岩藻糖与环糊精修饰多肽靶向动脉粥样硬化相关巨噬细胞纳米载体系统及其制备方法和应用

本发明涉及靶向药物纳米载体技术领域，特别涉及一种岩藻糖与环糊精共修饰多肽靶向动脉粥样硬化相关巨噬细胞纳米载体系统及其制备方法和应用。

背景技术：

动脉粥样硬化是一种以慢性炎症为驱动力，以斑块发展为特征的疾病，动脉粥样硬化所引起的心血管疾病已成为当今世界上致死率最高的疾病之一。目前，临床上动脉粥样硬化的治疗方法主要是全身给药和手术介入治疗。传统剂型的药物存在血浆半衰期短，清除率高，毒副作用大等问题，而介入治疗创伤性大，费用高且存在术后血栓形成和复发等风险，仅适合疾病发展的中后期。若能实现靶向药物治疗则可很好地避免上述问题。

中国专利文献cn110420198a公开了一种靶向动脉粥样硬化巨噬细胞树状纳米载体系统，文献中以pamamg5.0树枝状高分子为基础，经β-cd和mannose修饰，三者有效结合构建了靶向动脉粥样硬化相关巨噬细胞的靶向纳米载体系统，最终制备得到的纳米载体的平均粒子大小为119nm。该纳米载体系统具有靶向动脉粥样硬化相关巨噬细胞的作用，能包合溶解并移除动脉粥样硬化斑块内的胆固醇，有效减少斑块内的胆固醇结晶，并能抑制炎症，最终使斑块减小。虽然上述纳米载体系统表现出了良好的靶向性以及抑制炎症促使板块减小的效果，但其在以下两方面仍有进一步改进的空间：1、pamam表面氨基所带来的细胞毒性问题。2、粒子尺寸大小对于载体穿透能力影响的问题。

技术实现要素：

本发明的目的之一是提供一种低毒，穿透力强的动脉粥样硬化纳米粒子靶向载体系统。除此之外，本发明还提供上述纳米粒子靶向载体系统的制备方法和用途。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种岩藻糖与环糊精共修饰多肽靶向动脉粥样硬化相关巨噬细胞纳米载体系统，其结构式为：

。

上述纳米载体系统的结构数据为：(0<x≤100，0<y≤100，0<n≤100)，¹hnmr(400mhz,d2o):δ(ppm)1.09,1.18(m,糖环-ch3)，2.27-2.48(t,-nch2ch2co-)，2.67(t,-nch2ch2co-)，2.74-3.10(t,-nch2ch2conh-)，3.15-3.47(m,h2,4-cd)，3.72，3.79(m,h5,6-cd)，4.08(t,h3-cd)，4.08-4.31(t,h2-5-糖环)，4.76(s,h1-糖环)，4.91(s,h1-cd)，ft-ir(kbr):3348cm^-1(n-h)，3118cm^-1(oh-)，2921cm^-1,22851cm^-1(c-h)，1706cm^-1,1647cm^-1(c=o)，1553cm^-1(n-h)，1435cm^-1(c-n)，1385cm^-1,1264cm^-1,1155cm^-1,1080cm^-1(c-o-c)，1033cm^-1(c-n)。

另外，本发明还涉及上述岩藻糖与环糊精共修饰多肽靶向动脉粥样硬化相关巨噬细胞纳米载体系统在制备动脉粥样硬化靶向药物中的应用以及以该岩藻糖与环糊精共修饰多肽靶向动脉粥样硬化相关巨噬细胞纳米载体系统作为药物递送载体的动脉粥样硬化靶向药物。

在本发明的一个实施例中，上述岩藻糖与环糊精共修饰多肽靶向动脉粥样硬化相关巨噬细胞纳米载体系统的制备方法包括以下步骤：

一、第一中间产物的制备：

1.1、取重结晶环糊精和适量n,n’-羰基二咪唑用dmso溶解，在n2保护条件下充分搅拌混匀；

1.2取适量pamamg5.0甲醇溶液，用n2吹干后再加入适量dmso中溶解；

1.3将步骤1.2所得溶液滴加至步骤1.1所得溶液中，并在n2保护及避光条件下充分搅拌反应，反应结束后将反应液透析、干燥，得到白色絮状第一中间产物；

二、第二中间产物的制备：

2.1用醋酐将适量岩藻糖在n2保护及大约115℃-125℃的条件下搅拌溶解，之后加入适量无水乙酸钠，在n2保护及大约135℃-145℃的条件下回流反应，反应结束后冷却至室温，再加入适量ch2cl2溶解，之后加饱和nahco3溶液洗涤，直至反应液中不产生气泡；

2.2取反应液下层有机层，再用饱和nacl溶液洗涤，最后加入适量无水na2so4进行干燥，抽滤、减压干燥后得到棕黄色粘稠状液体，棕黄色粘稠状液体用无水乙醇重结晶后得第二中间产物；

三、第三中间产物的制备：

3.1、取适量第二中间产物用ch2cl2溶解，边搅拌边逐滴加入适量巯基丙酸和适量三氟化硼乙醚溶液，于冰浴中搅拌反应；

3.2反应结束后，加入冰水中分层，分液取下层，并用ch2cl2萃取多次，合并有机层再依次用饱和nahco3和水清洗，取下层有机层，用无水na2so4干燥，抽滤、旋干后得棕黄色粘稠液体，棕黄色粘稠液体纯化后得到粘性油状物第三中间产物；

四、第四中间产物的制备：

4.1取适量第三中间产物用dmso溶解，取适量edc^.hcl用dmso溶解并滴加至第三中间产物的溶液中，充分搅拌后，取适量nhs用dmso溶解并将其滴加至混合溶液中，混合溶液在n2保护条件下充分搅拌均匀；

4.2取适量第一中间产物用dmso溶解，并逐滴加入至充分搅拌均匀后的混合溶液中，再在n2保护条件下避光搅拌反应，反应结束完成后，将反应液先用dmso搅拌透析，再用去离子水透析，透析结束之后冷冻干燥，得到淡黄色絮状物第四中间产物；

五、目标产物的制备：

5.1取适量第四中间产物加乙醇溶解，在大约42℃-46℃条件下逐滴加入适量水合肼，充分搅拌反应；

5.2反应液经透析、冷冻干燥后得到的产物即为所述岩藻糖与环糊精共修饰多肽靶向动脉粥样硬化相关巨噬细胞纳米载体系统。

其中，在步骤一中，所述重结晶环糊精、n,n’-羰基二咪唑、pamamg5.0三者的配比关系为：每8g重结晶环糊精对应约5.8gn,n’-羰基二咪唑、约1.6gpamamg5.0。

其中，在步骤二中，岩藻糖、醋酐、无水乙酸钠三者的配比关系为：每1g岩藻糖对应约15ml醋酐、约2g无水乙酸钠。

其中，在步骤三中，第二中间产物、巯基丙酸和三氟化硼乙醚溶液三者的配比关系为：每1g第二中间产物对应约1ml巯基丙酸、约0.5ml三氟化硼乙醚溶液。

其中，在步骤四中，所述第三中间产物、edc^.hcl、nhs和第一中间产物四者的配比关系为：每1g第三中间产物对应约0.45gedc^.hcl、约0.26gnhs、约0.05g第一中间产物。

其中，在步骤五中，所述第四中间产物和水合肼的配比关系为：每1g第四中间产物对应约5ml水合肼。

本发明以pamamg5.0树状高分子为载体，分别将环糊精（β-cd）及靶向分子岩藻糖（fucose）连接在其表面，构建了一种新型靶向动脉粥样硬化斑块相关巨噬细胞的纳米载体系统，fucose作为靶向分子作用于巨噬细胞，能够提高病灶部位的药物浓度，籍由fucose与环糊精β-cd共修饰所形成的独特结构，能够较好地遮蔽pamam表面氨基所带来的细胞毒性，同时载体粒子尺寸极小（低于10nm），能够很好的穿透生物膜与血管壁，或可以透过肾脏的过滤，避免肾毒性，延长在血液中的循环时间，本发明所构建的载体具有低毒、高靶向性、强穿透力和较好的生物相容性，能够使动脉粥样硬化斑块部位的药物浓度富集，减少用药剂量，降低毒副作用，从而为动脉粥样硬化针对病灶部位的防治提供一种新的有效途径。

附图说明：

图1为实施例中纳米载体系统的制备过程反应方程式；

图2为实施例中制备的纳米载体系统的核磁共振氢谱结构数据图；

图3为实施例中制备的纳米载体系统的粒度分布情况图；

图4为实施例中制备的纳米载体系统mtt细胞毒性测定的结果图；

图5和图6均为实施例中制备的纳米载体系统靶向性测定的倒置荧光显微镜成像图；

图7为实施例中制备的纳米载体系统促进胆固醇流出性能的倒置荧光显微镜成像图。

具体实施方式

为了便于本领域技术人员的理解，下面结合具体实施例和附图对本发明作进一步的说明，实施例提及的内容并非对本发明的限定。需要提前说明的是，以下实施例是在实验室完成的，本领域技术人员应当明白，实施例中给出的各组分用量仅代表了各组分之间的配比关系，而非具体的限定。

一、纳米载体系统的制备。

首先，取一定量的环糊精（β-cd）于烧杯中，用去离子水加热溶解，趁热过滤，滤液置于冰箱里析出晶体，干燥，重复三次，得重结晶β-cd。应当指出的是，重结晶β-cd除自制外也可以外购，由于实验室制备纳米载体系统对于重结晶β-cd用量较少，故在本实施例中采用了自制的方案。纳米载体系统的制备过程见图1所示，具体包括以下步骤1-5。

1、制备第一中间产物。

1.1取重结晶β-cd（0.08g,70.48μmol）和n,n’-羰基二咪唑（cdi）(0.058g，357.69mol）置于100ml圆底烧瓶中，加入4mldmso溶解，n2保护并于室温条件下搅拌约6h。

1.2取400μlpamamg5.0（0.016g,0.56μmol）甲醇溶液，用n2吹干，加入4mldmso溶解。

1.3将步骤1.2所得溶液缓慢滴加至步骤1.1所得溶液中，在n2保护条件下，避光并于室温下搅拌反应约3d。反应结束后，将反应液转移至透析袋（8000-14000da）中用去离子水透析约3d，约每3h跟换一次去离子水，透析结束之后冷冻干燥，得到白色絮状第一中间产物。

2、制备第二中间产物。

2.1取1g岩藻糖（fucose）置于三颈烧瓶中，加入15ml醋酐，在n2保护下，于120℃左右搅拌溶解，待岩藻糖完全溶解后，加入2g无水乙酸钠，n2保护，约140℃条件下回流反应约4h，反应结束后，放置冷却至室温，加入15mlch2cl2溶解，加入饱和nahco3洗涤，直至反应液中不产生气泡。

2.2取下层有机层，再用饱和nacl溶液洗涤两次，最后加入适量的无水na2so4进行干燥，抽滤，减压干燥，得到棕黄色粘稠状液体，用无水乙醇重结晶得第二中间产物。

3、制备第三中间产物。

3.1取1g第二中间产物用6mlch2cl2溶解，边搅拌边逐滴加入1ml巯基丙酸、0.5ml三氟化硼乙醚溶液，冰浴中搅拌反应约5h。

3.2反应结束后，加入冰水中分层，分液取下层，用ch2cl2萃取三次，合并有机层，再依次用饱和nahco3和水洗，取下层有机层，用无水na2so4干燥，抽滤，旋干，得棕黄色粘稠液体，用硅胶层析柱分离纯化，用ch2cl2与ch3oh梯度洗脱，得到粘性油状物第三中间产物。

4、制备第四中间产物。

4.1取1g第三中间产物用6mldmso溶解，取0.45gedc^.hcl用3mldmso溶解，滴加至上述溶液，搅拌约30min后，取0.26gnhs用2mldmso溶解，滴加其中，n2保护并于室温条件下搅拌约5h，充分混合均匀。

4.2取0.05g第一中间产物用5mldmso溶解，逐滴缓慢加入至步骤4.1所得混合溶液中，室温条件下采用n2保护，避光搅拌反应约5d。反应完成后，将反应液转移至透析袋中，先用dmso搅拌透析约1d，然后再换用去离子水充分透析约3d，透析结束之后冷冻干燥，得到淡黄色絮状物第四中间产物。

5、制备目标产物。

5.1取0.02g第四中间产物置于烧瓶中，加入5ml85%的乙醇溶解，44℃下逐滴加入1ml水合肼，搅拌反应约6h。

5.2将反应液置于透析袋（mwco：8000-14000）中，用去离子水透析约3d，约每3h更换一次去离子水，透析结束之后冷冻干燥得目标产物。

二、目标产物的表征和性能测定。

1、目标产物的标准：使用zeta电位及粒度分析仪对目标产物粒子大小进行测定，图3示出了目标产物的粒度分布，结果显示目标产物平均粒子大小为8.97nm，如此小的粒径意味着该纳米载体将具有极强的细胞穿透力，使得纳米载体能够很好的穿透生物膜与血管壁，或可以透过肾脏的过滤，避免肾毒性，延长在血液中的循环时间。经测定分析，确定目标产物为岩藻糖与环糊精共修饰多肽纳米载体（cd-g5-s-fuc），其结构式为：，图2示出了上述纳米载体的核磁共振氢谱结构数据，其具体结构数据为：

(0<x≤100，0<y≤100，0<n≤100)，¹hnmr(400mhz,d2o):δ(ppm)1.09,1.18(m,糖环-ch3)，2.27-2.48(t,-nch2ch2co-)，2.67(t,-nch2ch2co-)，2.74-3.10(t,-nch2ch2conh-)，3.15-3.47(m,h2,4-cd)，3.72，3.79(m,h5,6-cd)，4.08(t,h3-cd)，4.08-4.31(t,h2-5-糖环)，4.76(s,h1-糖环)，4.91(s,h1-cd)，ft-ir(kbr):3348cm^-1(n-h)，3118cm^-1(oh-)，2921cm^-1,22851cm^-1(c-h)，1706cm^-1,1647cm^-1(c=o)，1553cm^-1(n-h)，1435cm^-1(c-n)，1385cm^-1,1264cm^-1,1155cm^-1,1080cm^-1(c-o-c)，1033cm^-1(c-n)。

2、对岩藻糖与环糊精共修饰多肽纳米载体系统进行mtt细胞毒性测定。

用mtt试验来测定不同浓度的g5、cd-g5和cd-g5-s-fuc载体对raw264.7细胞活性的影响。用浓度为10%fbs、100u/ml双抗的1640培养基先润湿96孔板，然后将细胞以5×10⁴的密度接种至孔板中，每孔加入200µl培养基，在细胞培养箱为37℃及5%co2的条件下培养24h，然后弃取培养基，加入180µl不含fbs的1640培养基和20µl浓度从500-20000nm的g5、cd-g5和cd-g5-s-fuc载体药物，以dmso作为空白对照实验组，培养24h后每孔加入10µl(5.0mg/ml)的mtt溶液，继续孵化4h，吸除孔内培养液，每孔加入150µldmso，使结晶紫充分溶解，加入dmso10min内用酶标仪测定波长570nm处每个孔中的od值。

如图4所示，g5、cd-g5和cd-g5-s-fuc载体在50-2000nm浓度下的细胞活性结果，细胞活性均随着载体的浓度增大而升高，在同一浓度下，毒性由大到小的顺序为g5、cd-g5、cd-g5-s-fuc，当浓度为2000nm时，cd-g5-s-fuc组的细胞存活率仍然在80%以上，说明cd-g5-s-fuc相比g5和cd-g5作为纳米载体与细胞的相容性明显更高且更安全，细胞毒性显著降低，这很可能与本实施例所制备的纳米载体的结构有较大关系，fucose分子（也有可能是fucose与β-cd分子协同作用）修饰于pamam上后，在一定程度上遮蔽了pamam表面氨基，从而降低了氨基阳离子所带正电荷带来的细胞毒性。

3、对岩藻糖与环糊精共修饰多肽纳米载体系统进行靶向性能测定。

为了监测示踪纳米粒子被细胞摄取与转运，利用荧光分子fitc对纳米载体进行标记，对未连接靶向分子与连接靶向分子fucose的纳米载体均进行标记，形成cd-g5-fitc和cd-g5-s-fuc-fitc荧光分子，检测其靶向性：取raw264.7细胞接种到24孔板中，培养24h后，以dmso作为对照组，分别加入200nmcd-g5-s-fuc-fitc、cd-g5-fitc样品溶液，分别孵育4h、8h、24h，每个样品加三组，然后用4%的多聚甲醛固定液固定细胞，置于冰浴固定20min，将多聚甲醛回收，pbs洗三遍后，每孔加250µlhoechst33258染液染细胞核，37℃培养箱放置30min后取出，用pbs洗三遍，边洗边晃动，将游离的荧光药物充分洗掉，避免污染荧光背景，在倒置荧光显微镜下拍摄荧光成像图，并通过imagej（fiji）软件定量分析荧光成像图的平均荧光密度。

如图5所示，将raw264.7细胞分别孵育在200nm纳米粒子cd-g5-fitc与cd-g5-s-fuc-fitc，图5中（a）为分别拍摄孵育4h、8h、24h后的荧光成像图，并通过imagej（fiji）软件定量分析平均荧光强度如图5中（b）。分析显示，通过孵育相同时间后，cd-g5-s-fuc-fitc的平均荧光强度大于cd-g5-fitc的平均荧光强度（n=3，**p<0.01），平均荧光强度越大表示细胞摄取的纳米粒子越多，反之，摄取的越少，因此，说明cd-g5-s-fuc-fitc纳米粒子能靶向raw264.7细胞并很好的与细胞结合，其靶向性优于纳米粒子cd-g5-fitc。

取raw264.7细胞接种在24孔板中培养24h，再分别加入0µm、5µm、50µm岩藻糖，每个浓度加三组，以dmso为对照，孵育4h，然后吸除培养液，都加入200nmcd-g5-s-fuc-fitc样品溶液，继续在培养箱孵育24h，培养结束后用移除溶液，用pbs洗三次，多聚甲醛固定细胞，置于冰浴中固定20min，吸除多聚甲醛，用pbs洗涤三次，加hochest33258染细胞核，置于37℃细胞培养箱放置30min，pbs洗涤三遍，在荧光显微镜下拍摄荧光成像图，并通过imagej（fiji）软件定量分析荧光成像图。

如图6所示，图6中（a）、（b）和（c）分别为不加fucose，加5μm与50μm孵育raw264.7细胞4h，在加200nm纳米粒子cd-g5-s-fuc-fitc孵育24小时后的荧光显微镜成像图，图6中（d）为通过imagej（fiji）软件定量分析荧光图中的平均荧光强度，(n=3,*p<0.05，p**<0.01)。结果显示，不加岩藻糖孵育细胞的平均荧光强度最大，随着加的fucose浓度增大，平均荧光强度显著减小，平均荧光强度越小，纳米粒子cd-g5-s-fuc-fitc被细胞摄取的越少，说明fucose能竞争抑制cd-g5-s-fuc-fitc被巨噬细胞摄取，因此，结合上述，相同条件下cd-g5-fitc与cd-g5-s-fuc-fitc孵育巨噬细胞后，cd-g5-s-fuc-fitc的平均荧光强度明显大于cd-g5-fitc，可以得出游离的fucose分子能够特异性的识别并结合巨噬细胞表面的cd206受体，使得纳米粒子cd-g5-s-fuc-fitc具有选择性靶向巨噬细胞的能力。

4、对岩藻糖与环糊精共修饰多肽靶向动脉粥样硬化相关巨噬细胞纳米载体系统进行细胞内胆固醇移除性能测定。

采用bodipy-胆固醇标记法研究细胞内胆固醇流出情况。取raw264.7细胞接种在24孔板中，加入含10%fbs和100u/ml双抗的1640培养基，在37℃、5%co2培养箱中培养24h，然后弃去培养液，用pbs洗三次，每孔加入5µm的bodipy-胆固醇，继续孵育24h后弃液，用温pbs洗三次，洗去未与细胞结合的荧光探针，加100µm的羟丙基-β-环糊精作为阳性对照组，加dmso作为空白对照组，分别加100nm、200nm的cd-g5-s-fuc纳米粒子为实验组，培养24h后用pbs洗涤三次，用4%的多聚甲醛固定半个小时，回收多聚甲醛，用pbs充分洗三遍，去处细胞体外的荧光探针，在倒置荧光显微镜下拍摄荧光成像图，通过imagej（fiji）软件定量分析平均荧光密度。

图7中（a）为bodipy-胆固醇流出的荧光显微镜成像图，图7中（b）是通过imagej(fiji)软件定量分析的平均荧光强度，（n=3，*p<0.05，**p<0.01）。用dmso作为空白对照组，100µmhp-β-cd作为阳性对照组，100nmcd-g5-s-fuc与200nmcd-g5-s-fuc作为实验组，通过荧光倒置显微镜观察，对荧光成像图及平均荧光强度分析可以得出空白对照组的平均荧光强度最大，100µmhp-β-cd组与100nmcd-g5-s-fuc组的平均荧光强度相差不大，200nmcd-g5-s-fuc组平均荧光强度最弱，bodipy-胆固醇流出的越多平均荧光强度越小。与空白对照组相比，200nmcd-g5-s-fuc实验组平均荧光强度最小，说明其具有较好的诱导巨噬细胞内胆固醇外流的能力，并且明显优于阳性对照组。主要的原因应该是cd-g5-s-fuc纳米粒子上有靶向分子fucose能特异识别巨噬细胞表面cd206受体，并且在纳米粒子上接有β-cd分子，β-cd能够包合增溶胆固醇分子，而诱导胆固醇从细胞中流出，相比单独的hp-β-cd分子，纳米载体cd-g5-s-fuc有靶向分子，能够与β-cd产生协同作用，所以能更高效的移除巨噬细胞内胆固醇。

综合上述分析和测定结果可知，上述实施例中以pamamg5.0树状高分子为载体，分别将环糊精（β-cd）及靶向分子岩藻糖（fucose）连接在其表面，构建了一种新型靶向动脉粥样硬化斑块相关巨噬细胞的纳米载体系统，其中，fucose作为靶向分子作用于巨噬细胞，能够提高病灶部位的药物浓度，籍由fucose与环糊精共修饰所形成的独特结构，能够较好地遮蔽pamam表面氨基所带来的细胞毒性，同时纳米载体粒子尺寸极小，能够很好的穿透生物膜与血管壁，或可以透过肾脏的过滤，避免肾毒性，延长在血液中的循环时间。基于上述原因，上述实施例中所制备的纳米载体具有低毒、高靶向性、强穿透力和较好的生物相容性，能够使动脉粥样硬化斑块部位的药物浓度富集，减少用药剂量，降低毒副作用，从而为动脉粥样硬化针对病灶部位的防治提供了一种新的有效途径。

上述实施例为本发明较佳的实现方案，除此之外，本发明还可以其它方式实现，在不脱离本技术方案构思的前提下任何显而易见的替换均在本发明的保护范围之内。

最后，应该强调的是，为了让本领域普通技术人员更方便地理解本发明相对于现有技术的改进之处，本发明的一些描述已经被简化，并且为了清楚起见，本申请文件还省略了一些其它元素，本领域普通技术人员应该意识到这些省略的元素也可构成本发明的内容。