一种通过化学偶联构建的靶向CD45的新型抗体药物的合成与应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种通过化学偶联构建的靶向cd45的新型抗体药物的合成与应用。

技术背景

cd45分子在所有的白细胞上都有表达，又称为白细胞共同抗原(leukocytecommonantigen,lca)。由于cd45是一种主要表达于免疫细胞表面的信号分子，且广泛的表达于t细胞、b细胞、粒细胞等免疫细胞，因此cd45成为了靶向免疫细胞的一个重要靶点。

抗体偶联药物(antibody-drugconjugate，adc)是采用特定的连接子将抗体和小分子细胞毒药物连接起来，其主要组成成分包括抗体、连接子和分子类细胞毒药物。其主要特点是将单克隆抗体药物的高特异性和细胞毒药的高活性相结合，用以提高药物的靶向性、减少毒副作用。和传统的完全或部分人源化抗体或抗体片段相比，adc具备能在肿瘤组织内精准释放高活性的细胞毒素，且不依赖抗体对靶点蛋白功能的阻断功能的优点。

血液病包括原发于血液系统的疾病和继发于其他疾病所致血液系统异常的疾病，在医学上血液病也是一种很“庞大”的疾病，它的病种很多，分类很广，主要分为四个大类：造血干细胞疾病、红细胞疾病、粒细胞疾病与出血性疾病,其中前三者可以通过骨髓移植来治疗。

骨髓移植分为两类：一类为异基因骨髓移植，一类为自体骨髓移植。异基因与自体骨髓移植各有优缺点。自体骨髓移植的最大缺点为复发率高，原因是自体骨髓中的基因缺陷并未得到修复。异基因骨髓移植需有与患者人类白细胞抗原(hla)相匹配的父母、子女、同胞以及极少数的无亲缘关系的供髓者所输入的异体骨髓。异基因骨髓移植受到诸多因素及时间影响，其成败的关键之一是hla(人类白细胞抗原)配型问题，如果骨髓供者与患者(受者)的hla不同，易发生轻重不等的移植物抗宿主病(gvhd)，甚至危及患者的生命。

靶向cd45抗体药物偶联物可用于清除病变或癌变免疫细胞，代替化疗药物，治疗血液系统疾病。与传统骨髓移植相比，具有四大优势：无需化疗、放疗即可清除受体原有免疫细胞，副作用低，减轻病人负担。靶向清除免疫系统能够避免移植物抗宿主病(gvhd),无需hla配对，使得骨髓赠体的范围大大增加，治疗白血病或淋巴瘤时，非hla配对的异基因骨髓移植可起到杀伤癌细胞作用。传统骨髓移植的感染的重要原因是化疗或者放疗会伤害其他活跃分裂细胞。其中包括肠道上皮细胞。肠道上皮细胞形成的物理屏障被破坏，肠道菌群转移，造成感染；以及赠体骨髓重新建立免疫细胞的空窗期时微生物入侵造成的感染。

靶向cd45抗体药物偶联物只针对免疫细胞，不会杀伤其他活跃分裂细胞。靶向清除免疫系统能够避免移植物抗宿主病(gvhd)，因此可同时移植大量的赠体成熟免疫细胞，快速建立免疫系统。从以上两个方面，靶向清除免疫系统避免感染的发生。但是目前市场上还缺乏有效的靶向cd45抗体药物偶联物。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明旨在提供一种通过化学偶联构建的靶向cd45的新型抗体药物，通过靶向cd45实现，用于清除正常、病变、癌变的免疫细胞，与car-t细胞、自体、异体骨髓移植联用，治疗血液系统疾病，并可通过car-t疗法、骨髓移植疗法治疗血液系统、免疫系统疾病，包括但不限于艾滋病。

为了达到上述目的，本发明提供了一种通过化学偶联构建的靶向cd45的新型抗体药物，所述抗体药物由靶向部分通过连接子与药物部分合成；所述靶向部分为能够与cd45特异性结合的抗体或其功能片段；所述连接子为可切割连接子或不可切割连接子；所述药物部分包括包括小分子药物、大分子毒素、生物活性肽、细胞裂解免疫活性蛋白、酶或者放射性核素。

进一步的，本发明提供靶向cd45抗体药物偶联物抗体序列，如seqidno.1所示。

进一步的，本发明提供了图1所示已构建完成的含有靶向cd45抗体基因的重组质粒ptrioz-higg1k-cd45。

进一步的，所述抗体由购自浙江美森细胞科技有限公司(货号：ctcc-zhyc-0208)的293t细胞所分泌。

进一步的，本发明提供了如seqidno.2所示的质粒ptrioz-higg1k-cd45的基因序列。

进一步的，本发明提供了用于偶联在本发明所述抗体上的药物，优先选择了细胞毒素mmae(monomethylauristatine)，其具有抑制细胞微管蛋白合成的作用，从而导致细胞死亡。

进一步的，本发明中使用的连接子可以通过本领域已知的任何方式与抗体连接，优选通过硫醇和/或氨基连接。在特定的优选实施方案中，本发明中用到的抗体通过硫醇与连接子连接。本发明中使用的连接子可以是可切割连接子(即，连接子可以在活体环境中断裂)或不可切割连接体。在一些实施例中，本发明的连接物选自可切割连接物，优选选自肽、腙和二硫化物连接物，例如马来酰亚胺丙基-缬氨酸-瓜氨酸-对氨基苯甲酰氧羰基(maleimidocaproyl-valine-citruline-p-amin-obenzyloxycarbonyl，以下简称mc-vc-pab或vc)。在其它实施方案中，本发明的连接子选自不可切割的连接体，例如马来酰亚胺丙基(maleimidocaproyl，以下简称mc)。

进一步的，本发明提供通式为ab-(l-u)n的抗体-药物结合物，其中ab代表根据本发明的抗体或其功能片段，l代表接头(例如mc-vc-pab或mc)，u代表治疗剂(例如，小分子药物：monomethylauristatine、maytansine、dolastatin、cemadotintasidotin、cryptophycin、eribulinmeslyat、(+)-cc-1065、adozelesin、carzelesin、bizelesin、kw-2189、sjg-136、vedotin、emtansine、ozogamicin、auristatins,taxolderivatives；大分子毒素：白喉毒素、假单胞菌外毒素、绿脓杆菌毒素、绿脓杆菌外毒素、菌外毒素)，n表示1-8的整数(例如，1、2、3、4、5、6、7或8)。本发明中使用的连接子可以是可切割连接体(即，连接子可以在体内断裂)或不可切割连接子。

进一步的，本发明提供一种药物组合物，其包括根据本发明中用到的抗体或其功能片段和/或根据本发明的结合物，以及药学上可接受的载体。

进一步的，本发明提供了一种辅助治疗血液病(特别帮助异基因骨髓移植患者避免产生移植物抗宿主病)的方法，其包括将根据本发明中用到的抗体、连接子、表达载体、结合物和/或药物组合物以治疗有效量给予需要它们的受试者

进一步的，本发明提供了根据本发明的抗体、表达载体、结合物和/或药物组合物在用于治疗或预癌症的药物的制造中的用途。

进一步的，本发明涉及一种可治疗癌症的抗体-药物结合物又称抗体偶联药物(adc)。该结合物包括能与癌细胞表面受体特异性结合的单克隆抗体、具有细胞毒作用的小分子药物以及能将上述两部分通过共价键结合在一起的接头。本发明还涉及这些结合物在治疗血液病的其他药物制造中的用途。

进一步的，本发明涉及的一种小分子细胞毒素是mmae(monomethylauristatine)，这是一种细胞微管蛋白抑制小分子。本发明涉一种连接体：maleimido-caproyl-valine-citrulline-p-aminobenzyloxy(以下简称mc-vc-pab，也简称为vc)(见图2)；该连接体是可切割的。该抗体药物结合物由靶向cd45抗体(简称cd45ab)通过半胱氨酸连接到接头上：cd45ab-vc-mmae(见图3)，该药物合成的certificateofanalysis(简称coa)如图4所示。

进一步的，本发明的结合物在体外具有与极高的抗原抗体结合能力。在细胞活力测定中，其具有明显的细胞毒性，其中实验使用的细胞包括表达cd45的人弥漫性组织淋巴瘤细胞株su-dhl-4和表达cd45的人白血病t细胞株jurkat细胞，除此之外，还有人巨核细胞白血病细胞株dami、白血病细胞株cem、淋巴瘤细胞raji、淋巴白血病细胞nalm-6、人淋巴瘤细胞daudi。毒性测试如图5所示，在su-dhl-4和jurkat上表现出明显的细胞毒性。

在一些具体实施例中，分离发现本发明的抗体或其功能片段。

在一些具体实施例中，发现本发明的抗体或其功能片段是单克隆抗体。

在一些具体实施例中，发现本发明的抗体或其功能片段是人源化抗体。

在一些具体实施例中，发现本发明的抗体或其功能片段具有adcc活性。

在一些具体实施例中，发现本发明的抗体或其功能片段具有cdc活性。

在一些具体实施例中，发现本发明的抗体或其功能片段特异性地与cd45结合。

在一些具体实施例中，发现本发明或其功能片段的抗体是igg1k抗体。

在一些具体实施例中，根据本发明的抗体或其功能片段可用于治疗或预防血液病，其中特别是针对血液病中的su-dhl-4及jurkat细胞具有很强的杀伤力。

综合上述方案，本发明提供了一种通过化学偶联构建的靶向cd45的新型抗体药物的合成与应用，至少有以下方面的有益效果：

本发明所述的靶向cd45的新型抗体药物可用于清除病变或癌变免疫细胞，代替化疗药物，治疗血液系统疾病；与传统骨髓移植相比，具有四大优势：

(1)无需化疗、放疗即可清除受体原有免疫细胞，副作用低，减轻病人负担；

(2)靶向清除免疫系统能够避免移植物抗宿主病(gvhd),无需hla配对，使得骨髓赠体的范围大大增加

(3)治疗白血病或淋巴瘤时，非hla配对的异基因骨髓移植可起到杀伤癌细胞作用

(4)肠道上皮细胞形成的物理屏障被破坏，肠道菌群转移，造成感染；以及赠体骨髓重新建立免疫细胞的空窗期时微生物入侵造成的感染。靶向cd45抗体药物偶联物只针对免疫细胞，不会杀伤其他活跃分裂细胞。靶向清除免疫系统能够避免移植物抗宿主病(gvhd)，因此可同时移植大量的赠体成熟免疫细胞，快速建立免疫系统。从以上两个方面，靶向清除免疫系统避免感染的发生。

附图说明

附图1:重组质粒ptrioz-higg1k-cd45，包含靶向cd45抗体基因；

附图2:maleimido-caproyl-valine-citrulline-p-aminobenzyloxy(简称mc-vc-pab，也简称为vc)的结构示意图；

附图3:adc药物cd45ab-vc-mmae结构示意图；

附图4:adc药物cd45ab-vc-mmae合成的分析(鉴定)证明书；

附图5:实施例5制备的抗体药物偶联物对su-dhl-4、jurkat、dami、cem、raji、nalm-6、daudi等七种细胞的毒性测试结果。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。

实施例1

cd45ab生产载体的构建：

商业公司合成如seqidno.3所示序列cd45ab轻链；

以合成产物为模板，利用序列如seqidno.4cd45ab-l-f-ncoi-ccatggcaatgatgtcctctgctcag所示的正向引物和序列如seqidno.5cd45ab-l-r-bsiwi-cgtacgtttgatttccagcttggtgc所示的反向引物进行pcr，扩增出序列如seqidno.6所示的基因片段cd45abl；

将pcr产物利用酶切位点ncoi、bsiwi克隆至载体空质粒ptrioz，得到生产载体ptrioz-l。

pcr反应体系如下：

pcr扩增条件为：

将目的基因片段cd45l克隆至载体ptrioz产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，分别切出目的条带并利用axyprepdnagelextractionkit(axygen)回收。纯化后的cd45ab和载体ptrioz分别经ncoi、bsiwi(neb)双酶切,载体ptrioz酶切时加入alkalinephosphatase(neb)。pcr酶切产物经axypreppcrclean-upkit(axygen)纯化回收，酶切的质粒载体经琼脂糖凝胶电泳分离后切出目的条带并利用axyprepdnagelextractionkit(axygen)回收。利用t4dnaligase(neb)将载体与目的片段连接，接着转化大肠杆菌dh5α，挑取单个菌落培养，提取质粒dna，经酶切初步鉴定后送商业公司测序。测序结果显示cd45abl插入成功并命名为中间ptrioz-cd45ab-l。

实施例2：

插入cd45ab重链，包括如下步骤：

商业公司合成如seqidno.7所示序列cd45ab重链；

以合成产物为模板，利用序列如seqidno.8cd45ab-h-f-ecorv所示的正向引物gatatcatgagcgtgctgattcttttgtggc和序列如seqidno.9cd45ab-h-r-nhei-gctagctactggtacttcgatgtctg所示的反向引物进行pcr，扩增出序列如seqidno.10所示的基因片段cd45abh；

pcr反应体系如下：

pcr扩增条件为：

将目的基因片段cd45h克隆至载体ptrioz-l：pcr产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，分别切出目的条带并利用axyprepdnagelextractionkit(axygen)回收。纯化后的cd45abh和载体ptrioz-l分别经ecorv、nhei(neb)双酶切,载体ptrioz-l酶切时加入alkalinephosphatase(neb)。pcr酶切产物经axypreppcrclean-upkit(axygen)纯化回收，酶切的质粒载体经琼脂糖凝胶电泳分离后切出目的条带并利用axyprepdnagelextractionkit(axygen)回收。利用t4dnaligase(neb)将载体与目的片段连接，接着转化大肠杆菌dh5α，挑取单个菌落培养，提取质粒dna，经酶切初步鉴定后送商业公司测序。测序结果显示cd45abh插入成功,并命名为生产载体ptrioz-higg1k-cd45，如图1所示。

实施例3

cd45ab的生产方法如下：

利用293t细胞生产靶向cd45抗体药物偶联物中的抗体部分即cd45ab。

(1)将293t细胞提前用六孔板铺板，待12-24h细胞密度达到70-90％时开始转染；

(2)取2000试剂9微升与150微升medium培养基混合；

(3)取载体ptrioz-higg1k-cd452.5微克与150微升medium培养基混合均匀；

(4)将步骤2和3获得培养基混合均匀，静置30分钟；

(5)将步骤4获得250微升培养基加入到293t细胞中并培养3天，3天后开始筛选。

(6)当步骤5中筛选出高表达的稳定细胞株之后，进一步扩培并开始生产并收取cd45ab。

实施例4

cd45ab的纯化方法如下：

(1)将30mlni-ntasuperflowresin700g离心2分钟，弃上清；

(2)加入60ml平衡液与ni-ntasuperflowresin混合均匀，700g离心2分钟，弃上清；

(3)将实施例2步骤5中获得细胞培养基300g离心5分钟，取上清加入上一步骤获得ni-ntasuperflowresin中，轻柔混合30分钟后700g离心2分钟，弃上清；

(4)使用60ml清洗液与ni-ntasuperflowresin混合均匀，700g离心2分钟，弃上清，并清洗3次；

(5)使用30ml洗脱液与ni-ntasuperflowresin混合均匀，轻柔混合10分钟后700g离心2分钟，取上清，上清中包含cd45ab；

(6)使用nanodrop测定cd45ab，并调整至2mg/ml；

实施例5

抗体药物的制备

单克隆抗体cd45ab与药物分子的偶联：

还原剂和保护剂用pbs缓冲液配制为：1～20mmol/l

tcep(tris-2-carboxyethyl-phosphine)，1～20mmol/ldtpa((diethylenetriaminepentacetateacid)原液，还原剂可按一定浓度范围添加，加入量视所需药物抗体比例而定，按一定浓度(如5～30mg/ml)与单克隆抗体一定体积比(如1：1)混合，其中tcep终浓度与抗体的摩尔比为0.5～6.0：1，并且在25℃条件下进行2小时的搅拌反应。dtnb法在412nm波长处检测游离巯基浓度，并根据抗体的摩尔比计算游离巯基的数目。与tcep的还原反应具有很好的重现性，还原后游离硫醇数可达1.0～8.0。

在用tcep还原后，抗体可以直接进行后续的偶联。药品(vc-mmae)(购自上海浩源化学快递有限公司)。用25％二甲基亚砜(dmso)溶解一定浓度(10mm)的药物，药物与硫醇的摩尔比为0.3～2.8：1，缓慢加入，在25℃下搅拌2h，dtnb法在412nm处检测游离硫醇浓度(接近于零)，sephadexg-25纯化除去残留的未反应药物和dmso等游离小分子，采用sds-page电泳、反相高效液相色谱(r-hplc)和疏水高效液相色谱(hic-hplc)方法确定偶联条件。

实施例6

cd45abadc对肿瘤细胞的抑制作用

将su-dhl-4、jurkat、dami、cem、raji、nalm-6、daudi等七种细胞中除jurkat外的六种用含1％的青霉素-链霉素双抗溶液(购自hyclone)和10％胎牛血清(购自gibco)的rpmi1640培养基(购自gibco)培养，jurkat用含blasticidinshcl(终浓度3ug/ml，购自hyclone)和10％胎牛血清(购自gibco)的rpmi1640培养基(购自gibco)培养，然后分别以10000个/孔的密度接种于96孔板中，37℃、5％co中孵育6h。6h后cd45ab-vc-mmae加入96孔板前，用相对应的培养基按梯度稀释后，按终浓度10-2、10-3、10-4、10-5、10-6以及一个空白对照0的梯度加入。在37℃、5％co中孵育72h后，用cck-8试剂盒(购自dojindo)进行检测，所得数据用prism软件进行统计分析。毒性测试如图5所示，在su-dhl-4和jurkat上表现出明显的细胞毒性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。

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<110>乾元康安（苏州）生物科技有限公司

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