具有生物活性的图案化细菌纤维素复合膜及制备和应用

本发明涉及生物医用高分子复合材料技术领域，更具体地，涉及一种具有生物活性的图案化细菌纤维素复合膜及制备和用于制备伤口敷料的应用。

背景技术：

由于皮肤损伤会使机体暴露于各种有害物质中甚至血液流失严重，因此，为了快速诱导皮肤恢复其保护功能，有研究者设计了各种各样的伤口敷料以恢复皮肤的物理屏障功能，并通过加速皮肤组织再生来促进伤口愈合。然而，伤口敷料面临着恢复皮肤天然组织结构完整性的挑战。其中一些敷料缺乏较好的生物活性不能加速伤口愈合，而另一些敷料则在相对较短的时间内能够诱导伤口愈合。这将会导致损伤的皮肤无法恢复到原来正常的结构形态。

在伤口处理过程中，传统的伤口敷料如纱布等容易粘附在伤口上，在更换的时候易损伤创伤面，因而在临床上使用受到限制。细菌纤维素(bc)是一种由微生物如醋酸菌属(acetobacter)、根瘤菌属(rhizobium)、土壤杆菌属(agrobacterium)等生产分泌而得的天然水凝胶，具有很好的生物相容性、高的持水能力、力学性能、渗透性和低毒性等优点，使得它在人工皮肤、伤口敷料、软骨组织工程材料、神经血管、血管和牙种植材料等方面有很好的应用。然而，由于bc缺乏生物活性，在促进伤口愈合方面的效果有待提高。天然高分子活性材料如胶原蛋白、明胶、透明质酸和蚕丝丝胶蛋白等来源丰富，具有优良的生物相容性和生物活性，在生物医药和组织工程领域受到越来越多的关注，逐渐成为天然生物材料领域研究的热点，然而，由于这些材料单独使用时力学性能较差，需要与其它材料进行复合而进行优劣势互补。此外，细胞外基质(ecm)的重塑对于皮肤组织创伤的修复起着至关重要的作用，它不仅可以作为一种动态的支架用于保护和促进伤口修复，还可以作为一种细胞生长的信号分子。因此，在时空上精确调控细胞-基质的生物化学和生物机械相互作用对于提高皮肤修复的有效性和质量至关重要。在我们之前的研究中，使用细菌纤维素-丝胶复合物(bc-ss)作为伤口敷料，体外研究结果表明该复合物能够促进成纤维细胞和上皮细胞的增殖，从而促进伤口愈合(lamboni.l,li.y,liu.jandyang,g.biomacromolecules,2016,17,3076–3084.)。然而，这种皮肤修复敷料会导致成纤维细胞无控制的增殖而导致过量胶原的沉积，从而会导致组织纤维化形成和生成瘢痕(keanet.j.,horejsc.,stevensm.m.,adv.drugdeliv.rev.,2018,129:407-419；coentroj.q.,pugliesee.,hanleyg.,raghunathm.,zeugolisd.i.,adv.drugdeliv.rev.,2019,146:37-59.)。

技术实现要素：

本发明解决了现有技术中伤口修复敷料会导致成纤维细胞无控制的增殖而导致过量胶原的沉积，从而会导致组织纤维化形成和生成瘢痕，提供一种具有生物活性的图案化细菌纤维素复合膜伤口敷料的制备方法，运用具有图案结构的细菌纤维素膜与天然高分子活性材料进行复合。该方法制备出的复合膜材料具有优异的力学性能和生物活性，表面具有细微沟纹结构，能够控制细胞的定向排列和生长形貌，并能促进伤口快速愈合，诱导成纤维细胞和沉积的胶原均匀分布，能减少成纤维化和瘢痕形成。

根据本发明的第一方面，提供了一种具有生物活性的图案化细菌纤维素膜的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将具有图案结构的模板倒置于能合成细菌纤维素的细菌培养液中，培养后，得到具有图案结构的细菌纤维素膜；

(2)将步骤(1)得到的具有图案结构的细菌纤维素膜浸渍到天然高分子活性材料溶液中，使所述具有图案结构的细菌纤维素与所述天然高分子活性材料通过氢键作用力复合，得到具有生物活性的图案化细菌纤维素膜。

优选地，所述图案结构为条纹沟槽结构。

优选地，所述条纹沟槽结构为均一宽度沟槽或不同宽度的第一沟槽和第二沟槽交替排列；

优选地，所述均一宽度沟槽的宽度具体为5μm-20μm；所述第一沟槽的宽度为5μm-15μm，所述第二沟槽的宽度为1μm-10μm。

优选地，所述天然高分子活性材料为丝胶蛋白、胶原、明胶和透明质酸中的任意一种；

优选地，所述能合成细菌纤维素的细菌为木醋杆菌属、固氮菌属、土壤杆菌属、根瘤菌属、假单胞菌属和产碱菌属中的任意一种。

优选地，步骤(1)中培养的时间为5-7天。

优选地，所述天然高分子活性材料溶液中天然高分子材料的质量分数为1％-3％，所述浸泡的时间为12h-48h。

优选地，所述具有图案结构的模板为具有图案结构的聚二甲基硅氧烷模板。

优选地，所述具有图案结构的聚二甲基硅氧烷模板的制备方法包括以下步骤：

s1：设计光刻掩膜的图案，将设计好的图案光刻在硅片上，得到图案化的光刻胶模板；

s2：将聚二甲基硅氧烷和固化剂充分混合，去除气泡，得到透明的粘稠液体，并倾倒在步骤s1中得到的图案化的光刻胶模板上，再进行加热固化，然后将聚二甲基硅氧烷从光刻胶模板上剥离，形成与光刻胶模板结构互补的具有图案结构的聚二甲基硅氧烷模板。

按照本发明的另一方面，提供了任一所述方法制备得到的具有生物活性的图案化细菌纤维素膜。

按照本发明的另一方面，提供了所述的具有生物活性的图案化细菌纤维素膜用于制备伤口敷料的应用；

优选地，所述伤口敷料用于控制细胞的定向排列和生长形貌，并诱导成纤维细胞和沉积的胶原均匀分布，从而减少成纤维化和瘢痕形成。

总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，主要具备以下的技术优点：

(1)本发明所制备的图案化细菌纤维素膜具有三维纤维网络结构，为天然高分子活性材料的均匀复合提供了空间结构基础。本发明制备得到的图案化细菌纤维素复合膜材料具有优异的力学性能，具有良好的生物活性和生物相容性。

(2)本发明所制备的图案化细菌纤维素复合膜具有条纹状沟槽结构，且条纹宽度可调，能引导细胞沿着纤维沟槽生长，从而控制细胞的定向排列和生长形貌。

(3)本发明制备得到的图案化细菌纤维素复合膜材料表面具有细微沟纹结构，能快速诱导组织和促进伤口快速愈合，且能诱导成纤维细胞和沉积的胶原均匀分布，能减少成纤维化和瘢痕形成。

(4)本发明优选地，条纹沟槽结构为均一宽度沟槽或不同宽度的第一沟槽和第二沟槽交替排列，有助于调整细胞的生长和取向，微丝微管及细胞骨架的重排，并进一步影响细胞的生长和生理行为的变化，促进伤口快速愈合，减少纤维化、瘢痕的形成。

(5)本发明制备方法简单、绿色环保，可以规模化生产。

附图说明

图1是对比例1所制备的rbc膜的fesem图。

图2是对比例2所制备的rbc-ss1的fesem图。

图3是对比例2所制备的rbc-ss2的fesem图。

图4是实施例1制备的均一宽度沟槽(10μm)pdms模板的光学显微镜图。

图5是实施例2所制备的mbc膜的fesem图。

图6是实施例4所制备的mbc-ss1膜的fesem图。

图7是实施例5所制备的mbc-ss2膜的fesem图。

图8是对比例1-3，实施例5-7所制备的样品的细胞相对增殖率测试结果。

图9是nih-3t3细胞在对比例1-3，实施例5-7所制备的样品的激光共聚焦显微镜图。

图10是对比例1-3，实施例5-7所制备的样品修复大鼠皮肤损伤的数码照片。

图11是对比例1-3，实施例5-7所制备的样品的修复大鼠皮肤损伤的伤口愈合率定量测试结果。

图12是对比例1-3，实施例5-7所制备的样品修复大鼠皮肤损伤3天的h&e染色结果，其中a:空白对照，b:rbc，c:mbc，d:rbc-ss2，e:mbc-ss2，f:mbc-ss1。

图13是对比例1-3，实施例5-7所制备的样品修复大鼠皮肤损伤不同天数肉芽组织生成厚度的测试结果。

图14是对比例1-3，实施例5-7所制备的样品修复大鼠皮肤损伤不同天数表皮层生成厚度的测试结果。

图15是对比例1-3，实施例5-7所制备的样品修复大鼠皮肤损伤7天和14天胶原-ⅲ免疫组化荧光染色图。

图16是对比例1-3，实施例5-7所制备的样品修复大鼠皮肤损伤7天和14天胶原-ⅲ合成的定量测定结果。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

对比例1

本对比例提供了一种bc膜的制备方法，具体为：配制hestrin&schramm培养基，各组分及比例为：柠檬酸(0.15％，w/v)、磷酸二钠(0.27％，w/v)、酵母膏(0.5％，w/v)、蛋白胨(0.5％，w/v)及葡萄糖(2％，w/v)。将各组分分别溶于去离子水中，高温灭菌后将木醋杆菌接种于已灭菌的培养基中，在30℃的培养箱中培养7天。之后用1m的naoh溶液煮沸去除bc膜中残留的菌体，然后用去离子水多次清洗直至其ph为中性。图1所示为所制备的rbc(randombc)膜的fesem图，从图中可见纳米纤维无规则排列，形成内外互通的网络结构。

对比例2

本对比例提供了一种bc/ss(丝胶蛋白)复合膜的制备方法，具体为：将蚕茧剪碎，在120℃煮沸1h，然后通过透析浓缩溶液并冷冻干燥，得到ss粉末。用去离子水配制质量分数为1％、2％和3％的ss溶液，加入bc膜中，在室温下浸渍24h得到bc/ss复合膜，然后用pbs清洗去除多余的ss。图2和图3分别是所制备的rbc-ss1和rbc-ss2膜的fesem图，可见ss均匀分布于rbc膜表面。

实施例1

本发明中图案化设计及制备聚二甲基硅氧烷pdms模板，包括以下步骤：

(1)采用autocad绘图软件设计宽度为10μm的均匀条纹沟槽图案，或者宽度为10μm和5μm交错排列的条纹沟槽图案。将设计好的图案光刻在硅片上，然后通过全氟硅烷对其表面进行硅烷化处理使图案化模板表面惰性增强，延长使用寿命；

(2)将聚二甲基硅氧烷(pdms)和固化剂两种液体按照质量比10:1充分混合，去除气泡，得到透明的粘稠液体；将除去气泡的pdms倾倒在图案化的光刻胶模板上，厚度为3mm，进一步通过抽真空的方法去除气泡；

(3)将模板置于烘箱中使pdms完全固化，然后将pdms从图案化的光刻胶模板上小心剥离，pdms形成与模板凹凸互补的图案，将其裁剪为符合需要的尺寸备用。

图4是均一宽度沟槽(10μm)pdms模板的光学显微镜图，从图中可见沟槽条纹结构平行排列，每个条纹宽度一致。

实施例2

本实施例提供了一种图案化bc膜的制备方法，具体为：配制hestrin&schramm培养基，各组分及比例为：柠檬酸(0.15％,w/v)、磷酸二钠(0.27％，w/v)、酵母膏(0.5％，w/v)、蛋白胨(0.5％，w/v)及葡萄糖(2％，w/v)。将各组分分别溶于去离子水中，高温灭菌后将木醋杆菌接种于已灭菌的培养基中，将条纹宽度为10μm的pdms模板倒置于培养基中，在30℃的培养箱中培养7天。之后用1m的naoh溶液煮沸去除bc膜中残留的菌体，然后用去离子水多次清洗直至其ph为中性。图5是所制备的mbc膜的fesem图，从图中可见mbc为定向排列为较为致密且排列整齐的纤维沟槽结构。

实施例3

配制hestrin&schramm培养基，各组分及比例为：柠檬酸(0.15％,w/v)、磷酸二钠(0.27％，w/v)、酵母膏(0.5％，w/v)、蛋白胨(0.5％，w/v)及葡萄糖(2％，w/v)。将各组分分别溶于去离子水中，高温灭菌后将木醋杆菌接种于已灭菌的培养基中，将宽度为10μm和5μm交错排列的条纹沟槽pdms模板倒置于培养基中，在30℃的培养箱中培养7天。之后用1m的naoh溶液煮沸去除bc膜中残留的菌体，然后用去离子水多次清洗直至其ph为中性，即得到不同宽度交错排列的纤维沟槽结构薄膜。

实施例4

本实施例提供了一种图案化bc/ss复合膜的制备方法，包括如下步骤：

将蚕茧剪碎，在120℃煮沸1h，然后通过透析浓缩溶液并冷冻干燥，得到丝胶蛋白ss粉末。用去离子水配制质量分数为1％的ss溶液，加入条纹宽度为10μm的图案化bc膜中，在室温下浸渍24h得到图案化bc/ss复合膜，然后用pbs清洗去除多余的ss。图6是所制备的mbc-ss1膜的fesem图，从图中可见ss均匀复合在bc膜中。

实施例5

本实施例提供了一种图案化bc/ss复合膜的制备方法，包括如下步骤：

将蚕茧剪碎，在120℃煮沸1h，然后通过透析浓缩溶液并冷冻干燥，得到ss粉末。用去离子水配制质量分数为2％的丝胶蛋白(ss)溶液，加入条纹宽度为10μm的图案化bc膜中，在室温下浸渍24h得到图案化bc/ss复合膜，然后用pbs清洗去除多余的ss，图7是所制备的mbc-ss2膜的fesem图。

实施例6

本实施例提供了一种图案化bc/ss复合膜的制备方法，具体为：将蚕茧剪碎，在120℃煮沸1h，然后通过透析浓缩溶液并冷冻干燥，得到丝胶蛋白(ss)粉末。用去离子水配制质量分数为3％的ss溶液，加入条纹宽度为10μm的图案化的bc膜中，在室温下浸渍24h得到mbc-ss复合膜，然后用pbs清洗去除多余的ss。

实施例7

精确称取0.2g胶原溶解于10ml去离子水中，搅拌溶解。待完全溶解后，加入沟槽宽度为10μm的mbc膜中，在室温下浸渍24h得到图案化的bc-胶原复合膜，然后用pbs清洗去除多余的胶原，即得胶原改性的mbc功能薄膜。

实施例8

精确称取0.2g明胶溶解于10ml去离子水中，搅拌溶解。待完全溶解后，加入沟槽宽度为10μm的mbc膜中，在室温下浸渍24h得到图案化的bc-明胶复合膜，然后用pbs清洗去除多余的胶原，即得明胶改性的mbc功能薄膜。

实施例9

精确称取0.2g透明质酸溶解于10ml去离子水中，搅拌溶解。待完全溶解后，加入第一沟槽宽度为5μm，第二沟槽宽度为10μm交错排列的图案化bc膜中，在室温下浸渍24h得到mbc-透明质酸复合膜，然后用pbs清洗去除多余的透明质酸，即得透明质酸改性的mbc功能薄膜。

实施例10

以nih-3t3(小鼠胚胎成纤维细胞系)为模型细胞评估实施例1、2、3、4所制备的mbc、mbc-ss1、mbc-ss2、mbc-ss3及对比例1、2所制备的rbc、rbc-ss1、rbc-ss2、rbc-ss3复合膜的细胞相容性。将两种细胞置于37℃、5％co2的二氧化碳培养箱中培养，待细胞融合至80～90％，将细胞种植与各组材料上，每个材料上种植细胞的量为6×10⁴，培养1、3、5天后，用cck-8进行细胞活力测定，每个样品重复三次，计算细胞相对增殖率。图8和图9是对比例1-3，实施例5-7所制备的样品的细胞相对增殖率测试结果和细胞在材料表面生长的激光共聚焦显微镜图，从图中可见mbc复合薄膜比rbc复合膜更能促进细胞的增殖，且能引导细胞沿着纤维沟槽生长，说明mbc复合薄膜在诱导组织定向排列生长具有较好的应用潜力。

实施例11

经武汉赛维尔生物技术有限公司实验室动物实验伦理委员会批准，使用成年雄性wistar大鼠进行体内实验。选用16只体重300～500g的成年雄性wistar大鼠，按实验时间点随机分为3天、7天、14天和21天四组。将大鼠麻醉，按照标准无菌规程进行创伤手术。剃除大鼠背部毛发，制造6个直径为9mm的圆形伤口。所有6个伤口均采用不同的敷料，包括mbc、mbc-ss1、mbc-ss2、rbc、rbc-ss2和纱布(对照)。mbc及其复合材料的微结构表面与伤口接触，而rbc及其复合材料的光滑表面与伤口接触。根据7天的初步试验结果，前7天每48h更换一次敷料，其余时间每24h更换一次。根据bc及其复合材料的表面结构，将敷料保持在伤口48h以诱导细胞(尤其是成纤维细胞)的分布。图10是各组样品修复大鼠皮肤损伤的数码照片，图11是对应的伤口愈合率定量测试结果，从两组图可以得知mbc和rbc复合薄膜组比对照组具有更快的伤口愈合速度和伤口愈合率，在皮肤损伤修复中表现出很大的优势。图12显示了不同组别的材料在鼠伤口上植入3天后的h&e染色图(其中a:空白对照，b:rbc，c:mbc，d:rbc-ss2，e:mbc-ss2，f:mbc-ss1)，可以看出，在rbc和mbc组中可见明显的肉芽组织，而空白对照组中没有肉芽组织的生成。此外，相对于rbc组，rbc-ss2，mbc-ss1和mbc-ss2复合材料组呈现更显著的肉芽组织生成。从肉芽组织生成的定量分析结果(图13)发现，在7天时，不同组别中肉芽组织生成的厚度增加，在14天和21天时，肉芽组织生成的厚度递减，这是因为在各组中皮肤组织由增生向重构过度，而且mbc和mbc-ss2组相对于rbc和rbc-ss2组更加明显，说明了mbc-ss2复合材料能有效抑制新生组织的过度生长。图14是皮肤修复表皮层厚度定量测试的结果，在7天时，除了全损皮肤组(对照)未发生上皮化，其余组均发生明显上皮化。在14天和21天时，不同bc组上新生的表皮层厚度相对于7天时减少，可能是在表皮重建的过程中，增生的角质细胞向角化细胞转化。此外，图15和图16分别是是不同组别胶原-ⅲ生成的免疫组化荧光染色图及定量测试结果，从实验结果发现，在7天时，除了空白对照组和单纯bc组，其余各组显著促进了胶原-ⅲ的分泌，说明了丝胶蛋白的复合提高了胶原的合成。在14天时，胶原-ⅲ在mbc和mbc-ss2组中分泌量较其它组合成减少，且在mbc-ss组中合成量显著相对于其它组更少，表明了在mbc-ss组中相对于其它组没有出现过度伤口收缩，间接反映了该组能防止纤维化和疤痕的形成。

本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。