CO释放载体组合物、CO释放载体及其制备方法、声动力诱导CO释放的方法与流程

co释放载体组合物、co释放载体及其制备方法、声动力诱导co释放的方法
技术领域
1.本发明涉及生物材料技术领域，具体涉及一种co释放载体组合物、co释放载体及其制备方法，含有co释放载体组合物或co释放载体的药物组合物，以及一种声动力诱导co释放的方法。


背景技术：

2.一个多世纪以来，一氧化碳(co)一直被作为一种有毒物质进行研究。co与血液中的血红蛋白具有高亲和力(其强度是o2与血红蛋白亲和力的220倍)，会干扰氧气向组织的输送，一旦co与血红蛋白形成的碳氧血红蛋白(cohb)占据总血红蛋白含量的50％-60％，人体就会出现昏迷、抽搐、呼吸抑制等致命后果。因此，co一直背负污名。
3.近年来，这种偏见发生了变化。1968年，tenhunen等人发现血红素加氧酶(ho)是负责血红素催化、诱导细胞内co产生的限速酶，提示高浓度的cohb不一定会干扰血液的携氧能力。自此，co被认为是哺乳动物系统中的一种多功能信号分子，与一氧化氮(no)和硫化氢(h2s)具有类似的生物活性。目前，大量研究已证明co具有显著的生物学效应，包括血管舒张、抗血栓形成、抗炎、抗菌、促进肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤细胞增殖等作用。这些有趣的生物活性激发了人们对开发基于co治疗各种疾病的研究兴趣，如缺血/再灌注损伤、器官移植、炎症、脓毒症、微生物感染和癌症等。
4.然而由于难以处理和输送co气体，其在体内的应用仍然具有很高的挑战性。目前临床中可供使用的co吸入装置存在着诸多问题，如吸入高浓度的co会导致中毒，且该方法缺乏目标选择性和剂量可控性，将造成全身毒副作用，尤其是对于那些对氧气水平非常敏感的重要器官(如中枢神经系统和心血管系统)。
5.为此，研究者们开发出了一类可释放co的药物，即一氧化碳释放分子(corms)，这种分子主要由过渡金属羰基配合物构成，能够在特定部位释放co，弥补了co吸入装置的缺陷，在一定程度上实现了co的精准递送。corms可以自发地释放co或通过外源(如光、热)触发、内源性(如h2o2、酶、ph)刺激释放co。然而，利用corms在体内释放co仍然存在一些问题。从corms本身来说，corms在水中溶解度低、生物亲和性差、金属离子具有潜在的毒性、co释放半衰期短、难以在深层组织中释放足够的co；而从corms的触发方式来说，现有的触发方式无法兼顾高穿透深度、低组织损伤、高靶向性及可控性。这些困境限制了corms在临床中的推广与应用，更阻碍了以co为基础的治疗方法的发展。
6.因此，亟需一种安全性高、靶向性强、可控性好的co释放载体，推进co治疗领域的发展。


技术实现要素：

7.有鉴于此，本发明的目的在于克服现有技术中存在的co气体递送和释放过程中无法兼顾生物安全性、组织穿透深度、可控靶向释放等问题，提供了一种co释放载体组合物，
及含有该co释放载体组合物的co释放载体及其制备方法。本发明的co释放载体组合物和/或co释放载体能够与超声动力诱导配合使用，有利于co在深层组织中的递送，并且能够兼顾生物安全性和可控靶向释放co。
8.本发明的发明人发现，使用本发明的co释放载体组合物在生物体内进行co递送时，将一端亲水的表面活性剂包裹co气体，具有良好的生物相容性，同时减少了co气体运输过程中不必要的消耗及对非靶向组织的毒副作用。此外，本发明的co释放载体组合物具有较好的稳定性，能够在生物体内循环较长时间(》3min)，从而更容易控制co仅在目标组织中释放。因此，本发明的co释放载体组合物具有生物安全性高、靶向性强、可控性好、组织穿透深度高等优点。
9.本发明第一方面提供了一种co释放载体组合物，包括表面活性剂、稳定剂和co气体；所述表面活性剂包裹co气体；
10.其中，所述表面活性剂与稳定剂的摩尔比为10:1-30。
11.在本发明中，所述表面活性剂为能够包裹co气体，一端亲水的，对生物体无毒无害的表面活性剂(例如磷脂)，根据co递送的组织位置和释放时间可以选择选择不同的表面活性剂。
12.在本发明中，所述稳定剂为与表面活性剂配合使用，增加co释放载体组合物稳定性的物质，在此不作具体限定，根据表面活性剂的不同进行自由的选择，能够实现其功能即可。
13.本发明的上述co释放载体组合物，一端亲水的表面活性剂包裹co气体，具有良好的生物相容性和靶向性，稳定剂修饰使组合物具有较好的稳定性，能在体内循环较长时间(》3min，优选实施方式中能够》5min，甚至能够达到10min)，与超声动力诱导配合使用时能够在深层组织中递送co。
14.优选地，本发明的co释放载体组合物还包括惰性气体，所述惰性气体与co气体混合均匀包裹于表面活性剂核心。
15.术语“惰性气体”是指进入人体后不容易发生反应的稳定气体，具有较高的生物安全性，经肺排出。
16.本发明中，惰性气体与co气体混合，增强co在气核中的稳定性。
17.优选地，所述惰性气体与co的体积比为20:1-200。
18.优选地，所述惰性气体选自全氮气、氩气、全氟乙烷、全氟丙烷、全氟丁烷或六氟化硫中的一种或多种。
19.本发明上述表面活性剂、稳定剂，惰性气体与co气体的特定配比即能够实现co释放载体组合物较好的效果，为了进一步增加co的负载量并保持或提高稳定性。优选惰性气体与co的体积比为5:1-20；更优选为3:1-9。优选所述表面活性剂与稳定剂的摩尔比为10:1-20；优选10:1-10。
20.在本发明的一种具体实施方式中，所述表面活性剂为磷脂、脂肪酸山梨坦或聚山梨酯中的一种或多种。为了与本发明的co释放载体组合物中的其他成分发挥更好的协同作用。更优选地，所述磷脂选自二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(dmpc、c14)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(dppc)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(dspc、c18)、二芥酰磷脂酰胆碱(depc)、1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine(dbpc、c22)中的一种或多种；所述脂肪酸山梨坦为脂肪酸
山梨坦-60(span 60)；所述聚山梨酯为聚山梨酯-80(tween 80)。
21.在本发明的一种具体实施方式中，所述稳定剂为二肉豆蔻酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(dmpe-peg2000)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(dppe-peg2000)、二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000(dspe-peg2000)、pluronic f68、pluronic f108、聚乙二醇4000、聚乙二醇2000、磷酸二十六烷基酯(dcp)中的一种或多种。优选稳定剂的种类能够在制备co释放载体微泡过程中防止气泡之间的融合，同时增强co释放载体的生物相容性。
22.在本发明的一种优选实施方式中，所述稳定剂为dmpe-peg2000、dppe-peg200、dspe-peg2000中的至少一种。
23.在本发明的一种优选实施方式中，所述稳定剂为dmpe-peg2000、dppe-peg200、dspe-peg2000中的至少一种，与pluronic f68、pluronic f108、、聚乙二醇4000、聚乙二醇2000、聚乙二醇40、dcp以3：1-5的摩尔比的组合。
24.在本发明的一种优选实施方式中，所述表面活性剂为dspc，所述稳定剂为dspe-peg2000和dcp(或pluronic f68)的组合。
25.在本发明的一种优选实施方式中，所述表面活性剂为dmpc，所述稳定剂为dmpe-peg2000和dcp(或pluronic f68)的组合。
26.在本发明的一种优选实施方式中，所述表面活性剂为dppc，所述稳定剂为dppe-peg2000和dcp(或pluronic f68)的组合。
27.在本发明的一种优选实施方式中，所述表面活性剂为dbpc，所述稳定剂为dspe-peg2000和dcp(或pluronic f68)的组合。
28.在本发明的一种优选实施方式中，所述表面活性剂为span 60、tween80，所述稳定剂为peg2000或peg4000。
29.进一步优选上述稳定剂和表面活性剂的种类和组合，能够进一步提升本发明co释放载体组合物的稳定性，提高其在体内的循环时间。
30.本发明第二方面提供了一种co释放载体，包括本发明第一方面所述的co释放载体组合物。
31.本发明中，co释放载体除包含本发明第一方面所述的co释放载体组合物之外，还可以包含其它的组分，例如配合使用的药物，或者其他功能性助剂。本发明第二方面提供的co释放载体具备本发明第一方面co释放载体组合物的所有技术效果，在此不作赘述。
32.本发明中，所述co释放载体为在声动力诱导下调控释放co的载体。
33.在本发明的一种具体实施方式中，所述co释放载体为空心微球或纳球，内部空心部位包裹co气体，实现储存co气体作为载体的功能，在声动力诱导下空心微球或纳球破碎释放co气体，实现co释放的功能。
34.本发明中，所述co释放载体的球状结构从内到外依次为co/惰性气体核-表面活性剂/稳定剂外壳。
35.优选地，所述co释放载体的粒径为0.3-6μm，更优选为0.4-2μm。优选co载体的粒径既可以更好地调控co的负载量和提高组织穿透深度，进一步提升co释放载体的综合效果。而且，优选co释放载体的粒径能够避免粒径过大造成的容易在体内堵塞，或者容易被免疫细胞捕获的问题。
36.在发明中，术语“粒径”指的是单个颗粒的几何学球形直径而并非平均值，当为范围时，指同一物料中的该种颗粒的粒径均落在该范围内；同时本发明允许一定的误差，即当占总数量不到5％的颗粒粒径不在要求的范围内时也视为满足要求，可以通过透射电子显微镜(tem)测量得到。
37.本发明第三方面提供了本发明第二方面所述co释放载体的制备方法，包括以下步骤：
38.(a)将表面活性剂、稳定剂与溶剂a混合接触，得到溶液i；
39.(b)将所述溶液i乳化至均匀，得到溶液ii；
40.(c)将所述溶液ii与惰性气体和co气体接触并高速混合。
41.本发明的步骤(a)中，所述溶液a的选择没有特别的限定，能够将本发明第一方面所述的表面活性剂、稳定剂溶解并且不发生化学反应，容易蒸发即可。
42.优选地，所述溶液a为纯水、离子缓冲液、丙酮、乙醚、乙醇、三氯甲烷、二氯甲烷中的一种。
43.本发明中，术语“离子缓冲液”是指具有调节ph值，有阻碍溶液ph变化作用的溶液，例如弱酸及其盐混合溶液，或弱碱及其盐的混合溶液。
44.本发明的步骤(b)中，对所述溶液i进行乳化处理，对于乳化方法不作具体限定，可以采用本领域常规的乳化方法进行。
45.为了进一步提升本发明第二方面所述的co释放载体的性能，溶液i乳化采用高温乳化法和/或膜乳化法。
46.在本发明的一种具体实施方式中，所述高温乳化法包括下述步骤：将所述溶液i加热至50-110℃后，保温10-60min至溶液透明，得到溶液ii。
47.优选地，所述高温乳化法的加热温度为60-90℃，保温时间为15-50min，更优选加热温度为65-80℃，保温时间为20-45min。
48.在本发明的一种具体实施方式中，将所述溶液i水浴旋蒸至溶剂完全蒸发形成膜，加入溶液b使完全溶解，得到溶液ii。
49.所述溶液b的选择没有特别的限定，能够将溶液i水浴旋蒸后形成的膜完全溶解并且不发生化学反应即可。
50.优选地，所述溶液b为丙三醇、丙二醇、纯水、离子缓冲液中的一种或几种。
51.优选地，所述水浴旋蒸的温度为45-85℃；水浴旋蒸的压强为0.01-0.1mpa。更优选水浴旋蒸的温度为50-70℃；水浴旋蒸的压强为0.05-0.8mpa。
52.采用高温乳化法或膜乳化法对溶液i进行乳化，并不断优化乳化的条件，使溶液i乳化更均匀，便于后续制备co释放载体，并且使co释放载体的粒径更加均一，同时提升其负载co气体的能力，提高其稳定性等优点。
53.在本发明的一种优选实施方式中，所述溶液b中丙三醇或/和丙二醇的体积含量为5-40％，更优选10-30％。优选溶液b的种类能够减少co释放载体中气泡之间的粘附。
54.在本发明的一种优选实施方式中，所述溶液b中丙三醇和丙二醇的体积含量为30％。
55.本发明的步骤(c)中，所述溶液ii与惰性气体和co气体高速混合是指在外力作用下，使气体与溶液ii高速混合至形成具有气核的球形co释放载体。
56.对于通过何种方式施加外力，在此不作具体限定，能够实现获得具有气核包裹的球形co释放载体即可。
57.在本发明的一种优选实施方式中，所述溶液ii与惰性气体和co气体高速混合采用超声空化法和/或机械震荡法。
58.优选地，所述超声空化法的工艺条件包括：功率为60-550w，占空比为10％-75％，时间为1-6min；更优选功率为130-460w，占空比为15％-60％，时间为2-4min。
59.优选地，所述机械震荡法的工艺条件包括：震荡速度为1000-4500rpm，时间为30-150s；更优选为震荡速度为1200-3000rpm，时间为50-150s。
60.本发明上述的co释放载体的制备方法制备获得的co释放载体与本发明第二方面所述的co释放载体具有相同的性能和效果，此外，在上述制备方法中额外增加一些其他的步骤，例如加入某些药物形成复合物，或者加入某些功能性助剂获得的co释放载体也在本发明的保护范围之内。
61.本发明第四方面提供了一种药物组合物，包括本发明第一方面所述的co释放载体组合物，或本发明第二方面所述的co释放载体，或本发明第三方面所述的制备方法获得co释放载体，以及任选地药物。
62.本发明中，所述药物的种类不作具体限定，可以选择不与co气体发生化学反应的常规使用的药物。
63.本发明中，co释放载体可以负载药物组成co-药物组合物载体，在释放co的同时也可以释放药物，提高药物递送的靶向性，稳定性和组织穿透能力。
64.本发明第五方面提供了一种声动力诱导co释放的方法，co释放载体在特征响应频率范围和/或特定功率范围的超声波刺激下，进行co的可控释放；其中，所述的co释放载体为本发明第一方面所述的co释放载体组合物，或本发明第二方面所述的co释放载体，或本发明第三方面所述的制备方法获得co释放载体中的一种或多种。
65.本发明的发明人发现，声诱导方式具有比光诱导更深的组织穿透力、比热诱导更强的靶向性，同时兼具安全性、操作简单。本发明的声动力诱导的co释放方法中，co释放载体在特定超声波场中发生破碎，从而能够可控得释放co，并且进一步提高co释放的靶向性。此外，co释放载体破碎过程中产生热效应、声辐射效应及空化效应，有利于co在深层组织中的递送，同时增强co的治疗效果。
66.因此，本发明的声动力诱导的co释放方法能够可控的、靶向的、更深的递送co气体，基于超声波诱导的co靶向可控释放方法将极大的推进co治疗领域的发展，对其在临床中的推广与应用具有深远的意义。
67.在本发明的一种具体实施方式中，所述特征响应频率范围为0.5-40mhz，优选0.5-20mhz，更优选0.5-10mhz；
68.在本发明的一种具体实施方式中，所述特定功率范围为0.5-2w/cm2，优选0.5-1w/cm2。
69.对于特征响应频率范围和/或特定功率范围的优选，使其更适合于本发明提供的co释放载体。
70.本发明采用上述技术方案具有以下有益效果：
71.(1)本发明提供的co释放载体组合物，安全性好，具有良好的生物相容性，较好的
稳定性，较高的靶向性。
72.(2)本发明提供的co释放载体，与声动力诱导配合使用，具有生物安全性高、体内循环时间长、靶向性强、可控性好、组织穿透深度高等优点。
73.(3)本发明提供的声动力诱导co释放的方法，可控的释放co，提高了co释放的靶向性，有利于co在深层组织中的递送。
74.在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
附图说明
75.图1所示为实施例a1所得co释放载体的光学显微镜图。
76.图2所示为实施例a1所得co释放载体co释放量检测图。
77.图3所示为实施例a1所得co释放载体的细胞安全性评价图。
78.图4所示为实施例a1所得co释放载体的抗肿瘤细胞增殖效果图。
79.图5所示为实施例a1所得co释放载体在体内半衰期的结果图。
具体实施方式
80.除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。
81.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
82.下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
83.下述实施例中使用的超声波破碎仪输出功率为650w，使用时调节输出功率的百分比来改变输出功率。
84.下面结合具体实施例详细描述本发明，这些实施例用于理解而不是限制本发明。
85.制备例1
86.离子缓冲液制备过程包括：称取kcl 0.097g、nacl 4.005g、na2hpo4·
h2o1.145g和kh2po
4 0.096g至1l的烧杯中，加入去离子水定容至500ml制得离子缓冲液备用。
87.制备例2
88.溶液b制备过程包括：称取制备例1获得的离子缓冲液70ml，加入10ml丙三醇和20ml丙二醇混合均匀，制得溶液b。
89.制备例3
90.溶液b制备过程包括：称取制备例1获得的离子缓冲液90ml，加入10ml丙三醇混合均匀，制得溶液b。
91.实施例a1
92.(i)准备co释放载体组合物，将其记为i1，包括:
93.表面活性剂：59.4mol％dspc；
94.稳定剂：15.7mol％dcp，24.9mol％dspe-peg2000；
95.惰性气体：全氟丙烷；
96.co气体。
97.(ii)制备co释放载体，将其记为ii1。
98.(1)将表面活性剂与稳定剂(摩尔比约为10:6.84)置于溶于15ml制备例1所得离子缓冲液中，表面活性剂与稳定剂的最终浓度为15mg/ml；
99.(2)通过磁力搅拌棒轻轻搅拌，并加热70℃保持15min，形成均匀的悬浮液，然后取2ml分装于5ml的容器中；
100.(3)通过向上排空气法向容器中通入20ml全氟丙烷后密封容器，通过向下排气法向容器中通入1.5ml co，用银汞调和机在2000rpm的速度下作用90s，得到co释放载体ii1。
101.实施例a2
102.(i)准备co释放载体组合物，将其记为i2，包括:
103.表面活性剂：59.4mol％dmpc；
104.稳定剂：15.7mol％dcp，24.9mol％dmpe-peg2000；
105.惰性气体：全氟丙烷；
106.co气体。
107.(ii)制备co释放载体，将其记为ii2。
108.(1)将表面活性剂与稳定剂(摩尔比约为10:6.84)置于容积为250ml的圆底烧瓶中，然后加入二氯甲烷5ml，表面活性剂与稳定剂的最终浓度为20mg/ml，充分混匀，溶液澄清透明；
109.(2)通过60℃、0.1mpa水浴旋蒸3h除去二氯甲烷，使瓶底上形成均匀的薄膜；
110.(3)向完成步骤(2)后的烧瓶中加入12ml制备例2所得溶液b，75℃水浴加热使得薄膜完全溶解，然后取10ml分装于50ml的离心管中；
111.(4)向50ml的离心管通入全氟丙烷-co混合气体(体积比为2：1)的同时，在超声波破碎仪于3/4”探头、25％的功率、40％占空比下作用2分钟，得到co释放载体ii2。
112.实施例a3
113.(i)准备co释放载体组合物，将其记为i3，包括:
114.表面活性剂：85mol％dppc；
115.稳定剂：15mol％dppe-peg2000；
116.惰性气体：全氟丙烷；
117.co气体。
118.(ii)制备co释放载体，将其记为ii3。
119.(1)将表面活性剂与稳定剂(摩尔比约为10:1.764)溶于20ml制备例1所得离子缓冲液中，表面活性剂与稳定剂的最终浓度为12mg/ml；
120.(2)通过磁力搅拌棒轻轻搅拌，并加热70℃保持10min，形成均匀的悬浮液，然后取3ml分装于5ml的容器中；
121.(3)向容器中通入全氟丙烷-co混合气体(体积比为1：1)的同时，在超声波破碎仪于1/2”探头、50％的功率、50％占空比下作用2分钟，得到co释放载体ii3。
122.实施例a4
123.(i)准备co释放载体组合物，将其记为i4，包括:
124.表面活性剂：60mol％dbpc；
125.稳定剂：10mol％pluronic f68，30mol％dspe-peg2000；
126.惰性气体：全氟丙烷；
127.co气体。
128.(ii)制备co释放载体，将其记为ii4。
129.(1)将表面活性剂与稳定剂(摩尔比约为10:6.67)置于容积为100ml的圆底烧瓶中，然后加入乙醇10ml，表面活性剂与稳定剂的最终浓度为20mg/ml，充分混匀，溶液澄清透明；
130.(2)通过60℃、0.1mpa水浴旋蒸2h除去乙醇，使瓶底上形成均匀的薄膜；
131.(3)向完成步骤(2)后的烧瓶中加入12ml制备例2所得溶液b，80℃水浴加热使得薄膜完全溶解，然后取2ml分装于5ml的容器中；
132.(4)通过向上排空气法向容器中通入20ml全氟丙烷后密封容器，通过向下排气法向容器中通入1mlco，用银汞调和机在3000rpm的速度下作用80s，得到co释放载体ii4。
133.实施例a5
134.(i)准备co释放载体组合物，将其记为i5，包括:
135.表面活性剂：1g span 60，1ml tween 80；
136.稳定剂：1gpeg2000；
137.惰性气体：全氟丙烷；
138.co气体。
139.(ii)制备co释放载体，将其记为ii5。
140.(1)将表面活性剂和稳定剂溶于20ml制备例所得离子缓冲液中；
141.(2)通过磁力搅拌棒轻轻搅拌，并加热80℃保持20min，形成均匀的悬浮液，然后取20ml分装于50ml的容器中；
142.(3)向容器中通入全氟丙烷-co混合气体(体积比为3：1)的同时，在超声波破碎仪于3/4”探头、25％的功率、50％占空比下作用3分钟，得到co释放载体ii5。
143.实施例a6组
144.该组实施例用于说明表面活性剂与稳定剂以不同摩尔比配合时的情况，该组实施例按照实施例a1的方法进行，所不同的是，分别改变表面活性剂和稳定剂加入量，最终分别得到co释放载体组合物和co释放载体(记为ii6a、ii6b)。
145.具体地：
146.实施例a6a中，表面活性剂的加入量为59.4mol％dspc，稳定剂的加入量为39.25mol％dcp，62.25mol％dspe-peg2000，表面活性剂与稳定剂摩尔比约为10:17.1；
147.实施例a6b中，表面活性剂的加入量为59.4mol％dspc，稳定剂的加入量为54.95mol％dcp，87.15mol％dspe-peg2000，表面活性剂与稳定剂摩尔比约为10:23.94。
148.实施例a7组
149.该组实施例用于说明稳定剂不同时的情况，该组实施例按照实施例a1的方法进行，所不同的是，分别改变稳定剂的种类，最终分别得到co释放载体组合物和co释放载体
(记为ii7a、ii7b、ii7c)。
150.实施例a7a中，稳定剂为40.6mol％dspe-peg2000；
151.实施例a7b中，稳定剂为40.6mol％dcp；
152.实施例a7c中，稳定剂为28.42mol％dcp，12.18mol％dspe-peg2000。
153.实施例a8组
154.该组实施例用于说明惰性气体与co以不同摩尔比配合时的情况，该组实施例按照实施例a1的方法进行，所不同的是，分别改变惰性气体与co加入量，最终分别得到co释放载体组合物和co释放载体(记为ii8a、ii8b)。
155.具体地：
156.实施例a8a中，全氟丙烷的加入量为20ml，co的加入量为1ml；
157.实施例a8b中，全氟丙烷的加入量为20ml，co的加入量为10ml。
158.实施例a9
159.参照实施例a1的方式进行，所不同的是，步骤(2)中加热60℃保持25min。最终得到co释放载体组合物和co释放载体(记为ii9)。
160.实施例a10组
161.该组实施例用于说明步骤(3)中溶液b不同时的情况，该组实施例按照实施例a2的方法进行，所不同的是，分别改变溶液b的种类，最终分别得到co释放载体组合物和co释放载体(记为ii10a、ii10b)。
162.实施例a10a中，溶液b采用制备例3所得溶液b；
163.实施例a10b中，溶液b为制备例1获得的离子缓冲液。
164.实施例a11组
165.该组实施例用于说明步骤(3)中惰性气体不同的情况，该组实施例按照实施例a1的方法进行，所不同的是，分别改变惰性气体的种类，或不通入惰性气体，最终分别得到co释放载体组合物和co释放载体(记为ii11a、ii11b)。
166.实施例a11a中，惰性气体为氩气；
167.实施例a11b中，惰性气体为六氟化硫。
168.对比例d1
169.参照实施例a1进行，所不同的是，不加入稳定剂。最终得到co释放载体，记为iid1。
170.测试例
171.将上述所得的co释放载体ii1-ii11和iid1选择性地进行如下测试：
172.(1)光学显微镜观测
173.将所得的co释放载体ii1-ii14和iid1、iid2分别进行光学显微镜观测。其中，ii1的观察结果如图1所示。从图1中可以看出该co释放载体为粒径在0.6μm左右的微球，该co释放载体的粒径分布窄且溶液中没有明显的杂质。其余co释放载体的观察结果记录于表1中。
174.(2)细胞毒性测试
175.为了探究上述实施例和对比例的co释放载体的细胞安全性，在无超声处理情况下，利用cck-8检测细胞与co释放载体共孵育后的存活率。将100μl(密度：1
×
104个/孔)4t1细胞悬浮液置于96孔板中，培养箱培养24h。细胞贴壁后，弃掉原有培养基，在不同组中分别加入200μl编号为ii1-ii14和iid1、iid2的co释放载体，co释放载体的浓度分别为0、105、
106、107、108个/ml的培养液，分别与4t1细胞共孵育30min后更换新的培养基，培养箱培养24h。更换新的培养基，在每个孔中加入10μl cck-8，于培养箱中孵育2h，用酶标仪测定每个孔在450nm处的吸光度，以此方法测定每个孔的细胞存活率。细胞存活率通过如下公式计算得到：
[0176][0177]
其中，od
x
为实验组的吸光度，odc为阴性对照组的吸光度，odb为空白对照组的吸光度。
[0178]
实施例a1中co释放载体ii1的细胞毒性结果如图3所示，在无超声处理情况下，单纯地将co释放载体与肿瘤细胞共孵育后，肿瘤细胞的存活率几乎无任何改变，co释放载体ii1在无超声作用时能够稳定得包裹co，具有安全性。其余co释放载体的观察结果记录于表1中。
[0179]
(3)co释放量测试
[0180]
利用高效气象色谱仪来检测co释放载体的co释放量。各取1ml编号为ii1-ii14和iid1、iid2的co释放载体，分别置于3ml的容器中，利用向上排空气法将容器中的气体置换为全氟丙烷，密封容器。将容器置于超声清洗机中处理12h使co释放载体完全破碎，检测co的释放量。
[0181]
(4))co释放载体的浓度测量
[0182]
采用红细胞计数板进行检测计数。具体操作步骤如下：取出co释放载体原液，将其稀释至合适的的倍数，取出10μl缓慢加入洗好的细胞计数板中，然后在镜下计数，按照相应的稀释倍数计算出相应的浓度。
[0183]
(5)体内稳定性计算
[0184]
对4t1肿瘤小鼠进行超声造影成像。实验前，采用3％的异氟烷对小鼠进行诱导麻醉，然后将小鼠固定在超声成像装置上，之后采用1.5％的异氟烷进行持续麻醉。然后采用尾静脉建立造影剂注射通道，注射造影剂的浓度为：1*108/ml，注射体积为：50μl。采用脉冲逆转成像模式来观察co释放载体在体内的造影效果，并实时记录小鼠肿瘤部位的造影图像，实验结束后对肿瘤区域的超声信号强度进行分析，绘制超声信号强度随时间变化的曲线，并计算信号半衰期。
[0185]
实施例a1中co释放载体ii1的结果如图2所示，在聚焦超声辐照下，co释放载体ii2可释放出大量的co。
[0186]
按照上述方法测试实施例a1-a5，对比例d1中co释放载体ii1的粒径，细胞毒性，co释放量。测试结果记录于表1中。
[0187]
表1
[0188][0189]
注：0、105、106、107、108分别表示对应的co释放载体的浓度为0、105、106、107、108个/ml。
[0190]
从表1的内容可以看出，相对于对比例，本发明提供的co释放载体，粒径均匀，无杂质；生物安全性较高，co释放量大，可以用于co相关的临床治疗领域中。
[0191]
其中，对比例d1中提供的co释放载体iid1，由于不加入稳定剂后稳定性较差，会有co释放出来，少量co会增强细胞的增殖能力，细胞存活率会有一个小幅度的升高现象。
[0192]
按照上述方法测试实施例a6-a11，对比例d1中co释放载体ii1的浓度和体内稳定性。测试结果记录于表2中。
[0193]
表2
[0194][0195][0196]
从表2和图3的结果可以看出，相对于对比例，本发明提供的co释放载体的浓度和半衰期更高，而且表面活性剂和稳定剂的配比，稳定剂的种类和配比，惰性气体和co气体的配比等因素均会影响co释放载体的浓度和体内稳定性。
[0197]
图5表示co释放载体在体内的半衰期，表明了本发明提供的co释放载体在生物体内具有较高的半衰期，稳定性高，能够在体内循环较长时间(能够大于10min)，从而能够进入深层组织释放co。
[0198]
应用例b1
[0199]
为了探究co释放载体抑制小鼠乳腺癌细胞4t1增殖的效果，在超声诱导与co释放载体共同作用下，利用cck-8检测4t1细胞的存活率。
[0200]
将100μl(密度：1
×
104个/孔)4t1细胞悬浮液置于96孔板中，培养箱培养24h。细胞贴壁后，弃掉原有培养基，在不同组中分别加入400μl编号为ii1的co释放载体，co释放载体的浓度为0、106、107、108个/ml的培养液。
[0201]
利用超声理疗仪以1mhz的频率、1w/cm2的强度处理2min后，在培养箱孵育30min，更换新的培养基，培养箱培养24h。更换新的培养基，在每个孔中加入10μl cck-8，于培养箱中孵育2h，用酶标仪测定每个孔在450nm处的吸光度，以此方法测定每个孔的细胞存活率。
[0202]
细胞存活率通过如下公式计算得到：
[0203][0204]
其中，od
x
为实验组的吸光度，odc为阴性对照组的吸光度，odb为空白对照组的吸光度。
[0205]
实施例a1中co释放载体ii1的抑制肿瘤细胞增殖的结果如图4所示，在超声与co释放载体共同作用下，t41肿瘤细胞的存活率显著降低，且肿瘤细胞增殖抑制效果依赖于co释放载体的浓度。
[0206]
应用例b2-b4
[0207]
参照应用例b1进行，所不同的是，应用例b2-b4中co释放载体分别为编号ii5、ii7c、ii8b的co释放载体。
[0208]
应用例b5
[0209]
参照应用例b1进行，所不同的是，应用例b5中超声理疗仪以15mhz的频率、1.5w/cm2的强度处理2min。
[0210]
应用例b1-b5的实验结果记录于表3中。
[0211]
表3
[0212][0213]
从表3的内容和图4可以看出，本发明提供的co释放载体能够显著地抑制肿瘤细胞的增长。
[0214]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。