一种新型脑转移瘤动物模型的构建方法与流程

本发明涉及动物模型构建技术领域，尤其是涉及一种新型脑转移瘤动物模型的构建方法。

背景技术：

目前，脑转移瘤动物模型的构建方法是将肿瘤细胞悬液通过特定的途径注射入小鼠的动脉血循环，从而通过血流将肿瘤细胞送达脑组织内的毛细血管，最终肿瘤细胞穿透血脑屏障在脑实质内定植，或者通过直接颅内种植的方法，使实验小鼠形成转移瘤。现有注射方法包括：1.左心室注射，2.颈总动脉注射，3.立体定向颅内原位注射。左心室注射是依赖经验或b超引导下，通过小鼠肋间隙穿刺左心室，将肿瘤细胞悬液注射入左心腔。颈动脉注射是通过作颈部正中切口，解剖分离颈总动脉，穿刺并注射肿瘤细胞悬液。立体定向颅内原位注射是在立体定位仪的辅助下，参照小鼠脑解剖图谱，设定坐标后，将肿瘤细胞悬液注射到脑组织的目标区域。

上述现有的3种注射方法均存在如下的局限性。1.左心室注射法：小鼠心脏较小且心率高达600次/分，左心室穿刺成功率很大程度上依赖于操作者的经验，b超引导可提高穿刺成功率。但左心室穿刺容易引起出血，误入右心室，肿瘤细胞外漏，造成胸腔种植转移。成功注射入左心腔内的肿瘤细胞在心室内易受高速血流的剪切力作用而损伤，降低成瘤率，且注射入左心腔内的肿瘤细胞，会经体循环到达全身各处，产生多器官转移，脑转移效率低下。且小鼠全身肿瘤负荷较重，很快发生恶病质，在形成有效的脑转移病灶之前，小鼠可能死于全身衰竭。2.颈总动脉注射：通过穿刺颈总动脉将肿瘤细胞定向注射到脑循环内，可显著提高肿瘤的脑转移效率，同时避免了其他脏器出现转移瘤，减轻了全身肿瘤负荷。但小鼠颈总动脉较细，直径不超过1mm，即使是使用胰岛素针头(直径0.3mm)，穿刺对血管造成的损伤非常显著，常常导致拔针后的大出血，联合使用止血材料压迫止血有助于止血，但也增加了颈动脉血栓发生率，导致小鼠脑梗死，癫痫发作，增加了造模死亡率，其缺血缺氧环境也不利于肿瘤在颅内的进展。还有个不容忽视的问题：穿刺注射过程中或拔除穿刺针后几乎不可避免的肿瘤细胞外漏会导致肿瘤细胞在颈部种植，侵犯气管，增加模型小鼠的死亡率。3.立体定向颅内原位注射虽可有效的将肿瘤细胞送达脑组织内，但并不能模拟肿瘤脑转移的病理生理过程，而是通过直接接种的方式使肿瘤在脑组织内生长。穿刺造成的脑组织损伤对实验结果亦可造成一定的影响。因此，构建稳定高效，且符合病理生理过程的脑转移瘤动物模型是研究肿瘤脑转移机制以及肿瘤微环境的关键。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种新型脑转移瘤动物模型的构建方法，较好的模拟人类肿瘤脑转移的病理生理过程，减少造模术中出血量和肿瘤细胞外漏的几率，提高了造模成功率，降低了模型的死亡率；并且制备的脑转移瘤动物模型避免了多脏器转移，降低了小鼠全身肿瘤负荷，本发明的小鼠模型可用于脑转移瘤的转移机制研究，纯属用于科研，完全不涉及临床病例。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：

一种新型脑转移瘤动物模型的构建方法，包括以下步骤：

分离小鼠颈部的左侧颈总动脉及左侧颈总动脉分支；将小鼠头位旋转，提起颈总动脉牵引丝线，再临时阻断颈总动脉；提起颈外动脉远心端，朝向近心端将肿瘤细胞悬液导入颈内动脉；肿瘤细胞悬液导入完毕后，关闭颈外动脉，开放颈总动脉。

本发明创新性地通过颈外动脉将肿瘤细胞悬液导入颈内动脉，导入完毕后关闭颈外动脉，开放颈总动脉，使肿瘤细胞顺着血流到达脑组织内毛细血管网，其构建方法可以较好的模拟人类肿瘤脑转移的病理生理过程，使得制备的脑转移瘤小鼠模型具有高成瘤率及低死亡率，本发明制备的脑转移瘤动物模型可用于脑转移瘤的转移机制及肿瘤微环境研究。

作为本发明所述新型脑转移瘤动物模型的构建方法的优选实施方式，所述构建方法还包括麻醉过程：使用浓度为1.25％的三溴乙醇溶液注射小鼠腹腔，剂量为0.2ml/10g体重。麻醉成功后清理小鼠气道分泌物。

作为本发明所述新型脑转移瘤动物模型的构建方法的优选实施方式，所述肿瘤细胞悬液中的肿瘤细胞为稳定过表达荧光素酶的细胞株。

作为本发明所述新型脑转移瘤动物模型的构建方法的优选实施方式，所述肿瘤细胞悬液中肿瘤细胞的浓度为10⁴/μl，导入速度为50μl/min，导入量为20μl/只。

作为本发明所述新型脑转移瘤动物模型的构建方法的优选实施方式，所述构建方法还包括预处理过程：小鼠颈部正中切口，上至门齿下方5mm，下至胸骨上方5mm，分离甲状腺两侧叶，显露气管软骨环，沿气管旁沟钝性分离颈旁肌肉，在气管旁沟内探及颈动脉鞘，打开颈动脉鞘可见颈总动脉、颈内静脉及迷走神经，在颈总动脉的下方带一根4-0丝线以备牵引；切断二腹肌，深面可见迷走神经、颈总动脉分叉，分出远离气管侧向深部走行的颈内动脉和近气管侧向浅部走行的颈外动脉。

作为本发明所述新型脑转移瘤动物模型的构建方法的优选实施方式，还包括，在颈总动脉及颈外动脉下方分别用4-0丝线带线牵引，在颈外动脉根部以8-0尼龙线预打一松结，以备拔针时结扎颈外动脉用。

作为本发明所述新型脑转移瘤动物模型的构建方法的优选实施方式，将小鼠头位旋转180°，临时阻断颈总动脉，逆向打开颈外动脉。

作为本发明所述新型脑转移瘤动物模型的构建方法的优选实施方式，所述颈外动脉远心端留有4-0丝线，注射前轻轻提起，使血管紧张，利于穿刺，同时使血管长轴与穿刺针尽量平行，避免穿透血管壁。

作为本发明所述新型脑转移瘤动物模型的构建方法的优选实施方式，将肿瘤细胞悬液导入颈外动脉后，打紧颈外动脉根部8-0尼龙线预打的松结，关闭颈外动脉。

颈外动脉穿刺注射肿瘤细胞悬液完毕后，由助手打紧颈外动脉根部8-0尼龙线预打的松结，结扎颈外动脉，避免穿刺点出血及肿瘤细胞外漏。

作为本发明所述新型脑转移瘤动物模型的构建方法的优选实施方式，关闭颈外动脉，开放颈总动脉后，顺向的血流将肿瘤细胞悬液通过颈内动脉送达脑组织内毛细血管。

作为本发明所述新型脑转移瘤动物模型的构建方法的优选实施方式，所述构建方法还包括使用蒸馏水冲洗小鼠颈部步骤。

本发明构建方法还包括使用蒸馏水冲洗小鼠颈部步骤，其作用为破坏可能漏至切口内的少量肿瘤细胞，防止颈部形成肿瘤。

与现有技术相比，本发明具有以下有益技术效果：

1)本发明提供了一种新型脑转移瘤动物模型的构建方法，创新性地打开颈外动脉，定向往颈内动脉导入肿瘤细胞，注射完毕关闭颈外动脉，避免了打开点出血和肿瘤细胞外漏，防止颈部肿瘤种植。并且打开点位于颈外动脉，不会损伤颈内及颈总动脉，不影响向颅内的血供，注射完毕通过结扎颈外动脉止血，无需压迫止血，避免了颈内和颈总动脉形成血栓，降低了造模死亡率；本发明的构建方法还可以较好的模拟人类肿瘤脑转移的病理生理过程；

2)本发明制备的脑转移瘤动物模型具有高成瘤率及低死亡率，可用于脑转移瘤的转移机制和肿瘤微环境研究，纯属用于科研，完全不涉及临床病例。

附图说明

图1为本发明新型脑转移瘤动物模型的颈部血管解剖图；

图2为本发明新型脑转移瘤动物模型的颈外动脉穿刺注射图；

图3为本发明新型脑转移瘤动物模型的颈外动脉注射完毕结扎图；

图4为本发明新型脑转移瘤动物模型的构建方法整体步骤图；

图5为采用新型脑转移瘤动物模型的构建方法构建得到的4t1脑转移小鼠模型活体荧光成像图；balb/c小鼠左侧大脑半球可见荧光信号，提示脑转移瘤形成；

图6为采用新型脑转移瘤动物模型的构建方法构建得到的4t1脑转移小鼠模型头颅磁共振图；t2wi图像显示balb/c小鼠左侧大脑半球可见皮层下病变，提示脑转移瘤形成(箭头所示)；

图7为采用新型脑转移瘤动物模型的构建方法得到的4t1脑转移小鼠模型病理切片he染色图；显示脑实质内大量转移瘤结节(箭头所示)。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

在以下实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例和实验例采用的肿瘤细胞可以是具有脑转移潜能的小鼠乳腺癌细胞株4t1、小鼠肺癌细胞株llc、人乳腺癌细胞株mda-mb-231、人肺癌细胞株nci-h2030和pc-9中的一种。

操作准备：

①器械准备：手术显微镜、动物台、微量注射泵、100μl微量注射器、pe10导管、bd胰岛素注射器、眼科剪、眼科镊、持针器、显微外科手术器械(显微镊、显微剪刀、显微持针器)、小号动脉夹。

②材料准备：缝线：4-0丝线、8-0尼龙缝线，4-0带针慕丝线，小棉球；微量注射器，③试剂准备：麻醉药物：三溴乙醇、注射用水、75％酒精。

③实验动物准备：从广东省医学实验动物中心购买的适用于各类转移瘤细胞株种属背景的实验小鼠(雄性c57bl/6小鼠、雌性balb/c小鼠、雌性和雄性balb/c裸鼠等，8周龄，体重22±2g)

实施例、一种新型脑转移瘤动物模型的构建方法

一种新型脑转移瘤动物模型的构建方法，包括以下步骤：

1、超净工作台内消化收集稳定过表达荧光素酶的肿瘤细胞，pbs洗涤1遍，细胞计数后，加入pbs缓冲液重悬，制备成10⁴/μl浓度的细胞悬液，冰浴保存备用；

2、使用浓度为1.25％的三溴乙醇溶液0.2ml/10g体重腹腔注射，麻醉实验小鼠，麻醉满意后固定于动物手术台，充分暴露颈部皮肤，剃毛。清理气道分泌物。

3、75％酒精消毒手术区域。于颈部正中作一纵行切口，上至门齿下方5mm，下至胸骨上方5mm，分离甲状腺两侧叶，显露气管软骨环，沿气管旁沟钝性分离颈旁肌肉，在气管旁沟内探及颈动脉鞘，打开颈动脉鞘可见颈总动脉、颈内静脉及迷走神经，在颈总动脉的下方带一根4-0丝线以备牵引。

4、切断二腹肌，深面可见迷走神经、颈总动脉分叉，分出远离气管侧向深部走行的颈内动脉和近气管侧向浅部走行的颈外动脉(参见图1)。并于颈外动脉下方用4-0丝线带线，便于牵引。在颈外动脉根部以8-0尼龙线预打一松结，以备拔针时关闭颈外动脉用。

5、取出经酒精浸泡的自制带延长管的微量注射器，使用生理盐水润洗，轻轻混匀细胞悬液，吸取细胞悬液，注意排除管道内气泡，设置微量注射泵，单次注射量20μl，注射速度50μl/min。

6、将小鼠头位旋转180°，提起颈总动脉牵引丝线，以小号动脉夹临时阻断颈总动脉，提起颈外动脉远心端牵引丝线，使其远端成角并尽量与注射针成＜15°夹角。穿刺颈外动脉，确认针头在位后，保持针头和颈外动脉相对静止，由助手按下微量注射泵开始注射按键，进行注射，此时可见细胞悬液往颈内方向流动(参见图2)。注射完毕，拔除穿刺针的同时由助手将颈外动脉根部预留的8-0线结打紧，结扎颈外动脉，开放颈总动脉，检查穿刺点无明显出血(参见图3)，切口内加入灭菌注射用水浸泡5min，以清除可能漏出的少量肿瘤细胞，缝合切口，术毕，整个造模过程参见图4。

实验例、病理检验和活体荧光成像验证实验

采用实施例1的构建方法共造模41只，包括3个品系小鼠(雄性c57bl/6小鼠、雌性balb/c小鼠、雌性和雄性balb/c裸鼠)和5种细胞株(小鼠乳腺癌细胞株4t1、小鼠肺癌细胞株llc、人乳腺癌细胞株mda-mb-231、人肺癌细胞株nci-h2030和pc-9)，结果发现：本发明构建得到的小鼠模型通过活体荧光成像观察，上述5种细胞系注射后10天成瘤率分别为：4t1:76.47％(13/17)，llc：71.4％(5/7)，mda-mb-231：14.3％(1/7)，nci-h2030：20％(1/5)，pc-9：60％(3/5)。通过病理切片he染色观察，上述5种细胞系注射后30天脑组织切片出现转移灶的发生率分别为：4t1:90％(9/10)，llc：100％(5/5)，mda-mb-231：100％(5/5)，nci-h2030：100％(3/3)，pc-9：100％(3/3)。具有高特异性(所有小鼠均未发现颅外肿瘤病灶，仅2只小鼠出现颈部种植肿瘤)和低死亡率(造模术后存活40只，死亡1只，死亡率为2.4％，病理切片证实，所有模型脑组织均未见到明显的脑梗死病灶)的优点。

通过选择合适品系的实验小鼠，该方法适用于注射接种各种人或小鼠源性具有脑转移潜力的肿瘤细胞(如人乳腺癌细胞株mda-mb-231和人肺癌细胞株nci-h2030和pc-9通过此方法注射到balb/c裸鼠体内，或将小鼠肺癌细胞株llc注射到c57bl/6小鼠体内、小鼠乳腺癌细胞株4t1注射到雌性balb/c小鼠体内等)，从而建立脑转移瘤动物模型用于科研目的。此外，由于小鼠和大鼠具有类似的颈部血管解剖，此方法亦可应用于建立脑转移瘤大鼠模型(如各种人源性肿瘤细胞株接种裸大鼠)，其操作难度远远低于此小鼠模型。

从活体荧光成像和病理切片观察可知，采用本发明的方法构建得到的脑转移瘤动物模型成功率高，特异性高，参见图5-7。

本发明提供的新型脑转移瘤动物模型的构建方法，创新性地打开颈外动脉，定向往颈内动脉导入肿瘤细胞，注射完毕关闭颈外动脉，避免了打开点出血和肿瘤细胞外漏，防止颈部肿瘤种植。并且打开点位于颈外动脉，不会损伤颈内及颈总动脉，注射完毕通过结扎止血，无需压迫止血，避免了颈内和颈总动脉形成血栓，降低了造模死亡率；此外，本发明的构建方法还可以较好的模拟人类肿瘤脑转移的病理生理过程。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。