一种负载两性霉素B与β-1，3-葡聚糖酶的双靶向复合纳米体系及其制备方法、应用

本发明属于纳米药物技术领域，具体涉及一种负载两性霉素b与β-1，3-葡聚糖酶的双靶向复合纳米体系及其制备方法、应用。

背景技术：

白色念珠菌是主要的食源性致病菌之一,引发的相关食物安全事件频有发生，甚至可导致病人死亡。据统计，侵袭性念珠菌病已成为真菌相关疾病死亡率的主要原因，其死亡率超过70%。生物膜是白色念珠菌主要存在形式，即真菌细胞粘附于接触表面，自身产生大量胞外基质（主要为多糖），将其自身包绕其中而形成的微生物聚集结构。胞外基质不仅参与生物膜结构形成，而且保护内部的微生物免受外界恶劣环境影响，显著提高其耐药性，可达1000倍以上。而采用高浓度的化学抗菌药物治疗，不但不能有效去除生物膜，同时还提高了严重副作用的风险，导致耐药菌甚至超级细菌的产生和严重感染。另外，临床的抗真菌药物相对细菌来说，选择也十分有限。因此，如何通过绿色环保的方式，来有效解决白色念珠菌的生物膜相关感染问题是食品安全领域遇到的巨大挑战。

白色念珠菌生物膜胞外基质的主要成分是多糖，包括α-1，6-甘露聚糖、β-1，6-葡聚糖和β-1，3-葡聚糖，这些成分保证生物膜结构的稳定性，并作为渗透性屏障隔离抗真菌药物，从而保护生物膜内的真菌细胞。因此，多糖降解酶的开发利用成为一种新型的抗生物膜方向：酶通过降解生物膜胞外基质中的多糖成分，从而对生物膜结构进行破坏，不仅可以抑制微生物粘附、减少生物膜形成，而且对已形成生物膜也具有破坏作用，从而可以释放出内部包埋的微生物细胞。针对细菌生物膜的多糖降解酶研究已经有一些报道，比如用于处理细菌生物膜的多糖降解酶dspb与alginate等。但大多数工作仅关注单一细菌生物膜，而对白色念珠菌生物膜的研究极其罕见。目前，过量化学药物（抗生素）的使用，导致耐药菌甚至超级细菌的感染等也成为了亟待解决的问题。

技术实现要素：

针对现有技术中存在问题，本发明提供了一种负载两性霉素b与β-1，3-葡聚糖酶的双靶向复合纳米体系。

本发明还提供了一种负载两性霉素b与β-1，3-葡聚糖酶的双靶向复合纳米体系的制备方法。

本发明还提供了上述负载两性霉素b与β-1，3-葡聚糖酶的双靶向复合纳米体系的应用。

本发明为了实现上述目的所采用的技术方案为：

本发明提供了一种负载两性霉素b与β-1，3-葡聚糖酶的双靶向复合纳米体系，所述纳米体系由壳聚糖纳米粒负载gls和ampb。

本发明还提供了一种双靶向复合纳米体系的制备方法，包括以下步骤：

（1）采用聚阴离子三磷酸钠通过离子凝胶化法制备壳聚糖纳米粒csnp；

（2）负载gls壳聚糖纳米粒csnp-gls的制备：同时将csnp和gls加入pbs缓冲液中，4℃搅拌12h，然后np悬浮液离心并最终冷冻干燥；

（3）负载gls和ampb的壳聚糖纳米粒csnp-ampb-gls：将csnp-gls悬浮液与ampb二甲基亚砜溶液混合并搅拌24小时，将混合物离心并冻干即可。

本发明所使用的壳聚糖纳米粒csnp具体通过以下方法制备而成：将tpp溶于蒸馏水中，得5mg/ml的tpp溶液；将壳聚糖溶于1%体积浓度的乙酸溶液中，得5mg/ml的壳聚糖溶液；将tpp溶液滴加到壳聚糖溶液中，然后将混合物搅拌2h，离心即可。

进一步的，所述壳聚糖和tpp的质量比为4∶1。

进一步的，步骤（2）中，所述csnp在pbs缓冲液中的浓度为1毫克/毫升；所述gls在pbs缓冲液中的浓度为100微克/毫升。

进一步的，步骤（2）中，所述离心的转速为14000转/分钟，时间为30分钟。

进一步的，步骤（3）中，所述csnp-gls悬浮液的浓度为1毫克/毫升，溶剂为pbs缓冲液；所述ampb二甲基亚砜溶液的浓度为100微克/毫升；所述csnp-gls悬浮液和ampb二甲基亚砜溶液的体积比为1:1。

本发明还提供了一种双靶向复合纳米体系在对真菌生物膜的破坏清除中的应用。

本发明提供的新的抗生物膜具有双靶向性:(1)通过降解基质成分，尤其是多糖成分，破坏生物膜胞外基质，彻底瓦解生物膜结构，并将其内部包埋的菌体细胞释放出来，恢复其对药物的敏感型；(2)以较少的副作用有效地杀死生物膜当中的真菌细胞，抑制生物膜的再次形成。因此，联合使用多糖降解酶与抗真菌药物，可以实现对生物膜的双靶向效果。从而避免了过量化学药物（抗生素）的使用，解决耐药菌甚至超级细菌的感染问题。

本发明的有益效果为：

（1）本发明首次构建了β-1，3-葡聚糖酶修饰的壳聚糖纳米粒，可以实现对真菌生物膜胞外多糖β-1，3-葡聚糖与内部菌体双靶向的纳米体系，同时，β-1，3-葡聚糖酶同两性霉素b具有协同增效作用，提高了清除能力。

（2）本发明首次采用双负载的纳米体系对真菌生物膜的破坏清除。

附图说明

图1为实施例1制备的csnp-ampb-gls的扫描电镜图。

图2为ampb从nps中的释放曲线图。

图3为实施例1制备的纳米粒子对生物膜的渗透的共聚焦激光扫描显微镜图。

图4为实施例1制备的纳米粒子对成熟生物膜的破坏清除作用图。

图5为生物膜的细胞活力图。

图6为生物膜结构变化的扫描电镜图。

图7为实施例1制备的csnp-ampb-gls对临床分离菌的活性图。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明的技术方案作进一步的解释和说明。

1、材料和方法

1.1菌株、培养基和试剂

菌株：白色念珠菌day185，维也纳医科大学获得3株白色念珠菌临床分离株，命名为白色念珠菌bf1、bf2和bf3。

培养基：酵母蛋白胨葡萄糖培养基(ypd)，rpmi1640培养基。

其它试剂：β-1，3-葡聚糖酶(gls)(≥2000单位/mg蛋白)，壳聚糖(低分子量，脱乙酰度75-85%)，两性霉素b（ampb）等试剂均购自sigma-aldrich。

实施例1

（1）采用聚阴离子三磷酸钠(tpp)通过离子凝胶化法制备壳聚糖纳米粒（csnp）:溶于蒸馏水的tpp(5毫克/毫升)滴加到壳聚糖溶液(5毫克/毫升，溶于1%(体积/体积)乙酸，10毫升)中，质量比cs∶tpp=4∶1，将混合物搅拌2小时；最后，通过14，000转/分钟离心30分钟获得纳米粒。

（2）负载gls壳聚糖纳米粒（csnp-gls）的制备，同时混合csnp(1毫克/毫升pbs)和gls(100微克/毫升pbs)，4℃搅拌过夜。然后np悬浮液离心(14000转/分钟，30分钟)并最终冷冻干燥。

（3）负载gls和ampb的壳聚糖纳米粒（csnp-ampb-gls），将csnp-gls悬浮液(1毫克/毫升)与ampb(100微克/毫升二甲基亚砜)混合并搅拌24小时，将混合物离心并冻干。

（一）纳米粒子的表征

通过动态光散射(dls)分析纳米粒子的尺寸，用激光多普勒测速仪测定ζ电位，扫描电镜证实其形态特征。使用酵母悬浮液作为底物来评估含有nps的gls活性。通过分光光度法测量405纳米处的吸收来计算装纳米粒子上ampb的载药量（lc），并根据下式计算:lc=(a-b)/c(a=ampb总量；b=未负载的ampb含量；c=nps重量)。

（二）体外释放

体外释放动力学如下进行：将4毫升csnp-ampb-gls溶液(1毫克/毫升)放置于透析袋，在搅拌下(100转/分)置于40毫升pbs中。给定时间点取4毫升的pbs，用4毫升新鲜的pbs代替。通过紫外分光光度法在405纳米处测量溶液中ampb的量。

（三）最低抑菌浓度测定

将100μl白色念珠菌(1×10⁶cfu/毫升)加入到含有不同浓度的游离ampb和csnp-ampb-gls(2，1，0.5，0.25，0.125，0.0625或0μg/毫升)的96孔板中。微孔板以150转/分的速度在37℃孵育24小时。最低抑菌浓度被定义为检测不到可见生长的最低ampb浓度。

（四）生物膜的生长

在96孔板上形成生物膜，将白色念珠菌稀释至1×10⁶cfu/毫升，并在37℃孵育24小时，不摇动。

（五）纳米粒子对生物膜的渗透

用异硫氰酸罗丹明b标记csnp(csnp-rbitc)。白色念珠菌在医用级硅胶上形成生物膜，与100微克/毫升的csnp-rbitc混合2小时，并用pbs洗涤。通过共聚焦激光扫描显微镜(clsm)测定纳米粒子的穿透性。

（六）纳米粒子对成熟生物膜的影响

白色念珠菌如上所述形成24小时成熟生物膜，并加入含有不同浓度的游离ampb、游离ampb和gls组合(2μg/ml)、csnp-ampb和csnp-ampb-gls。24小时后，用pbs洗涤生物膜，并用cck-8还原试验定量。

（七）医用硅胶表面生物膜的影响

如上所述，用游离ampb和nps处理硅胶上的生物膜。通过扫描电子显微镜研究生物膜结构。用clsm观察生物膜的生存力，用活/死菌染色试剂盒染色。

（八）对临床分离菌的活性

检测了游离ampb和nps(2μg/ml)对几种临床分离菌的抗生物膜作用。

2、结果

2.1纳米粒子的表征

扫描电镜图像显示，csnp-ampb-gls为圆形颗粒(图1)。csnp-ampb-gls平均粒径为174.47±5.12纳米，表面ζ电位为+15.84±1.41毫伏。载药量为3.05±0.13%。装载在纳米颗粒上的gls保留了活性，其活性为128.6±4.54u/mg纳米颗粒。

2.2体外释放研究

图2显示了ampb从nps中的释放曲线。csnp-ampb-gls在第一个1小时内出现了初始爆发释放阶段:总ampb的52.5%被释放。过了这个时期，药物释放变慢。24小时后，csnp-ampb-gls持续释放总ampb的80.6%。

2.3最低抑制浓度测定

表1显示了游离ampb和csnp-ampb-gls对浮游念珠菌的最低抑菌浓度测定。游离ampb和nps对实验菌株和临床分离株的生长都有效，显示出相同的最低抑菌浓度。这一结果表明，在csnp上负载ampb不会改变ampb对浮游念珠菌的抗真菌活性。

表1

2.4纳米粒子对生物膜的渗透

用纳米粒子处理2小时后，可以在生物膜的表面和内部观察到纳米粒子(红色)，这意味着纳米粒子可以附着并渗透到生物膜中(图3)。带正电荷的纳米粒子可以与带负电荷的细菌生物膜基质的成分结合。此外，壳聚糖具有穿透生物膜的能力。在这里，csnp被证明能够穿透念珠菌生物膜，这可以促进药物对生物膜内部的作用效果。

2.5抗生物膜活性

由于生物膜对抗菌剂的高抗性，我们使用4倍mic来评估对成熟生物膜的作用活性(图4)。正如所料，与浮游形式相比，生物膜中的念珠菌增加了对游离ampb或不含gls的nps的抗性。然而，ampb+gls和csnp-ampb-gls显示出良好的生物膜破坏作用。此外，csnp-ampb-gls在测试的任何浓度下都表现出最高的清除预制生物膜的活性。当ampb浓度为4μg/ml时，ampb+gls使生物膜减少83.1%，而csnp-ampb-gls使生物膜减少90.9%。

在已形成的生物膜上，我们的结果显示了纳米体系比游离ampb(有或没有gls)具有更好的抗生物膜活性，这表明了nps用于生物膜处理的优越性。纳米粒子可以保护负载的抗菌剂免受生物膜基质对药物的隔离作用。此外，纳米粒子可以将药物输送到生物膜基质内部，并直接靶向生物膜中的微生物细胞，从而最大限度地提高治疗效果。ampb+gls和csnp-ampb-gls显示出比游离ampb和csnp-ampb更好的抗生物膜活性，这表明gls的协同作用。β-1，3-葡聚糖的降解导致生物膜基质的破坏，进而提高了ampb的效率。这一结果也与我们以前的工作相一致。此外，csnp-ampb-gls显示出最高的抗菌膜活性，这意味着同时携带gls和ampb的csnps可以更好地杀死真菌细胞。这可归因于gls可分解生物膜结构，有利于带正电荷的nps的迁移，并结合带负电荷的生物膜成分，从而提供高局部ampb的浓度以增强抗生物膜活性。

2.6纳米粒子对硅胶生物膜的作用

用clsm观察了硅胶上生物膜的细胞活力(图5)。在没有任何处理的情况下观察到大量绿色(活细胞)(图5a)，这表明成熟生物膜主要由活细胞组成。用游离ampb和csnp-ampb处理后，绿色(活细胞)显著减少(图5b和5c)。与游离ampb处理相比，结合gls，显示出更多的红色(死细胞)和更少的生物膜厚度(图5d和e)。

扫描电镜图像证实了上述结果，并揭示了生物膜结构的变化(图6)。在对照组中，我们可以看到生物膜的典型致密组成(图6a)。但是用游离ampb和csnp-ampb治疗显著减少了菌落定植(图6b和c)。此外，ampb+gls和csnp-ampb-gls仅在硅胶上产生单细胞，甚至没有细胞(图6d和e)，这意味着生物膜的结构随着念珠菌细胞的杀死而被破坏。

2.7对临床分离菌的活性

如图7所示，所有临床分离株形成的生物膜都减少了。csnp-ampb-gls也显示出最佳的抗菌膜活性，其减少了临床分离株的74.5%、85.2%和59.5%的生物膜。