一种改性生物瓣膜材料的制备方法和改性生物瓣膜材料与流程

1.本发明涉及生物医疗技术领域，特别是涉及一种改性生物瓣膜材料的制备方法和改性生物瓣膜材料。


背景技术：

2.目前，风湿性病变、退行性改变、先天畸形、心内膜炎感染等都会引起心脏瓣膜疾病，当瓣膜发生比较严重的器质性病变时，则需要进行瓣膜置换。瓣膜置换通常采取外科手术置换的方式，需要进行开胸手术，建立体外循环。而近年来，随着介入手术的发展，经导管瓣膜置换术已经成为基础疾病较多、不能耐受开胸手术的患者的有效治疗方案。
3.用于置换手术的人工瓣膜假体分为机械瓣和生物瓣，无论应用哪种类型的人工瓣膜进行置换，都有可能导致凝血系统激活，在瓣膜局部形成血栓。外科手术中，采用机械瓣的患者需终身服用抗凝药物，而采用生物瓣的患者往往也需抗凝治疗数月。介入手术中所采用的瓣膜假体大多为生物瓣膜，在应用最为广泛的经导管主动脉瓣置换术中，有研究表明，与外科瓣膜置换相比，经导管主动脉瓣置换术后亚临床小叶血栓的发生率更高。患者在经导管主动脉置换术后，通常需要终身服用阿司匹林以减少血栓栓塞的发生。2017年美国心脏病学会和美国心脏协会发布的《心脏瓣膜病管理指南》建议，对于经导管主动脉瓣置换术后低出血风险的患者，可以考虑至少3个月的抗凝药物治疗。而长时间的口服药物抗栓，尽管降低瓣膜血栓的发生率，但也可能提高出血风险。因此，使人工瓣膜具备良好的抗凝血性能，提高瓣膜的血液相容性，对于减少瓣膜置换手术后血栓的发生率、降低患者药物服用的频率或使患者免于服用药物，有着重要意义。
4.目前已有一些关于生物瓣膜材料的抗凝改性技术的公开。如在心包膜表面通过层层叠加的方式，第一层采用疏水的低粘度预聚物和疏水改性的无机纳米粒子在瓣膜表面和内部形成疏水网络基础骨架，第二至五层采用高粘度预聚物和无机纳米粒子形成混合交联膜层，构建稳定的疏水网络结构。改性后的疏水瓣膜具有明显的抗粘附特性，能够降低血小板的粘附数量，从而达到抗凝和抗血栓的目的。但是上述方法所使用的心包膜需要在60-100℃的条件下进行数小时的预处理，而长时间置于高温环境下可能会对瓣膜结构性能产生影响，同时瓣膜改性处理中所采用的无机纳米粒子在体内的长期生物安全性尚有争议。
5.为了制备抗凝血涂层，将材料先浸入全氟磺酸树脂溶液中，使其具有磺酸基，再浸入多氨基化合物溶液中，在材料表面修饰氨基伸长链，最后浸入肝素溶液，使肝素与材料表面氨基反应，制备肝素抗凝涂层。但是，在医用材料表面修饰氨基后，在未添加缩合剂的情况下，直接与肝素进行反应，此时肝素表面官能团未被活化，反应效率低；并且材料表面氨基与肝素表面基团发生了多重共价结合，会造成肝素构型和分子构象发生改变，影响肝素活性，从而影响材料的抗凝血效果。
6.另外还有人报道了在基底材料上通过共价结合反应修饰一层阳离子聚合物涂层，再将材料浸泡于肝素溶液当中，肝素属于阴离子聚合物，可以与阳离子聚合物发生静电相互作用，通过静电吸附的方式从而在材料表面形成抗凝血涂层的方法。但是，静电吸附结合
力较弱，抗凝血材料表面的肝素容易释放，无法使抗凝血材料具有长期稳定的抗凝效果。
7.除了改性瓣膜材料，有文献还公开了一种基材，其含有具有抗凝血活性的化合物和亲水性高分子化合物，并且具有抗凝血活性的化合物含有抗凝血活性部分和高分子链部分。其制造方法为：在使具有抗凝血活性的化合物和亲水性高分子化合物与基材接触的状态下照射放射线，然后洗涤未反应的化合物。上述采用放射线照射的改性方法会对基材性能产生影响，当基材为一些动物源性的生物材料时，高剂量的放射线照射甚至会使材料原本的结构和成分发生改变，因此该方法并不适用于人工生物瓣膜材料的改性。


技术实现要素：

8.本发明主要解决的技术问题是提供一种生物瓣膜材料的改性方法和改性生物瓣膜材料，能够同时提高生物瓣膜材料的亲水性和抗凝活性。
9.为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种改性生物瓣膜材料的制备方法，该方法包括：提供修饰生物瓣膜材料和末端醛基化肝素，修饰生物瓣膜材料包括生物瓣膜材料及与生物瓣膜材料连接的亲水性聚合物链段，亲水性聚合物链段的末端具有氨基，使修饰生物瓣膜材料与末端醛基化肝素进行还原胺化反应，得到改性生物瓣膜材料。上述改性生物瓣膜材料兼具亲水性和抗凝血活性。本发明中，“末端醛基化肝素”指的是末端具有醛基的肝素。
10.其中，使修饰生物瓣膜材料与末端醛基化肝素进行还原胺化反应包括：将修饰生物瓣膜材料置于含末端醛基化肝素和还原剂的混合溶液中，于20～40℃反应1～24小时。优选的，反应温度为36～38℃，反应时间为12～18小时。通过末端醛基化肝素与末端具有氨基的亲水性聚合物反应，使肝素连接于生物瓣膜材料上，反应过程中，末端醛基化肝素只有末端的醛基与氨基基团发生反应，肝素分子的其他部分不参与化学反应，能够使肝素天然构象和生物活性得以保留。
11.其中，混合溶液中，末端醛基化肝素的浓度为0.1～3wt％(优选为0.3～1)；还原剂包括硼氢化钠和/或氰基硼氢化钠；还原剂在所述混合溶液中的浓度为0.001～1wt％(优选为0.05～0.1)；混合溶液的ph为2～8(优选为3～7)。
12.其中，末端醛基化肝素的制备方法包括：提供肝素钠水溶液；向肝素钠水溶液中加入亚硝酸盐，得到反应液，使肝素钠在亚硝酸的作用下发生重氮化反应，在释放氮气的同时糖苷键断裂，缩环生成末端醛基化肝素溶液。
13.进一步地，将修饰生物瓣膜材料与末端醛基化肝素反应时，每1cm2的修饰生物瓣膜材料与1ml的上述末端醛基化肝素溶液反应。
14.其中，肝素钠水溶液的浓度为0.1～3wt％(优选为0.3～1)；亚硝酸盐包括亚硝酸钠和/或亚硝酸钾；亚硝酸盐在反应液中的浓度为0.001～1wt％；和/或反应液的ph为2～4，重氮化反应温度为-5～30℃，重氮化反应时间为0.1～24小时。
15.其中，发生重氮化反应之后，还包括如下步骤：调节反应后的混合液的ph至7～8；采用截留分子量为1000-3500(优选为1000～2000)的透析膜，对反应后的混合液进行透析处理，得到透析液；对透析液进行冷冻干燥处理，得到末端醛基化肝素。
16.其中，提供修饰生物瓣膜材料包括：将生物瓣膜材料置于亲水性聚合物的溶液中；其中，生物瓣膜材料的表面具有多个羧基，亲水性聚合物的两末端具有氨基；使亲水性聚合
物与生物瓣膜材料进行共价反应，得到修饰生物瓣膜材料。
17.以上反应过程中，亲水性聚合物的两末端具有氨基，由于亲水性聚合物链段较长所带来的位阻的影响，其一端的氨基会容易与生物瓣膜材料进行共价反应，另一端氨基不易与生物瓣膜材料反应，导致亲水性聚合物在连接至生物瓣膜材料后，另一端的氨基得以保留，以便其后期与末端醛基化肝素反应。
18.其中，亲水性聚合物的溶液的ph为3～7(优选为5～6)；和/或亲水性聚合物的溶液的浓度为10～50wt％(优选为30～40wt％)；和/或亲水性聚合物的溶液中还包括偶联剂，偶联剂包括n-(3-二甲基氨基丙基)-n'-乙基碳二亚胺盐酸盐和/或n-羟基琥珀酰亚胺；和/或偶联剂在亲水性聚合物的溶液中的浓度为0.1～10wt％；和/或共价反应的反应温度为20～37℃(优选为35～37℃)，反应时间为0.1～24小时(优选为2～5小时)。偶联剂的作用是活化生物瓣膜材料表面的羧基，使亲水性聚合物与生物瓣膜材料的共价反应便于进行。
19.其中，亲水性聚合物包括分子量为500-5000的双端氨基聚乙二醇；亲水性聚合物的溶液为亲水性聚合物的缓冲液，所用缓冲液包括2-(n-吗啉代)乙烷磺酸缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中的一种或多种。优选地，双端氨基聚乙二醇的分子量为500～2000。
20.为解决上述技术问题，本发明采用的另一个技术方案是：提供一种改性生物瓣膜材料，该改性生物瓣膜材料包括生物瓣膜材料及与生物瓣膜材料连接的改性修饰结构；改性修饰结构包括亲水性聚合物链段和与亲水性聚合物链段共价连接的肝素；肝素与亲水性聚合物链段以碳氮单键键合。优选地，生物瓣膜材料与改性修饰结构中的亲水性聚合物通过共价键连接。
21.上述改性生物瓣膜材料中，亲水性聚合物链段一方面作为连接分子，以共价键连接肝素，使得具有抗凝血活性的肝素共价修饰于生物瓣膜材料的表面，赋予生物瓣膜材料以稳定的抗凝血活性；另一方面，亲水性聚合物链段具有良好的亲水性和生物相容性，将其共价连接至生物瓣膜材料中，以赋予生物瓣膜材料相应的亲水性，同时亲水性的提高也有利于生物瓣膜材料抗血液成分吸附能力的提高；第三，亲水性聚合物链段的引入，在肝素和生物瓣膜材料之间形成间隔层，有利于肝素活性保留。
22.其中，亲水性聚合物链段包括聚乙二醇链段，聚乙二醇链段的分子量为500-5000。
23.其中，肝素的分子量为100000以上，优选为150000～180000。
24.本发明的有益效果是：区别于现有技术，本发明提供一种改性生物瓣膜材料的制备方法和改性生物瓣膜材料，该方法包括：提供修饰生物瓣膜材料和末端醛基化肝素，修饰生物瓣膜材料包括生物瓣膜材料及与生物瓣膜材料连接的亲水性聚合物链段，亲水性聚合物链段的末端具有氨基，亲水性聚合物链段作为连接分子连接肝素和生物瓣膜材料。亲水性聚合物链段以共价结合的方式固定在生物瓣膜材料上，改善了材料亲水性的同时也提高了材料抗非特异性蛋白质吸附的能力，避免血小板在材料表面的粘附、聚集和激活而导致的血栓形成；而肝素通过终点固定的方式与亲水性聚合物链段共价结合。通过这种设置，使得改性生物瓣膜材料具备抗凝活性，且本发明的方法反应条件相对温和，对瓣膜材料性能没有明显影响，由于末端醛基化肝素只有末端基团发生反应，能够使肝素的天然构象和生物活性得以保留。
25.本发明制备的改性生物瓣膜材料具有良好亲水性和优异的抗凝活性，在凝血测试
中呈现出优异的抗凝效果，从而降低瓣膜置换术后瓣膜血栓的发生率。
附图说明
26.图1是本发明提供的改性生物瓣膜材料的抗凝血性能测试结果。
具体实施方式
27.为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下参照附图并举实施例对本发明进一步详细说明。
28.本发明提供一种改性生物瓣膜材料的制备方法和改性生物瓣膜材料，该方法包括：提供修饰生物瓣膜材料和末端醛基化肝素，修饰生物瓣膜材料包括生物瓣膜材料及与生物瓣膜材料连接的亲水性聚合物链段，亲水性聚合物链段的末端具有氨基，亲水性聚合物链段作为连接分子连接肝素和生物瓣膜材料，末端醛基化肝素与亲水性聚合物发生还原胺化反应，生成稳定的碳氮单键，从而使得改性生物瓣膜材料具备稳定的抗凝活性。而且由于末端醛基化肝素只有末端基团发生反应，能够使其天然构象和生物活性得以保留。
29.该实施例中，生物瓣膜材料的改性方法包括如下步骤，需注意的是，若有实质上相同的结果，本实施例并不以下述步骤顺序为限。
30.s110：提供修饰生物瓣膜材料和末端醛基化肝素。
31.其中，修饰生物瓣膜材料包括生物瓣膜材料及与生物瓣膜材料连接的亲水性聚合物链段，亲水性聚合物链段的末端具有氨基，末端醛基化肝素的末端具有醛基，能够使末端醛基化肝素末端的醛基与亲水性聚合物链段末端的氨基共价结合，使得末端醛基化肝素固定结合在生物瓣膜材料上。
32.肝素具有激活血液中的抗凝血酶和加速血液中的凝血酶的失活，进而阻断凝血进程的作用，将末端醛基化肝素连接到修饰生物瓣膜材料上，能够提高修饰生物瓣膜材料的抗凝活性。
33.s120：使修饰生物瓣膜材料与末端醛基化肝素进行还原胺化反应，得到改性生物瓣膜材料。
34.该实施例中，在修饰生物瓣膜材料中，亲水性聚合物链段末端的氨基与末端醛基化肝素末端的醛基发生还原胺化反应，形成稳定的碳氮单键，使得肝素稳定结合在生物瓣膜材料上，从而使生物瓣膜材料有稳定的抗凝血活性。也就是说，亲水性聚合物链段可看作一连接分子，连接生物瓣膜材料和末端醛基化肝素，而末端醛基化肝素只有末端基团发生反应，即通过终点固定的方法固定结合在生物瓣膜材料上，能够使其天然构象和生物活性得以保留，从而保证末端醛基化肝素能够激活血液中的抗凝血酶和加速血液中的凝血酶的失活，进而阻断凝血进程。
35.可选地，该生物瓣膜材料的改性方法可应用于改性以下生物瓣膜材料：如人工主动脉瓣、人工二尖瓣、人工三尖瓣和人工肺动脉瓣等，在此不做具体限定。
36.在另一实施例中，修饰生物瓣膜材料的制备方法包括如下步骤，需注意的是，若有实质上相同的结果，本实施例并不以下述步骤顺序为限。
37.s210：提供亲水性聚合物的缓冲液。
38.在该实施方式中，提供预定量的亲水性聚合物和缓冲液，将亲水性聚合物溶解于
缓冲液中，以得到混合液。
39.在一实施方式中，亲水性聚合物为双端氨基聚乙二醇(nh
2-peg-nh2)。具体地，聚乙二醇(peg)由于分子链中含大量乙氧基，能够与水形成氢键，具有良好的亲水性。当双端氨基聚乙二醇用于修饰生物瓣膜材料时，会提高生物瓣膜材料的亲水性，能够与水分子结合在生物瓣膜材料的表面形成水合层，阻止生物瓣膜材料对血液中凝血因子的吸附，避免血小板在生物瓣膜材料表面的粘附、聚集而导致的凝血发生。
40.其中，亲水性聚合物的分子量为500～5000，例如500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500或5000。以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷举所述范围包括的具体点值。优选分子量为500的双端氨基聚乙二醇(peg)。
41.在一实施方式中，缓冲液为2-(n-吗啉代)乙烷磺酸缓冲液、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠中的一种或多种组合。优选为2-(n-吗啉代)乙烷磺酸缓冲液。
42.其中，混合液的ph为3～7，例如3、4、5、6或7，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷举范围包括的具体点值。优选ph为5.5。
43.其中，混合液的浓度为10～50wt％，例如10wt％、15wt％、20wt％、30wt％、40wt％或50wt％，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷举范围包括的具体点值。优选混合液的浓度为30wt％。
44.s220：将生物瓣膜材料浸泡在亲水性聚合物的缓冲液中。
45.其中，在浸泡之前，生物瓣膜材料预先经过脱细胞处理和交联处理。生物瓣膜材料可以为猪心包膜、马心包膜、猪主动脉瓣膜等，在此不做具体限定。
46.具体地，生物瓣膜材料可通过化学法、物理法或酶消化法进行脱细胞处理；然后将脱细胞处理后的生物瓣膜材料浸泡于交联剂溶液中进行交联处理。
47.其中，交联剂为碳二亚胺、戊二醛或京尼平中的一种或多种组合；交联剂的浓度为0.1～5wt％，例如0.1wt％、1wt％、2wt％、3wt％、4wt％或5wt％；浸泡温度为20～40℃，例如20℃、25℃、30℃、35℃或40℃；浸泡时间为0.1～96小时，例如0.1小时、1小时、5小时、10小时、15小时、20小时、25小时、30小时、35小时、40小时、45小时、50小时、55小时、60小时、65小时、70小时、75小时、80小时、85小时或90小时，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷举范围包括的具体点值。
48.s230：向亲水性聚合物的缓冲液中加入偶联剂。
49.通过向亲水性聚合物的缓冲液中加入偶联剂以得到混合液，其中，偶联剂用于活化生物瓣膜材料上羧基，使亲水性聚合物与生物瓣膜材料进行反应，得到修饰生物瓣膜材料。
50.在该实施方式中，利用偶联剂，使生物瓣膜材料与亲水性聚合物进行偶联，亲水性聚合物中的氨基与生物瓣膜材料表面的羧基共价结合，从而将亲水性聚合物共价固定在生物瓣膜材料上。
51.其中，偶联剂为n-(3-二甲基氨基丙基)-n'-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)、n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)中的一种或多种。优选为n-(3-二甲基氨基丙基)-n'-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)的混合液。
52.其中，偶联剂在混合液中的浓度为0.1～10wt％，例如0.1wt％、1wt％、2wt％、3wt％、4wt％、5wt％、6wt％、7wt％、8wt％、9wt％或10wt％，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷举所述范围包括的具体点值。
53.步骤s230中，整个反应过程应当在预设的温度范围内进行，反应温度为20～37℃，例如20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃或37℃，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷举所述范围包括的具体点值。若温度太低则反应速度太慢，温度太高会损坏生物组织。优选反应温度为37℃。
54.步骤s230中，整个反应过程应当在预设的时间范围内进行反应，反应时间可以为0.1～24小时，例如0.1小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时或24小时，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷举范围包括的具体点值。优选反应时间为4小时。
55.为了制备改性生物瓣膜材料，还需要将末端醛基化肝素连接至修饰生物瓣膜材料上，使得改性生物瓣膜材料具有抗凝活性。可选地，末端醛基化肝素的制备和修饰生物瓣膜材料的制备无先后之分，可同步进行。在该实施例中，末端醛基化肝素的制备方法包括如下步骤，需注意的是，若有实质上相同的结果，本实施例并不以下述步骤顺序为限。
56.s310：提供肝素钠水溶液。
57.在该实施方式中，提供预定量的肝素钠粉末，将肝素钠粉末溶于水，得到肝素钠水溶液。
58.其中，肝素钠水溶液的浓度为0.1～3wt％，例如0.3wt％、1wt％、2wt％或3wt％，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷举范围包括的具体点值。优选肝素钠水溶液的浓度为0.33wt％。
59.s320：向肝素钠水溶液中加入亚硝酸盐，调节溶液ph为酸性，得到混合液，使肝素钠在亚硝酸的作用下发生重氮化反应。
60.在该实施方式中，向肝素钠水溶液中加入亚硝酸盐，使得肝素分子链发生解聚，在末端形成醛基。
61.其中，亚硝酸盐为亚硝酸钠和/或亚硝酸钾。优选亚硝酸盐为亚硝酸钠。
62.其中，亚硝酸盐在混合液中的浓度为0.001～1wt％，例如0.001wt％、0.1wt％、0.2wt％、0.3wt％、0.4wt％、0.5wt％、0.6wt％、0.7wt％、0.8wt％、0.9wt％或1wt％，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷举所述范围包括的具体点值。优选亚硝酸盐的浓度为0.003wt％。
63.在肝素钠水溶液中加入亚硝酸盐后，肝素钠在亚硝酸盐作用下发生重氮化反应。调节混合液的ph值，例如，将乙酸加入混合液中，以将混合液的ph调节至为2～4，例如2、3或4，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷举范围包括的具体点值。优选调节后混合液的ph为2.7。
64.其中，应当在预定的温度范围内进行反应，反应温度为-5～30℃，例如-5℃、-4℃、-3℃、-2℃、-1℃、0℃、1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28
℃、29℃或30℃，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷举所述范围包括的具体点值。优选反应温度为0℃。
65.其中，应当在预设的时间范围内进行反应，反应时间可以为1～24小时，例如1小时、2小时、3小时、4小时或5小时，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷举所述范围包括的具体点值。优选反应时间为2小时。
66.s330：调节反应后的混合液的ph至7～8。
67.通过调节反应后的混合液的ph至7～8以中止反应，以免肝素过度解聚影响活性。
68.其中，可以加入氢氧化钠溶液调节反应后的混合液的ph值。调节后混合液的ph值为7～8，例如7、7.5或8，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷举所述范围包括的具体点值。优选调节后混合液的ph为7。
69.s340：采用截留分子量为1000～3500的透析膜，对反应后的混合液进行透析处理。
70.其中，透析膜的截留分子量为1000～3500，例如1000、2000或3500，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷举所述范围包括的具体点值。优选透析膜的截留分子量为1000。
71.s350：对透析液进行冷冻干燥处理，得到末端醛基化肝素。
72.在该实施方式中，对分离得到的透析液进行冷冻干燥处理，以得到干燥的末端醛基化肝素钠粉末。
73.在另一实施例中，改性生物瓣膜材料的制备方法包括如下步骤，需注意的是，若有实质上相同的结果，本实施例并不以下述步骤顺序为限。
74.s410：提供末端醛基化肝素水溶液。
75.在该实施方式中，提供预定量的步骤s350制得的末端醛基化肝素钠粉末，将末端醛基化肝素钠粉末溶于水得到末端醛基化肝素水溶液。
76.其中，末端醛基化肝素水溶液的浓度为0.1～3wt％，例如0.3wt％、1wt％、2wt％或3wt％，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷举所述范围包括的具体点值。优选末端醛基化肝素水溶液的浓度为0.3wt％。
77.s420：向末端醛基化肝素水溶液中加入还原剂，得到含末端醛基化肝素和还原剂的混合液。
78.其中，还原剂为硼氢化钠、氰基硼氢化钠中的一种或多种。优选还原剂为氰基硼氢化钠。
79.其中，还原剂在混合液中的浓度为0.001～1wt％，例如0.001wt％、0.1wt％、0.2wt％、0.3wt％、0.4wt％、0.5wt％、0.6wt％、0.7wt％、0.8wt％、0.9wt％或1wt％，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷举所述范围包括的具体点值。优选还原剂在混合液中浓度为0.001wt％。
80.进一步地，在混合液中加入酸以调节ph值，酸为乙酸等常用酸。调节后混合液的ph为2～5，例如2、3、4或5，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷举所述范围包括的具体点值。优选调节后混合液的ph为3.5。
81.s430：将修饰生物瓣膜材料浸泡在含末端醛基化肝素和还原剂的混合液中，使修饰生物瓣膜材料中亲水性聚合物上的氨基与末端醛基化肝素中的醛基进行还原胺化反应，得到改性生物瓣膜材料。
82.其中，在还原胺化反应完后，利用磷酸盐缓冲液对得到的改性生物瓣膜材料进行漂洗，洗去材料上残留的反应试剂。
83.在该实施方式中，生物瓣膜材料上亲水性聚合物的氨基与肝素钠末端的醛基共价结合，形成希夫碱结构，并在还原剂的作用下，发生还原胺化反应，形成稳定的碳氮单键，使得肝素稳定结合在生物瓣膜材料上，使改性生物瓣膜材料具备稳定的抗凝活性。
84.其中，应当在预定的温度范围内进行反应，反应温度为20～40℃，例如20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷举所述范围包括的具体点值。优选反应温度为37℃。
85.其中，其应当在预设的时间范围内进行反应，反应时间可以为1～24小时，例如1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、11小时、12小时、13小时、14小时、15小时、16小时、17小时、18小时、19小时、20小时、21小时、22小时、23小时或24小时，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷举范围包括的具体点值。优选反应时间为4小时。
86.在另一实施方式中，本发明还提供一种改性生物瓣膜材料。该改性生物瓣膜材料包括生物瓣膜材料及与生物瓣膜材料连接的改性修饰结构；改性修饰结构包括亲水性聚合物链段和与亲水性聚合物链段共价连接的肝素；肝素与亲水性聚合物链段以碳氮单键键合。可以是利用上述改性方法对以下生物瓣膜材料进行改性得到人工主动脉瓣、人工二尖瓣、人工三尖瓣和人工肺动脉瓣等人工生物瓣膜。
87.其中，亲水性聚合物链段包括聚乙二醇链段，聚乙二醇链段的分子量为500-5000，例如500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷举所述范围包括的具体点值。
88.下面，将通过几组具体实验例对本发明的方案进行说明、解释，但这些实验例仅是一些示例性方案，不应用来限制本发明的范围。其中，实验例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照标准要求所规定的条件。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域技术人员所熟知的意义相同。
89.实施例1
90.本实施例以猪心包膜作为生物瓣膜材料制备改性生物瓣膜材料。
91.步骤1：将清洗干净的猪心包膜，采用化学萃取方法脱细胞后，浸泡于0.5wt％的戊二醛溶液中，在25℃下交联24小时。
92.步骤2：将分子量为1000的双端氨基聚乙二醇溶于ph为5的磷酸盐缓冲液(pbs)中，配制20wt％的双端氨基聚乙二醇溶液，将步骤1交联后的猪心包膜用去离子水清洗干净，浸泡于双端氨基聚乙二醇溶液中，加入n-(3-二甲基氨基丙基)-n'-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)/n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)的混合液，使edc/nhs在得到的溶液中的浓度为150mm/30mm，在25℃下轻微振荡反应6小时，磷酸盐缓冲液(pbs)过夜清洗。
93.步骤3：将2g肝素钠溶于200ml去离子水中，加入50mg亚硝酸钠，用1mol/l的盐酸调节ph至2.5，在25℃下搅拌1小时，然后用1mol/l的氢氧化钠调节ph至7.2，用截留分子量为2000的透析膜透析后冷冻干燥。
94.步骤4：将1g步骤3水解后的肝素钠溶于100ml去离子水中，加入10mg硼氢化钠，用
1mol/l的盐酸调节ph至3。
95.步骤5：将步骤2中双端氨基聚乙二醇修饰后的猪心包膜浸泡于步骤4的溶液中，25℃下静置2小时后，磷酸盐缓冲液(pbs)清洗3次，每次15分钟，得到具有亲水性和抗凝活性的改性生物瓣膜材料。
96.实施例2
97.本实施例以猪牛心包膜作为生物瓣膜材料制备改性生物瓣膜材料。
98.步骤1：将清洗干净的牛心包膜，采用高低渗法脱细胞后，浸泡于150mm/30mm的n-(3-二甲基氨基丙基)-n'-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)/n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)的混合液中，在25℃下交联4小时。
99.步骤2：将分子量为500的双端氨基聚乙二醇溶于ph为5.5的2-(n-吗啉代)乙烷磺酸缓冲液(mes)中，配制30％的双端氨基聚乙二醇溶液，将步骤1交联后的猪心包膜用去离子水清洗干净，浸泡于双端氨基聚乙二醇溶液中，加入n-(3-二甲基氨基丙基)-n'-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)/n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)的混合液，使edc/nhs在得到的溶液中的浓度为100mm/60mm，在37℃下轻微振荡反应4小时，磷酸盐缓冲液(pbs)清洗3次，每次15分钟。
100.步骤3：将2g肝素钠溶于600ml去离子水中，加入20mg亚硝酸钠，用乙酸调节ph至2.7，在0℃下搅拌2小时，然后用1mol/l的氢氧化钠调节ph至7，用截留分子量为1000的透析膜透析后冷冻干燥。
101.步骤4：将1g步骤3水解后的肝素钠溶于300ml去离子水中，加入3mg氰基硼氢化钠，用1mol/l的盐酸调节ph至3.5。
102.步骤5：将步骤2中双端氨基聚乙二醇修饰后的猪心包膜浸泡于步骤4的溶液中，25℃下静置2小时后，磷酸盐缓冲液(pbs)清洗3次，每次15分钟，得到具有亲水性和抗凝活性的改性生物瓣膜材料。
103.实施例3
104.本实施例以猪主动脉瓣膜作为生物瓣膜材料制备改性生物瓣膜材料。
105.步骤1：将清洗干净的猪主动脉瓣膜，采用酶消解法脱细胞后，浸泡于6.25wt％的京尼平溶液中，在37℃下交联72小时。
106.步骤2：将分子量为2000的双端氨基聚乙二醇溶于ph为4.5的2-(n-吗啉代)乙烷磺酸缓冲液(mes)中，配制50％的双端氨基聚乙二醇溶液，将步骤1交联后的猪心包膜用去离子水清洗干净，浸泡于双端氨基聚乙二醇溶液中，加入n-(3-二甲基氨基丙基)-n'-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)/n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)的混合液，使edc/nhs在得到的溶液中的浓度为200mm/100mm，在20℃下轻微振荡反应10小时,生理盐水清洗3次，每次15分钟。
107.步骤3：将4g肝素钠溶于200ml去离子水中，加入100mg亚硝酸钠，用乙酸调节ph至4，在5℃下搅拌4小时，然后用1mol/l的氢氧化钠调节ph至7.4，用截留分子量为3500的透析膜透析后冷冻干燥。
108.步骤4：将2g步骤3水解后的肝素钠溶于100ml去离子水中，加入5mg氰基硼氢化钠，用1mol/l的盐酸调节ph至4。
109.步骤5：将步骤2中双端氨基聚乙二醇修饰后的猪主动脉瓣膜用磷酸盐缓冲液(pbs)清洗干净，浸泡于步骤4的溶液中，40℃下静置8小时后，磷酸盐缓冲液(pbs)清洗过夜，得到具有亲水性和抗凝活性的改性生物瓣膜材料。
110.需要说明的是，若有实质上相同的结果，实施例1-3并不以上述流程步骤的顺序为限。在一实施方式中，实施例1-3中步骤2与步骤3可不分先后顺序同时进行。
111.请参阅图1，图1是本发明提供的改性生物瓣膜材料的抗凝血性能测试结果。采用凝血活酶时间(aptt)检测评估实施例2中制得的改性生物瓣膜材料的抗凝血性能。
112.将实施例2中制得的改性生物瓣膜材料在37℃下放置于生理盐水中浸泡0、1、3和7天后，将材料浸于贫血小板血浆中，检测血浆的凝血活酶时间(aptt)，具体检测结果如图1所示。
113.根据图1可知，改性处理前的生物瓣膜材料凝血活酶时间(aptt)与正常血液的凝血活酶时间(aptt)无明显差异；而改性处理后，凝血活酶时间(aptt)明显增大，表明改性生物瓣膜材料具有抗凝活性；并且改性生物瓣膜材料在生理盐水中浸泡后，凝血活酶时间(aptt)与浸泡前基本一致，表明改性生物瓣膜材料具有稳定的抗凝活性。
114.以上所述仅为本发明的实施方式，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。