一种基于外泌体的神经离断修复材料及其制备方法

1.本发明涉及神经离断修复技术领域，尤其涉及一种基于外泌体的神经离断修复材料exo
‑
bbc膜及其制备方法。


背景技术：

2.神经离断是临床常见的疾病之一，通常采用直接断端缝合技术或自体神经移植方法，但有限的供体来源限制了自体神经移植技术的应用，因此用于取代自体神经的桥接材料早已成为了当前生物医学研究的重要领域。近年来，有研究学者提出生物材料、细胞或神经营养因子是修复周围神经离断的有效方法。在上述方法中，以人工神经引导导管为基础的手术被认为是治疗周围神经离断的最有前景的方法之一。可降解的生物导管材料用于模拟神经的顶端和微观结构，显示出良好的热学性能，包括合成聚乳酸、聚碳酸酯和生物合成纤维素等材料。其中生物合成纤维素(biosynthesized cellulose，bc)是一种具有优异生物相容性和纯度的生物聚合物，具有低密度和高孔隙率特性，较好的生物相容性，已作为药物载体在生物医学领域进行相关应用研究。
3.据研究报道，从脂肪间充质干细胞(mesenchymal stem cells，mscs)分离出来的外泌体(exosomes，exo)是一种由细胞内吐至胞外的亚细胞双层膜小囊泡物质，直径约40
‑
120nm，在电镜下呈杯状或球状，内含有与来源细胞相似的生长因子、细胞因子等蛋白质及其他脂类、snrna和mirna等活性小分子物质，具有增加有髓纤维数量，促进周围神经髓鞘形成，进而促进神经损伤后功能恢复等作用，在神经修复领域具有潜在的应用前景。
4.目前临床上周围神经离断治疗材料繁多，除了自体神经外，其他材料的修复效果并不理想且价格昂贵、安全风险高。因此有必要研究出一种经济实惠且安全的神经离断修复材料，以满足医药市场需求。


技术实现要素：

5.有鉴于此，本发明提供了一种基于外泌体的神经离断修复材料exo
‑
bbc膜，解决现有技术存在问题。
6.本发明提供了一种基于外泌体的神经离断修复材料exo
‑
bbc膜的制备方法，包括以下步骤：取冻干的混合生物合成纤维素(blended biosynthesized cellulose，bbc)膜，25℃下用生理盐水浸泡5min后用镊子将其分为三层，后在单层bbc膜的两端打四个孔(以便进行后续的神经离断修复手术)，并将其进行高温高压灭菌(后续操作在25℃无菌条件下完成)，晾干bbc膜上的水分，再放置于无菌的六孔板中，将4μl无菌的外泌体溶液缓慢均匀滴加到单层bbc膜上并晾干，每μl外泌体溶液含1.9
×
109个外泌体，获得包埋外泌体的神经离断修复材料exo
‑
bbc膜，制备好的exo
‑
bbc膜于4
°
无菌条件下保存待用。
7.优选地，bbc膜由以下步骤制备而得：
8.(1)将gluconoacetobacter hansenii菌株接种至hestrin
‑
schramm(hs)改良培养基中，在25℃下静态培养7天便可获得原始的bc膜；
9.(2)将原始的bc膜浸入0.1m naoh溶液中，在50℃下搅拌洗涤24小时，并用蒸馏水充分漂洗获得初步纯净的bc膜；
10.(3)用匀浆机将湿的初步纯净的bc膜以1000rpm的速度进行搅拌，直到获得均匀的纤维素浆，在真空下经过滤器过滤后形成薄纸样硬膜，冻干后即得bbc膜。优选地，hs改良培养基由20.0g/l葡萄糖，5.0g/l蛋白胨，5.0g/l酵母提取物，2.7g/l磷酸氢二钠和1.5g/l柠檬酸组成。
11.优选地，外泌体由以下步骤制备而得：
12.(1)取第4代生长状态良好的老鼠脂肪间充质干细胞mscs，在其融合度达90％时用无血清培养基培养72小时，后用8个t175细胞培养瓶收集上清液；
13.(2)分离纯化获得外泌体：取收集到的上清液，4℃下300
×
g离心10分钟，去除活细胞，留上清液；4℃下2000
×
g离心10分钟，去除死细胞，留上清；4℃下10000
×
g离心30分钟，去除细胞碎片，留上清；0.22μm过滤器过滤上清液，用超滤管将上清液浓缩至2ml，100000
×
g离心70分钟，取沉淀物；用2ml pbs重悬沉淀物并等量分装，在
‑
80℃保存待用。
14.本发明的有益效果：
15.本发明一方面提供了一种基于外泌体的神经离断修复材料exo
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bbc膜的制备方法，方法简易，便于推广；另一方面根据该方法制备的exo
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bbc膜对大鼠坐骨神经离断的修复具有良好的效果，通过步态、神经功能指数、热痛潜伏期、离断处神经纤维再生等指标评价本方法制备的exo
‑
bbc膜对神经再生治疗效果后发现：exo
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bbc膜在大鼠坐骨神经离断的修复方面的作用显著优于肌肉注射外泌体+bbc膜或单独使用bbc膜，安全实惠。因此本发明制备的exo
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bbc膜在神经离断修复领域将具有广阔的临床应用前景。
附图说明
16.图1为实施例二的外泌体在电镜下的形态图；
17.图2为实施例五的4组大鼠离断神经桥接后第8周的步态印迹图；
18.图3为实施例五的4组大鼠离断神经桥接后第24小时、4周及8周的神经功能指数；
19.图4为实施例五的4组大鼠离断神经桥接后第24小时及8周的热痛潜伏期；
20.图5为实施例五的4组大鼠离断神经桥接后第8周的神经纤维分布图；
21.图6为实施例五的4组大鼠离断神经桥接后第8周的神经纤维数量；
22.图7为实施例五的4组大鼠离断神经桥接后第8周的神经纤维平均直径。
具体实施方式
23.以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
24.实施例一：bbc膜的制备，包括以下步骤：
25.(1)将gluconoacetobacter hansenii菌株接种至hs改良培养基中，在25℃下静态培养7天便可获得原始的bc膜；
26.(2)将原始的bc膜浸入0.1m naoh溶液中，在50℃下搅拌洗涤24小时，并用蒸馏水充分漂洗获得初步纯净的bc膜；
27.(3)用匀浆机将湿的初步纯净的bc膜以1000rpm的速度进行搅拌，直到获得均匀的
纤维素浆，在真空下经过滤器过滤后形成薄纸样硬膜，冻干后即得bbc膜。
28.扫描电子显微镜观测、比表面积和单丝强度测试表明：本实施例的bbc膜孔隙率为95％，拉伸强度达到15mpa，弹性模量达到160mpa。
29.实施例二：外泌体的制备，包括以下步骤：
30.(1)取第4代生长状态良好的老鼠脂肪间充质干细胞mscs，在其融合度达90％时用无血清培养基培养72小时，后用8个t175细胞培养瓶收集上清液；
31.(2)分离纯化获得外泌体：取收集到的上清液，4℃下300
×
g离心10分钟，去除活细胞，留上清液；4℃下2000
×
g离心10分钟，去除死细胞，留上清；4℃下10000
×
g离心30分钟，去除细胞碎片，留上清；0.22μm过滤器过滤上清液，用超滤管将上清液浓缩至2ml，100000
×
g离心70分钟，取沉淀物；用2ml pbs重悬沉淀物并等量分装，在
‑
80℃保存待用。
32.纳米颗粒跟踪分析仪(nanoparticle tracking analysis，nta)检测结果表明本试验制备的外泌体浓度为1.9
×
10
11
个/μl。利用透射电镜对外泌体进行测试，结果如图1显示，外泌体成不规则椭圆状，直径为30
‑
70nm之间。
33.实施例三：基于外泌体的神经离断修复材料exo
‑
bbc膜的制备，包括以下步骤：
34.取实施例一冻干后的bbc膜(长12mm，宽6mm，厚0.3mm)，25℃下用生理盐水浸泡5分钟后用镊子将其分为三层，后在单层bbc膜的两端打四个孔(以便进行后续的神经离断修复手术)，并将其进行高温高压灭菌(后续操作在25℃无菌条件下完成)，晾干bbc膜上的水分，再放置于无菌的六孔板中，将4μl无菌的外泌体溶液(每μl含1.9
×
109个外泌体)缓慢均匀滴加到单层bbc膜上并晾干，获得包埋外泌体的神经离断修复材料exo
‑
bbc膜。制备好的exo
‑
bbc膜于4
°
无菌条件下保存待用。
35.实施例四：大鼠坐骨神经离断及修复模型的构建
36.将健康成年雄性sd大鼠分为4组，每组6只，每只体重180
‑
200g。试验分组情况如下：
37.exo
‑
bbc膜组(a组)：采用exo
‑
bbc膜桥接的方法将离断的神经连接起来；
38.肌肉注射exo+bbc膜(b组)：采用腓肠肌注射外泌体+bbc膜桥接的方法将离断的神经连接起来；
39.bbc膜组(c组)：采用bbc膜桥接的方法将离断的神经连接起来；
40.筋膜组(d组)：采用筋膜桥接的方法将离断的神经连接起来。
41.术前准备工作(动物麻醉和固定消毒)：用1ml注射器向大鼠腹腔注射10％的水合氯醛(0.3ml/100g)用以麻醉大鼠，然后将大鼠以俯卧的姿势固于鼠板上，用手术剪剪去右侧股部梨状肌下缘的鼠毛，后用酒精对剪毛处进行3次消毒。
42.与bbc膜相关的桥接手术：无菌条件下用手术刀在大鼠右臀部作斜切口，将臀肌间隙钝性分离并显露出右侧坐骨神经。找到坐骨神经干后，用8
‑
0缝合线将膜材料一端的两个角缝合于坐骨神经上，后利用眼科剪将坐骨神经剪掉5mm，然后将膜材料的另外一端的两个角缝合于坐骨神经的另一断端上，将离断的坐骨神经包裹并连接起来，接着利用镊子将膜材料卷起来后再在膜中间处缝合，之后立即缝合皮肤切口，最后喷洒酒精消毒。
43.给药：将大鼠固定于鼠板上，用5μl的微量注射器吸取配制好的2μl外泌体(每μl含1.9
×
109个外泌体)，注入大鼠右侧腓肠肌，5分钟推注完，留针5分钟，以保证液体完全吸收，后缓慢地拔针，3天后再注射一次，两次共注射外泌体4μl。
44.筋膜桥接手术：找到坐骨神经干后，用8
‑
0缝合线把坐骨神经干的两端固定，固定后利用眼科剪剪掉5mm坐骨神经干，之后取一段长约为5mm宽为2mm的肌肉组织，在手术显微镜下利用8
‑
0缝合线将肌肉组织与坐骨神经干两端的神经外膜缝合，之后缝合皮肤切口，喷洒酒精消毒。
45.实施例五：exo
‑
bbc膜应用于神经离断修复的效果评价
46.(1)大鼠后足步态检测及坐骨神经功能指数(sfi)测试
47.步态检测和sfi测试方法：自制长形的大鼠行走通道，通道长1m、宽15cm、高15cm。裁剪长1m宽15cm的白纸，将裁剪好的白纸铺平放置于通道底部。戴上帆布手套后将受试鼠尾巴拎起，露出双后足，用刷子将炭素墨水刷到大鼠双后足上，将大鼠放入行走通道一端，大鼠在向另一端爬行过程中每侧会留4
‑
5个足印，选试验侧足(右侧足)和正常侧足(左侧足)的3个变量(足印长度、足趾宽度和中间足趾距离)进行sfi评分。
48.分别于大鼠离断神经桥接后第24小时、4周、8周进行步态分析及印迹测定(如图2)，并计算sfi值(见图3)。术后第24小时，各组大鼠的脚印不清楚，脚趾完全分不开，sfi值几乎无差异。术后第4周，相较于b
‑
d组，a组的脚印轮廓较清晰，趾间伸展得较开；a组的sfi值显著优于d
‑
f组(p<0.05)。术后第8周的a组在步态方面显著优于其它组，脚印轮廓更为清晰，趾间伸展得更开；a组在sfi值方面优于b组，显著优于c
‑
d组(p<0.05)。
49.这些试验结果表明，各组桥接材料对于神经离断修复的效果由好到差排列的顺序依次为：exo
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bbc膜组>肌肉注射exo+bbc膜>bbc膜组>筋膜组。
50.(2)热痛潜伏期测试
51.如图4所示，热痛潜伏期测试结果表明：4组大鼠在术后第24小时的热痛潜伏期几乎没有的差异；第8周时a组的热痛潜伏期显著短于b
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d组(p<0.01)。这说明采用实施例三的基于外泌体的神经离断修复材料exo
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bbc膜能够明显减少大鼠的热痛反应时间，是本试验中最佳的神经离断修复材料。
52.(3)神经纤维再生测试
53.组织学光镜观察结果如图5所示，术后8周时a组大鼠坐骨神经离断处再生神经纤维数量多，排列较整齐，髓鞘较厚；b组的再生神经纤维分布较均匀，排列稍规则；c组的再生神经纤维分布不均匀，排列不规则；而d组神经纤维再生数量很少，排列非常不规则。从神经纤维再生数量上看(图6)，a组显著优于b
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d组，并存在统计学差异(p<0.01)。而从神经纤维直径来看(图7)，a组也显著优于b
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d组(p<0.01)。这些试验结果说明采用实施例三的基于外泌体的神经离断修复材料exo
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bbc膜是本试验中最佳的神经离断修复材料。
54.综上所述，步态、神经功能指数、热痛潜伏期、离断处神经纤维再生等指标表明本发明制备的exo
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bbc膜对大鼠坐骨神经离断后的修复具有优良效果，其修复效果显著优于肌肉注射外泌体+bbc膜或单独使用bbc膜，是上佳的神经离断修复材料，安全实惠。因此本发明制备的exo
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bbc膜在神经离断修复领域将具有广阔的临床应用前景。
55.以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明保护的范围之内。