白及去分化细胞萃取物及其用途与包含其的化妆品的制作方法

1.本发明是有关于美容保养成分及其用途与产品，尤其是包含植物萃取物的美容保养成分。


背景技术：

2.随着科技进步与生活水平的提升，人与人之间的互动频繁，而在社交活动的过程中，人们也越来越注重自身的外表，并追求更为年轻与健康的外表，从而带来护肤市场的活络。
3.市面上的美容产品琳琅满目，然而，多数功能性越强的产品，对于人体肌肤的刺激性亦越大，例如：果酸或a醛虽然具有极佳的抗皱功效，但使用时有灼热感，并容易造成皮肤红肿、干燥及脱屑；苯二酚虽具有优良的美白效果，并可用来淡化黑斑，但其具有刺激性及光敏感性的副作用；以及左旋维生素c虽具有极佳的抗氧化功能，但其属酸性物质，对于肌肤的刺激性仍有待改善。因此，低皮肤刺激性的活性成分仍有待开发。


技术实现要素：

4.为解决上述问题，本发明提供一种植物去分化细胞萃取物，其是经超临界萃取而得；其中，所述植物为兰科(orchidaceae)白及属(bletilla)植物，以及所述超临界萃取的溶剂为二氧化碳。
5.本发明的植物去分化细胞萃取物不仅具有美白、抗氧化和抗皱三重美容功能，更兼具低皮肤刺激性的优点。
6.本发明的去分化细胞包含尚未分化或逆分化(dedifferentiation)的植物细胞。
7.较佳地，上述去分化细胞取自种子(seed)、拟胚(embryoid)、体胚(somatic embryos)、原球体(protocorm)、类原球体(protocorm-like bodies，plbs)、愈伤组织(callus)的任一或其组合。
8.较佳地，所述种子包含胚(embryo)、胚芽(germ)的任一或其组合。
9.依据本发明，上述植物去分化细胞萃取物的美容功效优于已分化的细胞萃取物的美容功效，且更为温和，而无皮肤或眼刺激性。
10.在一实施态样中，所述去分化细胞取自将种子诱导培养而得的组织培养物。
11.上述诱导培养的培养基与诱导培养方法属习知技术，并可依需求调整，例如：可采用ms培养基(murashige&skoog medium)或b5培养基(b5 medium)。
12.较佳地，所述诱导培养的天数为40天至70天，例如：40天、50天、60天或70天。
13.较佳地，所述诱导培养所用的诱导培养基的ph值为5.7至5.9；更佳地，其ph值为5.8。
14.在一实施态样中，所述诱导培养基包含蔗糖与椰子水。较佳地，以所述诱导培养基的总体积为基准，椰子水的含量为10体积百分比至15体积百分比，例如：10体积百分比、11体积百分比、12体积百分比、13体积百分比、14体积百分比或15体积百分比；以及所述蔗糖
的含量为20g/l至30g/l，例如：20g/l、22g/l、24g/l、26g/l、28g/l或30g/l。
15.较佳地，所述诱导培养基进一步添加选自由以下所组成的群：6-苄胺嘌呤(6-benzylaminopurine，6-ba)、2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-dichlorophenoxyacetic acid，2,4-d)和萘乙酸(naphthaleneacetic acid,naa)；更佳地，以所述诱导培养基的总体积为基准，6-ba、2,4-d或naa的含量为0.1mg/ml至5mg/ml，例如：0.1mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml或5mg/ml。
16.较佳地，所述组织培养物为上述的体胚、原球体、类原球体或愈伤组织。
17.上述诱导培养种子生成体胚、原球体、类原球体或愈伤组织的培养基与培养方法可依需求调整。因诱发种子生成去分化细胞属成熟技术，具有操作稳定性，故本发明予以采用，但不以此为限。
18.较佳地，所述去分化细胞是将上述组织培养物进一步经增殖培养而得。
19.上述增殖培养的培养基与增殖培养方法可依需求调整。
20.在一实施态样中，上述增殖培养的培养基与上述诱导培养基相同。
21.较佳地，所述增殖培养的天数为30天至45天，例如：30天、35天、40天或45天。增殖培养天数依去分化细胞的生长状况而定，并于去分化细胞长满或达需求量时，进行收成；在一实施态样中，以液态培养基进行悬浮的增殖培养一般约30天后收成；在另一实施态样中，以固体培养基进行增殖培养一般约45天后收成。
22.较佳地，所述增殖培养是于黑暗环境中培养。
23.较佳地，所述增殖培养每15天至40天进一步接种继代至新鲜的增殖培养基，例如：15天、20天、25天、30天、35天或40天。在去分化细胞长满或达需求量前，如去分化细胞出现营养不足的情况，可先接种继代至新鲜的增殖培养基，如细胞量足够多时，亦可随时进行继代培养或收成。在一实施态样中，以液态培养基进行悬浮的增殖培养一般约15天后收成或进行接种继代；在另一实施态样中，以固体培养基进行增殖培养一般约35天后收成或进行接种继代。
24.上述超临界萃取为习知技术，并可藉由调整参数来萃取不同特性的目标。经实验证实，本发明所获的萃取物具有不可预期的功效：美白、抗氧化、抗皱和低刺激性，且萃取条件如下所述。
25.较佳地，所述超临界萃取的压力为2000psi至7000psi，例如：2000psi、2500psi、3000psi、3500psi、4000psi、4500psi、5000psi、5500psi、6000psi、6500psi或7000psi。更佳地，所述超临界萃取的压力为4000psi至5000psi。
26.较佳地，所述超临界萃取的温度为40℃至60℃，例如：40℃、45℃、50℃、55℃或60℃。
27.较佳地，所述超临界萃取的时间为5小时至10小时，例如：5小时、6小时、7小时、8小时、9小时或10小时。
28.较佳地，所述超临界萃取所用溶剂的流速为4l/min至6l/min，例如：4l/min、4.2l/min、4.4l/min、4.6l/min、4.8l/min、5l/min、5.2l/min、5.4l/min、5.6l/min、5.8l/min或6l/min。
29.在一实施态样中，所述超临界萃取另使用夹带剂；较佳地，所述夹带剂包含甲醇、乙醇、丙醇、己醇、丙二醇、乙二醇、正丁醇、丙酮、丁酮、甲酸、乙酸、乙酸乙酯、环己烷、正己
烷、氯甲烷、二恶烷、二甲基亚砜、二甲基乙酰胺、乙二醇单甲醚、乙腈、六氟化硫、三氟化氯、二氧化硫、二硫化碳、四氢呋喃、碳酸亚丙酯、氯仿和石油醚中的任意一种或其组合；更佳地，所述夹带剂为乙醇。
30.在一实施态样中，上述植物为中国台湾白及(bletilla formosana(hayata)schltr.)。
31.依据本发明，上述植物去分化细胞萃取物的有效浓度为0.005重量百分比以上，较佳地，所述有效浓度为0.005重量百分比至30重量百分比，例如：0.005重量百分比、0.008重量百分比、0.01重量百分比、0.03重量百分比、0.05重量百分比、0.08重量百分比、0.1重量百分比、0.2重量百分比、0.3重量百分比、0.4重量百分比、0.5重量百分比、0.6重量百分比、0.7重量百分比、0.8重量百分比、0.9重量百分比、1重量百分比、1.5重量百分比、2重量百分比、2.5重量百分比、3重量百分比、3.5重量百分比、4重量百分比、4.5重量百分比、5重量百分比、10重量百分比、15重量百分比、20重量百分比、25重量百分比或30重量百分比。更佳地，所述有效浓度为人用有效浓度。
32.依据本发明的一特定实施例，斑马鱼胚胎采用10mm曲酸(约1421μg/ml)处理后，黑色素生成抑制率约55％，采用100μg/ml的本发明白及去分化细胞萃取物后，黑色素生成抑制率约66％，即本发明白及去分化细胞萃取物在浓度为曲酸的14分之1时，仍具有较佳的黑色素抑制功效。因1994年发表的
“コウジ
酸
のメラニン
生成抑制作用
と
各种色素沈着症
に
対
する
治疗効果(曲酸对黑色素产生的抑制作用及对各种色素沉着的治疗作用)”一文揭示男性及女性受试者涂抹1％曲酸后，可明显抑制黑色素沉着。可知，本发明植物去分化细胞萃取物的有效浓度于1/14％，即0.07重量百分比时，可展现优于曲酸的美白效果，且人用有效浓度可为0.005重量百分比至30重量百分比。
33.本发明另提供一种上述植物去分化细胞萃取物的用途，其是用于美白、抗氧化或抗皱。
34.较佳地，所述美白包含：抑制或防止黑色素生成，或降解黑色素。
35.较佳地，所述抗氧化包含：清除自由基、降低或减缓氧化压力、或提升过氧化氢酶或超氧化物歧化酶的基因表达。
36.较佳地，所述抗皱包含：提升弹性蛋白生成基因的表达量、或抑制或降低基质金属螯合蛋白酶的生成；更佳地，所述基质金属螯合蛋白酶为基质金属螯合蛋白酶-1(mmp-1)。
37.较佳地，上述植物去分化细胞萃取物具有低皮肤刺激性；更佳地，上述植物去分化细胞萃取物具有低眼睛刺激性。
38.本发明再提供一种化妆品，其包含上述植物去分化细胞萃取物，其中，所述化妆品的剂型包含溶液、悬浮剂、喷雾、液体洗剂、慕丝、精华液、凝胶、乳液、微乳液、乳霜、软膏、膏棒、皂块、粉剂或贴片。
39.在一实施态样中，所述化妆品可为洗面奶、卸妆乳、肥皂、沐浴乳、洗发乳、化妆水、面霜、妆前乳、防晒乳、隔离霜、粉底液、粉饼、贴片、护手霜、身体乳或面膜。
40.本发明的“化妆品”依中国台湾2018年05月02日修正的化妆品卫生安全管理法第3条第1项第1款的规定，指“施于人体外部、牙齿或口腔黏膜，用以润泽发肤、刺激嗅觉、改善体味、修饰容貌或清洁身体的制剂。但依其他法令认属药物者，不在此限”。因此，本发明的化妆品仅包含化妆品卫生安全管理法第3条第1项第1款规定的化妆品，而不包含依其他法
令认定属于药物者。
41.本发明又提供一种化妆品的用途，其是用于美白、抗氧化或抗皱，其中所述化妆品包含上述植物去分化细胞萃取物；较佳地，所述美白包含：抑制或防止黑色素生成，或降解黑色素；所述抗氧化包含：清除自由基、降低或减缓氧化压力、或提升过氧化氢酶或超氧化物歧化酶的基因表达；或所述抗皱包含：提升弹性蛋白生成基因的表达量、或抑制或降低基质金属螯合蛋白酶的生成。
42.综上，本发明的植物去分化细胞萃取物具有美白、抗氧化、抗皱和低皮肤刺激性的优点，不仅可避免消费者产生肌肤不适的体感与副作用，更满足消费者多重美容保养需求，以及减化以往单一产品仅具单一功效，而须采用多道不同美容功能的保养产品的繁复流程。换句话说，本发明兼具有效、效率与安全的三大优点，可全方位一次满足消费者所有的皮肤美容需求，极具市场竞争力。
附图说明
43.图1为不同萃取物的高效液相层析分析图。
具体实施方式
44.以下提供数种操作方式，以便说明本发明的实施方式；本领域技术人员可经由本说明书的内容轻易地了解本发明所能达成的优点与功效，并且于不悖离本发明的精神下进行各种修饰与变更，以施行或应用本发明的内容。
45.制备例1：白及种子的愈伤组织
46.本实验采用中国台湾白及的种子进行诱导培养，以获得愈伤组织。首先将授粉后发育2.5个月的蒴果果荚以清洁剂清洗外壳后，经75％酒精消毒1分钟，再以1％至3％次氯酸钠溶液消毒30分钟后，于无菌操作台中以无菌水清洗3次，取出种子，并以ph值为5.8的诱导培养基培养50天至70天，以获得愈伤组织；其中，所述诱导培养基的成分如表1所示；其中，所述诱导培养基择一或择二添加6-ba、2,4-d和naa，且各别添加量为0.1至5mg/l，并将所得的愈伤组织混合备用。
47.表1：诱导培养基
48.成分种类含量(mg/l)nh4no31650kno31900mgso4·
7h2o370cacl2·
2h2o440kh2po4170znso4·
7h2o8.6mnso4·
h2o16.9cuso4·
5h2o0.025ki0.083cocl2·
6h2o0.025h3bo362
na2moo4·
2h2o0.25na2edta37.3feso4·
7h2o27.8盐酸吡哆辛(维生素b6)0.5盐酸硫胺素(维生素b1)0.400烟碱酸(维生素b3)0.500甘胺酸1.000肌醇100agar7000椰子水100至150ml/l蔗糖200006-ba/2,4-d/naa0.1至10
49.制备例2：白及去分化细胞
50.将制备例1的愈伤组织接种至新鲜的固体增殖培养基，于室温25℃的黑暗环境中进行增殖培养，以获得包含白及去分化细胞的组织培养物；其中，进行增殖培养的过程中，取一部分组织培养物于第35天进行继代接种，其余组织培养物继续进行增殖培养或同时收成。此外，增殖培养基同上述的诱导培养基。
51.制备例3：白及萃取物
52.实施例1：去分化细胞的超临界二氧化碳萃取物
53.将培养35天至45天且包含制备例2的包含白及去分化细胞的组织培养物进行冷冻干燥后磨粉，获得细胞冻干粉，并以超临界二氧化碳流体为溶剂，于压力介于4000psi至5000psi，温度介于40℃至60℃，二氧化碳流体流速介于4l/min至6l/min，萃取5小时至10小时，以获得膏状的超临界二氧化碳流体萃取物，此即为白及去分化细胞的超临界二氧化碳萃取物。
54.比较例1：去分化细胞的乙醇萃取物
55.将培养35天至45天且包含制备例2的包含白及去分化细胞的组织培养物进行冷冻干燥后磨粉，获得细胞冻干粉。将冻干粉及50％乙醇水溶液依1：50的重量体积比例混合后，以超声波震荡1小时，所得萃取液过滤后进行减压浓缩，再经过冷冻干燥，以获得白及去分化细胞的乙醇萃取物。
56.比较例2：药材的乙醇萃取物
57.取干燥白及根进行磨粉，获得白及粉。将白及粉及50％乙醇水溶液依1：50的重量体积比例混合后，以超声波震荡1小时，所得萃取液过滤后进行减压浓缩，再经过冷冻干燥，以获得药材的乙醇萃取物。
58.分析例1：高效液相层析分析
59.本实验所用高效液相层析仪为waters 600；层析管柱为c-18，inertsil 5ods，4.6*250mm；波长为uv 200nm至400nm；流速为1.0ml/min；移动相的a液为h2o(0.1％磷酸)，b液为乙腈，梯度洗脱方式为0至15分钟(95～85：5～15)，15至50分钟(85～40：15～60)，50至55分钟(40～95：60～5)，55至60分钟(95：5)，进样量：20μl；管柱温度为室温。
60.将10毫克的实施例1、比较例1和比较例2分别溶于1ml溶剂中，其中实施例1的溶剂
为乙醇，比较例1和比较例2的溶剂为水，获得样品原液，并以超声波震荡溶解及过滤后进行分析，结果如图1所示；其中，图1显示实施例1、比较例1和比较例2的成分不同，由实施例1中的约落在40至45分钟及55分的波峰，可知实施例1含有较多极性小的成分。
61.分析例2：总多酚含量分析
62.将10毫克的实施例1、比较例1和比较例2分别溶于1ml溶剂，其中实施例1的溶剂为乙醇，比较例1和比较例2的溶剂为水，获得样品原液。将100μl样品原液以溶剂稀释10倍后，加入2ml水及0.25ml1n folin-ciocalteu reagent混合均匀及静置5分钟，加入0.25ml的20％na2co3溶液混合均匀，反应2小时后，以3多功能微量盘分光光谱仪测定750nm的吸光值，并以没食子酸(gallic acid)为对照标准品，以各组每克所含的没食子酸当量(gallic acid equivalent)毫克为总多酚含量，结果如表2所示。
63.表2：各组总多酚含量
64.组别总多酚含量(mg gallic acid eq./g)实施例123.74
±
0.75比较例125.07
±
0.97比较例226.10
±
0.62
65.从表2可知，实施例1、比较例1和比较例2的总多酚含量相近；其中，实施例1所测得的总多酚含量最低。
66.测试例1：美白功效的细胞实验
67.(一)小鼠黑色素细胞的细胞毒性测试
68.将培养于dmem培养基的小鼠黑色素细胞b16-f10(crl-6475
tm
)种入96孔培养盘，密度为每孔5
×
103个细胞，培养24小时使其贴附在培养盘。各控制组于dmem培养基添加溶剂，其中，实施例1以dmso作为溶剂，且实施例1的控制组添加如实施例1溶剂量相同的dmso量为对照－以培养基为基准的0.5％dmso；比较例1和比较例2以水作为溶剂，且比较例的控制组亦添加如比较例1和比较例2各组溶剂量相同的水量为对照－以培养基为基准的0.25％水，各实验组则添加不同浓度的实施例1、比较例1和比较例2，培养48小时后加入500μg/ml的mtt溶液，并以37℃培养2小时后，去除mtt溶液，加入200μl dmso以溶解结晶，测量570nm的吸光值，各组为二重复，并以控制组存活率作为基准，即存活率为100％，计算实验组的相对细胞存活率，结果如表3所示。
69.表3：实验组的相对细胞存活率结果
[0070][0071]
从表3所示结果可知，各组的小鼠黑色素细胞存活率相近，且皆超过90％。
[0072]
(二)小鼠黑色素细胞的黑色素生成抑制测试
[0073]
将上述小鼠黑色素细胞种入6孔培养盘，密度为每孔3
×
104个细胞，培养24小时使其贴附在培养盘后，更换新鲜的dmem培养基，除控制组外，其余组别加入100nm的α-黑色素细胞刺激素(α-melanocyte-stimulating hormone，α-msh)。各阴性对照组进一步添加溶剂，其中，实施例1以dmso作为溶剂，且实施例1的阴性对照组添加如实施例1溶剂量相同的dmso量为对照－以培养基为基准的0.4％dmso；比较例1和比较例2以水作为溶剂，且比较例的阴性对照组亦添加如比较例1和比较例2各组溶剂量相同的水量为对照－以培养基为基准的0.2％水，各实验组则添加不同浓度的实施例1、比较例1和比较例2。阳性对照组添加熊果苷(arbutin)。各组培养48小时后，以pbs冲洗一次后，加入胰蛋白酶使小鼠黑色素细胞脱落，收集小鼠黑色素细胞，经离心及去除上清液后，加入1m naoh与10％dmso，于80℃干浴槽中加热2小时后，测量400nm的吸光值，各组二重复，并以各自的阴性对照组的黑色素含量作为基准，即黑色素含量为100％，计算其余组别的相对黑色素含量，结果如表4所示；其中，t检定的比较对象为各自的阴性对照组。
[0074]
表4：各组的相对黑色素含量结果
[0075][0076]
从表4所示结果可知，实施例1于200μg/ml的浓度下，黑色素含量降至49.4％，而实施例1于50μg/ml的浓度下，黑色素含量降至74.0％，显示实施例1的黑色素生成抑制率约为25％至50％；相较之下，比较例1和比较例2的黑色素生成抑制率仅约为10％至20％。因此，实施例1抑制黑色素生成的功效明显优于比较例1和比较例2。
[0077]
其次，由于各组小鼠黑色素细胞存活率相近，故实施例1抑制黑色素生成的功效非
azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)溶液前，先测量734nm的吸光值作为背景值。添加abts溶液均匀混合后，于25℃反应15分钟后，测量734nm的吸光值，并计算abts自由基清除率达50％时的浓度(ic
50
)，计算公式如测试例3，结果如表7所示。
[0090]
表7：abts自由基的半清除浓度
[0091]
组别ic
50
(μg/ml)实施例160.69
±
0.50比较例139.01
±
0.62比较例255.81
±
1.80
[0092]
从表7可知，实施例1的abts自由基清除功效并未优于比较例1和比较例2。
[0093]
测试例5：人类纤维母细胞代谢活性氧化物实验
[0094]
(一)人类纤维母细胞的细胞毒性测试
[0095]
将培养于mem培养基的人类纤维母细胞ccd-966sk(crl-1881
tm
)种入96孔培养盘，密度为每孔5
×
103个细胞，培养24小时使其贴附在培养盘。
[0096]
各控制组于mem培养基添加溶剂，其中，实施例1以dmso作为溶剂，且实施例1的控制组添加如实施例1溶剂量相同的dmso量为对照－以培养基为基准的1％dmso，各实验组则添加不同浓度的实施例1。培养24小时后加入500μg/ml的mtt溶液，并以37℃培养2小时后，去除mtt溶液，加入200μl dmso以溶解结晶，测量570nm的吸光值，各组为三重复，并以控制组细胞存活率作为基准，即存活率为100％，计算实验组的相对细胞存活率，结果如表8所示。
[0097]
表8：实验组的相对细胞存活率结果
[0098][0099][0100]
从表8可知，当实施例1的浓度在250μg/ml以下时，细胞存活率皆达90％以上。
[0101]
(二)人类纤维母细胞的代谢活性氧化物实验
[0102]
将上述人类纤维母细胞种入96孔培养盘，密度为每孔5
×
103个细胞，培养24小时使其贴附在培养盘后，再加入500μm的h2o2，等待24小时后，更换新鲜的mem培养基。控制组于mem培养基添加溶剂，其中，实施例1以dmso作为溶剂，且实施例1的控制组添加如实施例1溶剂量相同的dmso量为对照－以培养基为基准的0.5％dmso，各实验组则添加不同浓度的实施例1。各组培养24小时后，将细胞分为两份，一份以pbs冲洗二次后，加入含10μm dcfh-da荧光染剂的溶液，并于37℃反应30分钟后，量测dcf荧光强度，以代表细胞活性氧化物的含量。各组二重复，并以控制组的荧光强度作为基准，即细胞活性氧化物含量为100％，计算实验组的相对细胞活性氧化物含量；另一份进行人类纤维母细胞的细胞毒性测试，并以500μg/ml mtt溶液在37℃反应3小时，测量570nm的吸光值以代表细胞活性，各组二重复，结果如表9所示；其中，t检定的比较对象为控制组。
[0103]
表9：实验组的相对细胞存活率和相对dcf荧光强度结果
[0104][0105]
从表9可知，各浓度的细胞存活率相近，且浓度为250μg/ml时，dcf荧光强度明显低于控制组，抑制氧化压力将近35％，显示实施例1确实可减少活性氧化物，而降低或减缓氧化压力。
[0106]
测试例6：人类纤维母细胞的过氧化氢酶及超氧化物歧化酶基因表达实验
[0107]
将上述人类纤维母细胞种入6孔培养盘，密度为每孔1.5
×
105个细胞，培养24小时使其贴附在培养盘后，更换新鲜的mem培养基。控制组于mem培养基添加溶剂，其中，实施例1以dmso作为溶剂，且实施例1的控制组添加如实施例1溶剂量相同的dmso量为对照－以培养基为基准的0.4％dmso。实验组则添加200μg/ml实施例1处理24小时。以pbs冲洗一次后，收集细胞并纯化rna，反转录出cdna后，进行实时定量聚合酶连锁反应(real-time pcr)，并以控制组的过氧化氢酶及超氧化物歧化酶基因表达量为基准，来换算经实施例1处理后的人类纤维母细胞中过氧化氢酶及超氧化物歧化酶的相对基因表达量；其中，本实验是分别以quick-rna
tm
miniprep kit纯化rna、以magic rt cdna synthesis kit反转录出cdna，并以kapa sybr fast qpcr master mix进行pcr，结果如表10所示。
[0108]
表10：经实施例1处理后的过氧化氢酶及超氧化物歧化酶相对基因表达量倍数
[0109]
组别浓度过氧化氢酶(倍)超氧化物歧化酶(倍)实施例1200μg/ml2.3
±
0.222.0
±
0.26
[0110]
从表10可知，实施例1的过氧化氢酶及超氧化物歧化酶相对基因表达量皆为控制组的2倍，表示实施例1确实可提升过氧化氢酶及超氧化物歧化酶基因的表达量，实施例1可增加人类纤维母细胞细胞抗氧化能力，抵御环境致病诱发因子，进而提升皮肤防御力。
[0111]
测试例7：抗皱的弹性蛋白生成基因(eln2)表达实验
[0112]
将上述人类纤维母细胞种入6孔培养盘，密度为每孔1.5
×
105个细胞，培养24小时使其贴附在培养盘后，更换新鲜的mem培养基。控制组于mem培养基添加溶剂，其中，实施例1以dmso作为溶剂，且实施例1的控制组添加如实施例1溶剂量相同的dmso量为对照－以培养基为基准的0.4％dmso。实验组则添加200μg/ml实施例1处理24小时。以pbs冲洗一次后，收集细胞并纯化rna，反转录出cdna后，进行实时定量聚合酶连锁反应，并以控制组的弹性蛋白原生成基因(eln2)表达量为基准，来换算经实施例1处理后的人类纤维母细胞中eln2的相对基因表达量；其中，本实验是分别以quick-rna
tm
miniprep kit纯化rna、以magic rt cdna synthesis kit反转录出cdna，并以kapa sybr fast qpcr master mix进行pcr，结果如表11所示。
[0113]
表11：实施例1弹性蛋白生成基因的相对基因表达量倍数
[0114]
组别浓度弹性蛋白生成基因(倍)实施例1200μg/ml1.8
±
0.26
[0115]
从表11可知，实施例1弹性蛋白原生成基因的相对基因表达量为控制组的1.8倍，表示实施例1确实可增加皮肤结构性蛋白，进而达到抗皱及提升皮肤防御力的功效。
[0116]
测试例8：抗皱的基质金属蛋白酶-1(mmp-1)蛋白实验
[0117]
(一)人类纤维母细胞的细胞毒性测试
[0118]
将培养于dmem培养基的人类纤维母细胞hs68(crl-1635
tm
)种入96孔培养盘，密度为每孔1
×
104个细胞，培养24小时使其贴附在培养盘。控制组于dmem培养基添加溶剂，其中，实施例1以dmso作为溶剂，且实施例1的控制组添加如实施例1溶剂量相同的dmso量为对照－以培养基为基准的0.2％dmso；比较例1和比较例2以水作为溶剂，且比较例的控制组亦添加如比较例1和比较例2各组溶剂量相同的水量为对照－以培养基为基准的10％水；实验组则加入20μg/ml的实施例1、1000μg/ml的比较例1和1000μg/ml的比较例2。培养24小时后加入500μg/ml的mtt溶液，并以37℃培养2小时后，去除mtt溶液，加入200μl dmso以溶解结晶，测量570nm的吸光值，并以控制组存活率作为基准，即存活率为100％，计算实验组的相对细胞存活率，结果如表12所示。
[0119]
从表12可知，实施例1于浓度为20μg/ml时，以及比较例1和比较例2于浓度为1000μg/ml时，皆具有高存活率。
[0120]
(二)人类纤维母细胞的mmp-1实验
[0121]
将上述人类纤维母细胞种入96孔培养盘，密度为每孔1
×
104个细胞，培养24小时使其贴附在培养盘后，更换新鲜的dmem培养基，再加入10ng/ml tnf-α。控制组于dmem培养基添加溶剂，其中，实施例1以dmso作为溶剂，且实施例1的控制组添加如实施例1溶剂量相同的dmso量为对照－以培养基为基准的0.2％dmso；比较例1和比较例2以水作为溶剂，且比较例的控制组亦添加如比较例1和比较例2各组溶剂量相同的水量为对照－以培养基为基准的10％水；实验组则加入20μg/ml的实施例1、1000μg/ml的比较例1和1000μg/ml的比较例2，等待18小时后，收集细胞培养液，并以免疫酶分析法(elisa)分析mmp-1含量。以控制组mmp-1含量作为基准，即mmp-1含量为100％，计算实验组的相对mmp-1含量，结果如表12所示。
[0122]
表12：实验组的相对细胞存活率与相对mmp-1含量结果
[0123][0124]
从表12可知，实施例1于浓度为20μg/ml时，即有mmp-1生成的抑制效果；反观比较例1和比较例2，即便采用50倍浓度仍无抑制效果，甚至提升mmp-1生成量。可知，实施例1可抑制皮肤结构蛋白的降解，进而达到抗皱及提升皮肤防御力的功效，且其抑制效果非来自于细胞毒性。
[0125]
测试例9：安全性分析
[0126]
(一)眼刺激性评估实验
[0127]
本实验通过重建人类角膜细胞(rhce)模型，依循oecd tg492规范进行测试，且所用套组是通过ecvam(the european reference laboratory for alternatives to animal testing)认证的epiocular
tm eye irritation test(ocl-200-eit)套组。
[0128]
本实验的阴性对照组添加水，阳性对照组添加醋酸甲酯(methyl acetate)，各实
验组则分别添加50mg的实施例1和比较例1，培养6小时后，更换新鲜培养液。再培养18小时后，加入1mg/ml mtt溶液反应3小时，并用异丙醇(isopropanol)溶解结晶，以量测570nm的吸光值。本实验以阴性对照组的吸光值为基准，即阴性对照组的吸光值为100％，其余组别的吸光值若低于60％，则判定为具有眼刺激性，结果如表13所示。
[0129]
表13：各组相对细胞存活率及眼刺激性判定结果
[0130]
组别相对细胞存活率(％)眼刺激性阳性对照组47.6％
±
4.17o实施例173.0％
±
1.20x比较例15.7％
±
0.33o
[0131]
从表13可知，实施例1与比较例1在相同添加量的情况下，实施例1并无眼刺激性，但比较例1出现眼刺激性，故实施例1的刺激性较低，使用上对人体较为安全。
[0132]
(二)皮肤刺激性评估实验
[0133]
本实验通过重建人类角质形成细胞(rhe)皮肤模型，依循oecd tg439规范进行测试，且所用套组是通过ecvam认证的in vitro epiderm
tm skin irritation test(epi-200-sit)套组。
[0134]
阴性对照组添加dpbs溶液，阳性对照组添加5％sds水溶液，实验组则分别添加25mg的实施例1和比较例1，培养1小时后，更换新鲜培养液。再培养42小时后，加入1mg/ml mtt溶液反应3小时，并用isopropanol溶解结晶，以量测570nm的吸光值。本实验以阴性对照组的吸光值为基准，即阴性对照组的吸光值为100％，其余组别的吸光值若低于50％，则判定为具有皮肤刺激性，结果如表14所示。
[0135]
表14：各组细胞相对存活率及皮肤刺激性判定结果
[0136]
组别相对细胞存活率(％)皮肤刺激性阳性对照组1.6
±
0.14o实施例198.0
±
0.30x比较例198.4
±
0.59x
[0137]
从表14可知，实施例1与比较例1在相同添加量的情况下，细胞存活率相近，且与阴性对照组的100％相近，故实施例1无皮肤刺激性，而适合外用。
[0138]
综上，本发明的植物去分化细胞萃取物不仅具有美白、抗氧化和抗皱三重美容功能，更兼具低皮肤、眼睛刺激性的优点。