一种靶向递药仿生纳米马达及其制备方法和应用与流程

1.本发明属于纳米马达领域，涉及药物载体技术，具体涉及具有自驱动特性和仿生属性的纳米马达，特别涉及一种具有主动捕获ctc和实现在肿瘤深部递送药物的仿生纳米马达及其制备方法和应用。


背景技术：

2.目前，在肿瘤的治疗领域，由于常规药物载体通常依赖体内特定环境实现在目标位置的被动截留，导致相应制剂仅有极少部分(通常为1～2％)达到肿瘤部位，这使得具有运动能力的微纳米马达日益受到研究者的重视。人们期望通过依靠其运动能力进一步的将相应制剂投递至肿瘤部位，从而发挥更好的肿瘤治疗效果。
3.在纳米马达研究方面，可依据驱动方式不同，将纳米马达分为物理场驱动、化学驱动和机械驱动三种类型。物理场驱动方式主要依赖外部的磁场、光场、声场、电场或者热场提供驱动力，例如中国cn106756813a提供了一种外界光、磁和电场的驱动从而控制纳米马达的运动的纳米马达。一般而言，该种纳米马达在体内工作时需依赖外部引导，并不具备体内自驱动能力。机械驱动方式基于相应材料具有力学梯度(如弹性梯度或弯曲梯度)性能，在纳米马达处于相应环境之后，依赖诸如范德华势能梯度等进行运动。不过这类纳米马达目前存在生物相容性等问题，鲜有应用在医药领域。
4.目前，在用于载药的纳米马达的研究中，主要采用化学驱动方式，其优点在于可以结合体内的化学环境实现自驱动运动，而无需外部提供动力源。如已授权的中国专利cn102556935b公布了一种人造中空微纳米马达及其制备方法，其提供的中空微纳米马达通过其内部的催化粒子分解过氧化氢产生氧气，利用氧气气泡作为马达的推动力，进而实现游动。然而，由于过氧化氢在人体内的含量较低、且对人体具有一定的毒副作用，且过量的h2o2会导致捕获的循环肿瘤细胞(ctc)活性降低，而循环肿瘤细胞(ctc)是判断癌症是否发生转移、评定癌症发展进程的理想标志物，这使得该专利技术不利于实际抗癌治疗工作。
5.另外，除了上述缺点之外，在利用h2o2作为动力源的纳米马达的现有技术中，通常还存在载药困难和易于被体内免疫系统清除的缺点。造成载药困难的原因，一方面是因为一些纳米马达需要外挂药物载体从而产生较高的载体脱落几率，另一方面是因为现有的纳米马达的载药率过低。针对纳米马达载药率问题，已授权的中国专利cn108992419b提供了一种介孔-大孔纳米马达，该纳米马达包括介孔二氧化硅内核和覆盖在介孔二氧化硅内核表面的大孔层和金属铂层。但是由于同样还是采用h2o2作为动力源，该专利仍未完全解决化学驱动纳米马达的缺点。
6.在对药物载体进行仿生修饰方面，采用细胞膜包覆药物载体是一个可选的方法，如红细胞膜上的上的免疫蛋白cd47，可使得巨噬细胞不会将被其包覆纳米马达识别为异物并进行清除。基于这一思路，中国专利cn110251479a提供了一种红细胞膜包裹仿生型血液六价铬还原去除剂/磁性纳米马达，该纳米马达从而提高血液去除剂对血液中六价铬的去除效率。另外，中国专利cn108042802a同样基于该思路，提供了一种人造红细胞马达，该马
达利用声场驱动方式克服了以h2o2作为动力源的缺点，同时也赋予了马达的仿生性质。
7.然而，在采用化学驱动方式的自驱动纳米马达的研究方面，目前至少还存在如下两方面的问题：(1)用于替换h2o2的动力源种类不够、研究不足，使得制备相应具有持续稳定自驱动运动功能的纳米马达不易获得；(2)在上述基础上，具有高效主动捕获ctc能力的纳米马达不易获得。
8.本专利发明人在前期的研究过程中发现，当将动力源(脲酶)固定在红细胞膜上并包覆相应载体时，所得纳米马达的自驱动运动功能非常难以保持。这提示在利用细胞膜制备仿生自驱动纳米马达方面，还存在着许多值得探索的内容，在赋予纳米马达以仿生能力时，还存在着许多不确定的因素，其中关键的因素之一在于维持纳米马达的运动稳定性。
9.综上所述，本领域亟需一种可以克服以h2o2作为动力源的缺点，并具有仿生功能和稳定自驱动运动功能的纳米马达。


技术实现要素：

10.针对现有技术的不足，本技术的目的之一在于提供一种靶向递药仿生纳米马达，该纳米马达具有仿生功能和稳定自驱动运动功能且可以实现高效ctc主动捕获。
11.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
12.一种靶向递药仿生纳米马达的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
13.(1)制备具有载药功能的纳米颗粒；
14.(2)将杂合细胞膜包覆在步骤(1)所得纳米颗粒上；所述杂合细胞膜至少包括癌细胞膜和白细胞膜，所述癌细胞膜和白细胞膜的膜蛋白重量比为2:1；
15.(3)将脲酶固定在步骤(2)所得物的一侧，即得。
16.本发明在研究的过程中发现，利用脲酶作为动力源时，对用于仿生的细胞膜的选择十分重要，其影响主要体现在自驱动运动功能稳定性、所得纳米马达在肿瘤的渗透性和ctc的主动捕获能力上。如本专利的若干对比实施例所示，当采用其它细胞膜组合制备杂合细胞膜时，脲酶容易从所得纳米马达上脱落，导致自驱动运动功能下降；同时，也不具有令人满意的ctc主动捕获能力。
17.在制备自驱动纳米马达研究领域，关于对纳米马达进行仿生修饰的研究目前刚刚起步。理论上而言，采用细胞膜对纳米马达进行修饰后，可使得纳米马达不易被体内免疫系统识别清除或可使得纳米马达在肿瘤环境下更具靶向性，但当纳米马达进行运动并渗透时，细胞膜的包覆稳定性将成为影响最终技术效果的关键性因素。同时，在关于自驱动方案设计方面，因受到生物相容性要求的限制，作为体内递药载体的自驱动马达的动力源种类十分有限。本领域通常是以h2o2溶液产生的气泡作为动力，然而过量的h2o2将会导致捕获的ctc活性降低，不利于后续研究。
18.本专利采用脲酶作为动力源，并单侧固定在杂合细胞膜上，使得所得纳米马达可在体内尿素作用下产生自驱力，从而具有自驱动运动特征。因此，理论上而言，动力源的稳定性是所得纳米马达是否能发挥预期效果的关键。具体到本专利中，基于本专利上述实验现象，发明人猜测，脲酶与杂合细胞膜之间的固定稳定性可能是技术效果的主要影响因素之一，而这种固定稳定性可能受杂合细胞膜组成的影响，具体体现在杂合细胞膜中具体细胞膜的选择及其相应配比。
19.另外，本发明在研究的过程中还发现，在固定脲酶的基础上，杂合细胞膜的选择对于ctc的主动捕获能力同样具有影响。如本发明的若干对比实施例所示，当选择其它细胞膜组合制备杂合细胞膜时，ctc主动捕获效果将出现明显的降低。
20.由此可见，本发明对于本领域的贡献之一在于：提供了一种采用脲酶作为动力源时，可以具有稳定运动特征和高效主动捕获ctc能力的纳米马达，由此可充分发挥所得纳米马达在靶向递药和肿瘤治疗方面的作用。
21.作为本发明的一个可选实施方案，步骤(1)中，所述纳米颗粒包括fe3o4磁性纳米颗粒。
22.作为本发明的一个优选技术方案，步骤(2)中，所述杂合细胞膜还包括红细胞膜，所述癌细胞膜、白细胞膜和红细胞膜的膜蛋白重量比为4:2:1。
23.在确定选择癌细胞膜与白细胞膜作为杂合细胞膜的原料，并确定两者之间的加入配比的基础上，本专利发现通过适当的添加红细胞膜还可以进一步的提高纳米马达的稳定性以及对于ctc的主动捕获能力。然而，如同本发明的一个对比实施例所示，红细胞膜的添加量只能是癌细胞膜的四分之一，否则反而会大幅降低稳定性和ctc的主动捕获能力。
24.作为本发明的一个可选实施方案，所述杂合细胞膜通过将不同细胞膜通过聚碳酸酯多孔膜进行挤压融合而得。具体的，在进行所述挤压融合时，通过400nm和200nm聚碳酸酯多孔膜进行。
25.作为本发明的一个可选实施方案，
26.步骤(3)中，在固定脲酶时，先将步骤(2)所得物均匀吸附在聚赖氨酸修饰的细胞培养板上，再向培养板中加入n-羟基磺酸基琥珀生物素和链霉亲和素进行反应，然后加入生物素修饰的脲酶进行反应；所述生物素修饰的脲酶为将脲酶溶解于pbs缓冲液中并加入n-羟基磺酸基琥珀生物素反应所得。
27.作为本发明的一个可选实施方案，所述癌细胞膜的获取方法为：1)在培养皿培养hepg 2细胞，消化后离心收集癌细胞，将其悬浮在hepes b缓冲液与1％蛋白酶抑制剂混合物中，冰浴冷却5分钟后将细胞匀浆数次，去除细胞核，收集上清液；2)用hepes b缓冲液配制重量体积百分数为30％40％和55％的蔗糖溶液，并按浓度由高到低加入离心管中，将收集的上清液缓慢加到蔗糖密度梯度柱中；3)在4℃下高速离心，收集所需的样品带，用hepes c缓冲液反复吹均匀、离心和重悬，即得。
28.本发明的另外一个目的在于提供由上述制备方法制备得到的靶向递药仿生纳米马达。
29.本发明的另外一个目的在于提供上述靶向递药仿生纳米马达肿瘤部位药物递送以及ctc捕获方面的应用，特别地，本发明在于提供利用所述靶向递药仿生纳米马达在肿瘤组织高效渗透并递送药物的应用。
30.本发明还有一个目的在于提供一种用于深部肿瘤具有高瘤内渗透分布和声动力治疗效果的纳米马达，该纳米马达参考前述的制备方法制备而得，关键在于选择了铁诱导细胞死亡诱导剂erastin作为药物进行装载。与前述制备方法的区别在于步骤(1)的纳米颗粒通过以zrocl2·
8h2o、4-(4-羧基苯基)卟啉和苯甲酸作为原料溶解在二甲基甲酰胺中加热反应而得。
31.本发明发现，利用本发明的纳米马达装载erastin后，在超声作用下，抗癌作用可
以得到大幅提升，这显示声动治疗联合铁诱导细胞死亡诱导剂erastin在抗癌方面具有协调增效的作用。如本发明的一个对比实施例所示，利用本发明纳米马达装载其它药物时，并未观察到明显的协同作用。这提示本发明制备的纳米马达药物载体，在提高药物治疗效果方面，对药物具有一定的选择性。
32.由此可见，本发明对于本领域的另一贡献在于：提供了一种在深部肿瘤具有渗透分布性好且能使得声动治疗和抗癌药物发挥协同作用的纳米马达。
33.本发明的有益效果：
34.本发明所得的纳米马达兼具自驱动运动特性和仿生特征，能长时稳定的依靠自身驱动力运动、不易被自身免疫系统清除且可以高效的实现ctc的主动捕获。同时，本发明装载erastin的纳米马达能实现药物与声动治疗的协同作用，有效提升抗癌效果，在深部肿瘤的治疗方面具有良好的应用前景。
附图说明
35.图1为本发明制备仿生纳米马达过程中对各步骤所得物的表征图；其中a部分从左至右分别为mof、mof@hm和mof@hm/ure的tem图，b部分为粒径表征图，c部分为电位表征图；
36.图2为本发明对实施例2所得仿生纳米马达进行运动特性表征和渗透效果表征的结果图；其中，a部分为运动轨迹结果，b部位为均方位移结果，c部分为扩散效率结果，d部分为仿生纳米马达的模拟渗透示意图，e部分为渗透效果的荧光检测结果；
37.图3为不同浓度的erastin处理hepg2和mcf-7后的结果图；其中a部分为铁离子含量变化结果，b部分为氧气含量变化结果。
具体实施方式
38.下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练人员根据上述发明内容所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
39.在本发明以下例子中，除了通过在相关物质后的括号中记载其缩写词之外，如无特别说明，其它的缩写词及其含义如下：
40.tcpp：4-(4-羧基苯基)卟啉
41.ctc：循环肿瘤细胞
42.sulfo-nhs-biotin：n-羟基磺酸基琥珀生物素
43.mof-era@hm：包覆杂合细胞膜且装载有mof-era
44.fe3o4@hm：包覆杂合细胞膜的fe3o4纳米颗粒
45.mof@hm/ure：固定有脲酶的mof-era@hm
46.实施例1
47.一种靶向递药仿生纳米马达的制备方法，制备步骤如下：
48.(1)制备具有载药功能的纳米颗粒；
49.(2)将杂合细胞膜包覆在步骤(1)所得纳米颗粒上；所述杂合细胞膜至少包括癌细胞膜和白细胞膜，所述癌细胞膜和白细胞膜的膜蛋白重量比为2:1；
50.(3)将脲酶固定在步骤(2)所得物的一侧，即得。
51.其中，步骤(1)中的纳米颗粒为fe3o4磁性纳米颗粒；步骤(2)中，将纳米颗粒与过量的杂合细胞膜混合，稀释后在冰浴中超声处理3分钟，随后通过400nm和200nm孔径的聚碳酸酯多孔膜，然后通过高速离心收集杂合膜包覆的纳米载体；步骤(3)中，先将步骤(2)所得物均匀吸附在聚赖氨酸修饰的12孔细胞培养板上，再向培养板中依次加入sulfo-nhs-biotin(160μm)和链霉亲和素(160μm)进行反应，然后加入生物素修饰的脲酶进行反应；所述生物素修饰的脲酶为将脲酶溶解于pbs缓冲液(1mg/ml)中并加入等体积的sulfo-nhs-biotin(16μm)室温反应后，过滤去除未反应的sulfo-nhs-biotin，然后离心所得。
52.实施例2
53.(1)载药纳米mof的制备
54.称取一定量zrocl2·
8h2o、tcpp和苯甲酸作为原料溶解在dmf中加热搅拌，反应完成后将得到的mof纳米颗粒依次用dmf和无水乙醇离心洗涤数次。以erastin作为铁死亡激活剂，将一定量的erastin和mof加入氯仿中振荡孵育，除去未载入的erastin，冷冻干燥即得载药纳米mof(mof-era)，使得载药率控制在3～4％(w/w)。
55.(2)仿生纳米载体的制备
56.1)配制hepes b(2.38g/l hepes，0.476g/lmgcl2，0.292g/l edta，0.154g/ldtt，0.746g/lkcl，ph 7.6)和hepes c(11.914g/l hepes，5.844g/lnacl，13.492g/l kcl，ph 7.6)缓冲液。在培养皿培养hepg 2细胞，消化后离心收集一定数量的癌细胞，悬浮在hepes b缓冲液与1％蛋白酶抑制剂混合物中，冰浴冷却5分钟后将细胞匀浆数次，去除细胞核。重复以上步骤，最终收集8-10ml上清液。用hepes b缓冲液配制浓度为30％、40％、55％(w/v)的蔗糖溶液，并按浓度由高到低加入离心管中，将收集的上清液缓慢加到蔗糖密度梯度柱中。在4℃下高速离心，收集所需的样品带，用hepes c缓冲液反复吹匀，离心。最后，将得到的癌细胞膜重新悬浮在hepes c缓冲液中保存备用。白细胞膜和红细胞膜的获取方法，在收集相应细胞后参照上述方法获得。
57.2)按膜蛋白比4:2:1的比例，将癌细胞膜、白细胞膜和红细胞膜混合。每个样品在室温下缓慢搅拌数分钟后进行超声处理3分钟，最后通过400nm和200nm聚碳酸酯多孔膜进行挤压融合，离心收集癌细胞-白细胞-红细胞杂合膜。
58.3)杂合膜包覆纳米载体的制备
59.取适量浓度的mof-era纳米粒子和fe3o4磁性纳米粒子加入过量的癌细胞-白细胞杂合膜中，对混合物进行稀释后在冰浴中超声处理3分钟，随后通过400nm和200nm孔径的聚碳酸酯多孔膜。
60.(3)仿生纳米马达的制备
61.将脲酶溶解于pbs缓冲液中(1mg/ml)，随后在酶溶液中加入等体积的sulfo-nhs-biotin(16μm)室温反应半小时，过滤去除未反应的sulfo-nhs-biotin，离心得到生物素修饰的脲酶(urease-biotin)溶解于pbs缓冲液4℃保存备用。将所得杂合膜包覆纳米载体悬浮液加入聚赖氨酸修饰的12孔细胞培养板，通过离心使仿生纳米载体均匀吸附在培养板底部，在室温下反应一个小时后移除上清液并用pbs冲洗数次去除未吸附的仿生纳米载体。随后向培养板中逐次加入sulfo-nhs-biotin(160μm)和链霉亲和素(160μm)室温反应1小时，用pbs冲洗每步反应。最后加入urease-biotin室温反应1小时，通过生物素和链霉亲和素的生物亲和作用将脲酶固定于仿生纳米载体的未封闭一侧，并用移液枪缓慢吹洗使其从培养
板释放得到仿生纳米马达。
62.实施例3
63.除了将癌细胞-白细胞-红细胞杂合膜替换为实施例1中的杂合细胞膜之外，其余与实施例2一致。
64.对比实施例1
65.相对于实施例1而言，除了选择将杂合细胞膜替换为由血小板与中性粒细胞膜组成的杂合细胞膜(膜蛋白重量比2:1)之外，其余与实施例1一致。
66.对比实施例2
67.相对于实施例1而言，除了选择将杂合细胞膜替换为红细胞膜与癌细胞膜组成的杂合细胞膜(膜蛋白重量比2:1)之外，其余与实施例1一致。
68.对比实施例3
69.相对于实施例1而言，除了选择将杂合细胞膜替换为白细胞膜与血小板膜组成的杂合细胞膜(膜蛋白重量比2:1)之外，其余与实施例1一致。
70.对比实施例4
71.相对于实施例1而言，除了癌细胞膜和白细胞膜的膜蛋白重量比为1:1之外，其余与实施例1一致。
72.对比实施例5
73.相对于实施例1而言，除了癌细胞膜和白细胞膜的膜蛋白重量比为1:2之外，其余与实施例1一致。
74.对比实施例6
75.相对于实施例1而言，除了癌细胞膜和白细胞膜的膜蛋白重量比为3:2之外，其余与实施例1一致。
76.对比实施例7
77.相对于实施例1而言，除了将杂合细胞膜替换为红细胞膜之外，其余与实施例1一致。
78.对比实施例8
79.除了将将癌细胞膜、白细胞膜和红细胞膜的膜蛋白比调整为2:1:1之外，其余与实施例3一致。
80.对比实施例9
81.相对于实施例2而言，除了将药物替换为顺铂之外，其余与实施例2一致。
82.对比实施例10
83.相对于实施例2而言，除了将药物替换为阿霉素之外，其余与实施例2一致。
84.实验例1
85.(1)杂合细胞膜的包覆表征及稳定性评价
86.为了表征杂合膜的形成，将dspe-peg-fitc染料和白细胞膜混合反应数小时，将dspe-peg-cy5染料与癌细胞膜混合反应数小时，待荧光标记完成后通过离心去除多余染料。用相同方法将荧光标记后的细胞膜融合形成杂合细胞膜并滴至载玻片上，利用clsm在488nm下激发fitc，收集525nm处的绿色荧光，在649nm激光下激发cy5，收集670nm处的红色荧光，将未挤压融合的细胞膜作为对照，以荧光颜色叠加确定两种杂合膜的形成。对实施例
1和实施例2进行上述实验观察，确定相应杂合细胞膜的形成。
87.用磷钨酸对mof-era@hm和fe3o4@hm进行复染，通过tem表征其形貌，观察杂合细胞膜对纳米载体的包覆情况。为了验证仿生纳米载体的核-壳结构，使用fitc对杂合细胞膜进行标记，通过clsm观察tpcc和fitc的荧光分布。采用dls测定了仿生纳米载体的水动力直径和zeta电位，比较杂合细胞膜包覆前后的变化。如图1中的a部分的tem图像显示，可知,：(1)包覆细胞膜前后纳米载体的形貌发生明显变化，mof@hm具备完整的核壳结构，同时可以观察到细胞膜厚度约为10nm；(2)脲酶均匀分布在mof@hm的一侧；(3)细胞膜包覆和动力酶修饰使纳米载体的粒径略微增加；(4)由于膜蛋白和脲酶呈负电性导致细胞膜包覆和酶修饰改变了纳米载体的表面电位。
88.将仿生纳米载体分散于pbs缓冲液和牛血清溶液保存两周，通过dls测定粒径变化验证其长期保存稳定性。同时，为了考察脲酶固定稳定性，将仿生纳米载体稀释分散于pbs缓冲液中，并置于摇床上(2000rpm/min)一段时间，记录所得仿生纳米载体自驱动运动功能的维持效果。对实施例1～3和对比实施例1～8进行长期保存性和自驱动运动功能稳定性评价，以粒径变化10％为指标考察长期保存性；以将仿生纳米马达在摇床上震荡30分钟后，于微流控设备中观察还具有自驱动运动能力的仿生纳米马达数量占总数量的占比为标准，考察自自驱动运动功能稳定性，结果如表1所示。
89.表1
[0090][0091]
(2)纳米马达的运动特征和渗透分布性
[0092]
通过将mof@hm/ure加入不同浓度的尿素溶液中，并采集运动轨迹，本发明研究了实施例1和实施例2仿生纳米马达的均方位移和扩散效率。以实施例2的方式纳米马达为例，如图2所示，结果表明纳米马达的运动能力与尿素浓度呈正相关。
[0093]
为了考察仿生纳米马达的渗透性，在transwell的下室中培养hepg2细胞，上室中加入mof@hm/ure纳米马达(示意图为图2中d部分)。通过细胞吞噬实验可以发现，在上室中加入脲酶后细胞对mof@hm/ure的吞噬明显增加，表明脲酶介导的运动特性有助于mof@hm/ure通过transwell的多孔膜，具有促渗透效应。作为对照，采用对比实施例5中的方式纳米马达进行上述实验，发现几乎没有相应吞噬的增加，表明对比实施例5的渗透效应差。
[0094]
(3)抗肿瘤效果实验
[0095]
体内抗肿瘤效果：分别使用生理盐水、erastin、mof、mof-era、mof-era@hm和mof-era@hm/ure组对荷瘤小鼠进行为期2次间隔2天的给药治疗，并每隔24小时使用超声进行治疗，记录18天内每3天肿瘤体积及小鼠体重及存活情况。治疗末期处死小鼠并取出肿瘤，记录肿瘤实验前后体积大小变化，以考察抗肿瘤效果。
[0096]
通过对上述实验组考察，发现将声动治疗和erastin联合，相对于其它组而言，可以显著的抑制肿瘤的生长，具有明显的协同作用。
[0097]
作为对照，对对比实施例9和对比实施例10进行上述实验，其相比于各自的纯药组而言，并未发现治疗意义上的协同作用。
[0098]
针对上述实验结果，本发明开展了胞内铁离子和氧气含量实验。实验操作为：分别用pbs、erastin、mof@hm/ure和mof-era@hm/ure处理hepg2细胞后加入铁离子分析缓冲液，取50μl的待测样品加入96孔板中，最后加入铁离子探针测定铁离子含量。采用便携式溶解氧测定仪测定每组培养基中的氧气浓度。如图3所示，erastin作用组的细胞内铁离子和氧气含量明显较对照组升高，并且随着erastin浓度的增加而增加。
[0099]
(4)ctc主动捕获检测
[0100]
参照文献(doi:10.1021/acsnano.7b08355)的方法，对实施例1～3和对比实施例1～8进行ctc主动捕获效率实验，结果如表2所示：
[0101]
表2
[0102]