一种化合物治疗血管增生相关疾病以及抗肿瘤的新用途

1.本技术涉及一种化合物的新用途，具体涉及该化合物治疗血管增生相关疾病以及抗肿瘤尤其是治疗胃癌方面的应用，属于化学领域。


背景技术：

2.肿瘤是危害人类健康最严重的一类常见病、多发病。中药治疗肿瘤在稳定瘤体、调节机体功能、增加免疫能力、改善临床症状、减轻放化疗毒副作用、延长带瘤生存时间方面有独特疗效。目前，祖国传统中药在肿瘤的治疗方面己取得了令人注目的成就，大力开展中医药治疗肿瘤的研究是一项非常有意义的探索。植物不仅是新型抗肿瘤药的重要来源之一，如长春新碱、喜树碱、紫杉醇等抗肿瘤药的发现和用途，而且植物药对机体免疫功能的调节作用也越来越受到人们的关注。研究表明不少中草药及其有效成分对免疫具有调节作用，这种调节作用既有增强作用也有抑制作用，有些则有双向调节作用，如黄芪、人参、当归、淫羊藿、菟丝子、刺五加、虫草、灵芝等等被证实对免疫功能具有增强作用，包括对细胞免疫、体液免疫、吞噬细胞吞噬功能、细胞因子的释放等多方面的明显增强作用，在抗肿瘤、抗感染等方面有着广泛用途的前景。
3.拓树cudrania tricuspidata(carr.)bur.为桑科拓属植物，其根入药，具有祛风除湿、活血通经、健脾益胃及消炎止痛等功效，临床用于治疗风湿关节痛、跌打损伤、脾虚泄泻及黄疽等症。国内研究发现柘树黄酮粗提物具有抗肿瘤活性，但活性成分未知。日本学者从其根皮中分离得到一些异戊烯基取代的
口
山酮及黄酮类化合物，但末对其进行生物活性研究尤其是抗肿瘤活性的研究。


技术实现要素：

4.为解决现有技术存在的问题，本技术提供一种具有式i结构的化合物在制备治疗血管增生相关疾病以及抗肿瘤的药物中的应用。
5.作为本技术的一个方面，本技术提供一种具有式i结构的化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体或同位素标记物在制备治疗血管增生相关疾病的药物中的应用，
[0006][0007]
式i。
[0008]
进一步，所述血管增生相关疾病包括癌症、子宫内膜异位症、类风湿性关节炎。
[0009]
作为本技术的另一个方面，本技术提供一种具有式i结构的化合物或其药学上可接受的盐、立体异构体或同位素标记物在制备抗肿瘤的药物中的应用，
[0010]
进一步，所述抗肿瘤包括抑制肿瘤细胞迁移和促进肿瘤细胞凋亡。
[0011]
进一步，所述肿瘤包括食管癌、子宫内膜癌、恶性淋巴瘤、多发性骨髓瘤、胃肠道间质瘤、结肠癌、直肠癌、乳腺癌、肝癌、胃癌、卵巢癌、子宫癌、宫颈癌、阴道癌、肺癌、肾癌、前列腺癌、膀胱癌、胰腺癌、脑癌、黑色素瘤等。优选针对胃癌效果最佳。
[0012]
作为本技术的另一个方面，本技术提供了一种药物组合物，其包含本技术上述的式i化合物、其药学上可接受的盐、立体异构体或同位素标记物，和药学上可接受的载体。
[0013]
所述药物组合物包括但不限于口服剂型、胃肠外给药剂型、外用剂型和直肠给药剂型。在一些实施方式中，所述药物组合物可以是口服的片剂、胶囊剂、丸剂、散剂、缓释制剂、溶液剂和悬浮液，用于胃肠外注射的无菌溶液、悬浮液或乳液，用于外用的软膏或乳膏，或者用于直肠给药的栓剂。在一些实施方式中，所述药物组合物和至少一种治疗剂分别以独立的剂型组合成组合产品，如药剂盒。
[0014]
本技术所述“药学上可接受的盐”是指保留了指定化合物的游离酸和游离碱的生物效力，并且在生物学或其他方面没有不良作用的盐。本技术中的盐指用有机酸/无机酸形成的酸式盐，以及用有机碱/无机碱形成的碱式盐。
[0015]
本技术所述“同位素标记物”是指由同位素标记的本技术化合物。例如本技术的化合物中的同位素包括h、c、o的各种同位素，如2h，3h，
13
c，
14
c，
18
o，
17
o。
[0016]
本技术所述“立体异构体”是指由分子中原子在空间上排列方式不同所产生的异构体。
[0017]
本发明式i化合物可抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管生成，效果显著优于阳性药沙利度胺和同类型化合物。且能有效抑制肿瘤细胞迁移并促进肿瘤细胞凋亡，对胰腺癌、肝癌、宫颈癌、胃癌等具有明显的效果。尤其是针对胃癌的治疗效果最佳，研究表明，本发明式i化合物对mgc803荷瘤鼠瘤体积和瘤重量的抑制率在30％以上，显著优于其他同类型化合物。
具体实施方式
[0018]
实施例1式i化合物的制备
[0019]
实施例1式i化合物的制备
[0020]
柘木干燥粉碎后,80％乙醇回流提取3次,滤液合并减压浓缩得膏。水混悬后，依次用石油醚(60～90℃)、乙酸乙酯萃取，回收得乙酸乙酯部位，乙酸乙酯部位经硅胶(200～300目)柱色谱分离，采用二氯甲烷
‑
甲醇(50:0～ 0:50)梯度洗脱，洗脱液经tlc薄层色谱检识，合并相同组分，得组分fr.1～ 10。fr.4经硅胶柱色谱分离，二氯甲烷
‑
甲醇梯度洗脱，洗脱液经薄层色谱检识，合并相同组分，得组分fr.4a～4d；fr.4d经sephadex lh
‑
20柱色谱，纯甲醇洗脱，分离得到化合物i。
[0021]
化合物i：黄色粉末、易溶于甲醇。esi
‑
ms m/z:395[m
‑
h]
‑
，推测分子式为c
23
h
24
o6。h
‑
nmr(cdcl3,500mhz)δ:13.7(1h，s，1
‑
oh)，8.61(1h，s，8
‑
h)， 7.52(1h，s，4
‑
h)，7.51(1h，dd，14
‑
h)，5.15(1h，m，17
‑
h)，5.53(1h，dd， 15h)，5.42(1h，dd，15
‑
h)，3.255(2h，m，16
‑
h2)，1.82(3h，s，19
‑
ch3)， 1.74(3h，s，20
‑
ch3)，1.66(6h，s，12
‑
ch3，13
‑
ch3)。根据esi
‑
ms和h
‑
nmr 波谱数据，确定化合物结构如下：
[0022][0023]
实施例2式1化合物对鸡胚绒毛尿囊膜血管生成的影响
[0024]
1实验方法
[0025]
(1)鸡胚孵育
[0026]
将鸡蛋置于38℃、相对湿度为70％的孵蛋箱中孵育。每天转蛋至少2～ 4次。
[0027]
(2)假气室制备
[0028]
取孵育第7d种蛋，用75％酒精擦拭蛋壳气室端(大头端)，用顿头镊子小心在蛋气室表面扎1小洞，用眼科弯剪小心夹去蛋壳及壳膜，开窗面积约为1.5cm
×
1.5cm。
[0029]
(3)构建cam模型
[0030]
开窗后，用洗耳球将落在气室膜上的蛋壳吹走，将5m l注射器针头置于与气室膜夹角约30℃上，用针头轻轻划气室膜，使破口长约2mm，在气室膜破口处滴0.9％生理盐水2
‑
3滴，此时破口处形成1个小水池，使紧贴在气室膜下面的cam血管显露出来，并且生理盐水处下层的cam与上层的气室膜分离并向下凹陷，揭去气室膜，使cam完全暴露。
[0031]
(4)加药
[0032]
分组与配药：将明胶海绵用打孔器制成直径约为6mm的圆形小块，分别用移液枪加
入5μl不同浓度的实验药物，给药组(高剂量组4mg/ml；低剂量组1mg/ml；甲醇溶解)、空白对照组(生理盐水)以及阳性对照组(vegf 抑制剂沙利度胺1mg/ml；甲醇：二氯甲烷1：1溶解)，将处理好的明胶海绵样品均放置在超净台内紫外消毒风干，备用。暴露cam后,将事先制备的含药明胶海绵置于cam中央血管稀少区,以便待测药物充分发挥作用。然后用无菌封口膜和透明胶带帖封贴气室端,使胶带超过窗口边缘0.5cm, 形成透明观察窗，观察鸡胚的存活情况。封窗后继续孵育3d。
[0033]
(5)制备cam标本
[0034]
加药孵育3d后，剪开透明胶带纸，由观察窗加入甲醇：丙酮＝1：1的固定液1ml室温下作用30min后，用眼科弯剪小心去除cam平面以上的卵壳及卵壳膜，并用眼科弯剪以待测物为中心完整地剪下cam,在生理盐水中展开后平铺在载玻片上阴干保存。
[0035]
(6)结果观察
[0036]
在解剖显微镜下(x10)观察鸡胚尿囊膜新生血管情况,并对实验区域(即以明胶海绵作为中心1cm 2范围)进行拍照，用image pro plus 6.0软件计算截取图片的总面积以及截面内新生血管的面积，并计算出新生血管占比值(％) 和血管再生抑制率(％)。计算公式分别为：
[0037]
新生血管占比％＝新生血面积/截面总面积
×
100％
[0038]
血管再生抑制率(％)＝(1
‑
给药组新生血管占比/对照组新生血管占比)
ꢀ×
100％
[0039]
实验结果见表1
[0040]
表1式1化合物对鸡胚绒毛尿囊膜血管再生的影响(x
±
s，n＝6)
[0041]
组别浓度μg血管面积(％)抑制率空白对照组 20.75
±
0.45 阳性对照组511.64
±
0.5843.90％化合物低剂量组510.84
±
0.2547.76％化合物高剂量组209.74
±
0.8253.06％
[0042]
由实验结果可知，式1化合物可抑制鸡胚绒毛尿囊膜血管生成，且效果优于阳性药沙利度胺。
[0043]
实施例3式1化合物抗肿瘤活性及作用机制研究
[0044]
1 cck
‑
8法筛选抗肿瘤活性
[0045]
将细胞配置成单个细胞悬液，调整悬液密度分别稀释为4
×
104个/ml，然后各吸取100ul接种到96孔板上(接种过程中需对细胞悬液进行多次混匀，以保证接种后每孔的细胞密度完全相同)，并放入培养箱。培养24h后，加入用不含fbs的培养基稀释的不同浓度的药物，同时还设置dmso对照组和不含细胞的空白组，继续培养24小时后，向每孔加入10μl cck
‑
8溶液(注意不要让孔中液体产生气泡，否则会影响光密度值的结果)，再培养2h后用全波长酶标仪检测各孔在450nm和630nm波长下的吸光度，每组设置4个复孔，实验共重复3次。
[0046]
细胞增殖抑制率(％)＝[(a对照
‑
a样品)/(a对照
‑
a空白)]
×
100％(所有吸光值均为测量波长450nm减去参比波长690nm所得)，取三次重复实验平均值。
[0047]
实验结果与讨论
[0048]
化合物浓度为200μm，作用24小时后，人胰腺癌细胞panc
‑
1、人肝癌细胞hepg2、人宫颈癌细胞hela、人胃癌细胞mgc803、人结肠癌细胞 hct116的增殖抑制情况，结果如表2所
示。由表可发现化合物对肿瘤细胞具有较强的抑制作用。然后用不同浓度(6、8、10、12、14、16、18μm)的化合物处理肿瘤细胞，计算ic50值，结果如表3所示。结果表明，化合物对 panc1的半数抑制浓度为14.64μm，对hepg 2半数抑制浓度为9.61μm，对 mgc 803半数抑制浓度为10.27μm。
[0049]
表2化合物对肿瘤细胞的增殖抑制率(x
±
s,n＝4)
[0050][0051]
(/：表示不抑制细胞的增殖)
[0052]
表3化合物对肿瘤细胞的ic50(x
±
s,n＝4)
[0053]
细胞ic50(μm)panc114.64hepg29.61mgc80310.27
[0054]
2化合物对胃癌细胞mgc803迁移的影响
[0055]
2.1划痕法检测化合物对胃癌mgc 803细胞迁移距离的影响
[0056]
培养板接种细胞之前先用marker笔在12孔板背面画横线标记。将生长状态良好的对数生长期细胞消化后，按5
×
10 5个/孔的量均匀接种到12孔板中，每孔加入1ml含10％fbs的完全培养基，待培养24h后，细胞贴壁且铺满板底。接着用100μl枪头垂直于孔板竖着画3道划痕，力道尽量均匀，保证各个划痕宽度一致。然后吸去细胞培养液，用pbs小心冲洗孔板三次，洗去划痕产生的细胞碎片。加入不同浓度含药培养基。将培养板置于荧光显微镜下
[0057]
拍照记录原始划痕宽度。将培养板放入培养箱继续培养，24h后，在相同位置拍照记录。收集图片，并用imagepro plus 6.0分析细胞迁移距离， graghpad prism 7.0统计实验结果。每组设3个复孔。
[0058]
细胞迁移率公式如下：细胞迁移率(％)＝(d 0
‑
d 24)/d 0
×
100％
[0059]
注：公式中所涉及d均为划痕面积除以划痕高度所得的平均宽度。d 0、 d 24分别为在0、24h下的划痕宽度。
[0060]
实验结果见表4
[0061]
表4化合物对mgc803细胞迁移距离的影响
[0062]
组别细胞迁移率(％)抑制率(％)空白对照组21.37
±
2.63 化合物5μm13.66
±
3.2836.08化合物10μm9.24
±
1.1156.76化合物15μm0.62
±
0.2097.105fu 200μm14.68
±
2.6331.31
[0063]
在划痕实验中，和对照组相比，给药浓度在5、10、15μm下的细胞迁移率(％)分别为
21.37
±
2.63、13.66
±
3.28、9.24
±
1.11、0.62
±
0.20。阳性对照药5fu 200μm的细胞迁移率为14.68
±
2.63。实验结果表明，化合物对mgc803细胞迁移距离具有抑制作用，且呈剂量依赖性。接下来用 transwell法对细胞迁移数目进行观察。
[0064]
2.2 transwell法检测化合物对胃癌mgc 803细胞迁移数目的影响
[0065]
24孔板下室加入600μl含20％fbs的完全培养基，transwell小室中加入200μl的细胞悬液，培养24h。培养结束后，将小室取出，吸出上、下室培养基，并用pbs洗涤两次，往下室加入600μl 4％多聚甲醛，将下层细胞常温固定30min，其后再用dapi染色，用医用棉签轻轻擦去上室基底膜内侧未穿膜的细胞。将其置于倒置荧光显微镜下观察拍照。结果见表5。
[0066]
transwell法细胞迁移抑制率＝(对照组细胞迁移个数
‑
加药组细胞迁移个数)/对照组细胞迁移个数
×
100％。
[0067]
表5 transwell法检测化合物对mgc803细胞迁移数目的影响
[0068]
组别迁移细胞数(n)迁移抑制率(％)空白对照组2,755
±
75.57 化合物5μm剂量组2,223
±
128.9719.31％化合物10μm剂量组1,548
±
113.0843.81％化合物15μm剂量组1,230
±
101.6855.35％化合物20μm剂量组595
±
83.9178.40％5
‑
fu 200μm1,663
±
200.8039.65％
[0069]
由表5可以看出，在transwell实验中，化合物能显著降低mgc803细胞的过膜数量。与对照组相比，化合物在5、10、15、20μm的药物浓度下，对mgc803细胞的迁移的抑制率分别为19.31％、43.81％、55.35％、78.40％，能显著抑制细胞迁移。且随着给药剂量的增加，抑制率成剂量依赖性增高。
[0070]
3化合物对胃癌细胞mgc803周期的影响
[0071]
实验方法：
[0072]
(1)细胞培养取对数生长期的mgc803细胞，3
×
10 5个/孔接种于6 孔板内，放入培养箱中培养24h后，进行药物处理，继续孵育48h后，终止培养。
[0073]
(2)细胞固定消化细胞，收集到离心管内。1000g离心3min，弃上清，收集细胞沉淀，用预冷pbs洗涤1次，加入1毫升冰浴预冷70％乙醇，并将细胞转移至1.5mlep管中，轻轻吹打混匀，于
‑
20℃固定16h。
[0074]
(3)细胞染色1000g离心3min，弃上清，收集细胞沉淀，用预冷pbs 洗涤1次，向每管细胞样品中加入0.5ml(碘化丙啶染色液均以如下比例按需酌量配制：0.5ml染色缓冲液+25μl碘化丙啶染色液(20x)+10μl rnasea(50x))，4℃避光孵育30min。
[0075]
(4)流式分析：以标准程序用流式细胞仪检测，结果用细胞周期拟和软件modfit分析。
[0076]
实验结果见表6。
[0077]
表6化合物对mgc803细胞模型周期影响
[0078]
组别g1(％)s(％)g2(％)空白对照组53.17
±
0.9434.98
±
0.9411.85
±
0.85化合物5μm剂量组54.62
±
1.5935.78
±
0.819.60
±
1.62
化合物10μm剂量组57.70
±
1.0230.47
±
1.9711.83
±
1.75化合物15μm剂量组54.39
±
1.6734.42
±
1.8211.19
±
0.39化合物20μm剂量组41.50
±
5.94***47.15
±
9.35***11.69
±
5.60
[0079]
由表可知，化合物浓度为20μm时，可显著影响mgc803的细胞周期，当药物作用48h后，相较空白组，s期细胞明显增加，g1期细胞明显减少。实验结果表明，细胞周期阻滞发生在s期。
[0080]
4化合物对胃癌细胞mgc803凋亡的影响
[0081]
将生长状态良好的对数生长期细胞，常规消化处理成细胞悬液后，均匀接种到6孔板内，每孔接种1
×
10 6个细胞，并在培养24h后。将旧培养基换成含药培养基继续孵育48h。孵育结束后，把旧细胞培养液吸出至15ml 离心管内备用，用pbs洗涤细胞一次，加入1ml不含edta的0.25％胰酶细胞消化液消化细胞。室温孵育至轻轻吹打可以使贴壁细胞吹打下来时，加入之前吸出至15ml离心管的旧培养基终止消化。小心吹打，将单细胞悬液转移到离心管内，1000g心5分钟，弃上清，收集细胞，加入195μlannexinv
‑
fitc结合液轻轻重悬细胞。再分别依次加入5μlannexin v
‑
fitc、 10μl化丙啶染色液轻轻混匀。室温(20
‑
25℃)避光孵育20min，立即用流式细胞仪检测实验结果。每组设5个复孔。
[0082]
实验结果见表7
[0083]
表7对胃癌mgc803细胞凋亡的影响
[0084] 存活细胞(％)早期凋亡(％)晚期凋亡(％)空白对照组86.10
±
0.879.42
±
0.593.94
±
0.59化合物5μm剂量组75.10
±
5.1415.80
±
3.617.23
±
4.36化合物10μm剂量组65.23
±
7.1622.43
±
10.369.70
±
2.86化合物15μm剂量组44.97
±
0.7643.00
±
4.6111.97
±
4.12化合物20μm剂量组31.45
±
1.5946.80
±
2.0421.65
±
2.445
‑
fu 200μm61.93
±
3.2430.80
±
3.756.98
±
0.83
[0085]
结果表明，化合物可显著促进mgc803的早期凋亡。
[0086]
5单细胞克隆形成实验
[0087]
实验方法
[0088]
取对数生长期的mgc803细胞，采用常规传代方法，对细胞进行消化，制成细胞悬液。将细胞悬液反复吹打，使细胞充分分散，单个细胞百分率应在95％以上。对细胞计数、离心并弃除上清液后，加入dmed完全培养基重悬细胞，备用。将细胞悬液进行倍比稀释，以每孔500个细胞的量分别接种于六孔板中，每孔加入2ml含h
‑
10的完全培养基(药物终浓度为80、 130、180μm,同时设置含相同dmso浓度的对照组)，并轻轻转动，使细胞分散均匀。置细胞培养箱中培养。经常观察，每3d换一次培养基，当培养7d后，培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用pbs 小心浸洗2次。每孔加入2ml 4％多聚甲醛常温固定20min，然后去除固定液，每孔加入1ml 0.1％结晶紫染液染色10min，然后用pbs缓慢洗去染色液，空气下干燥。将平皿底部叠加一张带网格的透明胶片，在显微镜下观察，并对大于50个细胞的克隆进行计数。每组设3个复孔。
[0089]
实验结果见表8。
[0090]
表8化合物对mgc803细胞集落形成的影响
[0091]
组别个数空白对照组199
±
26化合物5μm剂量组77
±
15化合物10μm剂量组54
±
4化合物15μm剂量组11
±
1化合物20μm剂量组05
‑
fu 200μm38
±8[0092]
结果表明，化合物显著抑制了mgc803细胞的克隆形成。对照组和给药浓度在5、10、15、20μm下的集落形成数分别为199
±
26、77
±
15、54
ꢀ±
4、11
±
10个。
[0093]
实施例4式1化合物体内抗胃癌作用
[0094]
mgc803细胞常规消化离心，pbs重悬为5x10 6个/100μl，接种于裸鼠右前肢腋下。待肿瘤组织长到100mm3时，实验组灌胃给药20mg
·
kg
‑
1，共 10天，模型对照组给与同等剂量生理盐水。每日测量肿瘤大小和体重。给药结束后取瘤组织称重，液氮冻存。结果见表9、10。
[0095]
表9化合物对mgc803荷瘤鼠瘤体积的影响
[0096][0097]
表10化合物对mgc803荷瘤鼠瘤重的影响
[0098][0099]
结果表明，与空白组相比，化合物对mgc803荷瘤鼠瘤体积的抑制率为 35.50％，对瘤重的抑制率为30.26％。
[0100]
实施例5
[0101]
取实施例1制备的化合物，加入注射剂(包括冻干粉针剂和无菌分装干粉针剂)适当辅料，按注射剂(包括冻干粉针剂和无菌分装干粉针剂)工艺制备成注射剂。
[0102]
实施例6
[0103]
取实施例1制备的化合物，加入片剂(包括缓控释片、骨架片、包衣片、分散片等)适当辅料，按片剂(包括缓控释片、骨架片、包衣片、分散片等) 工艺制备成片剂。
[0104]
实施例7
[0105]
取实施例1制备的化合物，加入胶囊剂适当辅料，按胶囊剂工艺制备成胶囊剂。
[0106]
实施例8
[0107]
取实施例1制备的化合物，加入乳剂(包括微乳、纳米乳等)适当辅料，按乳剂(包括微乳、纳米乳等)工艺制备成乳剂。
[0108]
实施例9
[0109]
取实施例1制备的化合物，加入颗粒剂适当辅料，按颗粒剂工艺制备成颗粒剂。
[0110]
实施例10
[0111]
取实施例1制备的化合物，加入缓释控释剂适当辅料，按缓释控释剂工艺制成缓释控释剂。
[0112]
实施例11
[0113]
取实施例1制备的化合物，加入口服液适当辅料，按口服液工艺制备成口服液。
[0114]
实施例12
[0115]
取实施例1制备的化合物，加入脂质体剂型适当辅料，按脂质体工艺制备成脂质体剂型。