甲基牛扁亭或其柠檬酸盐在预防或治疗HIV相关神经认知功能障碍中的应用

甲基牛扁亭或其柠檬酸盐在预防或治疗hiv相关神经认知功能障碍中的应用
技术领域
1.本发明属于生物医药领域，具体涉及甲基牛扁亭或其柠檬酸盐在预防或治疗hiv相关神经认知功能障碍中的应用。


背景技术：

2.hiv
‑
1是人类面临的最具有挑战的传染病之一。hiv
‑
1感染除了引起获得性免疫缺陷综合征(aids)以外，还会导致一系列系统性的并发症，例如慢性炎症和hiv相关神经认知功能障碍(hand)。hand的症状表现为涵盖轻度的认知障碍以及严重至神经系统痴呆紊乱，而且，hiv
‑
1并发hand的可能性很高，大约有50％的hiv患者会表现出认知障碍，从而严重影响患者的心理健康、运动功能、学习和执行功能。相关文件表明，hand症状的发生与高浓度的血浆病毒载量密切相关，尽管高效抗逆转录病毒治疗(haart，即鸡尾酒疗法)已被广泛应用于治疗hiv
‑
1患者并收效显著，但对于hiv
‑
1并发的hand却没有任何治疗效果，目前，临床上尚无明确的能够有效治疗hand的特效药物和治疗策略。
3.因此，开发一种能够用于预防或治疗hiv相关神经认知功能障碍的药物或治疗方案不仅能够有效改善hiv患者生存质量，而且对于临床中hiv
‑
1并发的hand治疗及预防具有极为重要的意义。


技术实现要素：

4.本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出甲基牛扁亭或其柠檬酸盐在预防或治疗hiv相关神经认知功能障碍中的应用。发明人发现，甲基牛扁亭或其柠檬酸盐能够有效抑制α7nachr活化，改善gp120诱导的炎症和细胞损伤，减轻脑组织损伤，改善hand造成的认知障碍，从而具有显著改善hiv并发的hand症状的作用。
5.本发明的第一个方面，提供甲基牛扁亭或其药学上可接受的盐在制备预防或治疗hiv相关神经认知功能障碍试剂中的应用。
6.根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，甲基牛扁亭盐包括甲基牛扁亭柠檬酸盐。
7.在本发明的一些优选实施方式中，甲基牛扁亭盐为甲基牛扁亭柠檬酸盐。
8.甲基牛扁亭柠檬酸盐为甲基牛扁亭盐的柠檬酸盐，分子量为874.92，化学式为c
43
h
58
n2o
17
，cas号为351344
‑
10
‑
0，结构式如式i所示：
[0009][0010]
发明人发现，烟碱型乙酰胆碱7受体(α7nachr)可作为预防和改善hiv相关神经认知功能障碍(hand)的有效靶点，而甲基牛扁亭柠檬酸盐则能够有效抑制α7nachr受体，从而起到预防和改善hand的作用。在本发明构建的hiv
‑
1 gp120转基因小鼠与野生型小鼠对比中，可以发现hiv
‑
1 gp120转基因小鼠在认知行为方面的表现比野生型小鼠差，并且表现出明显的运动障碍，而使用α7nachr拮抗剂治疗hiv
‑
1 gp120转基因小鼠可明显改善其行为学表现和运动障碍，从而可以确定其具有预防和改善hand的功效。
[0011]
根据本发明的第一个方面，在本发明的一些实施方式中，所述甲基牛扁亭或其药学上可接受的盐的使用剂量为1nm～1000nm。
[0012]
发明人发现，在甲基牛扁亭柠檬酸盐使用剂量为1nm～1000nm的情况下，无任何细胞毒性，而且具有较好的hand治疗效果。
[0013]
本发明的第二个方面，提供甲基牛扁亭或其药学上可接受的盐在制备细胞损伤修复试剂中的应用。
[0014]
根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，甲基牛扁亭盐包括甲基牛扁亭柠檬酸盐。
[0015]
在本发明的一些优选实施方式中，甲基牛扁亭盐为甲基牛扁亭柠檬酸盐。
[0016]
gp120作为hiv
‑
1的包膜蛋白，其在hiv
‑
1感染过程中发挥的重要作用，gp120蛋白可诱导α7nachr功能上调，这将促进ca
2+
进入细胞，从而导致神经元细胞的死亡，加重hand症状。在本发明中，发明人发现，gp120所诱导的神经元细胞凋亡可通过甲基牛扁亭柠檬酸盐拮抗α7nachr活性来避免。
[0017]
根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述甲基牛扁亭或其药学上可接受的盐的使用剂量为1nm～1000nm。
[0018]
发明人发现，在甲基牛扁亭柠檬酸盐的使用剂量为1nm～1000nm的情况下，无任何细胞毒性，而且具有较好的细胞损伤修复效果。
[0019]
根据本发明的第二个方面，在本发明的一些实施方式中，所述细胞包括神经细胞、上皮细胞。
[0020]
在本发明的一些优选实施方式中，所述神经细胞为神经元细胞和胶质细胞，所述上皮细胞包括血管内皮细胞。
[0021]
本发明的第三个方面，提供甲基牛扁亭或其药学上可接受的盐在制备抗炎药物中的应用。
[0022]
根据本发明的第三个方面，在本发明的一些实施方式中，甲基牛扁亭盐包括甲基牛扁亭柠檬酸盐。
[0023]
在本发明的一些优选实施方式中，甲基牛扁亭盐为甲基牛扁亭柠檬酸盐。
[0024]
在本发明中，发明人发现，使用甲基牛扁亭柠檬酸盐能够显著降低细胞内炎症因子il
‑
1α的转录，从而有效抑制炎症的发生和进一步发展。
[0025]
根据本发明的第三个方面，在本发明的一些实施方式中，所述甲基牛扁亭或其药学上可接受的盐的使用剂量为1nm～1000nm。
[0026]
发明人发现，在甲基牛扁亭柠檬酸盐的使用剂量为1nm～1000nm的情况下，无任何细胞毒性，而且具有较好的炎症抑制效果。
[0027]
本发明的第四个方面，提供一种试剂，该试剂含有治疗有效量的甲基牛扁亭或其药学上可接受的盐。
[0028]
根据本发明的第四个方面，在本发明的一些实施方式中，甲基牛扁亭盐包括甲基牛扁亭柠檬酸盐。
[0029]
在本发明的一些优选实施方式中，甲基牛扁亭盐为甲基牛扁亭柠檬酸盐。
[0030]
根据本发明的第四个方面，在本发明的一些实施方式中，所述试剂的剂型包括溶液剂、散剂、胶囊剂、片剂。
[0031]
本发明的有益效果是：
[0032]
1.在本发明中，发明人发现甲基牛扁亭或其柠檬酸盐能够有效抑制α7nachr活化，改善gp120诱导的炎症和细胞损伤，减轻脑组织损伤，改善hand造成的认知障碍，从而具有显著改善hiv并发的hand症状的作用，为临床治疗hand提供新靶标、新途径。
[0033]
2.在本发明中，发明人发现了甲基牛扁亭或其柠檬酸盐对于炎症信号通路蛋白jak2/stat3蛋白的转录水平的影响，同时，还发现了能够显著降低细胞内炎症因子il
‑
1α的转录，从而发现了甲基牛扁亭或其柠檬酸盐具有较好的炎症抑制效果。
[0034]
3.在本发明中，发明人发现了甲基牛扁亭或其柠檬酸盐具有较好的细胞修复能力，尤其是对于神经细胞具有较强的保护作用。甲基牛扁亭柠檬酸盐能够抑制hiv
‑
1感染后gp120蛋白诱导的α7nachr功能上调带来的神经元细胞凋亡，从而减缓hiv
‑
1感染及并发的hand症状。
附图说明
[0035]
图1为本发明实施例中的甲基牛扁亭柠檬酸盐的细胞毒性测试结果；
[0036]
图2为本发明实施例中使用和不使用mla(10nm)处理的人脑微血管内皮细胞(hbmec)中α7nachr活化水平差异，其中，a为显微镜下的荧光图，b为统计对比图；
[0037]
图3为本发明实施例中gp120(150pm)及mla处理前后的astr细胞内α7nachr转录水平的变化；
[0038]
图4为本发明实施例中mla(10nm)治疗前后，gp120诱导的astr细胞的炎症水平变化，其中，a为il
‑
1α转录水平，b为jak2转录水平，c为stat3转录水平；
[0039]
图5为本发明实施例中mla(10nm)治疗前后，gp120诱导的神经元细胞(sy5y)凋亡
情况变化，其中，a为空白对照，b为gp120诱导组，c为mla处理组，d为mla治疗的gp120诱导组；
[0040]
图6为本发明实施例中mla(10nm)治疗前后，hiv
‑
1 gp120转基因小鼠脑组织内的病理改变，其中，a、b为野生型小鼠的he染色脑组织切片，c、d为hiv
‑
1 gp120转基因小鼠的he染色脑组织切片，e、f为mla治疗的hiv
‑
1 gp120转基因小鼠的he染色脑组织切片；
[0041]
图7为本发明实施例中mla(10nm)治疗前后，hiv
‑
1 gp120转基因小鼠行为学变化，其中，a为逃避潜伏期，b为穿越时间，c为在在q4中所花时间的百分比占比，d为在象限中所花时间的百分比占比；
[0042]
图8为本发明实施例中mla(10nm)治疗前后，hiv
‑
1 gp120转基因小鼠在莫里斯水迷宫的路线图，a为野生型小鼠，b为hiv
‑
1 gp120转基因小鼠，c为mla治疗的hiv
‑
1 gp120转基因小鼠。
具体实施方式
[0043]
为了使本发明的发明目的、技术方案及其技术效果更加清晰，以下结合具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并非为了限定本发明。
[0044]
所使用的实验材料和试剂，若无特别说明，均为常规可从商业途径所获得的耗材和试剂。
[0045]
甲基牛扁亭柠檬酸盐的细胞毒性测试
[0046]
在本实施例中，为了验证甲基牛扁亭柠檬酸盐(methyllycaconitine citrate，mla)的细胞毒性，以不同浓度(1nm～1000nm)的甲基牛扁亭柠檬酸盐处理astr细胞，孵育24h后，检查astr细胞的存活情况。以不添加甲基牛扁亭柠檬酸盐的细胞为对照。
[0047]
通过cck8(cell counting kit
‑
8)检测细胞活性。
[0048]
细胞毒性实验结果如图1所示。
[0049]
结果发现，astr细胞在使用剂量为1nm～1000nm的甲基牛扁亭柠檬酸盐共同孵育条件下，细胞存活率未发生显著变化，且将孵育时间延长(48h)后，其细胞数量与对照组不存在显著差异性，因此，可以说明1nm～1000nm的甲基牛扁亭柠檬酸盐并不具有细胞毒性，且不会影响细胞的正常生长或增殖。
[0050]
甲基牛扁亭柠檬酸盐对于细胞内的α7nachr的活化抑制作用
[0051]
在本实施例中，为了验证甲基牛扁亭柠檬酸盐对人脑微血管内皮细胞(hbmec)中α7nachr活性的抑制能力，发明人使用α银环蛇毒素(α
‑
btx)作为检测试剂来检测hbmec中的α7nachr活性变化。
[0052]
具体步骤如下：
[0053]
设置3组实验，以加入10nm的mla的hbmec作为实验组(hbmec+mla)，以加入10nm的α7nachr激动剂(nicotine，nt)的hbmec作为反向对照组(hbmec+nt)，以不做任何处理的hbmec作为空白对照组(control)。各组在试剂加入后在适宜环境下培养1h。
[0054]
培养结束后，采用细胞免疫荧光检测方法，以alexa fluor 488
‑
conjugatedα
‑
bungarotoxin(α银环蛇毒素)作为唯一抗体，加入至各组中，避光4℃孵育1h，然后使用4',6
‑
二脒基
‑2‑
苯基吲哚(dapi)对细胞核染色，封片观察。各组实验数据均经calcusyn软件分
析后，用于评价mla对α7nachr活性的抑制水平。
[0055]
同时，使用荧光定量pcr定量检测α7nachr的mrna转录水平。在本实施例中，使用gp120作为诱导α7nachr表达上调的试剂。
[0056]
具体步骤如下：
[0057]
以星形胶质细胞(astrocyte，astr)为检测细胞，分别加入150pm的gp120、10nm的mla、和150pm的gp120+10nm的mla，孵育1h。设置对照组，对照组中的astr不做任何处理。
[0058]
采用trizol法提取各组中的贴壁细胞的总mrna，收集mrna逆转录成cdna。
[0059]
设计α7nachr上下游引物，具体引物序列如下所示：
[0060]
α7nachr
‑
f：5
’‑
ccaccaacatttggctgcaa
‑3’
(seq id no.1)；
[0061]
α7nachr
‑
r：5
’‑
tatgcctggaggcaggtact
‑3’
(seq id no.2)。
[0062]
在表1所示反应体系中的进行pcr扩增。
[0063]
表1荧光定量pcr反应体系
[0064][0065]
反应程序为：95℃30s；95℃5s、60℃30s，40个循环；4℃保存。
[0066]
根据扩增产物的荧光强度分析各组细胞中的α7nachr的mrna转录水平。
[0067]
结果如图2和图3所示。
[0068]
α7nachr荧光强度结果如图2所示：通过对免疫荧光强度的半定量分析，可以发现，相对于未作任何处理的对照组，nt处理显著激活了细胞膜上的α7nachr活性，而mla处理则降低了细胞膜上的α7nachr受体活性。进一步根据α7nachr转录水平变化(图3)，可以发现在使用gp120处理星形胶质细胞后，细胞内的α7nachr转录水平显著上调，而在仅使用mla处理的astr内，α7nachr转录水平与对照组相比，不存在显著差异性。使用mla治疗经过gp120处理后的astr可以使其胞内的α7nachr转录水平显著降低，α7nachr转录水平整体恢复至正常水平。结果表明，mla处理能显著抑制细胞内α7nachr的活化，从而有效防治hand症状的发生。
[0069]
mla对gp120诱导的炎症和细胞损伤的治疗作用
[0070]
使用荧光定量pcr检测astr细胞内jak2、stat3炎症通路蛋白以及il
‑
1α炎症因子的mrna转录水平，以说明mla对gp120诱导的炎症和细胞损伤的治疗作用。
[0071]
具体实验步骤如下：
[0072]
以星形胶质细胞(astrocyte，astr)为检测细胞，分别加入150pm的gp120、10nm的
mla、和150pm的gp120+10nm的mla，孵育1h。设置对照组，对照组中的astr不做任何处理。
[0073]
同时，使用荧光定量pcr定量检测jak2、stat3和il
‑
1α的转录水平，具体步骤如下：
[0074]
采用trizol法提取各组中的贴壁细胞的总mrna，收集mrna逆转录成cdna。
[0075]
设计jak2、stat3和il
‑
1α上下游引物，具体引物序列如下所示：
[0076]
jak2
‑
f：5
’‑
cgaatggtgtttctgatgtacc
‑3’
(seq id no.3)；
[0077]
jak2
‑
r：5
’‑
gtctcctacttctcttcgtacg
‑3’
(seq id no.4)；
[0078]
stat3
‑
f：5
’‑
ccccgtacctgaagaccaagt
‑3’
(seq id no.5)；
[0079]
stat3
‑
r：5
’‑
ccgttatttccaaactgcatca
‑3’
(seq id no.6)；
[0080]
il
‑
1α
‑
f：5
’‑
cttctgggaaactcacggca
‑3’
(seq id no.7)；
[0081]
il
‑
1α
‑
r：5
’‑
agcacacccagtagtcttgc
‑3’
(seq id no.8)。
[0082]
在表2所示反应体系中的进行pcr扩增。
[0083]
表2荧光定量pcr反应体系
[0084][0085]
反应程序为：95℃30s；95℃5s、60℃30s，40个循环；4℃保存。
[0086]
根据扩增产物的荧光强度分析各组细胞中的jak2、stat3和il
‑
1α的mrna转录水平。
[0087]
同时，为了进一步确认mla对gp120诱导的炎症和细胞损伤的治疗作用，使用神经元细胞(sy5y)为对象，分别加入150pm的gp120、10nm的mla、和150pm的gp120+10nm的mla，孵育1h。设置对照组，对照组中的sy5y不做任何处理。使用显微镜观察gp120、mla处理后的sy5y细胞形态和数量变化。
[0088]
结果如图4和图5所示。
[0089]
astr细胞内jak2、stat3和il
‑
1α转录水平如图4所示：可以发现，在仅使用mla处理过的astr细胞中，jak2、stat3转录水平的变化趋势基本一致，说明mla处理有效降低了astr细胞内的炎症蛋白转录水平。对照gp120诱导的astr细胞，当使用mla治疗gp120诱导的astr时，可以发现细胞内il
‑
1α炎症因子转录明显受到抑制，且il
‑
1α炎症因子的转录变化趋势与α7nachr一致(图4c)，因此，可以认为，使用mla治疗gp120诱导的astr细胞，可以有效抑制jak2和stat3炎症蛋白的转录过程，并显著抑制炎症因子il
‑
1α的转录。
[0090]
gp120、mla处理对神经元细胞的影响如图5所示：可以发现，在gp120处理后，sy5y细胞数量明显减少，细胞形态改变；而单独使用mla处理的细胞未发生明显损伤，细胞形态
呈现为典型的神经元细胞形态，说明mla处理并不会对细胞造成损伤，不具有细胞毒性。在使用mla治疗gp120诱导的神经元细胞时，可以发现，细胞数量减少的情况明显受到抑制，说明mla可以显著预防gp120对神经元细胞的损失，提高细胞存活率。
[0091]
mla对hand造成的脑组织损伤的治疗作用
[0092]
本实施例中，以9月龄hiv
‑
1 gp120转基因小鼠为研究对象，其中，hiv
‑
1 gp120转基因小鼠(gp120 tg)该小鼠以gfap为启动子在星形胶质细胞中高表达可溶性的hiv
‑
1lav gp120(x4)蛋白。
[0093]
将实验小鼠(gp120 tg)分为两组，其中一组使用mla处理，另一组则不作任何处理，同时，以野生型小鼠(wt，9月龄)作为空白对照，观察mla对实验小鼠脑组织损伤的治疗作用。
[0094]
具体实验步骤如下：
[0095]
gp120 tg和wt小鼠均每天腹腔注射0.1ml生理盐水，同时，gp120 tg+mla组小鼠每天额外腹腔注射0.1ml mla溶液(5mg/kg)，连续30天。实验30天后，处死小鼠并取小鼠全脑组织，在10％福尔马林缓冲液中固定24h，包埋在石蜡中，制备厚度为5μm的切片。小鼠全脑组织切片使用苏木精和伊红染色后，在显微镜下观察并记录大脑组织中的形态学改变。
[0096]
小鼠全脑组织切片he染色结果如图6所示：可以发现，相较于wt小鼠，hiv
‑
1 gp120转基因小鼠的海马回部位细胞形态、排列明显改变，而使用mla治疗的hiv
‑
1 gp120转基因小鼠海马回区域的细胞形态改变不明显，说明mla治疗显著改善了hand造成的海马回区域的细胞形态改变。从400
×
放大图来看，wt小鼠海马回细胞排列整齐，紧密可见细胞分层，细胞完整细胞核圆形，核仁明显，而hiv
‑
1 gp120转基因小鼠海马回细胞排列疏松，分层不明显，细胞形态胀大为圆形，说明gp120蛋白转入引起的hand会对海马回造成严重破坏。而在使用mla处理后，hiv
‑
1 gp120转基因小鼠海马回细胞排列相比于对照组hiv
‑
1 gp120转基因小鼠明显紧密，可见细胞分层，大部分细胞形态规整，细胞排列和形态接近wt小鼠，说明mla对hand造成的脑组织损伤具有较好的治疗作用。
[0097]
mla长期治疗对hand造成的学习认知障碍的改善效果
[0098]
本实施例采用莫里斯水迷宫实验验证mla长期治疗对hand造成的学习认知障碍的改善效果。莫里斯水迷宫实验是目前广泛应用于评价啮齿类动物认知障碍的行为学方法，主要用于检测动物的空间记忆能力，因此，能够很好的体现出检测对象的学习认知能力。
[0099]
将实验小鼠(gp120 tg)分为两组，其中一组使用mla处理，另一组则不作任何处理，同时，以野生型小鼠(wt，9月龄)作为空白对照。gp120 tg和wt小鼠均每天腹腔注射0.1ml生理盐水，同时，gp120 tg+mla组小鼠每天额外腹腔注射0.1ml mla溶液(5mg/kg)，连续30天。实验30天后，使用莫里斯水迷宫评价小鼠认知障碍损伤水平。
[0100]
结果如图7和8所示。
[0101]
可以发现，在莫里斯水迷宫实验中，相较于wt，hiv
‑
1 gp120转基因小鼠在寻找平台潜伏期明显花费更长时间(p＜0.05)(图7中a)。hiv
‑
1 gp120转基因小鼠在平台所在象限的探索时间明显低于wt小鼠和mla治疗后的hiv
‑
1 gp120转基因小鼠(具有统计学差异)，而且该点也可以从路线图中体现出来(图8)。hiv
‑
1 gp120转基因小鼠在平台所在象限的探索时间与其他三个区域的平均探索时间(图7中d)相比没有统计学差异，而wt小鼠花费更多时间探索平台所在区域(p＜0.001)。这一些系列结果均能有效表明hiv
‑
1 gp120转基因小鼠
相较于wt小鼠认知学习能力明显受损，而mla的长期腹腔注射治疗将明显改善hiv
‑
1 gp120转基因小鼠受损的认知和学习能力，说明mla长期治疗能够有效改善hand造成的学习认知障碍。
[0102]
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。