一种化疗免疫联合药物及其制备方法与应用

1.本发明属于纳米药物技术，具体涉及一种化疗免疫联合药物及其制备方法与应用。


背景技术：

2.化疗后期很多病人会出现耐药、癌细胞转移、肿瘤复发等不良预后反应，对于高度转移性肿瘤，如孕激素受体、雌激素受体和人表皮生长受体都不表达的三阴性乳腺癌（tnbc）患者几乎是束手无策。最近兴起的免疫疗法在肿瘤治疗上显示了巨大潜力，尤其是基于pd
‑
1单抗、pd
‑
l1单抗、或ctla
‑
4单抗的免疫检查点疗法，通过唤醒或恢复免疫细胞对肿瘤的免疫学监控来实现肿瘤治疗。但是单一免疫疗法如pd
‑
1/pd
‑
l1单抗只对20%
‑
25%的患者有效，而对棘手的tnbc病人的客观响应率（orr）只有12％
‑
19％，是因为tnbc肿瘤细胞突变率低、免疫微环境弱、肿瘤浸润淋巴细胞水平低。


技术实现要素：

3.本发明公开了一种化疗免疫联合药物及其制备方法与应用，分别制备了偶联phscnk多肽（atn1）、phscnk 多肽（atn2）或crgd多肽的纳米药物atn1
‑
ms
‑
ptx、atn2
‑
ms
‑
ptx和crgd
‑
ms
‑
ptx；并且制备了基于peg
‑
p(tmc
‑
dtc)
‑
sp的具有不对称膜结构的聚合物囊泡来装载、保护和递送环二核苷酸（cdn）adu
‑
s100（cps
‑
cdn）到apc，以更好地激活抗肿瘤免疫应答。实验结果表明，atn2
‑
ms
‑
ptx能高效靶向富集到小鼠肿瘤，增加了ptx在肿瘤细胞的浓度，其后顺序递送cps
‑
cdn激活了sting通路，明显延缓了小鼠肿瘤的生长、抑制了乳腺癌的肺转移，延长了小鼠的生存期。
4.本发明采用如下技术方案：一种化疗免疫联合药物，由化疗药物胶束与囊泡纳米sting激动剂组成；所述化疗药物胶束的制备方法为，将小分子药物、两亲性聚合物加入低聚乙二醇中，得到混合溶液，再将所述混合溶液加入缓冲溶液中，得到化疗药物胶束；或者将小分子药物、两亲性聚合物、靶向两亲性聚合物加入低聚乙二醇中，得到混合溶液，再将所述混合溶液加入缓冲溶液中，得到化疗药物胶束；所述低聚乙二醇的分子量（m
n
）为200～600；所述囊泡纳米sting激动剂由聚合物囊泡装载sting激动剂组成。
5.上述技术方案中，静置下，将所述混合溶液打入缓冲溶液中，然后搅拌、静置、涡旋、吹打或者倒置；打入为现有技术，比如用注射器或者注射泵；搅拌的转速为100～1000rpm。混合溶液中，小分子药物的浓度为0.1至10 mg/ml，聚合物浓度为1～100 mg/ml；聚合物为两亲性聚合物，或者聚合物为两亲性聚合物和靶向两亲性聚合物的混合物。
6.上述技术方案中，混合溶液中含有靶向两亲性聚合物时，靶向两亲性聚合物的用量为两亲性聚合物重量的1～30%，优选2～10%。本发明中，两亲性聚合物不偶联靶向分子，靶向两亲性聚合物偶联靶向分子。
7.上述技术方案中，低聚乙二醇、缓冲溶液的体积比为1∶（5～40），优选1∶（10～30）。
8.本发明制备了ptx载药量高的胶束，且制备的小粒径胶束（20
‑
40 nm）能够穿透至肿瘤深处。
9.本发明公开了上述囊泡纳米sting激动剂的制备方法，将sting激动剂溶液加入缓冲溶液中，再加入聚合物溶液，搅拌后透析，得到囊泡纳米sting激动剂。进一步的，sting激动剂溶液为sting激动剂水溶液；聚合物溶液为聚合物的dmf溶液；缓冲溶液为hepes缓冲溶液。其中，sting激动剂溶液的浓度为1～30 mg/ml；聚合物溶液的浓度为1～100 mg/ml。
10.上述技术方案中，小分子药物为紫杉醇ptx；所述低聚乙二醇的分子量（m
n
）为200～600。两亲性聚合物的分子量为3000～15000，靶向两亲性聚合物的分子量为2000～15000。本发明聚合物的分子量为核磁测定的数均分子量（m
n
），单位为da。
11.上述技术方案中，sting激动剂为环二核苷酸（cdn），包括环二单磷酸鸟苷（c
‑
di
‑
gmp）、环二单磷酸腺苷（c
‑
di
‑
amp）、2`,3`环单磷酸鸟
‑
单磷酸腺苷酸（2`,3`
‑
cgmap）、3`,3`环单磷酸鸟
‑
单磷酸腺苷酸（3`,3`
‑
cgmap）及其取代衍生物，比如硫、氟、氮取代环二核苷酸衍生物。
12.上述技术方案中，两亲性聚合物为peg
‑
p(cl
‑
dtc)、peg
‑
p(tmc
‑
dtc)、peg
‑
p(la
‑
dtc)等；靶向两亲性聚合物为所述两亲性聚合物偶联靶向分子，优选的，靶向分子为多肽，比如phscnk多肽、phscnk 多肽或crgd多肽；两亲性聚合物中，peg的分子量（m
n
）为1000～5000 da。
13.上述技术方案中，制备囊泡纳米sting激动剂时，聚合物包括亲水链段、疏水链段以及阳离子片段；所述疏水链段的侧链为含双硫键的二硫戊环，其化学结构式如下：r为亲水链段，比如聚乙二醇链段；t链段与侧链含双硫键的碳酸酯链段（dtc单体形成的单元）组成疏水链段，t为环酯单体或者环碳酸酯单体形成的单元，比如丙交酯、己内酯、三亚甲基碳酸酯；p为阳离子片段，比如聚乙烯亚胺（pei）、精胺（sp）；y、z表示重复单元；所述亲水链段的分子量为2000～9000da；疏水链段的分子量为亲水链段分子量的2.1～8.0倍；侧链含双硫键的碳酸酯链段的分子量为t链段分子量的10%～35%；阳离子片段的分子量为亲水链段分子量的5%～30%；比如所述聚合物为peg
‑
p(tmc
‑
dtc)
‑
sp。
14.本发明制备了ptx载药量高的胶束，且制备的小粒径胶束（20
‑
40 nm）能够穿透至肿瘤深处，并且cps
‑
cdn激活sting通路、激活并招募apc的顺序给药策略，可以更强地激活免疫系统，产生更多促炎细胞因子，使肿瘤和脾脏内的cd4
+
、cd8
+ t细胞比例显著增多、抑制性t
reg
减少，更好地抑制小鼠tnbc的生长和肺转移的发生。本发明公开了上述化疗免疫联合药物在制备抗肿瘤药物中的应用，优选肿瘤为三阴性乳腺癌（tnbc）。
15.本发明首先设计制备了高效载ptx、双硫交联的胶束ms
‑
ptx以及三种tnbc主动靶向的胶束纳米药物，载药量高达23.1wt.%，粒径在30～38 nm之间，具有良好的稳定性、还原响应的药物释放性能。细胞层面和动物层面的实验证实，atn2
‑
ms
‑
ptx对4t1细胞的靶向内吞作用最强，ic
50
值最低，在肿瘤的生物分布最高。此外，atn2
‑
ms
‑
ptx可诱导icd、促进bmdc
增值以及成熟、促进bmdm向m1型巨噬细胞极化，产生有利的免疫微环境。此外，为探索进一步加强靶向ptx胶束的免疫治疗效果，制备了载sting激动剂cdn的双硫交联的囊泡cps
‑
cdn，以激活apc的sting通路，诱导更强的免疫应答。atn2
‑
ms
‑
ptx和cps
‑
cdn联合可促进bmdc的成熟，释放ifn
‑
β和tnf
‑
等细胞因子。在荷4t1乳腺癌小鼠中，先静脉注射atn2
‑
ms
‑
ptx、诱导icd释放肿瘤抗原，8
‑
24 h后再瘤内注射cps
‑
cdn激活sting通路、激活并招募apc的顺序给药策略，可以更强地激活免疫系统，产生更多促炎细胞因子，使肿瘤和脾脏内的cd4
+
、cd8
+ t细胞比例显著增多、抑制性t
reg
减少，更好地抑制小鼠tnbc的生长和肺转移的发生，显著延长小鼠生存期，体现了化疗联合免疫治疗的优势，为治疗高转移性肿瘤带来了希望。
附图说明
16.图1为ms
‑
ptx和atn2
‑
ms
‑
ptx胶束的制备和理化性质（载药量4.8 wt.%）。（a）胶束的制备过程示意图；（b）ms
‑
ptx和atn2
‑
ms
‑
ptx的粒径分布以及ms
‑
ptx的tem示意图；（c）载药量为23.1 wt.%的ms
‑
ptx（i）及相同ptx浓度的pb溶液（ii）照片；（d）胶束在室温存放3周、制备后再透析后室温放置1 h的粒径变化；（e）空ms、atn2
‑
ms和ncms以及相同浓度的聚合物溶液（5 mg/ml）的紫外吸收谱图；（f）胶束中芘的荧光吸收谱中i
372
/i
383
（i1/i3）比值随浓度的变化；（g）ms
‑
ptx和atn2
‑
ms
‑
ptx浓度为20 μg/ml的粒径，以及ncms
‑
ptx浓度为1 mg/ml、50 μg/ml的粒径及其在室温下放置2天的粒径；图2为ms
‑
ptx和atn2
‑
ms
‑
ptx在37 度10%fbs中孵育24 h后的粒径分布（a），在10 mm dtt中孵育2 h后的粒径分布（b）；atn2
‑
ms
‑
ptx在模拟生理环境（pb，ph 7.4）和细胞内还原环境（含10 mm dtt 的pb）下ptx的累积释放（n = 3）（c）；图3为mtt法（n = 5）测定含不同多肽密度的（a）crgd
‑
ms
‑
ptx、（b）atn1
‑
ms
‑
ptx和（c）atn2
‑
ms
‑
ptx对4t1细胞的毒性；（d）自由ptx先孵育4 h、换新鲜培养基再孵育44 h（4+44 h）及共孵育48 h的细胞毒性；（e）空胶束ms和atn2
‑
ms共孵育48 h的细胞毒性；图4为流式细胞仪（a）和clsm（b&c）测试了标记cy5的ms
‑
ptx、at1
‑
ms
‑
ptx、atn2
‑
ms
‑
ptx和crgd
‑
ms
‑
ptx被4t1细胞内吞（孵育4 h）的情况。（b）为cy5半定量荧光强度。受体抑制实验用phscnk多肽（atn2）预先和4t1细胞孵育2 h再加cy5/atn2
‑
ms
‑
ptx。cy5聚合物浓度为2 μg/ml。标尺为25 μm；图5为cps
‑
cdn的制备（a）以及1 mg/ml cps
‑
cdn在4℃放置3周和在含10%的fbs的pb中粒径变化（b）；图6为bmdc的成熟（cd11c
+
cd86
+
cd80
+
）和培养基中细胞因子的浓度（n = 3）。自由cdn、atn2
‑
ms
‑
ptx、cps
‑
cdn及后两者联合和bmdc孵育24 h。（a）bmdc的代表性样品流式细胞仪伪色图（在cd11c
+
总bmdc圈门内）及其统计学分析（b）。培养基中（c）ifn
‑
β、（d）tnf
‑
α和（e）il
‑
6的浓度；图7为ms
‑
ptx（i.v. 10 mg ptx/kg，i.t. 5 mg ptx/kg）及其给药后2 h联合cps
‑
cdn（i.t. 1 mg cdn/kg）治疗荷4t1小鼠（n = 3）的肿瘤体积（a）和相对体重（b）；图8为atn2
‑
ms
‑
ptx胶束及其与cps
‑
cdn联合治疗荷4t1乳腺癌小鼠（7.5 mg ptx/kg，1 mg cdn/kg）的（a）抗肿瘤治疗方案；（b）肿瘤体积（#号代表肿瘤体积大于2000 mm3死亡或自然死亡）；（c）小鼠的生存曲线；（d）小鼠体重。n = 7；
图9为atn2
‑
ms
‑
ptx及其与cps
‑
cdn联合给药结束24 h后小鼠肿瘤的流式细胞仪分析（n = 4）。成熟dc（cd45
+
cd80
+
cd86
+
）（a）和m1m（cd11b
+
f4/80
+
cd206
‑
）（b）的比例。cd3
+
cd4
+
和cd3
+
cd8
+ t细胞代表性流式细胞图（c）。cd3
+
cd4
+
（d）和cd3
+
cd8
+
（e）t细胞比例。（d）tregs（cd3
+
cd4
+
foxp3
+
，cd45
+
圈门内）在cd4
+ t中的含量，（e）cd8+ t/tregs比例。（h）血清中细胞因子的浓度；图10为atn2
‑
ms
‑
ptx及其与cps
‑
cdn联合给药结束24 h后小鼠脾脏的流式细胞仪分析。（a）cd3
+
cd4
+
、cd3
+
cd8
+ t细胞代表性流式细胞伪色图（在cd45
+
总免疫细胞圈门内）以及（b）cd3
+
cd4
+ 和（c）cd3
+
cd8
+ t细胞比例统计。n = 4；图11为自由ptx、ms
‑
ptx、自由cdn、cps
‑
cdn、atn2
‑
ms
‑
ptx及其与cps
‑
cdn联合治疗后第22天小鼠的血常规（a）和血生化（b）分析（n = 3）；图12为pbs、自由ptx、ms
‑
ptx、自由cdn、cps
‑
cdn、atn2
‑
ms
‑
ptx及其与cps
‑
cdn联合治疗荷瘤小鼠22天后小鼠心、肝、肾、脾切片的h&e染色图（40
×
，标尺为50 μm）。wp：白髓，rp：红髓；图13为自由ptx、ms
‑
ptx、自由cdn、cps
‑
cdn、atn2
‑
ms
‑
ptx及其与cps
‑
cdn联合给药第22天小鼠的脾脏图片（a）和质量（b）。n = 3；图14为荷瘤小鼠在给药22天后肺部离体成像（a）、荧光值半定量（b）和质量（c）。（d）肺h&e染色图。左图为10
×
，标尺为500 μm；右图为40
×
，标尺为50 μm。
具体实施方式
甲氧基聚乙二醇（meo
‑
peg
‑
oh，m
n
= 2.0 kg/mol）、马来酰亚胺和琥珀酰亚胺酯官能化的聚乙二醇（mal/nhs
‑
peg
‑
oh，m
n
= 3.5 kg/mol）均购自北京键凯科技有限公司，经甲苯共沸蒸馏后使用。ε
‑
己内酯（ε
‑ꢀ
cl, 99%，alfa aesar）经氢化钙干燥、减压蒸馏后使用。1,2
‑
二硫戊环三亚甲基碳酸酯（dtc）由本实验室合成并提纯。磷酸二苯酯（dpp，> 99%，tci）使用前真空干燥30分钟。环肽c(rgdfc)（crgd）、ac
‑
phscnk
‑
nh2（atn
‑
1）和ac
‑
phscnk
‑
nh2（atn
‑
2）的纯度都大于 98%，均购自上海强耀生物。高效液相色谱（hplc）用试剂均从sigma aldrich (usa) 购买得到。紫杉醇（ptx，> 99%，上海金和生物制药有限公司）、甲氧基低聚乙二醇（peg 350，m
n
= 350 g/mol，sigma）、sting激动剂adu
‑
s100（> 99%，mce）、谷胱甘肽（gsh，> 99%，roche）和cy5
‑
nh2（lumiprobe）等试剂均是购买后直接使用。micro bca试剂盒（pierce，thermo scientific）、增强型atp检测试剂盒（s0027，碧云天）、小鼠高迁移率族蛋白b1（hmgb
‑
1）（e
‑
el
‑
m0676c， elabscience）、小鼠白细胞介素
‑
6（il
‑
6）elisa检测试剂盒（jn
‑
029562
‑
s，上海研域）、小鼠干扰素
‑
、干扰素
‑
（ifn
‑
、ifn
‑
）和细胞坏死因子
‑
（tnf
‑
）elisa检测试剂盒（invivogen）、钙网蛋白（crt）抗体（ab2907，abcam）、以及小鼠荧光标记的各种抗体（biolegend）cd45
‑
percp/cyanine5.5、cd80
‑
apc、cd86
‑
pe、cd11c
‑
fitc、cd11b
‑
fitc、cd206
‑ꢀ
alexa fluor 647、f4/80
‑
pe、cd4
‑
pe、cd8
‑
fitc、foxp3
‑ꢀ
alexa fluor 647和山羊抗兔
‑
alexa fluor 633等试剂盒和抗体均购买后按说明书使用。小鼠乳腺癌细胞株4t1是从中科院上海细胞库购买。
17.聚合物的核磁共振氢谱（1h nmr）由400 mhz超导核磁共振谱仪（unity inova，安捷伦）或600 mhz 超导核磁共振谱仪（directdrive2，瓦里安）以氘代氯仿（cdcl3）或氘代二甲亚砜（dmso
‑
d6）为溶剂测定，化学位移以溶剂峰为参考标准。聚合物分子量以及分子量分
布由waters 1515凝胶渗透色谱仪（gpc）测定，以dmf为流动相（流速为0.8 ml/min），测试温度为40℃，以一系列单分散的线性聚甲基丙烯酸甲酯作为分子量标准品。聚合物胶束和囊泡的粒径和粒径分布通过配有he/ne激光光源（波长为633 nm）和173
o
背折射检测器的zetasizer nano
‑
zs纳米粒度仪（malvern instruments）测定，温度为25
ꢀº
c。胶束样品的微观形貌由tecnai g220透射电镜（tem）在120 kv加速电压下测定，样品用1% 磷钨酸溶液染色。ptx的浓度由配有反相c18色谱柱（4.6
×
150 mm，5μm）的高效液相色谱仪（hplc）测试，流动相为 0.1%三氟乙酸的水/乙腈（v/v =45/55），流速为 1 ml/min，检测温度为40℃，检测波长为 227 nm。tcs sp5共聚焦激光扫描显微镜（clsm，leica）用来研究胶束的细胞内吞行为。流式细胞仪（facs calibur, bd biosciences）用来研究胶束内吞行为以及体内免疫细胞的定性和定量分析。酶标仪（thermo multiskan fc）用来测定活细胞与mtt形成的紫色甲瓒在570 nm处的吸光度值。多功能酶标仪（varioskan lux，thermo scientific）用来进行细胞因子的elisa检测。
18.本发明设计制备了纳米剂型的ptx 和cdn免疫佐剂，将其联合在以小鼠4t1为模型的tnbc中进行化学免疫治疗。首先制备了靶向、基于peg
‑
p(cl
‑
dtc)的双硫交联的ptx胶束纳米药物，提高ptx在肿瘤细胞里的浓度、提高疗效、降低毒副作用，分别制备了偶联phscnk、phscnk 多肽或crgd多肽的纳米药物atn1
‑
ms
‑
ptx、atn2
‑
ms
‑
ptx和crgd
‑
ms
‑
ptx。另一方面，cdn由于分子量小、易被降解、带负电水溶性强，难以进入抗原递呈细胞（apc）和内质网的sting蛋白结合激活sting通路，为了克服这些问题，本发明制备了基于peg
‑
p(tmc
‑
dtc)
‑
sp的具有不对称膜结构的聚合物囊泡来装载、保护和递送sting激动剂环二核苷酸adu
‑
s100（cps
‑
cdn）到apc，以更好地激活抗肿瘤免疫应答。研究发现，化学免疫疗法中化药和免疫调节剂的递送顺序会影响总体疗效。本发明首先用靶向tnbc的ptx胶束高效输送ptx至肿瘤，杀死部分肿瘤细胞并诱导免疫原性细胞死亡（icd），产生肿瘤相关抗原并被apc有效内吞，从而增加ctl的激活；然后瘤内注射cps
‑
cdn激活sting通路，并进一步活化肿瘤里包括dc在内的apc，增强其递呈抗原的能力，招募并激活t细胞产生抗肿瘤免疫应答。实验结果表明，atn2
‑
ms
‑
ptx能高效靶向富集到小鼠4t1肿瘤，增加了ptx在肿瘤细胞的浓度，其后顺序递送cps
‑
cdn激活了sting通路，显著延缓了小鼠肿瘤的生长、抑制了肺转移，延长了小鼠的生存期。
19.本发明的原料都是现有产品，具体操作方法以及测试方法为本领域常规方法。本发明所有数据均是以平均值呈现，组间差异性由anova单因素方差分析评估，*p < 0.05视为具有显著性差异，将**p < 0.01和***p < 0.001视为高显著性差异。
20.制备例peg
‑
p(cl
‑
dtc) 嵌段共聚物的合成是以meo
‑
peg
‑
oh (m
n
= 2.0 kg/mol) 为大分子引发剂、磷酸二苯酯（dpp）为催化剂引发dtc和cl的开环聚合而得。具体地，在惰性气体手套箱里，向25 ml密闭反应器中依次加入meo
‑
peg
‑
oh (800 mg, 0.4 mmol)、dpp (1.0 g，4 mmol)、dtc (400 mg，2.1 mmol) 、cl (400 mg，3.5 mmol) 和无水dcm（3.2 ml），搅拌溶解后密封，移出手套箱，置于40
ꢀº
c 油浴中磁力搅拌反应48 h。反应结束后，加入冰醋酸终止反应，在30倍体积的冰乙醚中沉淀2次，抽滤、真空干燥24 h后得到peg
2k
‑
p(cl
1k
‑
dtc
1k
)，制备路线如下所示：
用分子量为5000 da的meo
‑
peg
‑
oh为引发剂、dpp为催化剂，根据上述方法可控开环聚合cl和dtc得到peg
‑
p(cl
‑
dtc)，核磁分子量为5k
‑
4k
‑
3k或者5k
‑
4k
‑
2k。
21.用上述相同方法：不加dtc合成了peg
‑
pcl；以mal
‑
peg
‑
oh或nhs
‑
peg
‑
oh（m
n
= 3.5 kg/mol）替换meo
‑
peg
‑
oh (m
n
= 2.0 kg/mol)作为引发剂合成了mal
‑
peg
‑
p(cl
‑
dtc)或nhs
‑
peg
‑
p(cl
‑
dtc)。
22.atn
‑
peg
‑
p(cl
‑
dtc) 通过phscnk或phscnk多肽与nhs
‑
peg
‑
p(cl
‑
dtc)通过酰胺化反应得到。简言之，在氮气保护下，将nhs
‑
peg
‑
p(cl
‑
dtc)（132 mg，0.024 mmol）溶解在1 ml无水dmso中，phscnk多肽或phscnk多肽（20 mg，0.028 mmol）溶解在0.5 ml无水dmso中。将聚合物溶液滴加至30℃的多肽溶液中，30 min滴加结束后再加入7 μl的三乙胺调节体系ph在8.0，密闭反应器后再30度反应48 h。将反应液装入透析袋（mwco 3500 da）在dmso中透析4 h、dcm中透析2 h，然后在30倍体积的冰乙醚/无水乙醇（9/1，v/v）中沉淀2次，离心、真空干燥24 h后得到atn
‑
peg
‑
p(cl
‑
dtc)。1h nmr（600 mhz，dmso
‑
d6）测试得到谱图可进行聚合物结构和分子量分析，用micro bca蛋白试剂盒测试可计算多肽的官能化度，计算出phscnk和phscnk的官能化度分别为71.2%和79.6%。反应如下：crgd
‑
peg
‑
p(cl
‑
dtc) 由c(rgdfc) 多肽的巯基和mal
‑
peg
‑
p(cl
‑
dtc) 通过迈克尔加成反应制得，其步骤、聚合物的提纯和表征同上。反应如下：
上述聚合物及表征请参见申请人同日提交的发明名称为“一种小胶束纳米药物及其制备方法与应用”的发明申请，本发明与其一致。
23.将ptx和peg
2k
‑
p(cl
1k
‑
dtc
1k
) 按照质量比（1/20）溶于peg 350中，其中聚合物浓度保持1 mg/ml。常规超声5 min后，在37℃取100 μl的该混合溶液打入900 μl的pb溶液底部（ph 7.4，10 mm），过程中静置不搅拌。打入之后用移液枪贴液面吹打5次，即得到ptx载药胶束，为非靶向小胶束纳米药物，dls测定其粒径为27.8nm，粒径分布（pdi）为0.18。在上述方法基础上：将聚合物更换为peg
5k
‑
p(cl
4k
‑
dtc
3k
)，同样方法得到的ptx载药胶束，dls测定其粒径为55.1nm，粒径分布（pdi）为0.27。如果混液过程中常规搅拌（600 rpm），其余不变，得到的ptx载药胶束粒径达到168 nm，且存放1小时即出现药物析出。将peg 350更换为dmf或者dmso，同样方法得到的ptx载药胶束，粒径较小，但是稳定性差，常规环境下存放4小时后，出现大量沉淀，说明药物明显析出，较本发明存放20天以上无药物析出差得多。
24.实施例一 化疗
‑
免疫联合药物ptx胶束的制备将ptx和peg
2k
‑
p(cl
1k
‑
dtc
1k
) 按照不同质量比（5/100、10/100、20/100、30/100）溶于peg 350，其中聚合物浓度在50 mg/ml。常规超声5 min后，在37℃取100 ml的该混合液打入900 ml的pb溶液底部（ph 7.4，10 mm），过程中静置不搅拌。打入之后用移液枪贴液面吹打5次，即得到ptx载药量为4.8 wt.%～23.1 wt.%的胶束ms
‑
ptx，为非靶向小胶束纳米药物。dls测定其粒径及粒径分布（pdi），tem测定胶束形貌。用含20 mm dtt的乙腈溶解ms
‑
ptx（聚合物浓度为0.1 mg/ml），再用hplc测试其中ptx浓度，计算载药量和载药效率。用dls在不同时间点监测ptx胶束在25和37℃存放、稀释至低浓度（20 mg/ml）及在含10%fbs溶液中粒径和粒径分布的变化，见表1。
25.作为对照，用相同方法也制备了基于peg
‑
pcl的载ptx胶束（ncms
‑
ptx）。
26.现有技术多数文献中报道的ptx纳米载体载药量均较低。本发明利用少量peg350来溶解聚合物peg
‑
p(cl
‑
dtc)和ptx，将混合物加入到水相中（peg350的最终体积含量10%），通过疏水作用聚合物形成核壳结构的胶束把ptx包裹在疏水核中，而核中dtc可快速自交联，能更稳定地把ptx固定在胶束核中，得到ptx胶束纳米药物ms
‑
ptx（图1 a）。这里使用的peg350无毒，获fda批准使用。本发明通过该方法制备了载药量从4.8 wt.%到23.1 wt.%的
胶束ms
‑
ptx，粒径范围在30
‑
38 nm，粒径分布0.13
‑
0.17（表1）。例如，dls测试结果表明，载4.8 wt.%的ms
‑
ptx粒径为32.7 nm，pdi为0.16，tem图显示出其具有较规则的实心小球的形状（图1b）。此外，即使是理论载药量达23.1 wt.%时，ms
‑
ptx胶束依然保持澄清透明，粒径为38.1 nm，pdi为0.13（表1）。由于ptx的水溶性很低（水中溶解度为5.56mg/l），将相同量ptx用peg350 溶解后直接加入到水中，ptx迅速析出，而载23.1 wt.% ptx的ms
‑
ptx能保持澄清，说明ptx全装载在胶束里面（图1 c）。使用该方法制备胶束纳米药物过程简单、重现性好、胶束的稳定性好，在室温存放三周后胶束的粒径和粒径分布也基本不变（图1 d），没有沉淀；这比基于peg
‑
pdlla聚合物制备的genexol
‑
pm稳定得多，genexol
‑
pm在2～4 h内粒径会增大并且产生很多晶状沉淀。本发明制备的ms
‑
ptx比文献中报道的脂质体和多数纳米载体及genexol
‑
pm（ptx载药量10 wt.%）具有更高的载药量。
27.研究了制剂中的peg350对ms
‑
ptx载药量和稳定性的影响，将1 ml新制的载药量为4.8 wt.%的ms
‑
ptx（1 mg/ml）的一半室温存储，另一半装入透析袋（mwco 3500 da）中，放入50 ml pb溶液（ph 7.4，10 mm）中透析3 h（每30分钟换一次缓冲液）。测定透析后粒径及pdi变化和ptx载药量的变化。结果发现，除去peg350后胶束的ptx载药量稍微降低，但包封率保持在87%以上，说明该方法能把ptx紧密包在胶束里；但是透析后胶束粒径减小6
‑
8 nm，pdi变大（表2），室温下放置1 h就逐渐出现浑浊和ptx析出，在200
‑
1000 nm出现聚集体（图1 d），这与没有除去peg350样品的稳定形成鲜明对比。
28.研究了聚合物中dtc对形成的ptx胶束载药量和稳定性的影响，相同条件制备的基于peg
‑
pcl载ptx不交联胶束ncms
‑
ptx和载4.8 wt.% ptx的peg
‑
p(cl
‑
dtc)（ms
‑
ptx），一半室温存放、一半透析，测定两组各种透析前后粒径及pdi变化和ptx载药量的变化，研究比较了ncms和ms两种胶束的紫外吸收、临界胶束浓度（cmc）以及两种载药胶束的稳定性。纳米粒中dtc的二硫戊环的330 nm的紫外吸收值降低很多，说明发生硫硫交联反应得到交联纳米粒。而本胶束在制备中由于没有透析，peg350仍然存在，是否在制备后也能在胶束核内形成交联是不可预知的。本发明首先测定了两种胶束和相同浓度的对应聚合物溶液（5 mg/ml）的紫外吸收，发现peg
‑
pcl聚合物溶液及其胶束ncms无明显的吸收峰。而ms中dtc在326 nm出现二硫戊环的紫外吸收峰，但是其强度低于对应的聚合物溶液中dtc的强度（图1 e），下降了40.7%。这结果说明ms胶束中部分二硫戊环开环，形成核内自交联。其次，用芘为荧光染料来确定两种胶束的临界胶束浓度（cmc），发现ncms的cmc为15.6 mg/ml，但ms在聚合物浓度为1.2 mg/ml至 2.5 mg/ml范围内i1/i3没有发现明显的转变（图1 f），即没有cmc，胶束在稀释到cmc以下时也不会解离成单分子。在实验中也发现将ms
‑
ptx胶束浓度稀释到20 mg/ml测dls时，胶束仍然完整，粒径呈正态分布，而ncms
‑
ptx胶束稀释至50 mg/ml时测试就出现聚集现象，pdi也迅速变大（图1 g）。此外，ncms
‑
ptx在室温下放置2天后变得不稳定，出现ptx析出以及大分子聚集（图1 g）。这些实验结果都证实了本发明制备的ms
‑
ptx胶束是双硫
交联的，这有助于进一步稳定ptx。综上，本发明基于peg
‑
p(cl
‑
dtc) 的胶束ms
‑
ptx比基于t
g
高得多的peg
‑
pdlla的genexol
‑
pm还稳定得多。
29.载sting激动剂cdn的聚合物囊泡cps
‑
cdn的制备peg
‑
p(tmc
‑
dtc)
‑
sp的合成可参见申请人已经公开的专利或者文章，具体制备方法为现有技术。使用聚乙二醇
‑
聚（三亚甲基碳酸酯
‑
二硫戊环三亚甲基碳酸酯）
‑
精胺（peg
‑
p(tmc
‑
dtc)
‑
sp，m
n
= 5.0
‑
(15
‑
2)
‑
0.2 kg/mol）、通过溶剂置换法制备载cdn聚合物囊泡，cdn选用adu
‑
s100。简要步骤如下：配制peg
‑
p(tmc
‑
dtc)
‑
sp的dmf溶液（10 mg/ml）和cdn水溶液（不含核糖核酸酶的depc水，2 mg/ml）。将100
ꢀµ
l聚合物溶液加入900
ꢀµ
l含cdn的4℃的hepes缓冲溶液（ph 6.8），cdn理论载药量为13.0 wt.%。200 rpm搅拌10分钟后形成载药囊泡，先用hepes在4度透析2 h，再用ph 7.4的pb透析1 h得到cps
‑
cdn（1 mg/ml），研究表征见实施例五。cps
‑
cdn的粒径、pdi及稳定性等表征方法同ptx胶束。cdn的载药量（dlc）和载药效率（dle）通过测定nanodrop 2000在寡dna模式下260 nm处的吸光度值、基于标准曲线计算得来。
30.dlc (wt.%) =（cdn质量/cdn和聚合物的总质量）
×
100dle (%) = （cdn质量/投入的cdn质量）
×
100ptx胶束与载sting激动剂cdn的聚合物囊泡cps
‑
cdn组成化疗免疫联合药物。
31.此外，ms
‑
ptx在含10%fbs的pb缓冲液中（模拟体内血液环境）保持稳定，24 h粒径保持不变（图2 a）；然而在含10 mm dtt的pb溶液（模拟细胞质内还原环境）中其粒径在2 h时很快出现500
‑
1000 nm的大颗粒，4 h时出现十几纳米的小颗粒（图2 b），这是由于疏水核中的二硫键在还原条件下逐渐解交联、胶束溶胀、在低聚合物浓度下会解离成单分子的缘故。这表明该胶束具有快速还原响应性能。
32.实施例二装载ptx的靶向胶束是由两亲性嵌段聚合物peg
2k
‑
p(cl
1k
‑
dtc
1k
)和偶联靶向分子的聚合物ta
‑
peg
‑
p(cl
‑
dtc)（ta为多肽crgd、atn1或atn2）在水相中自组装而成。在peg
‑
p(cl
‑
dtc) 中分别混合重量百分含量为2.5%、5%、7.5%、10%或20%的atn1
‑
peg
‑
p(cl
‑
dtc)、atn2
‑
peg
‑
p(cl
‑
dtc)或crgd
‑
peg
‑
p(cl
‑
dtc) 作为起始的聚合物溶液，然后和ptx溶液混合，其余步骤同实施例一，得到不同多肽表面密度的胶束atn1
‑
ms
‑
ptx、atn2
‑
ms
‑
ptx和crgd
‑
ms
‑
ptx，为靶向小胶束纳米药物。
33.peg
‑
(cl
‑
dtc)和不同比例的偶联crgd、phscnk或phscnk的靶向聚合物混合后，制备靶向胶束，采用实施例一相同方法、保持ptx载药量为4.8 wt.%，分别制备了三个系列具有不同靶向分子密度的胶束crgd
‑
ms
‑
ptx、atn1
‑
ms
‑
ptx和atn2
‑
ms
‑
ptx。dls测试结果表明，在表面多肽不超过5%时，随着多肽的增加，胶束粒径基本不变，在31到35 nm之间，pdi保持
在0.2左右（表3）。此外，以ptx载药量为4.8 wt.%、多肽密度为5%的 atn2
‑
ms
‑
ptx为例，研究了其中peg350及dtc对胶束稳定性、fbs稳定性，以及冷冻/冻干复溶对粒径的影响，发现结果与非靶向ms
‑
ptx相同。研究了ptx胶束在模拟细胞中还原响应环境的药物释放行为，分别用含或不含10 mm dtt的pb溶液（含0.1%吐温80）作为释放介质，以atn2
‑
ms
‑
ptx为例研究了在不同时间点释放到介质中的ptx的累积量。发现浓度为0.5 mg/ml的胶束在10 mm dtt中能够快速释放ptx，24 h的释放ptx累积量达79.4%；而在不含dtt环境中ptx 24 h仅泄漏17.0%（图2c），结果表明胶束结构因为dtc交联而保持相对稳定、药物始终释放缓慢；而在还原条件下，双硫键断裂生成的巯基有一定的亲水性，胶束在较稀浓度下很难维持胶束结构，药物快速释放，呈现出明显的还原响应性药物控释行为。
34.采用同样的步骤，由两亲性嵌段聚合物peg
2k
‑
p(cl
1k
‑
dtc
1k
)和偶联靶向分子的聚合物ta
‑
peg
2k
‑
p(cl
1k
‑
dtc
1k
)（重量百分含量为5%）在水相中自组装而成装载ptx的靶向胶束；ta为多肽crgd、atn1或atn2对应的粒径分别为27 nm、29 nm 和28nm。
35.本发明制备了ptx载药量高的胶束，且制备的小粒径胶束（20～40 nm），能够有效穿透至肿瘤深处，尤其是本发明载药过程中无药物析出，静置三周也无药物泄露，采用的小分子量pge无需去除。
36.实施例三 mtt实验评估ptx胶束的细胞毒性具体测试方法为现有方法，可以参见申请人同日提交的发明名称为“一种小胶束纳米药物及其制备方法与应用”的发明申请，本发明与其一致。细胞选用小鼠高转移性三阴乳腺癌细胞株4t1，ptx浓度范围为0.002至5 μg/ml。本发明以鼠源三阴乳腺癌4tl细胞为研究对象，用mtt法研究了不同靶向分子密度的三种胶束的细胞毒性。结果表明，ms
‑
ptx对4t1的毒性具有浓度依赖性，ic
50
为0.6 μg/ml，明显低于ptx（ic
50
为1.12 μg/ml），偶联靶向分子的胶束均表现了比ms
‑
ptx更高的毒性（图3）。三种胶束对4t1的毒性不尽相同，整体来看，
atn2
‑
ms
‑
ptx比crgd
‑
ms
‑
ptx毒性略高，远高于atn1
‑
ms
‑
ptx；5%crgd
‑
ms
‑
ptx、20%atn1
‑
ms
‑
ptx、5%atn2
‑
ms
‑
ptx在各组中相对其他多肽密度胶束具有最低的ic
50
值，分别为0.27、0.46、0.21 μg/ml（表4），其中5%atn2
‑
ms
‑
ptx的ic
50
值最低，甚至低于自由ptx与4t1细胞共孵育48 h的ic
50
值（0.55 μg/ml）。
37.进一步考察了5%atn2
‑
ms
‑
ptx与4t1细胞共孵育24 h和48 h的细胞毒性（ic
50
值分别为0.54 和0.020 μg/ml），发现该ic
50
值均比无靶胶束（分别为1.19和0.064μg/ml）的低2
‑
3倍。此外，空胶束ms和atn2
‑
ms在浓度1 mg/ml时共孵育48 h对4t1细胞均没有显示出毒性，这说明该方法制备的纳米载体具有良好的生物相容性。
38.实施例四 ptx胶束的细胞内吞行为研究用流式细胞术facs和clsm来考察4t1细胞对ptx胶束的摄取，通过nhs
‑
peg
‑
p(cl
‑
dtc)与cy5
‑
nh2的酰胺化反应得到cy5标记的peg
‑
p(cl
‑
dtc)，并将其按照1% 掺杂到原聚合物中得到cy5标记的胶束。具体测试方法为现有方法，可以参见申请人同日提交的发明名称为“一种小胶束纳米药物及其制备方法与应用”的发明申请，本发明与其一致。用水合法制备即得到cy5标记的胶束，不同靶向密度均选用表4中的最佳靶向密度。m
n
= 5.0
‑
(15
‑
2)
‑
0.2 kg/mol）facs测试结果显示（图4 a），和cy5/crgd
‑
ms
‑
ptx、cy5/atn2
‑
ms
‑
ptx孵育4 h后的4t1细胞的荧光强度是对照无靶cy5/ms
‑
ptx组细胞的2.1倍和2倍，而cy5/atn1
‑
ms
‑
ptx与无靶组相比只有1.2倍。通过clsm观察到，4t1细胞经含cy5胶束孵育4 h后，各靶向胶束的荧光强度均高于无靶组，其中cy5/atn2
‑
ms
‑
ptx组最高，与pbs 和cy5/crgd
‑
ms
‑
ptx组都存在显著性差异（图4 b，*p），且cy5/atn2
‑
ms
‑
ptx组cy5荧光出现在每个细胞的细胞质中。而cy5/crgd
‑
ms
‑
ptx和cy5/atn1
‑
ms
‑
ptx组中均有部分细胞的细胞质中没有cy5荧光（图4 c）。
39.实施例五 载sting激动剂的聚合物囊泡cps
‑
cdn的表征由于sting蛋白一般驻留在apc中，所以要激活sting通路，其激动剂如环二核苷酸（cdns）必须递送到apc内。但cdn分子量小、带负电荷、亲水性强，进入胞质能力差，易降解，导致其生物利用率不高，效果大打折扣。为了将cdn有效递送至apc胞质中激活sting通路，本发明设计基于dtc的还原敏感、双硫交联的聚合物囊泡来实现这一目标，利用聚合物peg
‑
p(tmc
‑
dtc)
‑
sp形成的具有不对称膜结构的聚合物囊泡（cps）来递送cdn。为了验证该cps是否能稳定装载分子量小的cdn并递送到apc中，选用目前临床ii期试验中的adu
‑
s100为模型cdn展开研究。采取溶剂置换法制备装载cdn的囊泡cps
‑
cdn（图5 a），cdn的装载效率用nanodrop 2000测定。实验结果表明，在cdn理论载药量为16.7 wt.%时，其包封率和载药量
分别能达86.4%和14.4 wt.%（表5）。考虑到cdn的小分子量和强亲水性，这样高的载药量还是令人意想不到的，cps
‑
cdn的粒径为55.3
‑
56.8 nm，pdi为0.12
‑
0.18，具有良好的胶体稳定性，在4度冰箱中能储存3周且在含有10%胎牛血清（fbs）中能保持粒径不变（图5b）。
[0040] 以5%atn2
‑
ms
‑
ptx、cps
‑
cdn（cdn理论载药量为13.0 wt.%）组成化疗免疫联合药物，进行细胞、动物实验。
[0041]
实施例六ptx胶束、cps
‑
cdn及其联合激活bmdc的研究bmdc（1
×
106个/孔）在12孔板中培养24 h后加入pbs、ptx、ms
‑
ptx、atn2
‑
ms
‑
ptx、cdns和cps
‑
cdn孵育24 h，联合组是先加atn2
‑
ms
‑
ptx孵育8 h后再加cps
‑
cdn共孵育16 h，最终ptx浓度为5
ꢀµ
g/ml，cdn浓度为0.2
ꢀµ
g/ml（n = 3）。孵育结束后离心（1500 rpm，5 min），分离出上层培养基，收集细胞后用荧光标记的cd11c、cd80和cd86抗体按说明书来染细胞，最后用facs测试各组中总cd11c
+ bmdc的量和cd11c
+
cd80
+
cd86
+
成熟bmdc的含量。分离的培养基用elisa试剂盒测定ifn
‑
β、tnf
‑
α和il
‑
6浓度。
[0042]
sting激动剂cdn进入dc等apc中与内质网上的sting蛋白结合，诱导i型干扰素（ifn
‑
β）等细胞因子的产生，从而激活相关免疫细胞的成熟递呈抗原给t细胞，招募更多的免疫细胞进入肿瘤区域；但是不可预知cps
‑
cdn中cdn由于装在囊泡里面是否还能实现这样的功能，本发明检测了cps
‑
cdn及自由cdn和bmdc孵育16 h后cd11c
+
的dc细胞以及cd11c
+ cd86
+
cd80
+
的成熟bmdc的比例。此外，结合atn2
‑
ms
‑
ptx可诱导icd，产生一系列肿瘤抗原，并能使bmdc增殖与成熟。因此，用atn2
‑
ms
‑
ptx处理使bmdc增殖，之后再联用cps
‑
cdn也能增加cdn进入dc的量，会增强sting通路的激活，从而增加bmdc的成熟量；另一方面，atn2
‑
ms
‑
ptx诱导的taa能更有效地被这些激活的apc呈递给t细胞，从而招募更多的t细胞。检测了两者与bmdc孵育后其表达cd11c
+
的bmdc的量以及成熟bmdc比例的变化，来研究联合是否对bmdc的增殖、成熟有更强劲的提升。facs测试结果表明，相比于pbs组，cdn制剂和联合组都能在促进总cd11c
+
的bmdc含量，而cps
‑
cdn组中成熟 bmdc（81.7%）远高于自由cdn组（66.9%）（***p）（图6 a&b），表明cps的装载不但没有影响cdn的细胞内释放和功能，反而具有更高的刺激bmdc成熟的能力。此外，联用atn2
‑
ms
‑
ptx能进一步增加bmdc成熟，cd11c
+
cd80
+
cd86
+
的bmdc高达90.2%，比单用任何一种要显著高（*p/***p）。此外，也测定了bmdc培养基中ifn
‑
β、tnf
‑
和il
‑
6的浓度。细胞因子的增多表明bmdc成熟，抗原呈递能力增强，可极强地激活t细胞，其中ifn
‑
β是cdn与sting结合后产生的标志性细胞因子，对肿瘤引发t细胞启动具有关键作用。结果显示，三个cdn制剂组诱导的ifn
‑
β是pbs和atn2
‑
ms
‑
ptx组的两个数量级以
上，体现了cdn的强烈激活sting通路的功能。先用atn2
‑
ms
‑
ptx再用cps
‑
cdn的联合组处理细胞，分泌的ifn
‑
β、tnf
‑
和il
‑
6的浓度显著高于cps
‑
cdn组和atn2
‑
ms
‑
ptx组（*p/***p）和自由cdn组（**p/***p）（图6 c、d&e）。这些结果表明，cps
‑
cdn提升了cdn对dc激活的功能，和atn2
‑
ms
‑
ptx联用能更显著促进bmdc的增殖和激活、激活sting通路、诱导ifn
‑
β等细胞因子，更有效促进bmdc成熟并递呈抗原给t细胞。
[0043]
实施例七 ptx胶束联合cps
‑
cdn用于小鼠tnbc的化学免疫治疗采用荷4t1皮下瘤的balb/c小鼠作为小鼠三阴乳腺癌模型，初步考察ms
‑
ptx的药效、给药方式以及和cps
‑
cdn联用对肿瘤抑制的影响，在15只荷瘤小鼠的肿瘤体积为200
‑
250 mm3时开始给药，给药当天为第0天。共分5组，每组3只小鼠，每2天给药、共3次。组1：ms
‑
ptx尾静脉（i.v. 10 mg ptx/kg，200
ꢀµ
l）；组2：ms
‑
ptx瘤内注射（i.t. 5 mg ptx/kg，50
ꢀµ
l）；组3：ms
‑
ptx尾静脉（i.v. 10 mg ptx/kg，200
ꢀµ
l）给药2h后瘤内注射cps
‑
cdn（1 mg cdn/kg）；组4：ms
‑
ptx瘤内注射（i.t. 5 mg ptx/kg，50
ꢀµ
l）给药2h后瘤内注射cps
‑
cdn（1 mg cdn/kg）；组5：pbs。每2天监测肿瘤体积和小鼠体重，肿瘤体积通过公式v = 0.5
×
l
×
w2来计算（l、w分别为肿瘤最宽和最窄处的长度）。小鼠相对体重是测量时体重占第0天时体重的百分比（m/m0）。发现无论是静脉或瘤内注射ms
‑
ptx，肿瘤体积持续增加，和pbs组生长曲线相似，这和起始肿瘤体积过大、该肿瘤的恶性程度和侵袭性很高有关。而联合cps
‑
cdn给药时，两种方式均比单给ms
‑
ptx有显著的肿瘤抑制作用，其中ms
‑
ptx i.v. + cps
‑
cdn i.t. 组肿瘤抑制最显著（**p/***p），前10天肿瘤体积没有增长，10天后开始缓慢增长（图7 a）。相比之下，ms
‑
ptx i.t. + cps
‑
cdn i.t. 组肿瘤一直有缓慢的增长。这和ms
‑
ptx瘤内注射ptx浓度过高，杀死肿瘤细胞的同时也杀死免疫细胞有关，导致再给cps
‑
cdn也不能被很多apc内吞，整体sting激活程度差，产生的免疫应答较弱。而ms
‑
ptx尾静脉注射后，短时间富集至肿瘤的ms
‑
ptx相比要少、ptx浓度低，对免疫细胞无毒，却可诱导肿瘤细胞icd、使dc增殖；在给cps
‑
cdn后就能在大量dc中激起强免疫应答。但是，ms
‑
ptx i.v. + cps
‑
cdn i.t. 组小鼠体重在给药期间有下降，而后又恢复（图7 b）。
[0044]
系统研究ptx胶束以及其联合cps
‑
cdn的化学免疫治疗。在接种4t1（3
×
105/只）的荷瘤小鼠的肿瘤体积在50
‑
100 mm3（接种后第6天）开始给药，给药当天为第0天。小鼠随机分9组，每组7只，每两天给药，共4次；给药剂量为7.5 mg ptx/kg和/或1 mg cdn/kg。九组分别为：pbs、自由ptx（i.v.）、ms
‑
ptx（i.v.）、atn2
‑
ms
‑
ptx（i.v.）、自由cdn（i.v.）、cps
‑
cdn（i.t.）、三个atn2
‑
ms
‑
ptx（i.v.）+ cps
‑
cdn（i.t.）联合组，分别是atn2
‑
ms
‑
ptx（i.v.）给药2 h、8 h或24 h后再给cps
‑
cdn（i.t.）。实验过程中每2天监测小鼠体重、肿瘤体积和小鼠状态。小鼠死亡或肿瘤体积大于2000 mm3判定死亡，绘制生存曲线。给荷瘤（肿瘤体积约50 mm3）小鼠每2天尾静脉注射肿瘤靶向的atn2
‑
ms
‑
ptx，并把药量降低到7.5 mg/kg，共给药4次；在每次atn2
‑
ms
‑
ptx给药之后再瘤内注射cps
‑
cdn（1 mg/kg），研究该方案对小鼠肿瘤尺寸、体重和生存期的影响，当肿瘤体积大于2000 mm3时，判定小鼠死亡（#号表示）。系统比较该方案与单给atn2
‑
ms
‑
ptx、ms
‑
ptx、自由cdn或cps
‑
cdn的抗肿瘤效果。此外，还研究了atn2
‑
ms
‑
ptx和cps
‑
cdn之间的给药间隔时间（2、8或24 h）对抗肿瘤效果的影响（图8 a）。
[0045]
结果显示，4t1肿瘤的恶性程度极高，pbs组肿瘤快速增长（图8 b），到第20天肿瘤体积均大于2000 mm3，中位生存期为18天。自由ptx组在给药期间肿瘤缓慢生长，停药后开始快速生长。而atn2
‑
ms
‑
ptx、ms
‑
ptx、自由cdn、cps
‑
cdn与联合给药各组均能显著抑制肿瘤
的生长，10天内肿瘤基本不长，但10
‑
12天开始肿瘤都开始缓慢生长，其中联合组的肿瘤生长最慢。比较第22天肿瘤体积可知，ms
‑
ptx可能由于小粒径而使其epr效应显著，比ptx能更有效抑制肿瘤生长（*p）。而atn2
‑
ms
‑
ptx则能比ptx和ms
‑
ptx更进一步限制肿瘤生长（***p）（图8 b），延长小鼠的生存时间，体现了靶向抗肿瘤疗效。此外，瘤内给cdn或cps
‑
cdn也能减缓肿瘤生长速度，cdn减缓程度与ms
‑
ptx相似，cps
‑
cdn和atn2
‑
ms
‑
ptx类似，但cps
‑
cdn与自由cdn相比优势更显著（**p），再次表明囊泡能更高效地递送cdn，提高其生物利用率和激活sting通道的能力（图8 b）。
[0046]
令人兴奋的是，atn2
‑
ms
‑
ptx和cps
‑
cdn联用的抑瘤效果比单药组都更强，且二者间隔8或24 h比间隔2 h的疗效更佳（atn2
‑
ms
‑
ptx+cps
‑
cdn（2或8或24 h）vs atn2
‑
ms
‑
ptx，p = 0.1656（ns）或p = 0.0042（**）或0.0068（**）；atn2
‑
ms
‑
ptx+cps
‑
cdn（2或8或24 h）vs cps
‑
cdn，p = 0.2872（ns）或p = 0.0099（**）或0.0158（*））。联合组间隔2、8、24h组的小鼠中位生存期分别30、32、33天（pbs组为18天）（图8 c）。联合给药间隔2 h效果差些，可能是由于间隔太短，ptx释放量不多和/或诱导icd及促使dc增殖的程度还不足，导致apc的抗原递呈作用弱。研究发现，在“癌症
‑
免疫周期”的循环中，不仅需要taa的释放，同时需要apc的加工和递呈，激活t细胞，募集更多t细胞至肿瘤，从而识别杀伤肿瘤，每一环节都很重要。循环过程某一项被抑制或不足，都将使抗肿瘤免疫无法达到最佳状态。此外，小鼠在治疗期间体重变化很小，尾静脉给7.5 mg ptx/kg和/或瘤内给1 mg/kg的cps
‑
cdn都没有对小鼠产生毒副作用（图8 d）。
[0047]
实施例八 atn2
‑
ms
‑
ptx及其与cps
‑
cdn联合对荷瘤小鼠免疫系统的调节同实施例七描述，荷瘤小鼠随机分7组，每组7只。七组分别为：pbs（i.v.）、自由ptx（i.v.）、ms
‑
ptx（i.v.）、atn
‑
ms
‑
ptx（i.v.）、自由cdn（i.v.）、cps
‑
cdn（i.t.）、atn
‑
ms
‑
ptx（i.v.）+ cps
‑
cdn（i.t.）（间隔8 h），按照7.5 mg ptx/kg和/或1 mg cdn/kg给药4次，每2天一次。最后一次给药后24 h每组处死4只小鼠，取小鼠全血分离血清测定ifn
‑
β、ifn
‑
、il
‑
6和tnf
‑
的含量。取脾脏和肿瘤，研磨成单细胞悬液，裂红后计数。对脾脏，每个样品6
×
106个细胞进行t细胞染色。对肿瘤，每个样品分为4份，每份6
×
106个细胞，进行dc、巨噬细胞、t细胞染色，通过facs测试分析。免疫细胞相应的荧光标记的抗体为：dc：anti
‑
cd11c
‑
fitc、anti
‑
cd80
‑
apc、anti
‑
cd86
‑
pe；巨噬细胞：anti
‑
cd11b
‑
fitc、anti
‑ꢀ
f4/80
‑
pe、anti
‑
cd206
‑ꢀ
alexa fluor 647；t细胞：anti
‑
cd3
‑
apc、anti
‑
cd4
‑
pe、anti
‑
cd8
‑
fitc；tregs：anti
‑
cd3
‑
fitc、anti
‑
cd4
‑
pe、anti
‑
foxp3
‑ꢀ
alexa fluor 647。
[0048]
肿瘤免疫微环境（tme）是由恶性细胞、免疫细胞、血管、细胞外基质和信号分子组成的环境，可单独发挥作用，也可共同影响免疫疗法的敏感性。上文已证明，atn2
‑
ms
‑
ptx、cps
‑
cdn联合药物可进入肿瘤细胞诱导icd、释放肿瘤相关抗原，产生有利的免疫微环境，进入apc激活sting通道使dc成熟，两者联合在细胞层面已经展现出了优异的免疫效果。这里将分析atn2
‑
ms
‑
ptx、cps
‑
cdn及其联合按图8方案给药24 h后小鼠tme以及脾脏中t细胞的影响。首先分析了tme中cd80
+
cd86
+ 成熟dc和cd206
‑
的m1m的含量，图9 a显示，ptx胶束成熟dc比例都要比pbs高，cdn胶束更高些，cps
‑
cdn组成熟dc 为52.5%高于自由cdn（48.7%）；而联合组成熟dc（62.9%），显著高于分别单药组（*p）。前面细胞实验中，ptx可使巨噬细胞从m2m转化为m1m。在tme中，atn2
‑
ms
‑
ptx、cps
‑
cdn及联合给药均能促进了m2m极化为m1m（图9 b）。
[0049]
t细胞是人体攻击和杀灭肿瘤的免疫细胞，参与抗肿瘤免疫的t细胞亚群分为两类：cd8
+
细胞毒性t细胞（ctl）和cd4
+
辅助性t细胞（t
h
细胞），而t
h
又可产生淋巴因子增强ctl功能，激活巨噬细胞、dc或其他apc，产生肿瘤坏死因子发挥溶瘤作用。见图9 c
‑
e，结果显示，atn2
‑
ms
‑
ptx+cps
‑
cdn联合组的cd4
+ t和cd8
+ t细胞比atn2
‑
ms
‑
ptx和cps
‑
cdn都显著提升（cd4
+ t：***p和**p；cd8
+ t：*p）。另外，t
h
中的调节性t细胞（t
reg
）是减弱t细胞活性、使tme免疫抑制的t细胞的主要类型。分析了t
regs
在cd4
+ t中的占比及cd8
+ t/t
reg
，结果表明（图9 f&g），cps
‑
cdn能急剧降低t
reg
比例，与联合组相当。此外，cps
‑
cdn组的cd8
+ t/t
reg
显著高于自由组cdn（***p）。文献报道，sting激活程度越大，cd8
+ t细胞介导的抗肿瘤免疫力越强，也正因为cps
‑
cdn高效的cdn利用率，使其单独使用也能有效激活抗肿瘤免疫。联合组能强效激发t细胞的杀伤能力，其cd8
+ t/t
reg
进一步增强，是atn2
‑
ms
‑
ptx的14倍（***p）、cps
‑
cdn的3.4倍（*p）。elisa测试结果表明，atn2
‑
ms
‑
ptx和cps
‑
cdn联用组的促炎细胞因子ifn
‑
、ifn
‑
γ、tnf
‑
α和il
‑
6含量均增加（图9 h），这些结果充分证实了其能诱导强烈的抗肿瘤免疫反应。
[0050]
脾脏是人体最重要的免疫器官，含有丰富的免疫细胞，拥有全身25%的淋巴细胞。脾脏对t淋巴细胞的免疫调节作用是抗肿瘤免疫的一个重要环节。接着，分析了atn2
‑
ms
‑
ptx及其与cps
‑
cdn联合给药后小鼠脾脏中cd4
+
和cd8
+ t细胞占cd45
+
总免疫细胞的比例。图10显示，各组药物给药后第8天小鼠脾中的cd4
+ t和cd8
+ t细胞的变化趋势和肿瘤中的一致，联合组占二者比分别高达18.7%和6.3%，分别是单制剂atn2
‑
ms
‑
ptx和cps
‑
cdn组的1.3/1.4倍（cd4+：**p/*p）和2.1/1.5倍（cd8+ ***p/*p）。因此，联合组有效促进了脾脏t淋巴细胞的免疫调节作用，增加了cd4
+ t和cd8
+ t细胞的比例，有效增强抗肿瘤免疫应答。
[0051]
实施例九 atn2
‑
ms
‑
ptx与cps
‑
cdn联合对荷瘤小鼠的毒性研究 随着4t1乳腺癌病情的发展，小鼠的血液系统以及器官会受到一定影响；而长期用药也会给小鼠带来全身累计毒性。为了研究本发明设计使用的ptx胶束和cdn囊泡制剂及其联合对荷瘤小鼠的全身累计影响或毒副作用的改善，按图8方案给药第22天，每组牺牲3只小鼠，取全血进行血常规检测、分离血清进行血生化检测，并解剖取主要脏器观察并切片，用h&e染色进行组织学分析。
[0052]
血常规结果显示（图11 a），荷瘤小鼠血液（pbs组）中白细胞（wbc）数大量增多，是正常balb/c小鼠的91倍（**p），与文献报道一致。其中的中性粒细胞数（neut）（*p）和淋巴细胞数（lymph）（**p）升高最显著，这是由于肿瘤的生长和转移，以及出现了一些炎症导致的。红细胞数（rbc）、血红蛋白浓度（hgb）、红细胞压积（hct）较正常小鼠有所下降，这主要是由于荷瘤小鼠出现贫血。此外，pbs组小鼠血液中的血小板数（plt）、血小板压积（pct）和平均血小板浓度（mpv）均有增加，这将增加血栓发生的概率。有研究表明，血小板有助于肿瘤细胞的存活和转移，因此血小板的增加也促使了4t1乳腺癌发生转移。和pbs组小鼠相比，自由ptx或自由cdn组治疗小鼠的血常规指标基本无缓解，atn2
‑
ms
‑
ptx或cps
‑
cdn单制剂治疗的小鼠血常规指标均有所缓解；而atn2
‑
ms
‑
ptx与cps
‑
cdn联合给药的小鼠血液中的wbc总量以及wbc中的neut和lymph、rbc、hgb、hct、plt、pct和mpv均接近健康小鼠，进一步说明联合治疗对肿瘤的抑制效果明显、减少了肿瘤转移、避免小鼠发生贫血以及形成血栓。血生化检测表明，主要肝（碱性磷酸酶alp、谷氨酰基转移酶ggt、天门冬氨酸氨基转移酶ast、丙氨酸氨基转移酶alt）、肾（肌酐cre、尿素ure）功能的各项指标与正常balb/c小鼠的无显著性差
异（图11 b）。
[0053]
荷瘤小鼠主要脏器的h&e染色切片（图12）显示，各组小鼠心、肝、肾没有出现明显的组织损伤。但pbs组、cdn和cps
‑
cdn组小鼠心脏有少许炎症，而ptx制剂各组和联合组小鼠心脏正常；除atn2
‑
ms
‑
ptx与cps
‑
cdn联合组，其他组小鼠肝脏均有轻微炎症发生。此外，pbs组小鼠脾脏显著增大、质量增加（图13），yong等人也发现荷4t1乳腺癌balb/c小鼠有脾肿大现象。治疗组小鼠脾脏的质量和肿瘤大小呈现正相关，即肿瘤越小，脾越小。其中联合组脾最小（约0.15 g，和健康小鼠接近），和atn2
‑
ms
‑
ptx和cps
‑
cdn单制剂组相比具有显著性差异（***p和*p）。从脾的h&e染色（图12）可以看到，pbs组白髓明显减少，红髓变多，这是4t1小鼠病程发展的标志之一。治疗组尤其是联合组具有丰富的白髓，说明阻止了乳腺癌病程的发展。以上结果说明，尾静脉给7.5 mg ptx/kg及瘤内注射1 mg cdn/kg及其联合给药，每2天给药、共4次的方式对小鼠没有明显毒性。
[0054]
实施例十 atn2
‑
ms
‑
ptx与cps
‑
cdn联合抑制4t1乳腺癌的肺转移在给药第22天，给小鼠腹腔注射荧光素钾盐，10分钟内处死每组剩余的3只小鼠，取全血进行血常规分析、分离出血清进行血生化分析。此外，解剖小鼠，取和心、肝、脾、肺、肾等器官，用组织固定液固定、切片、石蜡封切。切片用苏木精和伊红（h&e）染色，显微镜观察切片进行组织学分析和肺转移判断。由于tnbc具有高浸润性及高转移性，本发明也研究了ptx胶束和cdn囊泡及atn2
‑
ms
‑
ptx与cps
‑
cdn联合对荷4t1
‑
luc乳腺癌肺转移的抑制。同图8方案给药后22天，解剖取肺部、称重以及离体成像、切片h&e染色做组织学分析。肺部成像及荧光定量结果显示（图14 a&b），pbs和自由ptx组小鼠发生了严重的肺转移，自由cdn和ms
‑
ptx组肺部荧光有显著下降（***p），而atn2
‑
ms
‑
ptx、cps
‑
cdn及联合联合能更有效抑制肺转移，分别为pbs组的22.8、19.3和107.7倍（***p）。其中atn2
‑
ms
‑
ptx较ms
‑
ptx也具有明显的肺转移抑制（*p），说明了atn2能精准靶向到4t1上。atn2
‑
ms
‑
ptx和cps
‑
cdn联合组小鼠肺部几乎检测不到荧光信号（ 8.9
×
10
5 p/s）；该组肺的质量最小，约0.10 g，和健康小鼠接近；而其他组肺转移瘤越多，质量也大（图14 c），证明了atn2
‑
ms
‑
ptx和cps
‑
cdn联合治疗能最有效抑制4t1的肺转移。此外，肺部h&e染色图片显示，pbs组和自由ptx小鼠肺部存在大量肿瘤细胞和炎症细胞的浸润，几乎没有肺泡结构；ms
‑
ptx组有所改善，atn2
‑
ms
‑
ptx相比没有明显的肿瘤细胞群，但也存在肿瘤细胞和炎症细胞的浸润，肺泡结构也不明显。cps
‑
cdn组比自由cdn组能看到大片的肺泡结构，肿瘤浸润少，但也存在炎症。形成鲜明对比的是，atn2
‑
ms
‑
ptx和cps
‑
cdn联合组肺部切片看不到肿瘤细胞和炎症细胞，生理结构和正常小鼠无异，肺泡多且都有明显的中空结构（图14 d），结果和生物发光图吻合。结果证明本发明化疗与免疫药物相结合不仅能有效抑制原发性tnbc肿瘤，也能显著抑制其肺转移，尤其是，联合组显著延长了小鼠的中位生存期（33天）。