水解能力为天然中草药有效成分的释放提取提供了新的方法，经酶解预处理之后，植物细胞壁被大大破坏，有效成分更易于释放，提高了提取效率和提取率。但是纯粹的纤维素酶酶解又给工业化生产带来了成本压力。因此，专家们把目光投入到了生物酵解手段，能极大得降低成本，并且对环境更加友好。

桦褐孔菌(inonotusobliquus)，别名为白桦茸、桦孔茸、桦癌褐孔菌，在民间被广泛用于治疗各类疑难杂症的特效药，桦褐孔菌的化学成分也不断被研究探索。桦褐孔菌中主要含有羊毛脂烷型三萜类、麦角甾醇过氧化物、鞘氨脂类似物、甘露醇、其水提取物含有低分子量的多酚类。桦褐孔菌还含有栓菌酸、半单宁化合物、类固醇、生物碱等。桦褐孔菌的菌丝和菌核中的多糖主要是β-葡聚糖，杂多糖和蛋白复合物。

为保证杜仲资源的可持续性和药用成分的稳定性，使杜仲叶中的多种活性成分得到充分释放并提取利用，提高有效成分的提取率，又尽可能地降低生产成本，成为亟需解决的问题。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种利用桦褐孔菌液体深层发酵杜仲叶提高活性成分产量的方法，能够大大提高杜仲叶提取物中活性成分的产量，且用时短，设备要求简单，设备投资少，后处理简单，基本无污染，成本低。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种利用桦褐孔菌液体深层发酵杜仲叶提高活性成分产量的方法，包括以下步骤：

(1)菌种活化：以桦褐孔菌为菌种，接种至斜面菌种培养基上培养，获得活化菌种；

(2)液体菌种培养：将活化菌种转入种子培养基中培养获得液体菌种；28℃下摇床转速150r/min的条件下摇床培养3天得液体菌种；

(3)杜仲叶粉末制备：将干燥的杜仲叶置于粉碎机中进行粉碎，过筛，得杜仲叶粉末；

(4)液体深层发酵：将液体菌种接种至液体发酵培养基中，28±1℃，摇床转速150±10r/min条件下发酵培养2-6天；所述液体发酵培养基的制备方法为：按照每3g杜仲叶粉末加100ml营养盐溶液的配比混合均匀，调节ph＝6.0，121±1℃湿热灭菌30min而得；

(5)发酵液去多糖：发酵结束后，通过抽滤得到发酵原液，将发酵原液旋蒸浓缩得浓缩液，然后加入95％乙醇溶液充分搅拌，4℃静置过夜，离心分离发酵液中的多糖，收集上清液为含活性成分的胞外液。

本发明利用桦褐孔菌，采用液体深层发酵法以杜仲叶为对象进行液体发酵，能够大大提高杜仲叶提取物中活性成分的产量，且用时短，设备要求简单，设备投资少，后处理简单，基本无污染，成本低，多种活性成分产量能得到有效提高。

杜仲是我国珍稀濒危二类保护树种，从杜仲叶中提取活性成分的成本也随之提高。利用本发明工艺可以有效提高杜仲叶中活性成分的释放，减少成本。该措施也遵从了我国节约资源和保护环境的基本国策，遵循了尊重自然、顺应自然、保护自然的理念。

作为优选，所述活性成分包括绿原酸、环烯醚萜、黄酮、多酚及酚酸。

作为优选，所述杜仲叶粉末的大小为≦60目。

作为优选，所述营养盐溶液配方为：玉米粉3.5g，蛋白胨0.23g，酵母粉0.12g，cacl20.048g，cocl2·6h2o0.002g，kh2po40.1g，mgso40.02g，znso4·7h2o0.001g，k2hpo4·3h2o0.05g，feso4·7h2o0.005g，cuso4·5h2o0.002g，mncl2·4h2o0.009g，用蒸馏水定容至100ml，调节ph＝6.0。

作为优选，所述斜面菌种培养基的配方为：麦芽浸膏40g，蛋白胨4g，琼脂10g，用蒸馏水定容到100ml，ph值为5.4-5.6。

作为优选，所述种子培养基组成为：kh2po40.03g，mgso40.02g，酵母浸膏0.3g，蛋白胨0.05g，葡萄糖1g，用蒸馏水定容至100ml，121±1℃湿热灭菌30min。

作为优选，步骤(4)中，28±1℃，摇床转速150±10r/min条件下发酵培养2-4天。最佳发酵培养时间为2小时。

作为优选，步骤(5)中，95％乙醇溶液用量为浓缩液体积的4倍。

本发明的有益效果是：能够大大提高杜仲叶提取物中活性成分的产量，且用时短，设备要求简单，设备投资少，后处理简单，基本无污染，成本低。本发明生产的多种活性成分能用于制备抗氧化、抗炎药物等。

附图说明

图1为发酵对照、杜仲叶水提、杜仲叶发酵(液体发酵)胞外液/提取液中a：胞外多酚、b：酚酸、c：黄酮发酵/提取14天中的含量变化。

图2为发酵对照、杜仲叶水提、杜仲叶发酵(液体发酵)胞外液/提取液中绿原酸在发酵/提取14天中的含量变化。

图3为发酵对照、杜仲叶水提、杜仲叶发酵(液体发酵)胞外液/提取液中环烯醚萜在发酵/提取14天中的含量变化。

图4为杜仲叶固体发酵培养8天杜仲胶的得率变化。

图5为杜仲叶固体发酵培养8天酚酸的含量变化。

图6为杜仲叶固体发酵培养8天黄酮的含量变化。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。

本发明中，若非特指，所采用的原料和设备等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例1：

一种利用桦褐孔菌液体深层发酵杜仲叶提高活性成分产量的方法，包括如下步骤：

(1)菌种活化：以桦褐孔菌为菌种(市售)，接种至斜面菌种培养基上培养，获得活化菌种；所述斜面菌种培养基的配方为：麦芽浸膏40g，蛋白胨4g，琼脂10g，用蒸馏水定容至100ml，ph值为5.4-5.6，斜面菌种培养基上培养的参数为：温度28℃，培养250h。

(2)液体菌种培养：将活化菌种转入种子培养基中，28℃下摇床转速150r/min的条件下摇床培养3天得液体菌种；所述种子培养基组成：kh2po40.03g，mgso40.02g，浓缩酵母浸膏0.3g，蛋白胨0.05g，葡萄糖1g，用蒸馏水定容至100ml，121℃湿热灭菌30min。

(3)杜仲叶粉末制备：将干燥的杜仲叶置于搅拌粉碎机中进行粉碎，碎渣过60目分子筛，收集筛出的杜仲叶粉末(≤60目)，室温储存以备后续使用。

(4)液体深层发酵：将2ml液体菌种接种至液体发酵培养基中，28℃，150r/min下发酵培养2天；所述液体发酵培养基由3g杜仲叶粉末与100ml营养盐溶液配成，ph6.0，充分搅拌，121℃湿热灭菌30min而得；所述的营养盐溶液配方：玉米粉3.5g，蛋白胨0.23g，酵母粉0.12g，cacl20.048g，cocl2·6h2o0.002g，kh2po40.1g，mgso40.02g，znso4·7h2o0.001g，k2hpo4·3h2o0.05g，feso4·7h2o0.005g，cuso4·5h2o0.002g，mncl2·4h2o0.009g，用蒸馏水定容至100ml，调节ph≈6.0。

(5)发酵液去多糖：发酵结束后，通过抽滤得到发酵原液，将发酵液旋蒸浓缩至20ml，然后加入80ml95％乙醇溶液充分搅拌，在4℃冰箱里静置12h，用高速离心机分离发酵液中的多糖，离心机参数为8000r/min，离心10min，收集上清液为含活性成分(多酚、黄酮、酚酸、绿原酸、环烯醚萜)的胞外液。

实施例2

本实施例与实施例1不同之处在于150r/min下发酵培养4天，其它同实施例1。

实施例3

本实施例与实施例1不同之处在于150r/min下发酵培养6天，其它同实施例1。

液体深层发酵时间试验

试验设置：

杜仲叶发酵组：将液体菌种接种至液体发酵培养基中，28℃，150r/min下发酵培养14天；发酵对照组：将液体菌种接种至营养盐溶液中，28℃，150r/min下发酵培养14天；

杜仲叶水提组：3g杜仲叶粉+100ml水，28℃，150r/min提取14天。

每2天分别测定经过醇沉去多糖的发酵液中多酚、黄酮、酚酸含量，确定最佳发酵天数。如图1所示，综合多酚、黄酮、酚酸含量变化，最佳发酵天数为2天。相比于杜仲叶水提样品，杜仲叶发酵后释放到胞外液中的多酚(第4天)、黄酮(第2天)、酚酸(第2天)产量分别提高了6.54％，56.37％，46.86％(图1、表1)。

表1

发酵6天时，相比于杜仲叶水提样品，杜仲叶发酵后释放到胞外液中的绿原酸产量提高了404.30％(图2、表1)。

发酵4天时，相比于杜仲叶水提样品，杜仲叶发酵后释放到胞外液中的环烯醚萜产量提高了67.28％(图3、表1)。

固体发酵法对照试验

发明人进一步采用了固体发酵法处理杜仲叶：固体发酵：将杜仲叶粉末与营养盐溶液按照2g杜仲叶粉末加1ml营养盐溶液混匀，灭菌后，接种液体菌种，液体菌种用量为每1g杜仲叶粉末加0.1ml，在温度28℃下发酵8天。

每2天分别测定杜仲胶、酚酸、黄酮含量，杜仲胶提取方法为：将发酵后的杜仲叶粉末烘干，烘干的杜仲叶粉末按照料液比为1:16(g/ml)向其中加入石油醚，在70℃条件下加热回流1h后，趁热过滤得滤液，冷却至室温后放置在-20℃的冰箱中7h析出杜仲胶，过滤后冷冻干燥得杜仲胶，称重。

杜仲叶经固体发酵8天的动态分析实验表明，杜仲胶得率先升高后逐渐降低，发酵2天的杜仲叶，其杜仲胶的得率达到最高为4.90％，较未经发酵的对照组得率提高了32.5％，之后随着发酵时间的延长，杜仲胶得率逐渐下降(图4)。

不同固体发酵时间处理，杜仲叶酚酸、黄酮的产量都呈下降趋势，且随着时间的延长，得率越来越低，在第六天达到最低，酚酸得率从未经发酵的对照组的12.92mg/g降至6.65mg/g(图5)，黄酮得率从未经发酵的对照组的45.52mg/g降至24.21mg/g(图6)。

综合分析表明，固体发酵法能促进杜仲胶的产量，但是反而会降低活性物质的产量。

以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。