一种Fascaplysin类化合物的应用的制作方法

一种fascaplysin类化合物的应用
技术领域
1.本发明涉及医药技术领域，尤其涉及一种fascaplysin类化合物的应用。


背景技术：

2.铁死亡是一种发生机制独立于凋亡和其他方式的新型细胞死亡方式，是2003年由dolma等高通量筛选2万多种化合物的致死效应时发现的，由erastin诱导的靶向杀伤hras过表达肿瘤细胞的一种新型铁依赖性的细胞死亡方式，与凋亡，坏死和自噬等经典细胞死亡方式在形态学、生物化学等方面都有较大的差异。2012年，dixon把这种细胞死亡方式命名为铁死亡。细胞发生铁死亡时，细胞质内线粒体发生浓缩，内膜嵴变少甚至消失，外膜密度增加、破裂，细胞内活性的二价铁离子增加，最后致命性脂质过氧化物积累进而引起细胞的死亡。随着研究的深入，铁死亡的发现使得人们对于肿瘤疾病的发生发展有了新的认识。诱导铁死亡对于肿瘤治疗的重要性已经越来越受到重视，同时研究发现肿瘤细胞会产生铁死亡抵抗。在治疗肺癌的药物中，有一些已被证实可以诱导铁死亡。研究也发现肺癌细胞中存在铁死亡抑制的现象。研究表明，铁死亡诱导剂erastin在肝癌、乳腺癌、卵巢癌等癌症中都有较好的抑癌效果，且最近越来越多的研究表明，铁死亡不仅与肿瘤相关，在神经退行性疾病、心血管疾病、糖尿病、炎症等疾病中都发挥重要作用。
3.天然产物是化疗药物的主要来源。海洋拥有丰富的生物多样性，成为抗癌新药开发重要的宝库。目前研究最多的海洋植物主要有红藻类、褐藻类、绿藻类、微藻类等，生物活性物质包括卤代萜类、多酚类、脂类、多糖类和多肽类等，在抗氧化、抗肿瘤、抗炎、增强机体免疫力等研究方面呈现出良好的作用效果。目前发现很多天然海产品已被发现对癌症进展具有生物活性。不过尚未发现海洋天然产物在铁死亡方面的相关报道。


技术实现要素：

4.本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种fascaplysin类化合物的应用。
5.fascaplysin是罗尔等人从海绵中分离出的一种化合物，其具有抗细菌、抗真菌和抗病毒特性，以及抗血管生成和抗增殖活性，也可以对抗一系列癌细胞系。在研究过程中，发明人发现fascaplysin及其衍生物可以诱导非小细胞肺癌a549细胞系铁死亡，从而可以作为铁死亡诱导剂。
6.具体地，本发明采取的技术方案是：
7.本发明的第一方面是提供fascaplysin类化合物在制备铁死亡诱导剂中的应用，其中所述fascaplysin类化合物的结构式为：
8.a环含有1～4个相同的或不同的取代基r1，b环含有1～4个相同的或不同的取代基r2，所述r1、r2独立选自h、卤素、苯基、c
1～6
烷基、c
1～6
任意取代的烷基中的任意一种。
9.在本发明的一些实施方式中，所述fascaplysin类化合物为即fascaplysin。
10.在本发明的一些实施方式中，所述r1、r2不全为h。
11.在本发明的一些实施方式中，所述r1为卤素，r2为h。
12.在本发明的一些实施方式中，所述卤素为br或cl。
13.在本发明的一些实施方式中，所述fascaplysin类化合物选自
14.本发明的第二方面是提供上述fascaplysin类化合物在制备用于提高细胞中铁离子浓度药物中的应用。
15.在本发明的一些实施方式中，所述细胞包括非小细胞肺癌细胞。
16.本发明的第三方面是提供上述fascaplysin类化合物在制备抗肿瘤药物、抗炎药物、治疗神经退行性疾病的药物、治疗心血管疾病的药物或治疗糖尿病的药物中的应用；优选地，所述抗肿瘤药物包括抗非小细胞肺癌药物。
17.相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
18.本发明发现了fascaplysin类化合物可诱导铁死亡的发生，以一种新型的促进细胞死亡的方式调控非小细胞肺癌细胞的死亡，可以提高细胞中的铁离子浓度，是一种有效的铁死亡诱导剂，可用于制备开发抗肺癌药物以及其他与铁死亡相关的疾病治疗药物。
附图说明
19.图1为mar
‑
03对a549细胞的细胞毒性测定结果；
20.图2为mar
‑
03在铁死亡抑制剂作用下对a549细胞的毒性研究结果；
21.图3为不同浓度的mar
‑
03对a549细胞gpx4、slc7a11、fth1蛋白的相对表达量；
22.图4为不同浓度mar
‑
03下a549细胞内活性氧水平测试结果；
23.图5为加入mar
‑
03和铁死亡诱导剂erastin后的细胞荧光成像结果；
24.图6为不同浓度mar
‑
03下a549细胞内过氧化物水平测试结果；
25.图7为加入mar
‑
03后a549细胞的透射电镜图。
具体实施方式
26.以下结合具体的实施例进一步说明本发明的技术方案。以下实施例中所用的原料，如无特殊说明，均可从常规商业途径得到；所采用的工艺，如无特殊说明，均采用本领域的常规工艺。
27.以下以一种fascaplysin类化合物mar
‑
03为例，研究其对细胞铁死亡的诱导作用，具体包括如下步骤：
28.(1)a549细胞的培养和传代
29.在h1640培养基中加入10％(v/v)胎牛血清和1％(v/v)双抗，作为非小细胞肺癌细胞a549的完全培养液。用完全培养液重悬混匀后置于无菌的培养瓶中，放在37℃、5％co2的培养箱中培养，待细胞贴壁几乎长满培养瓶底部时进行传代。传代时，先将旧培养基吸弃，用pbs缓冲液清洗2次后，加入5ml新鲜的完全培养基，将细胞从瓶壁吹打下来，将细胞悬液按照一定比例传代至新细胞培养瓶中，放在细胞培养箱中继续培养。
30.(2)fascaplysin类化合物mar
‑
03的配制
31.mar
‑
03(结构式为)由fascaplysin与nbs(n
‑
溴代琥珀酰亚胺)在acoh(醋酸)条件下反应得到，产率一般在70％左右，合成路线为：
32.具体可参考现有技术合成。
33.将mar
‑
03用dmso溶解，配制得到浓度为20mm的母液，以备实验待用。
34.(3)细胞毒性测定
35.细胞毒性用cck8法测定。将a549细胞(5000个细胞/孔)接种在96孔板中，放在37℃、5％co2的培养箱中培养，培养24小时，分别以10μm、5μm、2.5μm、1.25μm、0.625μm、0.3125μm的mar
‑
03处理24小时，加入cck8孵育3小时，用酶标仪测定450nm波长处光密度值。用化合物mar
‑
03处理的细胞的生存力通过用graphpad pro prism 5.0分析，结果如图1所示。实验结果过表明，随着mar
‑
03浓度的增加，对a549细胞有明显的抑制作用，并呈剂量依赖性，mar
‑
03对a549细胞的ic
50
为3.9μm。
36.(4)抑制剂研究
37.将a549细胞(5000个细胞/孔)接种在96孔板中，放在37℃、5％co2的培养箱中培养
24小时，设置空白对照组，加药组1(mar
‑
03 2μm)和加药组2(mar
‑
032μm，铁死亡抑制剂fer
‑
1，5μm)三组，处理后，继续放在37℃、5％co2的培养箱中培养24小时。然后，向每个孔中加入cck8继续孵育3小时。测定450纳米处光密度值。用化合物mar
‑
03处理的细胞的生存力通过用graphpad pro prism5.0分析，结果如图2所示。
38.实验结果表明，mar
‑
03明显抑制肺癌细胞a549的活性，mar
‑
03联合铁死亡抑制剂fer
‑
1可以逆转mar
‑
03对肺癌细胞的毒性作用，表明mar
‑
03可能是以铁死亡方式诱导a549细胞死亡。
39.(5)western blot分析
40.采用western blot检测gpx4、slc7a11、fth1几个铁死亡的标志性蛋白水平，具体实验步骤为：
41.1.在12孔板中接种10万个/孔a549细胞，培养24小时，分为4组；
42.2.取3个无菌1.0ml离心管，用1640培养基作为溶剂配置0.5、1.0及2.0μm的mar
‑
03溶液，将不同浓度的mar
‑
03溶液分别加入a549细胞中，每组做三个重复，继续处理3.5h，同时设置mar
‑
03浓度为0的空白对照组；
43.3.吸去培养基，细胞皿中每孔依次加入100μl胰酶消化1min，将每组细胞收集于1.5ml ep管中，3000r/min离心5min，弃去上清，加入完全裂解液为ripa中加入消泡剂pmsf(1:100)60μl每管置于冰上裂解10min；
44.4.蛋白液按照12000r条件4℃离心10min；
45.5.收集上清，用bca蛋白定量试剂盒测定浓度；
46.6.根据不同样品的蛋白质浓度，根据蛋白丰度选择相同上样量，取等量蛋白并用不完全裂解液ripa调整至相同体积，加入5
×
loading buffer，98℃变性5min，短暂离心，置冰上待上样或
‑
80℃长期保存；
47.7.sds
‑
page电泳：配制10％的sds
‑
page胶，待胶凝结之后，安装电泳系统，所述10％的sds
‑
page胶用于检测gpx4，slc7a11、fth1等铁死亡相关蛋白；
48.8.上样进行蛋白电泳，浓缩胶80v，分离胶120v，至溴酚蓝刚好跑到分离胶底部时停止；
49.9.将玻璃板撬开。撬的时候动作要轻，要在两边轻轻的反复撬，直到撬去玻板，去除浓缩胶；
50.10.转膜：采用nc膜，300ma转膜2.5h，转膜槽加入冰袋，转膜盒放置于冰盒中；
51.11.待转膜结束，取下nc膜；
52.12.封闭：5％bsa
‑
tbst作为封闭液，室温封闭1h；
53.一抗配制：按抗体推荐稀释浓度，配制抗体于5％bsa
‑
tbst中，并加入1：1000的20％叠氮钠防止长菌；
54.13.一抗在室温摇床孵育2h或者4℃过夜，过夜的膜需在摇床上室温稳定30min，结束后回收抗体；
55.14.tbst洗3次，每次5min；
56.15.二抗孵育：用封闭液稀释相应源性的荧光二抗1:4000，室温避光摇床孵育1h；
57.16.避光，tbst洗3次，每次5min；
58.17.利用image j软件分析灰度值；统计作图。
59.western blot检测结果如图3所示。结果显示，不同浓度的mar
‑
03对a549细胞gpx4、slc7a11、fth1蛋白的相对表达量不同，不过在mar
‑
03的刺激下，a549细胞gpx4、slc7a11、fth1蛋白的表达量都明显下降，表明mar
‑
03明显诱导了铁死亡相关信号通路。
60.(6)测定mar
‑
03对a549细胞内活性氧(ros)的影响
61.1.将a549细胞接种于12孔板中，每孔接种细胞1
×
105个/ml，37℃、5％co2培养箱中孵育24h。依次加入新配的不同浓度mar
‑
03溶液(0、0.5、1.0、2.0μm)，37℃、5％co2培养箱中继续孵育3.5h。胰酶消化后，ep管收集细胞；离心1500r/min、3min，弃去上清；
62.2.按照1:1000的比例用无血清培养基稀释活性氧检测探针dcfh
‑
da，使终浓度为10μm。每管加入100μl稀释的dcfh
‑
da溶液；
63.3.将ep管放到37℃细胞培养箱中孵育20min，然后用无血清培养基洗涤细胞三次，以充分去除未进入细胞内的dcfh
‑
da探针。每管加入300μl无血清培养基，用流式细胞仪检测细胞内ros，检测结果如图4所示。
64.实验结果表明，随着mar
‑
03剂量增大，a549细胞内活性氧的含量明显上升，且呈剂量依赖性。
65.(7)铁浓度的测定
66.在6孔板中接种1
×
105个/孔a549细胞，37℃、5％co2培养箱中培养24小时。设置三个实验组，其中第一组为空白，第二组加入2μm mar
‑
03，第三组加铁死亡诱导剂erastin 10mμ，继续培养3.5h。弃去培养基，用无血清培养基洗涤3次，加入1ml配制好的含有10μm ferrorang探针的培养基孵育30min，用biotek细胞成像仪拍照，结果见图5。
67.实验结果表明，加入mar
‑
03后a549细胞中铁离子荧光强度明显比对照组强，且比加铁死亡诱导剂erastin组荧光强度强。证明mar
‑
03可以诱导a549细胞中铁离子增加。
68.(8)mar
‑
03对a549细胞内脂质过氧化物水平的影响
69.将a549细胞接种于12孔板，每孔接种细胞1
×
105个/ml，培养24h时，实验共分为4组，分别加入0μm(空白对照)、0.5μm、1.0μm、2.0μm的mar
‑
03于a549细胞中，继续培养3.5h，使用bodipy c11作为探针检测脂质过氧化物水平，然后在12孔板中每孔加入10μm bodipy c11，在37℃细胞培养箱里孵育1h，弃去培养基，用pbs清洗细胞两次以去除多余的染料，胰酶消化，重悬于pbs(含5％fbs)中，用流式细胞仪分析488nm激发波长下的细胞荧光强度，结果如图6所示。
70.实验结果表明，mar
‑
03随剂量增大对a549细胞内脂质过氧化物水平影响程度增大。当mar
‑
03浓度为1μm、2μm时脂质活性氧含量明显增加。该结果提示mar
‑
03诱导a549细胞铁死亡。
71.(9)细胞超微结构形态变化的透射电镜测量
72.在6孔板中接种a549细胞1
×
105万个/孔，37℃、5％co2培养箱中培养24小时。设置两个实验组，其中第一组为空白，第二组加入2μm mar
‑
03，继续培养3.5h。弃去培养液，加入电镜固定液固定约30分钟，倒去固定液，pbs清洗2次后，用胰蛋白酶消化30秒，并快速加入血清中止消化作用，而后带液体一起转入1.5～2ml圆底的ep管低速离心，800～1200转/分钟，离心5分钟使细胞沉淀成团，离心完后去上清，沿壁缓慢加满电镜固定液。4℃下固定过夜送检，检测结果见图7，其中c是a中框内区域的放大图，d是b中框内区域的放大图。
73.实验结果表明，用mar
‑
03处理后的a549细胞中线粒体比对照组线粒体有明显的变
化，mar
‑
03处理的细胞质内线粒体发生浓缩，内膜嵴变少甚至消失，外膜密度增加。
74.综上，fascaplysin的衍生物mar
‑
03可诱导铁死亡的发生，以一种新型的促进细胞死亡的方式调控非小细胞肺癌细胞的死亡，可以提高细胞中的铁离子浓度，是一种有效的铁死亡诱导剂，可用于制备开发抗肺癌药物。其他fascaplysin也具有类似现象，在此不再赘述。
75.上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。