磷烯功能化改性的3d打印聚乳酸仿生纳米纤维支架的制备方法
技术领域
1.本发明属于骨修复生物材料技术领域，具体涉及一种磷烯功能化改性的3d打印聚乳酸仿生纳米纤维支架的制备方法。
背景技术：
2.当骨组织大面积受损而无法自愈时需要进行手术干预，作为一种极具吸引力的策略，骨组织工程已被广泛研究用于骨缺损的修复重建。作为种子细胞载体的组织工程支架是组织工程技术的关键，因此构建具有良好的生物活性和成骨能力的支架也就成了骨组织工程领域的研究重点。除了必须具有良好的活性以外，用于骨组织修复的组织工程支架还必须具有类似天然骨组织的相互贯通的三维孔洞结构以便于细胞的植入、迁移以及营养成分的渗入和细胞代谢产物的排出等。由各种原因所引起的骨缺损一般都具有不规则的复杂形状和特殊的内部孔隙结构，而多孔支架传统的制备方法，如粒子沥滤法、相分离/冷冻干燥法、气体发泡法以及静电纺丝法等都无法做到对支架材料内部的孔隙结构进行精确控制，而且制备的支架形状也无法做到与患者不规则骨缺损区的复杂形态完全契合，从而影响植入后的修复效果。3d打印快速成形技术的出现有效地弥补了这些不足，由于其可以实现在计算机的控制下快速而精确地“打印”出各种复杂形状的零部件并能够精准地控制所打印物品的内部细微结构，因而在个性化骨组织工程支架植入材料的制备方面展现出独特的优势。
3.3d打印技术中的熔融沉积成型技术(fdm)常用于构建具有热塑性的高分子生物材料支架，如3d打印聚乳酸支架。聚乳酸材料具有良好的生物相容性和生物可降解性，已被广泛用于组织工程支架的制备，但作为骨组织工程支架材料的应用也存在其内在的一些性能上的不足：首先，聚乳酸是一种强疏水性材料，不利于细胞在其表面粘附和增殖，因此细胞亲和性差、生物活性低；其次，聚乳酸分子结构中缺乏诱导成骨矿化的活性位点，因此骨诱导性差、成骨能力低，而且采用fdm法制备支架时所需的高温会使聚乳酸材料发生降解，降解释放出的酸性单体会使植入部位出现非感染性炎症反应，从而导致植入手术的失败。此外，采用fdm法构建的聚乳酸支架还存在结构上的缺陷，制备的支架由于具有光滑的表面，细胞黏附性能比较差，影响了细胞在支架表面的增殖和分化。本发明的主要目的是针对目前3d打印聚乳酸支架存在的这些问题，采取适当的方法对支架的结构和性能进行改性以提高其骨修复能力。首先，以溶液
‑
低温3d打印技术代替fdm技术构建聚乳酸支架。采用低温3d打印技术不仅可以避免聚乳酸材料在高温条件下发生降解变质，而且可以利用聚乳酸溶液在低温固化成型的过程中发生的相分离作用而得到网状纳米纤维的仿生结构，通过结构上对天然细胞外基质的高度模拟促进细胞在其表面的黏附，提高其生物活性。此外，采用这种溶液体系还便于对聚乳酸材料进行适当的化学改性。以分子结构中含有多个氨基基团的多元胺材料（包括乙二胺、己二胺、支化聚乙烯亚胺与聚丙烯亚胺）为改性剂，通过其含有的氨基与聚乳酸分子含有的酯基发生氨解反应而在聚乳酸分子链上接枝亲水性的
‑
nh2活性基
团来增加聚乳酸材料的亲水性从而提高支架表面细胞的黏附性能和增殖能力。其次，以负载抗炎药物布洛芬的纳米片状磷烯对3d打印聚乳酸支架进行改性。研究发现，从黑磷剥离出来的、由有序磷原子构成的纳米片状的磷烯是一种新型的二维纳米材料，因其具有的一些独特的性质，如优异的光热转化性能、良好的生物相容性、较大的比表面积且表面易于功能化修饰改性等而在癌症治疗、药物递送以及生物传感等生物医学领域有着广阔的应用前景，而且其氧化降解过程释放出的磷酸盐物质对人体安全无毒并能有效促进成骨，此外其具有的特殊的光热转化性能赋予了其优异的光热促骨生长和光热抗菌的活性。但磷烯的化学稳定性较差，易与空气中的水蒸气和氧气发生反应而氧化降解，光热性能变差。布洛芬是一种疏水性药物，借助磷烯材料凹凸不平的蜂窝结构形成的大比表面积和强吸附性能负载布洛芬药物可以在磷烯的表面形成一层疏水膜，减少磷烯与空气中的氧气和水的接触，从而在一定程度上提高磷烯材料的稳定性，而且布洛芬药物的负载可以赋予材料良好的抗炎功能，缓解或避免支架植入而引起的炎症。此外还可以通过在载药磷烯的表面进一步包覆聚多巴胺涂层来提高磷烯材料的稳定性、延缓药物的释放，并能通过光热和ph响应智能控制药物的释放从而达到长效抗炎、按需释药的目的。利用此方法制备的载药磷烯修饰聚乳酸材料可以构建兼具光热治疗、促骨生长、抗菌消炎、智能释药的多功能支架。
技术实现要素：
4.针对上述情况，本发明的目的是提供一种由载药磷烯修饰改性的集光热治疗、药物控释和成骨作用于一体的多功能3d打印改性聚乳酸仿生纳米纤维个性化支架的制备方法。其特征在于：以块状黑磷经液相超声剥离制得的纳米片状磷烯为载体负载抗炎药物布洛芬并在载药磷烯的表面包覆聚多巴胺涂层以防止其氧化并实现药物的智能控制释放；将得到的载药磷烯均匀掺杂到经多元胺改性的、接枝了亲水性氨基活性基团的改性聚乳酸基质材料中得到混合浆料；采用低温3d打印技术构建个性化多功能支架，并利用低温打印过程诱导的相分离使支架形成仿生天然细胞外基质的网状纳米纤维的结构。
5.本发明的目的是这样实现的，一种磷烯功能化改性的3d打印聚乳酸仿生纳米纤维支架的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：ⅰ、以聚左旋乳酸为原料，多元胺为改性剂，通过氨解反应得到共价接枝了氨基活性基团的氨基化改性聚乳酸；ⅱ、以乙醇为溶剂，采用液相超声剥离法制备纳米片状磷烯；ⅲ、以步骤ⅱ制得的纳米片状磷烯为载体，布洛芬为模型药物，通过浸渍吸附法实现药物的负载，并利用多巴胺进行表面包覆制备载药磷烯；ⅳ、将步骤ⅰ制得的氨基化改性聚乳酸溶解于1,4
‑
二氧六环溶剂中得到改性聚乳酸溶液，然后将步骤ⅲ制得的载药磷烯均匀分散到该改性聚乳酸溶液中得到打印浆料；
ⅴ
、利用3d打印机在低温条件下对步骤ⅳ制得的打印浆料进行3d打印，得到打印支架；
ⅵ
、将步骤
ⅴ
制得的打印支架置于低温冰箱中进行冷冻相分离，然后用蒸馏水抽提移除溶剂，最后经冷冻干燥后得到具有仿生细胞外基质纳米纤维结构的载药磷烯功能化修饰改性的3d打印聚乳酸个性化支架。
6.上述步骤ⅱ所述的纳米片状磷烯是以块状黑磷通过液相超声剥离法制得，具体
为：将块状黑磷分散在乙醇溶剂中使得到的溶液中所含黑磷的浓度为1 mg/ml，将此溶液置于冰水浴中超声48 h后得到纳米片状磷烯，超声频率为100 hz。
7.上述步骤ⅲ所述的载药磷烯是通过将步骤ⅱ制得的纳米片状磷烯先后浸渍于布洛芬乙醇溶液和多巴胺碱性溶液的分步浸渍法制备的，具体制备条件为：所用的布洛芬药物溶液的浓度为1 mg/ml，载药时间为24 h，载药温度为25℃；多巴胺溶液的浓度为1 mg/ml，ph值为8.5，磷烯在溶液中的分散浓度为1 mg/ml，包覆条件为冰水浴超声6 h，超声频率为100 hz。
8.上述步骤ⅰ所述的氨基化改性聚乳酸是通过聚乳酸与多元胺发生氨解反应制备的，所用的氨解改性剂为多氨基化合物中的乙二胺、己二胺、支化聚乙烯亚胺或聚丙烯亚胺。
9.上述步骤
ⅴ
所述的打印支架是采用低温3d打印技术制备的，打印浆料为步骤ⅲ所制备的载药磷烯均匀分散在改性聚乳酸溶液中得到的混合浆料，其中所含改性聚乳酸的浓度为25~35 wt%，载药磷烯的浓度为0.5~2.0 wt%，打印温度为
‑
15~
‑
25℃。
10.上述步骤
ⅵ
所述的3d打印聚乳酸个性化支架是经过热致相分离的过程获得具有仿生细胞外基质的网状纳米纤维的结构，冷冻诱导的相分离过程中的冷冻相分离温度为
‑
20~
‑
40℃，冷冻时间为4~12 h。
11.本发明上述的方法制得的磷烯功能化改性的3d打印聚乳酸仿生纳米纤维支架，其特征在于具有良好的亲水性、细胞相容性、光热转换性能及促进成骨和长效抗炎的作用，能通过光热和ph响应智能控制药物的释放。
12.具体地说，本发明采用的技术方案，包括如下步骤：1）将块状黑磷在玛瑙研钵中研磨至微细的粉末状态后分散于无水乙醇中使其中所含黑磷的浓度为1 mg/ml。将所得到的混合液置于冰水浴中，氩气保护下超声48 h，超声频率为100 hz。收集2000~10000 rpm之间的沉淀，用无水乙醇清洗三次后置于
‑
80 ℃的冷冻干燥机干燥得到纳米片状磷烯。
13.2） 取10 mg步骤1）制备得到的纳米片状磷烯加入到5 ml浓度为1 mg/ml的布洛芬乙醇溶液中，25 ℃下震荡吸附24 h后离心分离，上清液用无水乙醇稀释至合适的浓度后用紫外
‑
可见分光光度法检测其中的药物浓度，根据载药前后药物溶液浓度的变化计算磷烯的载药量。将下层沉淀干燥后得到载药磷烯。
14.3）称取一定量的三（羟甲基）氨基甲烷配制ph为8.5的缓冲液，将5 mg的多巴胺溶解于5 ml的缓冲液中得到浓度为1 mg/ml的多巴胺溶液。往溶液中加入5 mg步骤2）制备得到的载药磷烯，冰水浴中超声6 h，超声频率为100 hz。10000 rpm下离心15 min，收集沉淀，用无水乙醇清洗三次后置于
‑
80 ℃的冷冻干燥机中干燥，得到表面包覆聚多巴胺涂层的载药磷烯。
15.4）用一定量的1,4
‑
二氧六环溶剂充分溶解聚乳酸得到浓度为25~35 wt%的均相溶液，往所得的溶液中加入浓度为0.3~1.2 wt%的多元胺水溶液，氨解反应15~30 min后得到氨基化改性的聚乳酸溶液。称取一定量步骤3）制备得到的聚多巴胺包覆的载药磷烯用1,4
‑
二氧六环溶剂超声分散后加入到改性聚乳酸溶液中，充分搅拌至分散均匀得到混合浆料，其中载药磷烯的浓度为0.5~2.0 wt%。
16.5）将步骤4）制备得到的载药磷烯/改性聚乳酸混合浆料注入3d打印机的料筒中，
设置好打印头和打印平台的温度、气压、挤出速度、固化速度等打印条件，选择好3d模型，在
‑
15~
‑
25 ℃的低温打印温度条件下实现个性化三维多孔支架的构建。
17.6）将步骤5）制备得到的3d打印支架置于
‑
20~
‑
40℃的低温条件下冷冻4~12 h进行更为深度的相分离，促使支架纳米纤维结构更好地形成。将冷冻后的支架用4℃的去离子水抽提去除溶剂，
‑
80 ℃下冷冻干燥3 d后得到磷烯功能化改性的3d打印聚乳酸仿生纳米纤维支架。
18.采用上述方案得到的3d打印聚乳酸纳米纤维复合支架具有如下特点：
①
支架的形状、尺寸及内部孔隙结构可控，可根据骨缺损部位特征进行个性化设计。
②
以多元胺为改性剂，利用氨解结合低温3d打印技术制备的聚乳酸支架不仅亲水性得到改善，而且还具有仿生天然细胞外基质的纳米纤维结构，有利于细胞在其表面的黏附和生长，因此生物活性得到显著地改善。
③
以负载布洛芬药物的载药磷烯修饰改性聚乳酸材料，使构建的3d打印聚乳酸个性化支架兼具光热治疗、促骨生长、抗菌消炎、智能释药等多重功能。
具体实施方式
19.实施例11）纳米片状磷烯的制备：将块状黑磷研磨至粉末后分散于无水乙醇中使其混合液中所含黑磷的浓度为1 mg/ml。将所得到的混合液置于冰水浴中，通入氩气，在100 hz的频率下超声48 h后收集2000~10000 rpm之间的沉淀，用无水乙醇清洗三次后置于
‑
80 ℃的冷冻干燥机中干燥得到纳米片状磷烯。
20.2）载药磷烯的制备：称取10 mg步骤1）制得的纳米片状磷烯加入到5 ml浓度为1 mg/ml的布洛芬乙醇溶液中，放入25 ℃的摇床中震荡吸附24 h后离心分离，下层沉淀经干燥后得到载药磷烯。称取5 mg载药磷烯超声分散于5 ml浓度为1 mg/ml的多巴胺溶液中，超声6 h后离心分离，将沉淀干燥后得到聚多巴胺包覆的载药磷烯。
21.3）载药磷烯/改性聚乳酸混合浆料的制备：用一定量的1,4
‑
二氧六环溶剂充分溶解聚乳酸得到浓度为25 wt%的均相溶液，往所得的均相溶液中加入浓度为0.3 wt%的乙二胺水溶液，氨解反应15 min后得到氨基化改性的聚乳酸溶液。称取一定量步骤2）制得的聚多巴胺包覆的载药磷烯用1,4
‑
二氧六环溶剂超声分散后加入到上述氨基化改性的聚乳酸溶液中，充分搅拌至分散均匀得到载药磷烯/改性聚乳酸混合浆料，其中载药磷烯的浓度为1.0 wt%。
22.4） 3d打印支架的制备：将步骤3）制得的载药磷烯/改性聚乳酸混合浆料注入3d打印机的料筒中，设置好打印温度、气压、挤出速度、固化速度等打印条件，选择好3d模型，在
‑
20 ℃的低温打印温度条件下实现个性化三维多孔支架的构建。将打印好的支架放入
‑
25 ℃冰箱中冷冻12 h进行更为深度的相分离，促使支架纳米纤维结构更好地形成。将冷冻后的支架用4 ℃的去离子水抽提去除溶剂，
‑
80 ℃下冷冻干燥3 d后得到磷烯功能化改性的3d打印聚乳酸支架。扫描电镜观察所制备的支架具有仿生天然细胞外基质的网状纳米纤维的结构。
23.实施例21）纳米片状磷烯的制备：将块状黑磷研磨至粉末后分散于无水乙醇中使其混合液中所含黑磷的浓度为1 mg/ml。将所得到的混合液置于冰水浴中，通入氩气，在100 hz的频
率下超声48 h后收集2000~10000 rpm之间的沉淀，用无水乙醇清洗三次后置于
‑
80 ℃的冷冻干燥机中干燥得到纳米片状磷烯。
24.2）载药磷烯的制备：称取10 mg步骤1）制得的纳米片状磷烯加入到5 ml浓度为1 mg/ml的布洛芬乙醇溶液中，放入25 ℃的摇床中震荡吸附24 h后离心分离，下层沉淀经干燥后得到载药磷烯。称取5 mg载药磷烯超声分散于5 ml浓度为1 mg/ml的多巴胺溶液中，超声6 h后离心分离，将沉淀干燥后得到聚多巴胺包覆的载药磷烯。
25.3）载药磷烯/改性聚乳酸混合浆料的制备：用一定量的1,4
‑
二氧六环溶剂充分溶解聚乳酸得到浓度为28 wt%的均相溶液，往所得的均相溶液中加入浓度为0.6 wt%的己二胺水溶液，氨解反应20 min后得到氨基化改性的聚乳酸溶液。称取一定量步骤2）制得的聚多巴胺包覆的载药磷烯用1,4
‑
二氧六环溶剂超声分散后加入到上述氨基化改性的聚乳酸溶液中，充分搅拌至分散均匀得到载药磷烯/改性聚乳酸混合浆料，其中载药磷烯的浓度为0.8 wt%。
26.4） 3d打印支架的制备：将步骤3）制得的载药磷烯/改性聚乳酸混合浆料注入3d打印机的料筒中，设置好打印温度、气压、挤出速度、固化速度等打印条件，选择好3d模型，在
‑
15 ℃的低温打印温度条件下实现个性化三维多孔支架的构建。将打印好的支架放入
‑
20 ℃冰箱中冷冻10 h进行更为深度的相分离，促使支架纳米纤维结构更好地形成。将冷冻后的支架用4 ℃的去离子水抽提去除溶剂，
‑
80 ℃下冷冻干燥3 d后得到磷烯功能化改性的3d打印聚乳酸支架。扫描电镜观察所制备的支架具有仿生天然细胞外基质的网状纳米纤维的结构。
27.实施例31）纳米片状磷烯的制备：将块状黑磷研磨至粉末后分散于无水乙醇中使其混合液中所含黑磷的浓度为1 mg/ml。将所得到的混合液置于冰水浴中，通入氩气，在100 hz的频率下超声48 h后收集2000~10000 rpm之间的沉淀，用无水乙醇清洗三次后置于
‑
80 ℃的冷冻干燥机中干燥得到纳米片状磷烯。
28.2）载药磷烯的制备：称取10 mg步骤1）制得的纳米片状磷烯加入到5 ml浓度为1 mg/ml的布洛芬乙醇溶液中，放入25 ℃的摇床中震荡吸附24 h后离心分离，下层沉淀经干燥后得到载药磷烯。称取5 mg载药磷烯超声分散于5 ml浓度为1 mg/ml的多巴胺溶液中，超声6 h后离心分离，将沉淀干燥后得到聚多巴胺包覆的载药磷烯。
29.3）载药磷烯/改性聚乳酸混合浆料的制备：用一定量的1,4
‑
二氧六环溶剂充分溶解聚乳酸得到浓度为30 wt%的均相溶液，往所得的均相溶液中加入浓度为0.9 wt%的聚乙烯亚胺水溶液，氨解反应25 min后得到氨基化改性的聚乳酸溶液。称取一定量步骤2）制得的聚多巴胺包覆的载药磷烯用1,4
‑
二氧六环溶剂超声分散后加入到上述氨基化改性的聚乳酸溶液中，充分搅拌至分散均匀得到载药磷烯/改性聚乳酸混合浆料，其中载药磷烯的浓度为1.5 wt%。
30.4） 3d打印支架的制备：将步骤3）制得的载药磷烯/改性聚乳酸混合浆料注入3d打印机的料筒中，设置好打印温度、气压、挤出速度、固化速度等打印条件，选择好3d模型，在
‑
25 ℃的低温打印温度条件下实现个性化三维多孔支架的构建。将打印好的支架放入
‑
30 ℃冰箱中冷冻6 h进行更为深度的相分离，促使支架纳米纤维结构更好地形成。将冷冻后的支架用4 ℃的去离子水抽提去除溶剂，
‑
80 ℃下冷冻干燥3 d后得到磷烯功能化改性的3d
打印聚乳酸支架。扫描电镜观察所制备的支架具有仿生天然细胞外基质的网状纳米纤维的结构。
31.实施例41）纳米片状磷烯的制备：将块状黑磷研磨至粉末后分散于无水乙醇中使其混合液中所含黑磷的浓度为1 mg/ml。将所得到的混合液置于冰水浴中，通入氩气，在100 hz的频率下超声48 h后收集2000~10000 rpm之间的沉淀，用无水乙醇清洗三次后置于
‑
80 ℃的冷冻干燥机中干燥得到纳米片状磷烯。
32.2）载药磷烯的制备：称取10 mg步骤1）制得的纳米片状磷烯加入到5 ml浓度为1 mg/ml的布洛芬乙醇溶液中，放入25 ℃的摇床中震荡吸附24 h后离心分离，下层沉淀经干燥后得到载药磷烯。称取5 mg载药磷烯超声分散于5 ml浓度为1 mg/ml的多巴胺溶液中，超声6 h后离心分离，将沉淀干燥后得到聚多巴胺包覆的载药磷烯。
33.3）载药磷烯/改性聚乳酸混合浆料的制备：用一定量的1,4
‑
二氧六环溶剂充分溶解聚乳酸得到浓度为35 wt%的均相溶液，往所得的均相溶液中加入浓度为1.2 wt%的聚丙烯亚胺水溶液，氨解反应30 min后得到氨基化改性的聚乳酸溶液。称取一定量步骤2）制得的聚多巴胺包覆的载药磷烯用1,4
‑
二氧六环溶剂超声分散后加入到上述氨基化改性的聚乳酸溶液中，充分搅拌至分散均匀得到载药磷烯/改性聚乳酸混合浆料，其中载药磷烯的浓度为1.8 wt%。
34.4） 3d打印支架的制备：将步骤3）制得的载药磷烯/改性聚乳酸混合浆料注入3d打印机的料筒中，设置好打印温度、气压、挤出速度、固化速度等打印条件，选择好3d模型，在
‑
25 ℃的低温打印温度条件下实现个性化三维多孔支架的构建。将打印好的支架放入
‑
40 ℃冰箱中冷冻4 h进行更为深度的相分离，促使支架纳米纤维结构更好地形成。将冷冻后的支架用4 ℃的去离子水抽提去除溶剂，
‑
80 ℃下冷冻干燥3 d后得到磷烯功能化改性的3d打印聚乳酸支架。扫描电镜观察所制备的支架具有仿生天然细胞外基质的网状纳米纤维的结构。