长柔毛薯蓣根提取物的美白用途的制作方法

1.本发明涉及化妆品领域，具体涉及一种长柔毛薯蓣(dioscorea villosa)根提取物的美白用途。


背景技术：

2.长柔毛薯蓣(dioscorea villosa)原产于北美，已被用作雌激素替代疗法的天然替代品，以改善妇女的健康状况以及治疗炎症，肌肉痉挛和哮喘。长柔毛薯蓣根提取物中含有丰富的次生代谢产物，包括类固醇，双氯丁烷二萜，醌，花青素，酚类，二芳基庚烷类和含氮化合物。除了丰富的营养价值外，它还是预防/治疗几种疾病的重要生物活性物质的潜在来源。目前，虽然长柔毛薯蓣及其提取物的一些方面得到应用，但其用途仍有待进一步开发。
3.因此，本领域需要提供长柔毛薯蓣提取物的新用途。


技术实现要素：

4.本发明的目的是提供长柔毛薯蓣根提取物的用于美白的用途。
5.本发明第一方面，提供了一种长柔毛薯蓣根提取物的用途，用于制备一药物组合物或化妆品组合物，且所述药物组合物或化妆品组合物用于：抑制黑色素生成、减少色素沉积、祛斑、美白和/或均匀肤色。
6.在本发明的一个优选例中，提取物的制备通过溶剂提取法、萃取法、超临界萃取法和/或色谱法进行。
7.在另一优选例中，所述提取物还用于选自下组的用途：表皮修复。
8.在另一优选例中，所述提取物的由下述方法制备，包括步骤：
9.(a)在强酸存在下，将长柔毛薯蓣根粉末在醇水溶剂中加热水解，固液分离得反应液；
10.(b)用将所述反应液用有机溶剂萃取，合并有机相；
11.(c)将所述有机相洗涤，所得有机相，浓缩去除有机溶剂，得所述长柔毛薯蓣根提取物。
12.在另一优选例中，步骤(a)具有选自下组的一个或多个特征：
13.(1)所述强酸为硫酸；
14.(2)所述加热温度为50-80℃，较佳地，60-70℃，如回流温度；
15.(3)所述加热的时间为4-12h,较佳地，6-10h；
16.(4)所述醇水溶剂中，所述醇为c1-c4醇，如甲醇、乙醇、异丙醇，或其组合；
17.(5)所述醇水溶剂中，所述醇的含量为50-80wt％，较佳地，60-70wt％；
18.(6)所述强酸在反应溶剂(酸和醇水溶剂之和)中的浓度为15-25wt％，较佳地，18-20wt％；和/或
19.(7)所述固液分离为离心或过滤。
20.在另一优选例中，所述长柔毛薯蓣根粉末与所述醇水溶剂用量比为5-100g/l，较佳地，10-50g/l，如20-30g/l。
21.在另一优选例中，所述长柔毛薯蓣根粉末的目数为30-100目，较佳地，50-80目。
22.在另一优选例中，步骤(b)具有选自下组的一个或多个特征：
23.(1)所述有机溶剂选自下组：正己烷、乙酸乙酯、或其组合；
24.(2)所述萃取次数为1-5次，较佳地，2-4次。
25.在另一优选例中，步骤(c)具有选自下组的一个或多个特征：
26.(1)所述洗涤为依次用氢氧化钠溶液(2-4次)、水(2-4次)漂洗；
27.(2)所述氢氧化钠溶液为3-8wt％的naoh溶液；和/或
28.(3)所述浓缩选自下组：减压浓缩、常压挥发、冻干，或其组合。
29.(4)所述浓缩的温度≤45℃，较佳地，≤40℃，如-20-40℃。
30.在另一优选例中，所述组合物还包括化妆品学上或药学上可接受的载体。
31.在另一优选例中，所述药物或化妆品组合物还包括选自下组的额外组分：美白或祛斑成分、抗炎成分、抗氧化成分、抗紫外线成分、或其组合。
32.在另一优选例中，所述化妆品学上可接受的载体或赋形剂选自下组：保湿剂、抗氧化剂、抗紫外线剂、防腐剂、成膜剂、油溶性凝胶化剂、有机改性粘土矿物、树脂、抗菌剂、香精、盐类、ph调节剂、螯合剂、清凉剂、抗炎剂、皮肤美化用成分、维生素、氨基酸、核酸、激素、包合化合物或其组合。
33.在另一优选例中，所述药物组合物包括：膏剂、霜剂、凝胶剂或糊剂。
34.在另一优选例中，所述化妆品组合物的剂型为固体剂型、半固体剂型、或液体剂型，如溶液、凝胶、膏霜、乳液、喷雾、膏剂、霜剂、糊剂、饼、粉剂、贴剂等。
35.本发明第二方面，提供了一种化妆品组合物，所述组合物包括：
36.(a)作为美白活性成分的长柔毛薯蓣根提取物；
37.(b)化妆品学上可接受的载体或赋形剂。
38.在另一优选例中，化妆品组合物用于：抑制黑色素生成、减少色素沉积、祛斑、美白和/或均匀肤色。
39.在另一优选例中，在所述化妆品组合物中，所述长柔毛薯蓣根提取物(以干重计)的质量百分比为0.0001-15wt％，较佳0.0001-10wt％，较佳地0.001-5wt％，如0.0.1wt％、0.1wt％、1wt％、2wt％、3wt％，4wt％，6wt％或8wt％，以化妆品组合物的总重量计。
40.在另一优选例中，所述化妆品组合物还包括选自下组的额外组分：美白或祛斑成分、抗炎成分、抗氧化成分、抗紫外线成分、或其组合。
41.在另一优选例中，所述化妆品学上可接受的载体或赋形剂选自下组：保湿剂、抗氧化剂、抗紫外线剂、防腐剂、成膜剂、油溶性凝胶化剂、有机改性粘土矿物、树脂、抗菌剂、香精、盐类、ph调节剂、螯合剂、清凉剂、抗炎剂、皮肤美化用成分、维生素、氨基酸、核酸、激素、包合化合物或其组合。
42.在另一优选例中，所述化妆品组合物的剂型为固体剂型、半固体剂型、或液体剂型，如溶液、凝胶、乳液、膏剂、霜剂、糊剂、饼、粉剂、贴剂、喷雾等。
43.在另一优选例中，所述化妆品组合物用于抑制黑色素生成、减少色素沉积、祛斑、美白和/或均匀肤色。
44.在另一优选例中，所述化妆品组合物含有长柔毛薯蓣根提取物作为有效成分，较佳地，所述有效成分为用于抑制黑色素生成、减少色素沉积、祛斑、美白和/或均匀肤色的成分。
45.本发明第三方面，提供了一种护肤的方法，包括步骤：给予有需要的对象有效量的长柔毛薯蓣根提取物或包含其的组合物，从而抑制黑色素生成、减少色素沉积、祛斑、美白和/或均匀肤色。
46.在另一优选例中，所述长柔毛薯蓣根提取物或包含其的组合物施用于所述对象的皮肤。
47.应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
48.图1显示通过cck-8分析，长柔毛薯蓣根粗提物对melan-a黑色素细胞处理72h后的细胞存活率的影响。每个值表示为平均值
±
标准差；*与对照组的显着差异p《0.05；**与对照组的显着差异p《0.01。
49.图2显示长柔毛薯蓣根粗提物对melan-a黑色素细胞处理72h后，对细胞内黑色素合成的抑制作用，*与对照组的显着差异p《0.05；**与对照组的显着差异p《0.01；***与对照组的显着差异p《0.001。
具体实施方式
50.本发明人经过广泛而深入的研究，通过大量筛选和测试，提供了长柔毛薯蓣(dioscorea villosa)根提取物的在美白方面的用途。本发明人意外地发现，长柔毛薯蓣根提取物能够显著抑制细胞内黑色素的产生，从而具有美白作用。在此基础上完成了本发明。
51.此外，长柔毛薯蓣根提取物对细胞无毒害，且够促进皮肤细胞生长，非常适合用于制备皮肤用化妆品或药品。
52.术语
53.除非另有定义，否则本文中所用的全部技术术语和科学术语均具有如本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。
54.如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。
55.如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由
…
构成”、或“由
…
构成”。
56.如本文所用，术语“室温”是指温度为4-40℃，较佳地，25
±
5℃。
57.长柔毛薯蓣(dioscorea villosa)
58.长柔毛薯蓣(dioscorea villosa)原产于北美，已被用作雌激素替代疗法的天然替代品，以改善妇女的健康状况以及治疗炎症，肌肉痉挛和哮喘。
59.提取物
60.如本文所用，术语“本发明的提取物”或“活性成分”指提取自长柔毛薯蓣根的，具有抑制黑色素生成、减少色素沉积、祛斑、美白或均匀肤色等作用的提取物。
61.在本发明中，本发明活性成分可用长柔毛薯蓣根为原料进行提取。
62.如本文所用，术语“提取物”或“活性成分”包括水溶性的和/或脂溶性的提取物。该术语还包括醇提取物、或水提取物、或醇水溶剂提取物。此外，还包括活性成分群，即含有脂溶性活性成分和水溶性活性成分的提取物或其混合物。
63.如本文所用，“水溶性提取物”指的是可溶于极性溶剂(优选地，水)的提取物。
64.在另一优选例中，本发明提取物是通过本发明提取方法提取得到的。
65.经分析，本发明提取物所含的化学成分至少包括一种或多种选自下组的物质：皂苷、苷元、多巴胺、生物碱、氨基酸、甾醇，二芳基庚烷或其组合。
66.在另一优选例中，所述提取物富含二芳基庚烷(diarylheptanoids)类化合物。
67.经分析，本发明提取物所含的二芳基庚烷类化合物的含量≥0.005wt％，较佳地≥0.05wt％或≥0.1wt％更佳地，0.1-0.5wt％，所述提取物干重计。
68.可用于制备本发明的长柔毛薯蓣根提取物的方法没有特别限制。可以用常规方法，以长柔毛薯蓣根为原料，获得水溶性的和/或脂溶性的提取物。
69.在本发明的一个优选例中，提取物的制备通过溶剂提取法、萃取法、超临界萃取法和/或色谱法进行。
70.在本发明中，提取次数可以是一次或多次(如2次、3次、4次、5次)。当多次提取时，可将多次的提取物合并后进行后续处理。
71.在本发明中，对于溶剂提取法，其所用的溶剂没有特别限制，代表性的例子包括(但并不限于)：水、乙醇、甲醇、异丙醇、醇水(混合)溶剂，或其组合。
72.在本发明中，所述醇水溶剂指水与其他溶剂如醇(尤其是c1-c4醇，如甲醇、乙醇、异丙醇)所形成的混合溶剂。通常，在醇水溶剂中，醇的含量为20-90wt％，较佳地50-80wt％，如60wt％、70wt％，按醇水溶剂的总重量计。
73.优选地，所述提取溶剂中含有酸，如硫酸等。通常，所述提取溶剂中酸的浓度为0.5-30wt％，较佳地，5-25wt％，如10wt％或20wt％。
74.在本发明中，对于溶剂萃取法，其所用的溶剂没有特别限制，代表性的例子包括(但并不限于)：正丁醇、二氯甲烷、氯仿、c5-c7烷烃(如正己烷)、环己烷、石油醚中的一种或几种溶剂的混合溶剂。萃取次数可以是一次或多次。
75.在本发明中，对于超临界萃取，其所用溶剂没有特别限制，代表性的例子包括(但并不限于)：二氧化碳或丙烷。
76.在本发明中，对于柱色谱法，其柱色谱没有特别限制，代表性的例子包括(但并不限于)：活性碳、硅胶、反相硅胶、大孔树脂、葡聚糖凝胶中的一种或几种的组合。
77.在本发明的一个优选例中，以长柔毛薯蓣根(干燥或新鲜的根)为原料，以足量的含酸的醇水溶剂(如5-200倍重量)加热水解，从而获得提取物。此外，本发明中，还可进一步地用非极性溶剂(如正己烷)萃取合并有机层用碱水洗涤，从而获得脂溶性活性成分含量(或相对含量)更高的长柔毛薯蓣根提取物。
78.更优选地，将长柔毛薯蓣(dioscorea villosa)根研磨成粉末(如50-80目)，取细粉，以25-35ml/g细粉的量加入含有20％硫酸的70％异丙醇(如将2体积的98％浓硫酸稀释
在8体积的70％异丙醇溶液中来配置)中回流(60-65℃)水解6-10h。过滤得提取液，用正己烷萃取(2-4次)。合并正己烷萃取液，然后用4-6％的氢氧化钠溶液漂洗(2-4次)，再用蒸馏水漂洗(2-4次)，留下清洗后的正己烷萃取液，浓缩至无正己烷，得长柔毛薯蓣根粗提物浸膏。
79.经测试，该提取物具有显著更低或没有细胞毒性。
80.应用
81.如本文所用，术语“药物或化妆品组合物”包括(a)本发明所述的提取物；和(b)药学上或化妆品学上可接受的载体或赋形剂。此外，所述药物组合物还包括保健品组合物，所述化妆品组合物包括护肤品。
82.有可能将本发明的长柔毛薯蓣根提取物制备成药物组合物，诸如片剂、胶囊、粉剂、微粒剂、溶液剂、锭剂、胶冻、乳膏制剂、醑剂、悬液、酊、泥敷剂、搽剂、洗剂、和气雾剂之类的剂型。药物能够由通常已知的制备技术来制备，并且合适的药物添加剂能够被添加到该药物中。
83.药物添加剂的例子包括赋形剂、粘结剂、分解剂、润滑剂、流动助剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂、保温(润湿)剂、防腐剂、溶剂、增溶剂、防腐剂、调味剂、增甜剂、染料、香料、推进剂等，这些药物添加剂可以进行选择并以在不影响本发明的效果的范围内的合适量添加。
84.有可能将本发明的长柔毛薯蓣根提取物制备成化妆品组合物，如乳剂、液体、膏剂、霜剂、糊剂、饼、粉剂之类的剂型。
85.在不防碍本发明的效果的范围内，本发明的化妆品中可以添加通常的化妆品中使用的其它成分，例如成膜剂、油溶性凝胶化剂、有机改性粘土矿物、树脂、保湿剂、防腐剂、抗菌剂、香精、盐类、抗氧化剂、ph调节剂、螯合剂、清凉剂、抗炎剂、皮肤美化用成分(美白剂、细胞活性剂、皮肤粗糙改善剂、血液循环促进剂、皮肤收敛剂、抗脂漏剂等)、维生素类、氨基酸类、核酸、激素、包合化合物等。
86.可用于本发明的油溶性凝胶化剂包括但并不限于硬脂酸铝、硬脂酸镁、肉豆蔻酸锌等金属皂；n-月桂酰基-l-谷氨酸、α，γ-二-正丁基胺等氨基酸衍生物；环糊精棕榈酸酯、环糊精硬脂酸酯、环糊精2-乙基己酸棕榈酸酯等环糊精脂肪酸酯；蔗糖棕榈酸酯、蔗糖硬脂酸酯等蔗糖脂肪酸酯；一亚苄基山梨醇、二亚苄基山梨醇等山梨醇的亚苄基衍生物；二甲基苄基十二烷基铵蒙脱石粘土、二甲基二十八烷基铵蒙脱石粘土等有机改性粘土矿物等的凝胶化剂，可以根据需要使用一种，或者使用二种或以上。
87.保湿剂包括但并不限于甘油、山梨醇、丙二醇、双丙甘醇、1，3-丁二醇、葡萄糖、木糖醇、麦芽糖醇、聚乙二醇、透明质酸、硫酸软骨素、吡咯烷酮羧酸盐、聚氧乙烯甲基葡糖苷、聚氧丙烯甲基葡糖苷等。
88.抗菌防腐剂包括但并不限于对羟基苯甲酸烷基酯、苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸、山梨酸钾、苯氧基乙醇等，抗菌剂有：苯甲酸、水杨酸、石炭酸、山梨酸、对羟基苯甲酸烷基酯、对氯间甲酚、六氯酚、苯扎氯铵、氯化洗必泰、三氯-n-碳酰苯胺、三氯生、感光素、苯氧基乙醇等。
89.抗氧化剂包括但并不限于生育酚、丁基羟基茴香醚、二丁基羟基甲苯、植酸等，ph调节剂有：乳酸、柠檬酸、乙醇酸、琥珀酸、酒石酸、dl-苹果酸、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢铵等，螯合剂有丙氨酸、乙二胺四乙酸钠盐、多磷酸钠、偏磷酸钠、磷酸等，清凉剂有：l-薄荷
press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
103.实施例1
104.1.提取方法
105.将长柔毛薯蓣(dioscorea villosa)根研磨成粉末，使其通过60目(0.25mm)筛。取10g细粉，在300ml含有20％硫酸的70％异丙醇(61.2ml的98％浓硫酸稀释在238.8ml的70％异丙醇溶液中)中回流(60℃)水解8h。过滤得提取液，用100ml正己烷萃取3次。合并三次正己烷萃取液，然后用5％的氢氧化钠溶液漂洗三次，再用蒸馏水漂洗三次，留下清洗后的正己烷萃取液，40℃以下减压浓缩至无正己烷，得长柔毛薯蓣根粗提物浸膏。
106.2.活性实验
107.2.1小鼠melan-a黑色素细胞培养及处理
108.melan-a细胞由香港中文大学赠与。细胞培养于含10％胎牛血清(gibco,grand island,ny)以及1％抗生素的(青霉素100u/ml，链霉素100ug/ml)的rpmi1640(gibco,grand island,ny)培养基内，放置于37℃，5％co2条件下常规培养。长柔毛薯蓣根粗提物溶解于100％dmso溶液中储存，在使用前用细胞培养基稀释至相应浓度。最终培养基内的dmso浓度不超过0.1％。
109.2.2cck-8法细胞存活率测试
110.cck-8法细胞存活率测试用于决定提取物的安全实验浓度。实验前24h接种100μl melan-a细胞(2x104个/孔)至96孔板内，加入不同浓度的提取物(50ug/ml,以干重计)处理72h后，用pbs冲洗细胞以去除培养基以及加入的提取物，每孔再加入10μl cck-8溶液培养2h，酶联免疫检测仪(bio-rad)450nm波长下读取吸光度值。细胞存活率＝(实验组od值-空白组od值)/(对照组od值-空白组od值)。每一个结果由三次独立实验结果的mean
±
s.d表示。
111.2.3srb法细胞数目统计及细胞黑色素含量测试
112.srb法用于黑色素含量测试前统计相应的细胞数目，以保证黑色素含量的减少不是因为细胞的大量死亡。接种melan-a细胞(3x105个/孔)于12孔板内，培养24h后，用含提取物(50ug/ml,以干重计)和α-msh(1μm)，以及不含提取物的α-msh(1μm)新鲜培养基换液1次，继续孵育72h。结束培养后，先用srb法统计每一孔内细胞的数量：每孔细胞培养液中加入250μl三氯乙酸(4℃)来固定细胞于12孔板壁，固定1h后，用pbs洗涤细胞5次来除去三氯乙酸，培养基以及死细胞。将12孔板风干后，每孔加入500μl含0.4％w/v srb的1％醋酸溶液，染色30min，再用1％醋酸溶液洗涤10次来彻底去除未与细胞结合的srb晶体。风干12孔板，每孔加入300μl 10mm trisbase溶解细胞中的紫色晶体，震动摇晃15min充分溶解，转移至96孔板内，酶联免疫检测仪(bio-rad)595nm波长下读取吸光度值ods。srb法的固定步骤使得细胞中的黑色素总量能够在细胞数目统计后测量。用pbs洗涤细胞2次除去细胞中的srb晶体，风干十二孔板后加入300μl胰酶消化1h。加入300μl培养基停止消化并收集细胞悬浊液于1.5ml离心管内，13500*g离心10min，去除上清液，放入冻干机内12h彻底去除残留液体。加入150μl 1n氢氧化钠溶液彻底溶解细胞中黑色素后，转移至96孔板内，用酶联免疫检测仪(bio-rad)595nm波长下读取吸光度值odm。由于黑色素溶液和srb结晶溶液与黑色素含量以及细胞数目均具有线性关系，因此提取物对细胞内黑色素的抑制结果＝ods/odm。每一
个结果由三次独立实验结果的mean
±
s.d表示。p值小于0.05表示有显著性差异。*表示p值小于0.05，**表示p值小于0.01。
113.2.4.实验结果
114.结果如图1所示，处理72h后，长柔毛薯蓣根粗提物显著增加了melan-a细胞的存活率，证明其对细胞无毒害且有助于细胞的生长。
115.结果如图2所示，处理72h后，长柔毛薯蓣根粗提物显著降低了melan-a细胞内的黑色素含量，抑制了黑色素的生成，因此可作为一种新的美白成分添加于护肤品以及药品中。
116.综上所述，长柔毛薯蓣根提取物能够显著抑制黑色素的产生，从而具有美白作用。此外，长柔毛薯蓣根提取物对细胞无毒害，且够促进皮肤细胞生长，非常适合用于制备皮肤用化妆品或药品。
117.在本发明提及的所有文献都在本技术中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本技术所附权利要求书所限定的范围。