SP/KLF转录因子抑制剂的用途

sp/klf转录因子抑制剂的用途
技术领域
1.本发明涉及预防和/或治疗肿瘤的药物领域。具体地，本发明涉及sp/klf转录因子抑制剂用于预防和/或治疗胶质瘤的用途、包含sp/klf转录因子抑制剂的药物组合物，以及sp/klf转录因子抑制剂的制药用途。


背景技术：

2.儿童弥漫内生型脑桥胶质瘤(diffuse intrinsic pontine gliomas，dipg)占儿童脑干胶质瘤的80％以上，是恶性程度最高的儿童高级别胶质瘤类型，预后极差，诊断后的平均生存期仅为8-11个月(hargrave,d et al,2006)。尽管近十年来不断有新的治疗方法进入临床试验，包括放射线治疗、化疗及新药研发等，目前仍然没有有效的治疗策略。
3.现有研究证明，在80％的dipg病例中都发生组蛋白h3(h3.1或h3.3)27位赖氨酸向甲硫氨酸的突变(h3.1k27m或h3.3k27m)，该突变造成了肿瘤中一系列表观修饰模式的改变，包括直接导致细胞中h3k27的二甲基和三甲基(h3k27me3和h3k27me2)修饰水平的降低(bender et al.,2013；chan et al.,2013；lewis et al.,2013；venneti et al.,2013)，并伴随着h3k4me3、h3k36me2、h3k27ac水平的上调和dna甲基化水平的下调(larson et al.,2019；stafford et al.,2018,nagaraja et al.,2017；piunti et al.,2017,bender et al.,2013；sturm et al.,2012)。在发生h3k27m的dipg(后面简称dipg(h3k27m))中，组蛋白h3的突变及大规模表观修饰的异常必然伴随着染色质结构及转录因子的结合模式的异常，导致基因转录调控网络异常，从而驱动或加速了dipg的发生发展(cordero et al.,2017；harutyunyan et al.,2019；larson et al.,2019；pathania et al.,2017)。虽然h3k27m突变主要与儿童脑肿瘤有关，例如儿童高级别胶质瘤(phgg)及儿童弥漫内生型脑桥胶质瘤(dipg)，但它们也存在于成人肿瘤中，包括急性髓样白血病、黑色素瘤及胶质瘤(lowe br,et al.,histone h3 mutations:an updated view of their role in chromatin deregulation and cancer.cancers(basel).)。
4.sp(specificity protein)和klf(kruppel-like factor)同属于sp/klf转录因子家族(又称锌指转录因子家族)，自1983年首次发现该家族成员之一sp1至今，在人中已经报道发现了17个klf蛋白和9个sp蛋白，并且该家族成员在真核生物的进化上非常保守(presnell js et al.，2015；suske g et al.,2005)。该家族成员均可通过其位于c末端高度保守的3个cys2his2锌指结构域与dna上高gc富集的区域及5
’‑
caccc-3’基序结合，继而通过其n末端的功能区域或与其他协同因子结合发挥转录激活子或抑制子的功能(kaczynski j et al.,2003；bouwman p et al.,2002；lomberk g et al.,2005；lomberk g et al.,2013)。sp/klf转录因子家族成员众多，功能广泛，在细胞干性维持、细胞增殖、胚胎发育、组织分化和代谢等关键的生物过程中发挥关键作用，并且其表达或活性的失调与许多人类疾病和癌症有关(safe s et al.,2005；nandan mo et al.2009；jiang w et al.,2012)。然而，现有技术中并没有提及sp/klf转录因子家族与dipg(h3k27m)的相关性。
5.综上所述，在dipg(h3k27m)及其他发生h3k27m突变的肿瘤中抑制异常活跃地、驱
动肿瘤发生发展的关键转录因子可能是有效的治疗策略。当前，对获得作为潜在的肿瘤治疗标靶的这些转录因子的抑制剂存在需求。


技术实现要素：

6.本发明的技术方案是基于以下研究的基础上提出的：
7.本发明人发现在dipg(h3k27m)中，sp/klf转录因子特异结合的dna位点呈现出更加开放的染色质状态，并且该家族成员在dipg(h3k27m)中有更高水平的转录活性。具体地，本发明人利用染色质可及性高通量测序分析(assay for transposase-accessible chromatin with high throughput sequencing，atac-seq)联合转录因子结合染色质模式预测分析，发现sp/klf转录因子家族在dipg(h3k27m)特异性开放的染色质上有更多地富集。体外的细胞实验证明，sp/klf转录因子家族的抑制剂能有效地抑制dipg(h3k27m)细胞的增殖、自我更新和侵袭能力。
8.因此，本发明的目的是提供sp/klf转录因子抑制剂在预防和/或治疗胶质瘤中的用途。本发明还提供了包含sp/klf转录因子抑制剂的药物组合物，以及sp/klf转录因子抑制剂的制药用途。
9.一方面，本发明提供了sp/klf转录因子抑制剂在制备用于预防和/或治疗具有组蛋白h3k27m突变的肿瘤的药物中的用途。
10.根据本发明所述的用途，其中所述具有组蛋白h3k27m突变的肿瘤选自儿童高级别胶质瘤(phgg)、儿童弥漫内生型脑桥胶质瘤(dipg)、成人急性髓样白血病或成人黑色素瘤或成人胶质瘤中的一种或多种。
11.根据本发明所述的用途，其中所述组蛋白h3k27m突变为组蛋白h3(h3.1或h3.3)的27位赖氨酸突变为甲硫氨酸(h3.1k27m或h3.3k27m)。
12.根据本发明所述的用途，其中所述预防和/或治疗肿瘤为抑制肿瘤细胞生长、肿瘤细胞迁移/侵袭、肿瘤生长和/或肿瘤定殖。
13.根据本发明所述的用途，其中所述sp/klf转录因子抑制剂选自光神霉素(mithramycin)(cas号：18378-89-7)、咖啡豆醇(cas号：6894-43-5)、手霉素a(cas号：52665-74-4)、6,7-二羟基香豆素(cas号：305-01-1)、姜黄素(cas号：458-37-7)及姜黄素类似物二亚苄叉丙酮(cas号：538-58-9)、甘草查尔酮a(cas号：58749-22-7)、2,4-双(对羟基苯基)-2-丁烯醛(2,4-bis(p-hydroxyphenyl)-2-butenal(hpb242))、帕比司他(cas号：404950-80-7)、β-拉帕醌(cas号：4707-32-8)、4-o-和厚朴酚(cas号：68592-15-4)、托芬那酸(cas号：13710-19-5)、茉莉酸甲酯(cas号：39924-52-2)、四硫化四砷(cas号：12044-30-3)、抗坏血酸(cas号：50-81-7)、阿司匹林(cas号：50-78-2)、合成大麻素win 55,212-2、舒林酸(cas号：38194-50-2)及其硫化物/磺化物、jw 67(cas号：442644-28-2)、jw74(cas号：863405-60-1)、莫能霉素、塞来昔布(cas号：169590-42-5)、尼美舒利(nimesulfide)、ns-398(cas号：123653-11-2)、托芬那酸(cas号：13710-19-5)、去甲斑蝥素(5442-12-6)、β-cdoda-me和α-cdoda-me、ml 133(cas号：1222781-70-5)、哇巴因cid 439501(cas号：630-60-4)、cid 5951923(cas号：749872-43-3)、ml264(cas号：1550008-55-3)、15-羟基二十烷四烯酸(54845-95-3)、px-12(cas号：141400-58-0)、桦木酸(cas号：472-15-1)、cddo(cas号：218600-44-3)和cddo-me(cas号：218600-53-4)、二甲双胍(cas号：657-24-9)、与托芬那
酸(cas号：13710-19-5)结构相关的联芳基衍生物、塞来昔布(cas号：169590-42-5)、雷公藤多甙(cas号：38748-32-2)、mcc-555(cas号：161600-01-7)、白藜芦醇(cas号：501-36-0)，或其变体、药学上可接受的盐、酯或立体异构体。其中，cas(chemical abstract service)号为美国化学文摘社登记号。
14.优选地，所述sp/klf转录因子抑制剂为光神霉素或其变体；
15.更优选地，所述sp/klf转录因子抑制剂为如式(i)所示的光神霉素变体ec-8042：
[0016][0017]
另一方面，本发明提供了一种用于预防和/或治疗具有组蛋白h3k27m突变的肿瘤的方法，所述方法包括给予有需要的受试者预防和/或治疗有效量的sp/klf转录因子抑制剂。
[0018]
根据本发明所述的方法，其中所述具有组蛋白h3k27m突变的肿瘤选自儿童高级别胶质瘤(phgg)、儿童弥漫内生型脑桥胶质瘤(dipg)、成人急性髓样白血病、成人黑色素瘤或成人胶质瘤中的一种或多种。
[0019]
根据本发明所述的方法，其中所述组蛋白h3k27m突变为组蛋白h3(h3.1或h3.3)的27位赖氨酸突变为甲硫氨酸(h3.1k27m或h3.3k27m)。
[0020]
根据本发明所述的方法，其中所述预防和/或治疗肿瘤为抑制肿瘤细胞生长、肿瘤细胞迁移/侵袭、肿瘤生长和/或肿瘤定殖。
[0021]
根据本发明所述的方法，其中所述sp/klf转录因子抑制剂选自光神霉素(mithramycin)(cas号：18378-89-7)、咖啡豆醇(cas号：6894-43-5)、手霉素a(cas号：52665-74-4)、6,7-二羟基香豆素(cas号：305-01-1)、姜黄素(cas号：458-37-7)及姜黄素类似物二亚苄叉丙酮(cas号：538-58-9)、甘草查尔酮a(cas号：58749-22-7)、2,4-双(对羟基苯基)-2-丁烯醛(2,4-bis(p-hydroxyphenyl)-2-butenal(hpb242))、帕比司他(cas号：404950-80-7)、β-拉帕醌(cas号：4707-32-8)、4-o-和厚朴酚(cas号：68592-15-4)、托芬那酸(cas号：13710-19-5)、茉莉酸甲酯(cas号：39924-52-2)、四硫化四砷(cas号：12044-30-3)、抗坏血酸(cas号：50-81-7)、阿司匹林(cas号：50-78-2)、合成大麻素win 55,212-2、舒林酸(cas号：38194-50-2)及其硫化物/磺化物、jw 67(cas号：442644-28-2)、jw74(cas号：863405-60-1)、莫能霉素、塞来昔布(cas号：169590-42-5)、尼美舒利(nimesulfide)、ns-398(cas号：123653-11-2)、托芬那酸(cas号：13710-19-5)、去甲斑蝥素(5442-12-6)、β-cdoda-me和α-cdoda-me、ml 133(cas号：1222781-70-5)、哇巴因cid 439501(cas号：630-60-4)、cid 5951923(cas号：749872-43-3)、ml264(cas号：1550008-55-3)、15-羟基二十烷四烯酸(54845-95-3)、px-12(cas号：141400-58-0)、桦木酸(cas号：472-15-1)、cddo(cas号：218600-44-3)和cddo-me(cas号：218600-53-4)、二甲双胍(cas号：657-24-9)、与托芬那
酸(cas号：13710-19-5)结构相关的联芳基衍生物、塞来昔布(cas号：169590-42-5)、雷公藤多甙(cas号：38748-32-2)、mcc-555(cas号：161600-01-7)、白藜芦醇(cas号：501-36-0)，或其变体、药学上可接受的盐、酯或立体异构体。
[0022]
优选地，所述sp/klf转录因子抑制剂为光神霉素或其变体；
[0023]
更优选地，所述sp/klf转录因子抑制剂为如式(i)所示的光神霉素变体ec-8042：
[0024][0025]
再一方面，本发明还提供了一种预防和/或治疗具有组蛋白h3k27m突变的肿瘤的药物组合物，其中所述药物组合物包含预防和/或治疗有效量的sp/klf转录因子抑制剂、任选的一种或多种其他治疗剂，以及药学上可接受的辅料。
[0026]
根据本发明所述的药物组合物，其中所述具有组蛋白h3k27m突变的肿瘤选自儿童高级别胶质瘤(phgg)、儿童弥漫内生型脑桥胶质瘤(dipg)、成人急性髓样白血病、成人黑色素瘤或成人胶质瘤中的一种或多种。
[0027]
根据本发明所述的药物组合物，其中所述组蛋白h3k27m突变为组蛋白h3(h3.1或h3.3)的27位赖氨酸突变为甲硫氨酸(h3.1k27m或h3.3k27m)。
[0028]
根据本发明所述的药物组合物，其中所述预防和/或治疗肿瘤为抑制肿瘤细胞生长、肿瘤细胞迁移/侵袭、肿瘤生长和/或肿瘤定殖。
[0029]
根据本发明所述的药物组合物，其中所述sp/klf转录因子抑制剂选自光神霉素(mithramycin)(cas号：18378-89-7)、咖啡豆醇(cas号：6894-43-5)、手霉素a(cas号：52665-74-4)、6,7-二羟基香豆素(cas号：305-01-1)、姜黄素(cas号：458-37-7)及姜黄素类似物二亚苄叉丙酮(cas号：538-58-9)、甘草查尔酮a(cas号：58749-22-7)、2,4-双(对羟基苯基)-2-丁烯醛(2,4-bis(p-hydroxyphenyl)-2-butenal(hpb242))、帕比司他(cas号：404950-80-7)、β-拉帕醌(cas号：4707-32-8)、4-o-和厚朴酚(cas号：68592-15-4)、托芬那酸(cas号：13710-19-5)、茉莉酸甲酯(cas号：39924-52-2)、四硫化四砷(cas号：12044-30-3)、抗坏血酸(cas号：50-81-7)、阿司匹林(cas号：50-78-2)、合成大麻素win 55,212-2、舒林酸(cas号：38194-50-2)及其硫化物/磺化物、jw 67(cas号：442644-28-2)、jw74(cas号：863405-60-1)、莫能霉素、塞来昔布(cas号：169590-42-5)、尼美舒利(nimesulfide)、ns-398(cas号：123653-11-2)、托芬那酸(cas号：13710-19-5)、去甲斑蝥素(5442-12-6)、β-cdoda-me和α-cdoda-me、ml 133(cas号：1222781-70-5)、哇巴因cid 439501(cas号：630-60-4)、cid 5951923(cas号：749872-43-3)、ml264(cas号：1550008-55-3)、15-羟基二十烷四烯酸(54845-95-3)、px-12(cas号：141400-58-0)、桦木酸(cas号：472-15-1)、cddo(cas号：218600-44-3)和cddo-me(cas号：218600-53-4)、二甲双胍(cas号：657-24-9)、与托芬那酸(cas号：13710-19-5)结构相关的联芳基衍生物、塞来昔布(cas号：169590-42-5)、雷公藤
多甙(cas号：38748-32-2)、mcc-555(cas号：161600-01-7)、白藜芦醇(cas号：501-36-0)，或其变体、药学上可接受的盐、酯或立体异构体。
[0030]
优选地，所述sp/klf转录因子抑制剂为光神霉素或其变体；
[0031]
更优选地，所述sp/klf转录因子抑制剂为如式(i)所示的光神霉素变体ec-8042：
[0032][0033]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：儿童弥漫内生型脑桥胶质瘤是目前预后最差的癌症之一，且在我国高发。本发明的发明人发现，sp/klf转录因子家族在dipg(h3k27m)特异性开放的染色质上有更多地富集。体外的细胞实验证明，sp/klf转录因子家族的抑制剂能有效地抑制dipg(h3k27m)细胞的增殖、自我更新和侵袭能力。说明sp/klf转录因子家族对具有组蛋白h3k27m突变的肿瘤，特别是儿童弥漫内生型脑桥胶质瘤的发生、发展有重要作用，并且可以作为儿童弥漫内生型脑桥胶质瘤治疗的靶点，其抑制剂是重要的预防和/或治疗药物，对降低具有组蛋白h3k27m突变的肿瘤，如儿童弥漫内生型脑桥胶质瘤的发病和提高儿童弥漫内生型脑桥胶质瘤的治疗水平起到有效作用。
附图说明
[0034]
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
[0035]
图1示出sp/klf转录因子家族成员在正常脑组织(n.c.)和dipg样本中的转录水平分析(a-h)
[0036]
图2示出dipg细胞(dipg-iv、dipg-xiii、dipg-xvii)、胶质母细胞瘤细胞(u87、tpc1115、gl261)及正常神经祖细胞(hppc)的光神霉素(a)或ec-8042(b)半数抑制剂量比较；
[0037]
图3示出dipg细胞在不同浓度的光神霉素(a)或ec-8042(b)处理条件下的增殖情况；
[0038]
图4示出dipg细胞在不同浓度的光神霉素处理条件下的成球能力检测，其中，n.s.：常规生理盐水(normal saline)处理组；
[0039]
图5示出dipg细胞在不同浓度的ec-8042处理条件下的成球能力检测，其中，n.s.：常规生理盐水(normal saline)处理组；
[0040]
图6示出dipg细胞在不同浓度光神霉素(a)或ec-8042(b)处理条件下的侵袭能力检测。
具体实施方式
[0041]
除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均为分析纯级试剂，且可从正规渠道商
购获得。
[0042]
细胞系来源：人胶质母细胞瘤细胞系u87采购自atcc；人胶质母细胞瘤原代细胞tpc1115由武汉大学周严实验室馈赠；小鼠胶质母细胞瘤细胞系gl261由天津医科大学总医院康春生实验室馈赠；人正常神经祖细胞hppc由首都医科大学附属北京天坛医院张力伟实验室馈赠；儿童弥漫内生型脑桥胶质瘤原代细胞dipg-iv(h3.1k27m)、dipg-xiii(h3.3k27m)、dipg-xvii(h3.3k27m)由斯坦福大学michelle monje实验室和上海交通大学唐玉杰实验室馈赠。
[0043]
实验试剂：转座酶试剂盒(trueprep dna library prep kit v2，illumina品牌vazyme，货号td501)；建库试剂盒(trueprep index kit v2，illumina品牌vazyme，货号td202)；pcr纯化试剂盒(qiaquick pcr purification kit，品牌qiagen，货号28106)；微量双链dna检测试剂盒(qubit
tm
dsdna hs assay kit，品牌invitrogen，货号q32851)；mts试剂盒(celltiteraqueous non-radioactive cell proliferation assay，品牌promega，货号g5430)；mithramycin(品牌mce，货号hy-a0122)；ec-8042由西班牙entrechem公司馈赠。
[0044]
实验仪器：
[0045]
生物安全柜(品牌thermo fisher，型号1300iia2)；二氧化碳细胞培养箱(品牌thermo fisher，型号311)；细胞成像微孔板分析仪(品牌biotek，型号cytation5)；倒置显微镜(品牌leica，型号dfc295)。
[0046]
实施例1治疗靶点筛选
[0047]
在不同来源的三株dipg(h3k27m)细胞(dipg-4、dipg-13、dipg-17)中利用染色质可及性高通量测序分析(assay for transposase-accessible chromatin with high throughput sequencing，atac-seq)联合转录因子结合染色质模式预测分析，发现sp/klf转录因子家族在dipg(h3k27m)特异性开放的染色质上有更多地富集。并且，dipg细胞表达谱(源自geo数据库gse115976、gse117446、gse118954、gse115397、gse99812、gse94259、gse95277)分析结果显示，sp/klf转录因子在dipg(h3k27m)肿瘤中的转录水平比正常脑组织相对较高。在dipg(h3k27m)中，sp/klf转录因子特异性结合的dna位点呈现出更加开放的染色质状态。
[0048]
实施例2 ec-8042能够抑制肿瘤细胞增殖、自我更新和侵袭
[0049]
光神霉素及其变体ec-8042是sp/klf转录因子家族的特异性抑制剂，能有效的阻断sp/klf转录因子家族成员通过cys2his2锌指结构域与染色质的结合，从而抑制其发挥转录调节作用。发明人在dipg(h3k27m)细胞中对光神霉素及其变体ec-8042的抑瘤效果进行检测，发现其能有效地抑制dipg(h3k27m)细胞的增殖、自我更新和侵袭能力。方案如下：
[0050]
1)细胞的药物敏感性检测：将人正常神经祖细胞hppc、人胶质母细胞瘤细胞u87、tpc1115、小鼠胶质母细胞瘤细胞gl261和人儿童弥漫内生型脑桥胶质瘤原代细胞dipg-iv(h3.1k27m)、dipg-xiii(h3.3k27m)、dipg-xvii(h3.3k27m)细胞各分成十二组，每组取1*106个细胞，每种细胞每组按相同浓度梯度加入光神霉素或ec-8042(浓度梯度为0、1、5、25、125、725ng/ml，以0.9％氯化钠溶液溶解并稀释)，培养48h后采用celltiteraqueous non-radioactive cell proliferation assay试剂盒检测方法(下文简称mts法)对活细胞进行定量。检测光神霉素或ec-8042在正常神经祖细胞和不同来源不同种类的脑胶质瘤细
胞中的半数抑制剂量(50％growth inhibition,gi50)。
[0051]
2)在人儿童弥漫内生型脑桥胶质瘤原代细胞dipg-iv(h3.1k27m)、dipg-xiii(h3.3k27m)、dipg-xvii(h3.3k27m)细胞中加入光神霉素或ec-8042，用mts法对加药后0、2、4、6和8天时的活细胞进行定量分析，检测光神霉素或ec-8042对dipg(h3k27m)细胞增殖能力的影响。
[0052]
3)自我更新能力检测：在三株dipg(h3k27m)细胞中加入光神霉素或ec-8042，在无血清培养基中进行成球培养，两周后观察肿瘤细胞球大小，并对肿瘤细胞球进行计数，检测光神霉素或ec-8042对dipg(h3k27m)细胞自我更新能力的影响。
[0053]
4)侵袭能力检测：在三株dipg(h3k27m)细胞中加入光神霉素或ec-8042，并加入到铺有基质胶的穿孔小室(transwell)中，培养72小时后将小室取出进行结晶紫染色，观察穿过小室的细胞的数量，检测光神霉素或ec-8042对dipg(h3k27m)细胞侵袭能力的影响。
[0054]
方法如下：
[0055]
1)转座酶法检测染色质可及性(assay for transposase-accessible chromatin，atac)：取5万个新鲜细胞，500g，4℃离心5分钟收集细胞沉淀；用预冷的pbs洗涤细胞沉淀一次；用50μl冰预冷的裂解液(10mm tris cl，ph7.5，10mm nacl，3mm mgcl2，0.1％igepal ca-630)充分重悬细胞，然后500g，4℃离心10分钟收集细胞核沉淀，置于冰上；用转座酶试剂盒中的试剂配制转座反应混合液(37μl ddh2o；10μl 5*ttbl；3μl tte mixv50)，并将其加入细胞沉淀，轻轻吹打混匀，37℃放置30分钟；用建库试剂盒扩增建库，用pcr纯化试剂盒纯化dna，微量双链dna检测试剂盒检测浓度。
[0056]
2)数据分析：使用bowtie2将测序结果与人类基因组(hg19)进行比对。选取单次映射的非重复读取序列进行后续分析。使用macs2调取序列占位集中的峰值。用meme模块进行转录因子结合基序预测分析。
[0057]
3)细胞增殖检测(mts法)：采用celltiteraqueous non-radioactive cell proliferation assay(promega，cat no.g5430)试剂盒检测方法。首先在96孔板中每个孔铺1000个细胞/100μl细胞培养基，每种细胞6个重复孔。对于半数抑制剂量检测，检测培养2天后细胞数量；对于细胞增殖能力检测，设置0、2、4、6、8天五个时间点进行检测。检测前将培养孔中培养基除去，每个孔加入100μl mts buffer(配制比例为dmem培养基：mts：pms＝100：20：1(体积比))，用锡箔纸将96孔板包裹住，37℃孵育2小时(注意：需保证每次孵育时间相同)，然后用酶标仪进行检测，设置吸光度值为490nm。
[0058]
4)细胞侵袭能力检测：首先冰上融化基质胶后，加入两倍胶体积的冰上预冷的不完全dmem培养基稀释，备用。在24孔板中预加含趋化因子的培养基(dmem，10％血清)，培养基上方小心放入穿孔小室(购自corning，货号3422)，注意不要在小室下方产生气泡，在每个小室中加入50μl准备好的基质胶。37℃放置30分钟。将5
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105个细胞于100-150μl无趋化因子培养基(dmem)重悬，接种到具有已经凝好的基质胶的小室中，培养6-8小时，用棉签擦去上层小室中的残余细胞和基质胶，用10％甲醛固定10min，pbs洗一遍，再用20％结晶紫染色15min，pbs冲洗至无浮色后，置于倒置显微镜观察拍照。
[0059]
5)有限稀释法检测克隆形成能力：
[0060]
首先取各组处理的gbm细胞，用胰蛋白酶消化并轻轻吹打，使之成为单细胞，用作活细胞计数，用无血清培养基(dmem/f12、1*n2、1*b27、insulin(10μg/ml)、egf和bfgf(各
20ng/ml))调整细胞密度至合适的梯度(三个梯度分别为5个细胞/孔、20个细胞/孔、100个细胞/孔)；然后取0.1ml细胞悬液加至低吸附的96孔板中，每种细胞做60个重复孔，边缘孔加pbs，置入37℃5％co2温箱中培养2周；最后把平皿放置在倒置显微镜下，观察细胞球体大小，记录成球个数并分析克隆形成频率，计算公式参考http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/。
[0061]
结果如图1-6所示。在dipg(h3k27m)细胞中对光神霉素及其变体ec-8042的抑瘤效果进行检测，发现两个抑制剂均能有效地抑制dipg(h3k27m)细胞的增殖能力、自我更新和侵袭能力。
[0062]
图1示出sp/klf转录因子家族成员在正常脑组织(n.c.)和dipg样本中的转录水平分析(a-h)；从图1中可以得知，与正常脑组织相比，dipg中的sp/klf转录因子家族成员有更高水平的转录活性。
[0063]
图2示出dipg细胞(dipg-iv、dipg-xiii、dipg-xvii)、胶质母细胞瘤细胞(u87、tpc1115、gl261)及正常神经祖细胞(hppc)的光神霉素(a)或ec-8042(b)半数抑制剂量比较；从图2中可以得知，与正常神经祖细胞相比，胶质瘤细胞(包括胶质母细胞瘤和dipg)更容易被光神霉素或ec-8042抑制生长，且dipg细胞比胶质母细胞瘤对光神霉素或ec-8042更加敏感。
[0064]
图3示出dipg细胞在不同浓度光神霉素(a)或ec-8042(b)处理条件下的增殖情况；从图3中可以得知，光神霉素和ec-8042均能显著抑制dipg细胞的增殖，并且随着其浓度增长，抑制作用更加显著。
[0065]
图4示出dipg细胞在不同浓度光神霉素处理条件下的成球能力检测，其中，n.s.：常规生理盐水(normal saline)处理组；从图4中可以得知，光神霉素能显著抑制dipg细胞的成球能力，并且随着其浓度增长，抑制作用更加显著。
[0066]
图5示出dipg细胞在不同浓度ec-8042处理条件下的成球能力检测，其中，n.s.：常规生理盐水(normal saline)处理组；从图5中可以得知，ec-8042能显著抑制dipg细胞的成球能力，并且随着其浓度增长，抑制作用更加显著。
[0067]
图6示出dipg细胞在不同浓度光神霉素(a)或ec-8042(b)处理条件下的侵袭能力检测；从图6中可以得知，光神霉素和ec-8042均能显著抑制dipg细胞的侵袭能力，并且随着其浓度增长，抑制作用更加显著。
[0068]
尽管对本发明已进行了一定程度的描述，明显地，在不脱离本发明的精神和范围的条件下，可进行各个条件的适当变化。可以理解，本发明不限于所述实施方案，而归于权利要求的范围，其包括所述每个因素的等同替换。