一种壳聚糖修饰的苯并异噻唑啉酮聚乳酸纳米球及其制备方法和应用

：
1.本发明属于抗菌材料领域，具体涉及一种壳聚糖修饰的苯并异噻唑啉酮聚乳酸纳米球及其制备方法和应用。


背景技术：

2.苯并异噻唑啉酮(1,2
‑
benzisothiazolin
‑3‑
one,bit)及其衍生类化合物对靶标受体细胞膜极具穿透性，经跨膜转运，bit与细胞膜及胞内含巯基蛋白质(谷胱甘肽、半胱氨酸、巯基乙酸及巯基乙醇等)相互作用，使含巯基蛋白s
‑
n键断裂，从而与相应受体结合形成s
‑
s键，造成蛋白变性失活，细胞膜结构受损，破坏细胞的正常功能，最终导致细胞凋亡，进而有效抑制细菌、真菌等有害微生物的生长与繁殖的化合物。因此，bit具备抗菌谱广、环境安全等优良性能，广泛应用于工业抗菌防霉和海洋防污，其在农业和医药领域也取得了重大研究进展。bit因存在难溶性、分散性、稳定性问题，严重制约其在防霉、防腐等抗菌领域的高效利用。
3.纳米载药系统是材料学、物理化学、生物医学等多学科融合的新型交叉集群体，具有长效、缓控释和靶向递释等优点。在疾病防控、医学显影和抗菌等领域有着重大的发展空间。聚乳酸(polylactic acid，pla)人工合成的生物可降解聚酯类高分子材料，已经被美国食品和药物管理局以及欧洲药品管理局批准应用于医疗领域。pla通过酯键的水解成乳酸单体，经柠檬酸循环代谢，生成无毒的二氧化碳和水。pla作为药物载体，具备机械强度高、生物相容性好等优点，可以有效改善药物吸收、延长药物持效期，进而提高生物利用度。
4.壳聚糖(chitosan,cs)是一种天然的阳离子多糖，是由甲壳素在碱性条件下脱乙酰作用从甲壳类动物的壳中衍生而来的，其产量仅次于纤维素的第二大天然高分子多糖，具有优异的生物相容性、生物可降解性、抗菌性能，在生物医药领域尤其是药物载体界面修饰方面具有广阔的应用前景。


技术实现要素：

5.本发明的第一个目的在于克服难溶性bit药物抗菌活性偏低不足之处，提出一种壳聚糖修饰的苯并异噻唑啉酮聚乳酸纳米球，它可以增强药物在菌体的跨膜转运率，从而提高药物制剂对e.coli和s.aureus抗菌活性。
6.本发明的壳聚糖修饰的苯并异噻唑啉酮聚乳酸纳米球，其是在聚乳酸纳米球上负载苯并异噻唑啉酮，然后用壳聚糖修饰负载苯并异噻唑啉酮的聚乳酸纳米球，得到壳聚糖修饰的苯并异噻唑啉酮聚乳酸纳米球。
7.优选，所述的壳聚糖修饰的苯并异噻唑啉酮聚乳酸纳米球的平均粒径为186.47
‑
206.57nm，相应zeta电位为0.76
‑
25.61mv。
8.优选，具体制备方法为：
9.将聚乳酸和苯并异噻唑啉酮溶解于二氯甲烷中制得有机相，将聚乙烯醇溶解于去
离子水中制得水相，将有机相加于水相中，搅拌均匀，然超声乳化，再将乳液搅拌固化，将固化后的bit
‑
pla纳米球离心收集固体，去离子水洗涤，冻干制得bit
‑
pla纳米球，将bit
‑
pla纳米球分散于壳聚糖溶液中，搅拌反应使得壳聚糖修饰bit
‑
pla纳米球，收集固体用去离子水洗涤，制得壳聚糖修饰的苯并异噻唑啉酮聚乳酸纳米球。
10.优选，所述的聚乳酸、苯并异噻唑啉酮和壳聚糖的用量质量比为：70
‑
90：20：20
‑
100。进一步优选为80：20：20
‑
100。
11.优选，所述的超声乳化是采用探头式超声破碎仪在360w，冰浴条件下，超声3
‑
7s，间隙5s，超声乳化3分钟。
12.优选，所述的将乳液搅拌固化是将乳液在室温下以700
‑
900rpm搅拌固化10
‑
14小时。
13.优选，所述的将固化后的bit
‑
pla纳米球离心收集固体是将固化后的bit
‑
pla纳米球于8000
‑
12000rpm，22
‑
28℃，离心25
‑
35分钟，收集固体。
14.优选，将每70
‑
90mg聚乳酸和20mg苯并异噻唑啉酮溶解于5ml二氯甲烷中制得有机相，将120mg聚乙烯醇溶解于18
‑
22ml去离子水中制得水相，在700
‑
900rpm磁力搅拌下，将有机相逐步滴加于水相中，磁力搅拌15分钟，然后采用探头式超声破碎仪在360w，冰浴条件下，超声3
‑
7s，间隙5s，超声乳化3分钟，随后，将乳液在室温下以700
‑
900rpm搅拌固化10
‑
14小时，将固化后的bit
‑
pla纳米球于8000
‑
12000rpm，22
‑
28℃，离心25
‑
35分钟，去离子水洗涤3次，冻干得到bit
‑
pla纳米球，将bit
‑
pla纳米球分散至20ml的质量分数0.1～0.5％壳聚糖溶液中，并以800rpm的磁力搅拌12小时，去离子水洗涤3次，制备出壳聚糖修饰的苯并异噻唑啉酮聚乳酸纳米球。
15.本发明的第二个目的是提供壳聚糖修饰的苯并异噻唑啉酮聚乳酸纳米球在制备抗菌药物中的应用。
16.所述的抗菌药物是抗e.coli和s.aureus的药物。
17.本发明采用溶剂挥发法制备出负载bit抗菌药物的pla纳米球，将壳聚糖修饰在bit
‑
pla纳米球表面，得到壳聚糖修饰的苯并异噻唑啉酮聚乳酸纳米球。所制备的壳聚糖修饰的苯并异噻唑啉酮聚乳酸纳米球可以有效提高纳米载药体系跨膜转运率以及抗菌活性，从而有利于苯并异噻唑啉酮在防霉、防腐等抗菌领域的高效利用，克服其难溶性、分散性、稳定性问题。
附图说明
18.图1是基于cs修饰的bit
‑
pla纳米球水合粒径(a)bit
‑
pla；(b)bit
‑
pla
‑
0.1％cs；(c)bit
‑
pla
‑
0.5％cs。
19.图2是基于cs修饰的bit
‑
pla纳米球zeta电位(a)bit
‑
pla；(b)bit
‑
pla
‑
0.1％cs；(c)bit
‑
pla
‑
0.5％cs。
20.图3是香豆素
‑
6bit
‑
pla
‑
cs纳米粒的跨膜转运荧光定量分析(a)荧光光谱；(b)荧光值。
具体实施方式：
21.以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
22.实施例1
23.(1)将80mg聚乳酸pla(平均分子量100kda)和20mg苯并异噻唑啉酮bit原药溶解于5ml二氯甲烷dcm中，形成有机相；
24.(2)将120mg聚乙烯醇pva(粘度3.2
‑
3.6，醇解度87.0％
‑
89.0％)溶解于20ml去离子水中，形成水相；
25.(3)在800rpm磁力搅拌下，将有机相缓慢滴加入水相中，磁力搅拌15分钟；
26.(4)采用探头式超声破碎仪(jy92
‑
iidn)在360w，冰浴条件下，超声5s，间隙5s，超声乳化3分钟，形成乳液；
27.(5)将上述乳液室温下以800rpm搅拌固化12小时；
28.(6)固化后的bit
‑
pla纳米球于10000rpm，25℃，离心30分钟，去离子水洗涤3次，冻干备用，得到bit
‑
bla纳米球。
29.(7)在步骤(1)有机相中添加1mg香豆素6，重复步骤2
‑
6，制备出负载荧光染料香豆素6bit
‑
pla。
30.所制备的bit
‑
bla纳米球水合平均粒径约172.73nm(图1a)，相应zeta电位为
‑
21.92mv(图2a)。
31.实施例2
32.(1)将80mg pla(平均分子量100kda)和20mg bit原药溶解于5mldcm中，形成有机相；
33.(2)将120mg pva(粘度3.2
‑
3.6，醇解度87.0％
‑
89.0％)溶解于20ml去离子水中，形成水相；
34.(3)在800rpm磁力搅拌下，将有机相缓慢滴加入水相中，磁力搅拌15分钟；
35.(4)采用探头式超声破碎仪(jy92
‑
iidn)在360w，冰浴条件下，超声5s，间隙5s，超声乳化3分钟，形成乳液；
36.(5)将上述乳液室温下以800rpm搅拌固化12小时；
37.(6)固化后的bit
‑
pla纳米球于10000rpm，25℃，离心30分钟，去离子水洗涤3次；
38.(7)称取20mg壳聚糖cs，溶解于20ml去离子水溶液中(乙酸，ph 5.0)，得到cs溶液(0.1％,w/v)；
39.(8)步骤(6)所述的bit
‑
pla纳米球，分散至20ml的cs溶液(0.1％，w/v，ph 5.0)中，并以800rpm的磁力搅拌12小时，去离子水洗涤3次，制备出bit
‑
pla
‑
0.1％cs纳米球(即为壳聚糖修饰的苯并异噻唑啉酮聚乳酸纳米球)，冻干备用。
40.(9)在步骤(1)有机相中添加1mg香豆素6，重复步骤2
‑
8，制备出负载荧光染料香豆素6bit
‑
pla
‑
0.1％cs。
41.所制备的bit
‑
bla
‑
0.1％cs纳米球水合平均粒径约186.47nm(图1b)，相应zeta电位为0.76mv(图2b)。
42.实施例3
43.(1)将80mg pla(平均分子量100kda)和20mg bit原药溶解于5mldcm中，形成有机相；
44.(2)将120mg pva(粘度3.2
‑
3.6，醇解度87.0％
‑
89.0％)溶解于20ml去离子水中，形成水相；
45.(3)在800rpm磁力搅拌下，将有机相缓慢滴加入水相中，磁力搅拌15分钟；
46.(4)采用探头式超声破碎仪(jy92
‑
iidn)在360w，冰浴条件下，超声5s，间隙5s，超声乳化3分钟，形成乳液；
47.(5)将上述乳液室温下以800rpm搅拌固化12小时；
48.(6)固化后的bit
‑
pla纳米球于10000rpm，25℃，离心30分钟，去离子水洗涤3次；
49.(7)称取100mg cs，溶解于20ml去离子水溶液中(乙酸，ph 5.0)，得到cs溶液(0.5％,w/v)；
50.(8)步骤(6)所述的bit
‑
pla纳米球，分散至20ml的cs溶液(0.5％，w/v，ph 5.0)中，并以800rpm的磁力搅拌12小时，去离子水洗涤3次，制备出bit
‑
pla
‑
0.5％cs纳米球(即为壳聚糖修饰的苯并异噻唑啉酮聚乳酸纳米球)，冻干备用。
51.(9)在步骤(1)有机相中添加1mg香豆素6，重复步骤2
‑
8，制备出负载荧光染料香豆素6bit
‑
pla
‑
0.5％cs.
52.所制备的bit
‑
bla
‑
0.5％cs纳米球水合平均粒径约206.57nm(图1c)，相应zeta电位为25.61mv(图2c)。
53.实施例4
54.采用香豆素6荧光标记法测定壳聚糖修饰bit
‑
pla纳米球在e.coli和s.aureus跨膜转运能力。将500μl 2
×
108cfu/mle.coli或s.aureus加至2ml无菌离心管，随后与500μl香豆素6荧光标记bit
‑
bla、bit
‑
pla
‑
0.1％cs或bit
‑
pla
‑
0.5％cs，bit有效成分终浓度为2μg/ml，于37℃，180rpm振荡培养2小时，然后用无菌磷酸盐缓冲盐水(pbs，0.01m，ph7.4)洗涤3次，将细菌细胞悬浮于1ml pbs中，通过荧光光谱仪(ls45，perkin elmer，ma，usa)在430nm激发波长下，发射波长扫描范围为450nm～700nm，测量e.coli和s.aureus菌体内香豆素6荧光值(图3)。负载香豆素6bit
‑
pla
‑
0.1％cs和bit
‑
pla
‑
0.5％cs进入e.coli菌体内荧光值分别约为bit
‑
pla处理组的1.08倍和1.37倍。相比之下，负载香豆素6bit
‑
pla
‑
0.1％cs和bit
‑
pla
‑
0.5％cs进入s.aureus菌体内荧光值分别约为bit
‑
pla处理组的1.15和1.43倍。正电荷cs界面修饰bit
‑
pla纳米粒，更易于与细胞表面负电荷相互作用，进而获得更优的渗透性及跨膜转运能力。
55.采用比浊法对cs修饰bit
‑
pla纳米粒e.coli和s.aureus抗菌活性分析。将100μl浓度梯度bit
‑
pla，bit
‑
pla
‑
0.1％cs或bit
‑
pla
‑
0.5％cs加入96孔板中。随后，每孔接种100μl 2
×
106cfu/ml菌体，37℃下培养24小时，通过酶标仪(thermo multiskan go,thermo fisher scientific,vartaa,finland)测定od
60
，采用ibm spss 25计算bit
‑
pla，bit
‑
pla
‑
0.1％cs或bit
‑
pla
‑
0.5％cs对e.coli和s.aureus的ec
50
(表1和表2)。bit
‑
bla，bit
‑
pla
‑
0.1％cs和bit
‑
pla
‑
0.5％cs对e.coli和s.aureus ec
50
分别是：5.6331μg/ml，3.8305μg/ml和1.9087μg/ml以及12.4093μg/ml，7.6955μg/ml和5.8852μg/ml。以未经cs修饰的bit
‑
pla纳米球作为标准药剂，bit
‑
pla
‑
0.5％cs对e.coli和s.aureus相对毒力约为bit
‑
pla的2.95倍和2.11倍。经cs修饰bit
‑
pla纳米球可以有效提高纳米载药体系的抗菌活性。
56.表1 bit
‑
pla
‑
cs纳米粒对e.coli毒力分析
[0057][0058]
表2 bit
‑
pla
‑
cs纳米粒对s.aureus毒力分析
[0059]