熊果酸衍生物在制备预防或治疗心血管疾病药物中的应用

本发明涉及医药领域，具体涉及熊果酸衍生物在制备预防或治疗心血管疾病药物中的应用。

背景技术：

随着生活水平的提高和人口老龄化加剧，同时受社会、环境等因素影响，心血管疾病发病率逐年增加，已成为人类死亡率最高的疾病之一。在心肌梗死，缺血再灌注损伤等多种心血管疾病的发生发展过程中多伴有心肌细胞损伤，进而发生细胞凋亡等，引起心血管功能的紊乱。心肌缺血和氧化应激是心血管疾病产生的重要因素。

熊果酸又名乌索酸，是一类结构比较特殊的五环三萜类成分，存在于多种中草药，如山茱萸、女贞子和五味子等。现代药理研究发现，熊果酸具有抗肿瘤、抗氧化、抗炎、降糖、抗肝纤维化等作用。此外，近年来亦有许多关于熊果酸心脏保护作用的研究。在化学结构修饰方面，熊果酸的化学合成衍生物在抗肿瘤方面的研究较为丰富，化学结构修饰的位点主要为熊果酸3位的羟基和28位的羧基。但是，由于五环三萜类化合物结构的特殊性，母核缺乏活泼基团，反应位点少，采用常规化学反应方法难以获得母核上具有羟基、羰基等修饰的衍生物。因此，具有母核结构修饰的熊果酸衍生物化学和药理研究尚不全面。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种熊果酸衍生物或其药学上可接受的盐在制备预防或治疗心血管疾病药物中的应用，可用于制备治疗心肌细胞凋亡与心力衰竭、心肌缺血再灌注损伤等引起的心血管疾病药物。所述熊果酸衍生物为结构式为式ⅰ-ⅳ的化合物：

结构式为式ⅰ、式ⅱ、式ⅲ和式ⅳ的化合物为本发明首次公开的熊果酸新衍生物。

本发明还提供了上述应用中熊果酸衍生物的制备方法，包括如下步骤：

1)在培养基中发酵培养微生物，然后加入熊果酸进行转化培养，除去菌丝体后得到发酵液，所述微生物为蝇卷霉circinellamuscaecgmcc3.2695；所述熊果酸的加入量为每1ml培养基中加入2-5000μg的熊果酸。

2)将所述发酵液经乙酸乙酯溶剂萃取后，蒸干萃取液，得到转化粗提物；

3)将所述转化粗提物用反相高效液相色谱纯化，获得所述熊果酸衍生物；

其中，所述反相高效液相色谱的制备条件为：半制备用色谱柱ymcods-a，10.0i.d×250mm，体积比为45:55的乙腈-水溶液，流速2.5ml/min，检测波长203nm。

进一步的，所述心血管疾病包括心肌细胞凋亡、心力衰竭或心肌缺血再灌注损伤引起的心血管疾病。

进一步的，所述心血管疾病包括心肌梗死、冠状动脉粥样硬化性心脏病或慢性心力衰竭。

进一步的，所述药物还含有药学上可以接受的辅料。

进一步的，所述药学上可接受的辅料为稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体和润滑剂中的一种或几种。

与现有技术相比，本发明利用微生物转化技术，对熊果酸成功地进行了结构修饰，获得了一类新的熊果酸衍生物，通过体外心肌细胞损伤保护试验和心肌细胞缺血再灌注试验证实，这些化合物具有较好的心肌细胞保护活性，可以作为治疗心肌梗死、冠状动脉粥样硬化性心脏病、慢性心力衰竭药物的活性成分，具有广泛的用途。

附图说明

图1为本发明所述熊果酸衍生物的hplc液相色谱图。

具体实施方式

实施例1结构式为式ⅰ-式ⅳ的化合物的制备

本发明采用微生物转化方法，以熊果酸为原料，经过发酵、提取、分离等步骤，来制备本发明化合物。卷霉(circinella)属的菌株可以购自中国科学院微生物菌种保藏管理中心(cgmcc)，选用马铃薯培养基，于固体斜面培养基上置4℃冰箱内保存。

以蝇卷霉circinellamuscaecgmcc3.2695为例，制备结构式为式ⅰ-式ⅳ的化合物的过程如下：

1)发酵、转化以及萃取

将蝇卷霉circinellamuscaecgmcc3.2695接入2个250ml三角瓶(装有100ml马铃薯培养基)中，作为种子液。于摇床上160rpm、26℃下振荡培养1天后，待菌丝生长处于旺盛期，用无菌移液管吸取1ml的种子液，加入到20个1000ml摇瓶(装有400ml马铃薯培养基)中。振荡培养1天后，每个摇瓶中加入25mg熊果酸(0.2ml，125mg/mldmso溶液)，共用500mg底物。相同条件下继续转化5天，将发酵液过滤，滤除菌丝体，滤液用等体积的乙酸乙酯萃取3次，萃取液减压浓缩至干，得到转化物粗提物约0.83g。

2)反相高效液相色谱纯化

合并组分用反相高效液相色谱纯化。制备条件为半制备用色谱柱ymcodsa-5μm，10.0×250mm，乙腈-水(45:55，v/v)，流速2.5ml/min，检测波长203nm。得到结构式为式ⅰ-式ⅳ的4个转化产物，其¹³c-nmr数据如表1所示。

表1.化合物ⅰ、化合物ⅱ、化合物ⅲ和化合物ⅳ的碳谱数据(氘代吡啶)

以上结果表明，所得化合物结构正确。

实施例2化合物ⅰ-ⅳ对由过氧化氢损伤的心肌细胞保护活性

(1)实验材料

co2培养箱(jouanigo150)；酶标仪(bio-tekelx800)；荧光倒置显微镜(olympusix51)；mtt细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)、dmem高糖培养基(gibcolbrl)，胎牛血清、二甲基亚砜(dmso)、胰蛋白酶(上海生物工程有限公司)、30％的过氧化氢(h2o2)(天津市瑞金特化学品有限公司)、h9c2细胞(中国医学科学院肿瘤研究所)。

(2)实验方法

采用mtt法测定各受试化合物对h2o2损伤的h9c2细胞活性的影响：用胰酶消化后进行细胞计数，调整细胞悬液的细胞密度至5×10⁴个/ml，于96孔培养板中每孔加入200μl，置于5％co2，37℃恒温co2培养箱中培养12h。待细胞贴壁后分组处理：对照组、模型组(h2o2400μmol/l损伤4h)、模型+受试化合物(1、10、20μm)组。每孔终体积均为200μl，每个浓度设3个平行。药物处理24h后，于各孔内加入mtt溶液10μl(5mg/ml，即0.5％mtt)，继续培养4h。酶标仪490nm处测量各孔的吸光值，计算细胞存活率：细胞存活率＝加药组od值/对照组od值。

(3)实验结果

根据mtt法测试结果，计算熊果酸衍生物ⅰ-ⅳ对h2o2损伤的h9c2细胞存活率的结果如表2所示。

表2测试化合物对h2o2损伤的h9c2细胞存活率的影响

(与对照组相比较，^#p＜0.05；与模型组相比较，^*p＜0.05，^**p＜0.01)

与对照组比较，h2o2处理组的细胞存活率显著降低，说明细胞造模成功。与h2o2处理组比较，熊果酸衍生物ⅰ-ⅳ均能显著提高细胞的生存率，表明熊果酸衍生物ⅰ-ⅳ具有显著的心肌细胞保护作用，且在一定的剂量范围内呈现良好的剂量依赖关系，可以作为治疗心肌梗死、冠状动脉粥样硬化性心脏病、慢性心力衰竭药物的活性成分。

实施例3本发明化合物ⅰ-ⅳ对心肌细胞缺血再灌注损伤保护作用

1)实验材料

co2培养箱(jouanigo150)；酶标仪(bio-tekelx800)；荧光倒置显微镜(olympusix51)；mtt细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒(碧云天生物技术研究所)、dmem高糖培养基(gibcolbrl)，胎牛血清、二甲基亚砜(dmso)、胰蛋白酶(上海生物工程有限公司)、h9c2细胞(中国医学科学院肿瘤研究所)。

测试样品：熊果酸及实施例1所合成得到的化合物ⅰ–ⅳ，纯度在95％以上，各化合物均以dmso溶解后稀释。

2)实验方法

取对数生长期的h9c2细胞，用含10％小牛血清及1％青霉素-链霉素双抗液的dmem培养液，调整细胞浓度为5×10⁴个/ml，接种于96孔培养板，约24h后更换新无糖、无血清鲜培养液，并加入化合物，放入无氧工作站内缺氧损伤1h，取出后加入糖和血清再灌24h，24h后用mtt染色法检测各孔细胞成活率。

3)实验结果

根据mtt法测试结果，计算熊果酸衍生物ⅰ-ⅳ对缺血再灌注损伤的h9c2细胞存活率的影响结果如表3所示。

表3测试样品对缺血再灌注损伤的h9c2细胞存活率的影响

(与对照组相比较，^#p＜0.05；与模型组相比较，^*p＜0.05，^**p＜0.01)

结果表明，与模型组比较不同浓度的化合物ⅰ–ⅳ处理后均可明显升高心肌细胞存活率，表明本发明的化合物ⅰ–ⅳ可有效保护缺氧/复氧对h9c2心肌细胞的损伤，且具有一定的剂量依赖性，可以作为治疗心肌梗死、冠状动脉粥样硬化性心脏病、慢性心力衰竭药物的活性成分。

本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。