包含分支接头的抗体-药物缀合物及其相关方法与流程

包含分支接头的抗体
‑
药物缀合物及其相关方法
1.本技术是申请号为201680030719.7、标题为“包含分支接头的抗体
‑
药物缀合物及其相关方法”的专利申请的分案申请，而专利申请201680030719.7是pct国际申请pct/ib2016/001811的中国国家阶段申请，其要求于2015年11月25日提交的序号为62/260,006的美国临时申请的优先权，该临时申请特此以其整体通过引用被并入。


背景技术：

2.抗体
‑
药物缀合物(antibody
‑
drug conjugate)(adc)技术是靶导向技术，其允许选择性杀死或抑制癌细胞的生长或分裂。通常，adc通过利用抗体靶向癌细胞和然后在细胞中释放毒性物质(即药物)而起作用，由此引发细胞死亡。由于adc技术允许将药物准确地递送到靶癌细胞并在特定条件下释放，同时最小化对健康细胞的附带损伤，所以adc技术增加了治疗性抗体的功效并降低了不良反应的风险。
3.抗体
‑
药物缀合物的基本结构是“抗体
‑
接头
‑
低分子药物(毒素)”。所述接头理想地允许药物对靶癌细胞展现效应，例如在与抗体分离(例如通过酶介导的水解)之后、在药物到达靶细胞之后。所述接头还通过连接所述抗体和药物起到功能性作用。所述抗体
‑
药物缀合物的功效和毒性因而部分取决于所述接头的稳定性，因此，所述接头在药物安全性中起重要作用。
4.所述抗体
‑
药物缀合物的接头可大致分为不可裂解的或可裂解的。许多不可裂解的接头利用硫醚连接到抗体上，所述硫醚包含抗体的半胱氨酸。侧缀的药物通常不能在体内与抗体分离，并且当adc内化差时还可能发生功效降低。在广泛使用的硫醇
‑
马来酰亚胺方法的情况下，抗体
‑
药物缀合物是不稳定的，这可能导致药物在它到达靶细胞之前或之后从所述缀合物上分离。
5.代替在生理学细胞外条件中稳定性有限的化学不稳定接头，例如腙和二硫化物类接头，存在对于在生理学细胞外条件下稳定的接头的需要。此外，存在对于具有高血浆稳定性以改善治疗适用性的接头的需要，因为药物应当只释放到该药物所连接的蛋白质靶向的细胞内，而不是细胞之外。
6.可裂解的接头可以，例如，通过溶酶体酶水解。可裂解的接头可以包含二硫键，例如包括抗体的半胱氨酸。允许经由硫醇交换反应离解的二硫化物接头在某种程度上依靠将抗体
‑
药缀合物摄取到靶细胞中并将所述二硫化物暴露于作为还原环境的胞质溶胶中。然而，因为血液中存在各种类型的硫醇(例如白蛋白和谷胱甘肽)，所以药物可能在到达它的靶之前与抗体分离。
7.最近，已经描述了一种制备抗体
‑
药物缀合物的新方法，其利用c
‑
端氨基酸序列的蛋白质异戊二烯化来安装改性的类异戊二烯单元，该改性的类异戊二烯单元允许药物或其它活性剂以温和的和位点特异性的方式与抗体连接(例如，参见美国专利公布no.2012/0308584)。进一步的改进是可能的。
8.鉴于上述情况，期望用于抗体
‑
药物缀合物的改进的接头。


技术实现要素：

9.在一些方面，本发明涉及抗体
‑
药物缀合物(adc)，其包含抗体、至少一个与所述抗体共价偶联的分支接头、以及至少一个或两个与所述分支接头共价偶联的活性剂。分支接头可以包含支化单元，至少一个药物通过二级接头与所述支化单元偶联；所述支化单元通过一级接头与所述抗体偶联。所述一级接头和/或二级接头可以包含至少一个聚乙二醇单元。
10.在一些实施方式中，本发明涉及配体
‑
药物缀合物，其包含配体和一个或多个与所述配体共价偶联的分支接头，其中
11.i)每个分支接头包含通过一级接头(pl)与所述配体共价偶联的支化单元(br)；
12.ii)每个分支接头包含第一分支(b1)，其中第一活性剂通过二级接头(sl)和裂解基团(cg)与所述支化单元共价偶联；并且
13.iii)每个分支接头还包含第二分支(b2)，其中a)第二活性剂通过二级接头(sl)和裂解基团(cg)与所述支化单元共价偶联，或b)聚乙二醇部分与所述支化单元共价偶联，
14.其中每个裂解基团可被水解以从所述配体
‑
药物缀合物释放所述活性剂。
15.在一些实施方式中，本发明涉及分支配体
‑
活性剂化合物，其中
16.i)所述分支接头包含通过一级接头(pl)与反应性部分共价偶联的支化单元(br)；
17.ii)所述支化单元与第一分支(b1)共价偶联，所述第一分支包含与二级接头(sl)和裂解基团(cg)共价偶联的第一活性剂；以及
18.iii)所述支化单元与第二分支(b2)共价偶联，所述第二分支包含a)与二级接头(sl)和裂解基团(cg)共价偶联的第二活性剂或b)聚乙二醇部分，
19.其中每个裂解基团可被水解以从所述配体
‑
活性剂化合物释放所述活性剂。
20.在一些实施方式中，所述裂解基团具有下式：
[0021][0022]
其中：
[0023]
g表示糖、糖酸、或改性糖，优选糖或糖酸，最优选葡糖醛酸；
[0024]
w表示
‑
c(o)
‑
、
‑
c(o)nr
’‑
、
‑
c(o)o
‑
、
‑
s(o)2nr
’‑
、
‑
p(o)r”nr
’‑
、
‑
s(o)nr
’‑
、或
‑
po2nr
’‑
，在每种情况下其中c(o)、s或p优选与苯环直接结合，并且r'和r”各自独立地是氢、(c1‑
c8)烷基、单羧基(c1‑
c8)烷基或二羧基(c1‑
c8)烷基、(c3‑
c8)环烷基、(c1‑
c8)烷氧基、(c1‑
c8)烷硫基、单(c1‑
c8)烷氨基或二(c1‑
c8)烷氨基、(c3‑
c
20
)杂芳基、或(c6‑
c
20
)芳基并且w直接或间接地与所述支化单元偶联；
[0025]
每个z独立地表示氢、(c1‑
c8)烷基、或吸电子基团(例如酰胺、羧酸、羧酸酯、卤素、氰基或硝基)，优选氢、(c1‑
c8)烷基、卤素、氰基或硝基，最优选氢；
[0026]
n是1至3的整数；
[0027]
m是0或1，优选1；并且
[0028]
r1和r2各自独立地是氢、(c1‑
c8)烷基、或(c3‑
c8)环烷基，优选氢，或者r1和r2与它们
所连接的碳原子合起来形成(c3‑
c8)环烷基环。
[0029]
在一些实施方式中，所述活性剂通过具有下式的裂解基团：
[0030][0031]
或其药学上可接受的盐与所述第一分支偶联，其中
[0032]
g表示糖、糖酸、或改性糖，优选糖或糖酸，最优选葡糖醛酸；
[0033]
b是与所述活性剂共价联接的单元，
[0034]
w表示
‑
c(o)
‑
、
‑
c(o)nr
’‑
、
‑
c(o)o
‑
、
‑
s(o)2nr
’‑
、
‑
p(o)r”nr
’‑
、
‑
s(o)nr
’‑
、或
‑
po2nr
’‑
，在每种情况下其中c(o)、s或p与苯环直接结合，并且r'和r”各自独立地是氢、(c1‑
c8)烷基、(c3‑
c8)环烷基、(c1‑
c8)烷氧基、(c1‑
c8)烷硫基、单(c1‑
c8)烷氨基或二(c1‑
c8)烷氨基、(c3‑
c
20
)杂芳基、或(c6‑
c
20
)芳基；
[0035]
每个z独立地表示氢、(c1‑
c8)烷基、或吸电子基团(例如酰胺、羧酸、羧酸酯、卤素、氰基或硝基)，优选氢、(c1‑
c8)烷基、卤素、氰基或硝基，最优选氢；
[0036]
n是1至3的整数，优选3；
[0037]
l表示与接头或支化单元的连键；
[0038]
r1和r2各自独立地是氢、(c1‑
c8)烷基、或(c3‑
c8)环烷基，优选氢，或者r1和r2与它们所连接的碳原子合起来形成(c3‑
c8)环烷基环。
[0039]
在一些实施方式中，所述糖或糖酸是单糖。在一些实施方式中，所述糖包含：
[0040]
g是
[0041]
r3是氢或羧基保护基团；并且
[0042]
每个r4独立地是氢或羟基保护基团。
[0043]
在一些实施方式中，所述一级接头或二级接头具有
‑
(ch2)
r
(v(ch2)
p
)
q
‑
、
‑
((ch2)
p
v)
q
‑
、
‑
(ch2)
r
(v(ch2)
p
)
q
y
‑
、
‑
((ch2)
p
v)
q
(ch2)
r
‑
、
‑
y(((ch2)
p
v)
q
‑
或
‑
(ch2)
r
(v(ch2)
p
)
q
ych2‑
的结构
[0044]
其中：
[0045]
r是0至10的整数；
[0046]
p是1至10的整数；
[0047]
q是1至20的整数；
[0048]
v和y各自独立地是单键、
‑
o
‑
、
‑
s
‑
、
‑
nr
21
‑
、
‑
c(o)nr
22
‑
、
‑
nr
23
c(o)
‑
、
‑
nr
24
so2‑
、或
‑
so2nr
25
‑
；并且
[0049]
r
21
至r
25
各自独立地是氢、(c1‑
c6)烷基、(c1‑
c6)烷基(c6‑
c
20
)芳基或(c1‑
c6)烷基(c3‑
c
20
)杂芳基。
[0050]
在一些实施方式中，所述至少一个支化单元具有以下结构
[0051][0052]
其中l1、l2、l3各自独立地是直接键或
–
c
n
h
2n
‑
，其中n是1至30的整数，
[0053]
其中g1、g2、g3各自独立地是直接键、各自独立地是直接键、
[0054]
其中r3是氢或c1‑
c
30
烷基；
[0055]
其中r4是氢或
–
l4‑
coor5，其中l4是直接键或
‑
c
n
h
2n
‑
，其中n是1至10的整数，并且r5是氢或c1‑
c
30
烷基。
[0056]
二级接头(例如，将活性剂与分支单元连接)可以包含通过1,3
‑
偶极环加成反应、杂diels
‑
alder反应、亲核取代反应、非醛醇缩合型羰基反应、与碳
‑
碳重键加成、氧化反应或点击反应形成的结合单元。结合单元可通过乙炔与叠氮化物之间的反应、或非醛醇缩合型羰基反应例如醛或酮基团与肼或烷氧基胺之间的反应形成，所述反应允许活性剂和/或裂解基团与所述支化单元轻度偶联。这样的结合单元可以由式(a)、(b)、(c)或(d)表示。
[0057][0058]
l1是单键或具有1
‑
30个碳原子、优选10、11、12、13、14、15或16个碳原子的亚烷基；
[0059]
r
11
是氢或具有1至10个碳原子的烷基，优选甲基；并且
[0060]
l2是具有1
‑
30个碳原子、优选10、11、12、13、14、15或16个碳原子的亚烷基。
[0061]
在一些实施方式中，如上所述的配体
‑
药物缀合物包含配体、接头和活性剂，并具有下式：
[0062][0063]
其中：
[0064]
g表示糖、糖酸或改性糖；
[0065]
a表示所述配体；
[0066]
b表示所述活性剂；
[0067]
w表示
‑
c(o)
‑
、
‑
c(o)nr
’‑
、
‑
c(o)o
‑
、
‑
s(o)2nr
’‑
、
‑
p(o)r”nr
’‑
、
‑
s(o)nr
’‑
、或
‑
po2nr
’‑
，在每种情况下其中c(o)、s或p与苯环直接结合，并且r'和r”各自独立地是氢、(c1‑
c8)烷基、(c3‑
c8)环烷基、(c1‑
c8)烷氧基、(c1‑
c8)烷硫基、单(c1‑
c8)烷氨基或二(c1‑
c8)烷氨基、(c3‑
c
20
)杂芳基、或(c6‑
c
20
)芳基；
[0068]
每个z独立地表示氢、(c1‑
c8)烷基、或吸电子基团(例如酰胺、羧酸、羧酸酯、卤素、氰基或硝基)，优选氢、(c1‑
c8)烷基、卤素、氰基或硝基，最优选氢；
[0069]
n是1至3的整数，优选3；
[0070]
m是0或1，优选1；
[0071]
l是包含至少一个支化单元(br)和至少一个一级接头(pl)的接头；
[0072]
r1和r2各自独立地是氢、(c1‑
c8)烷基、或(c3‑
c8)环烷基，优选氢，或者r1和r2与它们所连接的碳原子合起来形成(c3‑
c8)环烷基环。
[0073]
在本文中公开的任何实施方式中，所述配体优选是抗体。
[0074]
在一些实施方式中，本发明涉及抗体
‑
药物缀合物，其包含抗体；至少一个与所述抗体共价偶联的分支接头；以及至少两个与所述分支接头共价偶联的活性剂。优选地，至少两个分支接头与所述抗体偶联，并且每个分支接头与至少两个活性剂偶联。三个或甚至四个这样的分支接头可以与所述抗体偶联。在一些实施方式中，正好一个分支接头与所述抗体偶联。在某些实施方式中，每个分支接头与正好两个活性剂偶联。在一些实施方式中，所述抗体
‑
药物缀合物的所有活性剂是相同的。在其他实施方式中，所述抗体
‑
药物缀合物包含至少两个不同的活性剂。在一些这样的实施方式中，至少一个分支接头与两个不同的活性剂偶联。
[0075]
在一些实施方式中，每个活性剂通过可裂解的(例如可水解的)键，例如经由自牺牲(self
‑
immolative)基团，例如下文更详细描述的裂解基团，与分支接头偶联。
[0076]
在优选的实施方式中，每个分支接头包含支化单元，并且每个活性剂通过二级接头与所述支化单元偶联，而所述支化单元通过一级接头与所述抗体偶联。例如，所述支化单元可以包含氮原子，例如胺或酰胺的氮原子。在所述支化单元是酰胺的实施方式中，所述一级接头可以包含所述酰胺的羰基，或者二级接头可以包含所述酰胺的羰基。在某些优选实施方式中，所述支化单元是胺。在其他优选实施方式中，所述支化单元是赖氨酸单元，例如，使得一个二级接头从α
‑
氮延伸以及另一个二级接头从骨架氮延伸。
[0077]
在一些实施方式中，一个或多个或甚至每个活性剂通过具有下式的裂解基团与所
述分支接头偶联：
[0078][0079]
其中：
[0080]
g表示糖或糖酸，优选葡糖醛酸；
[0081]
b表示所述活性剂；
[0082]
w表示吸电子基团，优选
‑
c(o)nr
’‑
，其中c(o)与苯环键合并且nr'(其可以是氨基酸、优选亲水性氨基酸的氨基)与l键合；
[0083]
每个z独立地表示氢、(c1‑
c8)烷基、或吸电子基团(例如酰胺、羧酸、羧酸酯、卤素、氰基或硝基)，优选氢、(c1‑
c8)烷基、卤素、氰基或硝基，最优选氢；n是1至3的整数；
[0084]
l表示与所述抗体的连键；
[0085]
r1和r2各自独立地是氢、(c1‑
c8)烷基、或(c3‑
c8)环烷基，优选氢，或者r1和r2与它们所连接的碳原子合起来形成(c3‑
c8)环烷基环。
[0086]
可替选的裂解基团包括缬氨酸
‑
瓜氨酸
‑
对氨基苄基氨基甲酸酯(vc
‑
pabc)。
[0087]
在一些实施方式中，w是
‑
c(o)
‑
、
‑
c(o)nr
’‑
、
‑
c(o)o
‑
、
‑
s(o)2nr
’‑
、
‑
p(o)r”nr
’‑
、
‑
s(o)nr
’‑
、或
‑
po2nr
’‑
，在每种情况下其中c(o)、s或p与苯环直接结合，并且r'和r”各自独立地是氢、(c1‑
c8)烷基、(c3‑
c8)环烷基、(c1‑
c8)烷氧基、(c1‑
c8)烷硫基、单(c1‑
c8)烷氨基或二(c1‑
c8)烷氨基、(c3‑
c
20
)杂芳基、或(c6‑
c
20
)芳基。在某些优选实施方式中，w表示
‑
c(o)nr’，并且w的氮是氨基酸、优选亲水性氨基酸的氮。在一些实施方式中，w是
‑
c(o)nr
’‑
，其中
‑
c(o)与苯环键合并且nr'与l键合。
[0088]
在一些实施方式中，所述糖或糖酸是单糖。在一些实施方式中，所述糖包含：
[0089]
g是
[0090]
r3是氢或羧基保护基团；并且
[0091]
每个r4独立地是氢或羟基保护基团。
[0092]
在一些这样的实施方式中，r3是氢并且每个r4是氢。
[0093]
在一些实施方式中，每个z表示氢并且n是3。
[0094]
在某些优选实施方式中：
[0095]
g是葡糖醛酸；
[0096]
w是
‑
c(o)nr
’‑
，其中c(o)与苯环键合并且nr'与l键合；
[0097]
z表示氢；
[0098]
n是3；并且
[0099]
r1和r2各自表示氢。
[0100]
在本发明的一些实施方式中，所述抗体
‑
药物缀合物的一级接头包含具有1至100、优选1至50个碳原子的亚烷基，并且或是：
[0101]
所述亚烷基包括至少一个不饱和键；
[0102]
所述亚烷基包括至少一个杂亚芳基；
[0103]
所述亚烷基的碳原子被一个或多个选自氮(n)、氧(o)和硫(s)的杂原子替换；或是
[0104]
所述亚烷基进一步被一个或多个具有1至20个碳原子的烷基取代。
[0105]
在一些这样的实施方式中，所述亚烷基的所述至少一个碳原子被氮替换，所述一级接头包含至少两个亲水性氨基酸的原子，并且所述氮与所述亲水性氨基酸的骨架羰基形成肽键。所述亲水性氨基酸可以是，例如，精氨酸、天冬氨酸酯、天冬酰胺、谷氨酸酯、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、脯氨酸、丝氨酸或苏氨酸。
[0106]
在一些实施方式中，所述抗体
‑
药物缀合物的分支接头包含具有侧链的氨基酸，所述侧链具有在中性ph下的水溶液中带电荷的部分，所述氨基酸优选精氨酸、天冬氨酸酯、谷氨酸酯、赖氨酸或鸟氨酸。该氨基酸可以存在于所述分支接头中的任何地方。例如，它可以将所述分支接头的肟与所述分支接头的聚乙二醇单元共价联接。可替选地或附加地，这样的氨基酸可以存在于二级接头中，可选地在每个二级接头中。
[0107]
在某些优选实施方式中，所述抗体
‑
药物缀合物的分支接头通过硫醚键与所述抗体共价结合，并且所述硫醚键包含所述抗体的半胱氨酸的硫原子，最优选c
‑
端半胱氨酸，其可以是被类异戊二烯转移酶识别的氨基酸基序的一部分。
[0108]
例如，所述氨基酸基序可以是选自cxx、cxc、xcxc、xxcc和cyyx的序列；
[0109]
c表示半胱氨酸；
[0110]
y在每次出现时独立地表示脂族氨基酸；
[0111]
x在每次出现时独立地表示谷氨酰胺、谷氨酸酯、丝氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸或亮氨酸；并且
[0112]
所述硫醚键包含所述氨基酸基序的半胱氨酸的硫原子。
[0113]
在一些实施方式中，所述氨基酸基序是：
[0114]
序列cyyx；并且
[0115]
y在每次出现时独立地表示丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸或缬氨酸。
[0116]
在某些优选实施方式中，所述氨基酸基序是序列cvim或cvll。
[0117]
在一些实施方式中，所述氨基酸基序前面的七个氨基酸中的至少一个是甘氨酸。在一些实施方式中，所述氨基酸基序前面的七个氨基酸中的至少三个各自独立地选自甘氨酸和脯氨酸。在一些实施方式中，紧接在所述氨基酸基序前面的一至十个氨基酸是甘氨酸。在某些优选实施方式中，紧接在所述氨基酸基序前面的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个氨基酸是甘氨酸，最优选至少五个是甘氨酸。在某些优选实施方式中，所述氨基酸基序前面的所述一、二、三、四、五、六、七、八、九或十个氨基酸中的每一个都是甘氨酸。在一些实施方式中，所述抗体的c
‑
端包含氨基酸序列gggggggcvim。
[0118]
在一些实施方式中，上述硫醚键包含至少一个由表示的异戊二烯基
单元的碳原子。在优选实施方式中，n是1或2，最优选2。
[0119]
在本发明的一些实施方式中，所述分支接头包含肟，并且所述至少一个异戊二烯基单元将所述肟与所述抗体共价联接。在一些实施方式中，所述分支接头包含：
[0120][0121]
在一些实施方式中，所述接头可以包含在一些实施方式中，所述接头可以包含
[0122]
在本发明的一些实施方式中，所述一级接头和/或二级接头(优选每个二级接头)包含至少一个由表示的聚乙二醇单元。所述聚乙二醇单元可以包含1至19个
‑
och2ch2‑
单元，优选4至20个
‑
och2ch2‑
单元。在一些优选实施方式中，所述接头可以包含1至20个
‑
och2ch2‑
单元。在某些优选实施方式中，所述接头可以包含1至12个
‑
och2ch2‑
单元。在其它优选实施方式中，所述接头可以包含3至12个
‑
och2ch2‑
单元。在一些实施方式中，所述接头包含肟，并且所述至少一个聚乙二醇单元将所述肟与所述肽共价联接。
[0123]
在本发明的一些实施方式中，所述一级接头、所述二级接头(优选每个二级接头)或二者包含由
‑
(ch2)
r
(v(ch2)
p
)
q
‑
表示的连接单元，其中：
[0124]
r是1至10的整数，优选2；
[0125]
p是0至12的整数，优选2；
[0126]
q是1至20的整数；
[0127]
v是单键、
‑
o
‑
、
‑
s
‑
、
‑
nr
21
‑
、
‑
c(o)nr
22
‑
、
‑
nr
23
c(o)
‑
、
‑
nr
24
so2‑
、或
‑
so2nr
25
‑
，优选
‑
o
‑
；并且
[0128]
r
21
至r
25
各自独立地是氢、(c1‑
c6)烷基、(c1‑
c6)烷基(c6‑
c
20
)芳基、或(c1‑
c6)烷基(c3‑
c
20
)杂芳基。
[0129]
在一些实施方式中，所述一级接头、所述二级接头(优选每个二级接头)或二者包含由
‑
(ch2)
r
(v(ch2)
p
)
q
‑
、
‑
((ch2)
p
v)
q
‑
、
‑
(ch2)
r
(v(ch2)
p
)
q
y
‑
、
‑
((ch2)
p
v)
q
(ch2)
r
‑
、
‑
y(((ch2)
p
v)
q
‑
或
‑
(ch2)
r
(v(ch2)
p
)
q
ych2‑
表示的连接单元
[0130]
其中：
[0131]
r是0至10的整数；
[0132]
p是1至10的整数；
[0133]
q是1至20的整数；
[0134]
v和y各自独立地是单键、
‑
o
‑
、
‑
s
‑
、
‑
nr
21
‑
、
‑
c(o)nr
22
‑
、
‑
nr
23
c(o)
‑
、
‑
nr
24
so2‑
、或
‑
so2nr
25
‑
；并且
[0135]
r
21
至r
25
各自独立地是氢、(c1‑
c6)烷基、(c1‑
c6)烷基(c6‑
c
20
)芳基、或(c1‑
c6)烷基(c3‑
c
20
)杂芳基。
[0136]
在这些接头的一些实施方式中，q是4至20的整数。在这些接头的一些实施方式中，q是6至20的整数。在某些优选实施方式中，q是1至10的整数。在其它优选实施方式中，q是2、5或11。
[0137]
在这些接头的一些实施方式中，r优选是2。在这些接头的一些实施方式中，p优选是2。在一些实施方式中，v和y各自独立地是
‑
o
‑
。
[0138]
在这些接头的一些实施方式中：
[0139]
r是2；
[0140]
p是2；
[0141]
q是2、5或11，并且
[0142]
v是
‑
o
‑
。
[0143]
在本发明的一些实施方式中，所述一级接头、所述二级接头(优选每个二级接头)或二者包含由
‑
(ch2ch2x)
w
‑
表示的连接单元，其中：
[0144]
x表示
‑
o
‑
、(c1‑
c8)亚烷基或
‑
nr
21
‑
，优选
‑
o
‑
；
[0145]
r
21
表示氢、(c1‑
c6)烷基、(c1‑
c6)烷基(c6‑
c
20
)芳基、或(c1‑
c6)烷基(c3‑
c
20
)杂芳基，优选氢；并且
[0146]
w是1至12的整数，优选1、3、6或12。
[0147]
在一些实施方式中x是
‑
o
‑
并且w是6至12的整数。
[0148]
在本发明的一些实施方式中，所述一级接头包含通过1,3
‑
偶极环加成反应、杂diels
‑
alder反应、亲核取代反应、非醛醇缩合型羰基反应、与碳
‑
碳重键加成、氧化反应或点击反应形成的结合单元。在一些实施方式中，所述结合单元通过乙炔与叠氮化物之间的反应、或醛或酮基团与肼或烷氧基胺之间的反应形成。在一些实施方式中，所述结合单元由式a、b、c或d的任何一个表示，优选由d表示：
[0149][0150]
其中：
[0151]
l1是单键或具有1
‑
30个碳原子、优选12个碳原子的亚烷基；
[0152]
r
11
是氢或具有1至10个碳原子的烷基，优选甲基；并且
[0153]
l2是具有1
‑
30个碳原子、优选11个碳原子的亚烷基。
[0154]
在一些实施方式中，所述一级接头包含
[0155][0156]
v是单键、
‑
o
‑
、
‑
s
‑
、
‑
nr
21
‑
、
‑
c(o)nr
22
‑
、
‑
nr
23
c(o)
‑
、
‑
nr
24
so2‑
、或
‑
so2nr
25
‑
，优选
‑
o
‑
；
[0157]
r
21
至r
25
各自独立地是氢、(c1‑
c6)烷基、(c1‑
c6)烷基(c6‑
c
20
)芳基、或(c1‑
c6)烷基(c3‑
c
20
)杂芳基；
[0158]
r是1至10的整数，优选2或3；
[0159]
p是0至10的整数，优选1或2；
[0160]
q是1至20的整数，优选1至6；并且
[0161]
l1是单键。
[0162]
在本发明的一些实施方式中，所述分支接头包含o
‑
取代的肟；其中
[0163]
a)所述肟的氧原子被例如经由所述支化单元将所述肟与所述活性剂共价联接的基团取代；并且
[0164]
所述肟的碳原子被将所述肟与所述抗体共价联接的基团取代；或者
[0165]
b)所述肟的氧原子被将所述肟与所述抗体共价联接的基团取代；并且
[0166]
所述肟的碳原子被例如经由所述支化单元将所述肟与所述活性剂共价联接的基团取代。
[0167]
在一些实施方式中，所述抗体
‑
药物缀合物包含式ii的结构：
[0168][0169]
其中：
[0170]
b和b'表示活性剂，其可以相同或不同；
[0171]
n在每次出现时独立地表示0至30的整数；
[0172]
f在每次出现时独立地表示0至30的整数；并且
[0173]
l表示与所述抗体的连键。
[0174]
在一些实施方式中，n是1至10的整数。在一些实施方式中，n是4至20的整数。在一些实施方式中，f是1至10的整数。在一些实施方式中，f是4至20的整数。优选选择n和f，使得n+f小于20，例如小于15。在一些实施方式中，所述接头包含肟，并且所述至少一个聚乙二醇单元将所述肟与所述活性剂共价联接。
[0175]
在本发明的一些实施方式中，所述抗体是单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段、fab、fab'、fab'
‑
sh、f(ab')2、fv、单链fv(“scfv”)、双抗体、线性抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、或包含抗体的抗原结合部分的融合蛋白。
[0176]
在本发明的一些实施方式中，所述抗体选自莫罗单抗
‑
cd3、阿昔单抗、利妥昔单
抗、达利珠单抗、帕利珠单抗、英夫利昔单抗、曲妥珠单抗、依那西普、巴利昔单抗、吉妥珠单抗、阿仑单抗、替伊莫单抗、阿达木单抗、阿法赛特、奥马珠单抗、依法利珠单抗、托西莫单抗、西妥昔单抗、abt
‑
806、贝伐单抗、那他珠单抗、雷珠单抗、帕尼单抗、依库丽单抗、利纳西普、赛妥珠单抗、罗米司亭、amg
‑
531、戈利木单抗、优特克单抗、abt
‑
874、贝拉西普、贝利木单抗、阿塞西普、抗cd20抗体、卡纳单抗、托珠单抗、阿特珠单抗(atlizumab)、美泊利单抗、帕妥珠单抗、humax cd20、曲美木单抗、替西木单抗、伊匹单抗、idec
‑
114、英妥珠单抗、humax egfr、、阿柏西普、humax
‑
cd4、特普利珠单抗(teplizumab)、奥特西珠单抗、卡妥索单抗、抗epcam抗体ign101、阿德木单抗、奥戈伏单抗、地妥西单抗、吉瑞妥昔单抗、地诺单抗、巴匹珠单抗、莫维珠单抗、依福谷单抗(efumgumab)、瑞西巴库、ly2469298和维妥珠单抗。
[0177]
在本发明的一些实施方式中，所述活性剂独立地选自化疗剂和毒素。
[0178]
在本发明的一些实施方式中，所述活性剂独立地选自：
[0179]
(a)厄洛替尼、硼替佐米、氟维司群、索坦、来曲唑、甲磺酸伊马替尼、ptk787/zk222584、奥沙利铂、5
‑
氟尿嘧啶、亚叶酸、雷帕霉素、拉帕替尼、洛那法尼、索拉非尼、吉非替尼、ag1478、ag1571、噻替派、环磷酰胺、白消安、英丙舒凡、哌泊舒凡、苯并多巴、卡巴醌、美妥替哌、乌瑞替派、乙烯亚胺、六甲蜜胺、三乙烯三聚氰胺、三乙烯磷酰胺、三乙烯硫代磷酰胺、三羟甲基三聚氰胺、泡番荔枝辛、泡番荔枝辛酮、喜树碱、喜树碱衍生物和代谢产物(sn
‑
38)、拓扑替康、苔藓抑素、卡利斯汀(callystatin)、cc
‑
1065、阿多来新、卡折来新、比折来新、念珠藻素1、念珠藻素8、多拉司他汀(dolastatin)、多卡米星、kw
‑
2189、cb1
‑
tm1、五加素、水鬼蕉碱、匍枝珊瑚醇、海绵抑制素、苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺、美法仑、新恩比兴、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥、卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀、卡里奇霉素、卡里奇霉素γ1、卡里奇霉素ω1、达内霉素(dynemicin)、达内霉素a、氯膦酸盐、埃斯培拉霉素(esperamicin)、新制癌菌素发色团、阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素c、卡比柔星、洋红霉素(carninomycin)、嗜癌素、色霉素、更生霉素、柔红霉素、地托比星(detorubucin)、6
‑
重氮
‑5‑
氧代
‑
l
‑
正亮氨酸、阿霉素、吗啉代阿霉素、氰基吗啉代阿霉素、2
‑
吡咯啉代
‑
阿霉素、脂质体阿霉素、脱氧阿霉素、表柔比星、依索比星、麻西罗霉素、丝裂霉素c、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、派来霉素、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链霉黑素(streptomigrin)、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他汀、佐柔比星、5
‑
氟尿嘧啶、二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙、氟达拉滨、6
‑
巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤、安西他滨、阿扎胞苷、6
‑
氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、卡鲁睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯、氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦、亚叶酸、醋葡醛内酯、醛磷酰胺糖苷、氨基乙酰丙酸、恩尿嘧啶、安吖啶、巴斯布西(bestrabucil)、比生群、依达曲沙、地磷酰胺、秋水仙胺、地吖醌、依氟鸟氨酸(elfornithine)、依利醋铵、依托格鲁(etoglucid)、硝酸镓、羟基脲、香菇多糖、氯尼达明、美登素、安丝菌素、米托胍腙、米托蒽醌、莫哌达醇、二胺硝吖啶、喷司他丁、蛋氨氮芥(phenamet)、吡柔比星、洛索蒽醌、2
‑
乙基酰肼、甲基苄肼、多糖
‑
k、雷佐生、根霉素、西佐糖、锗螺胺、细交链孢菌酮酸、三亚胺醌、2,2',2
”‑
三氯三乙胺、t
‑
2毒素、抚抱菌素a、杆孢菌素a、以及蛇形菌素(anguidine)、乌拉坦、长春地辛、达卡巴嗪、甘露醇氮芥、二溴甘露醇、二溴卫矛醇、哌泊溴烷、干胞嘧啶(gacytosine)、阿拉伯糖苷、环磷酰胺、噻替派、紫杉醇、紫杉醇
的白蛋白工程纳米粒子制剂、多烯紫杉醇、苯丁酸氮芥、吉西他滨、6
‑
硫鸟嘌呤、巯基嘌呤、顺铂、卡铂、长春花碱、铂、依托泊苷、异环磷酰胺、米托蒽醌、长春新碱、长春瑞滨、米托蒽醌、替尼泊苷、依达曲沙、道诺霉素、氨基喋呤、希罗达、伊班膦酸盐、cpt
‑
11、拓扑异构酶抑制剂rfs 2000、二氟甲基鸟氨酸、视黄酸、卡培他滨，或前述任一种的药学上可接受的盐、溶剂化物或酸；
[0180]
(b)单核因子、淋巴因子、传统多肽激素、甲状旁腺激素、甲状腺素、松弛素、松弛素原、糖蛋白激素、促卵泡激素、促甲状腺激素、黄体生成素、肝生长因子、成纤维细胞生长因子、催乳素、胎盘催乳素、肿瘤坏死因子
‑
α、肿瘤坏死因子
‑
β、缪勒抑制物质、小鼠促性腺激素相关肽、抑制素、激活素、血管内皮生长因子、血小板生成素、红细胞生成素、骨诱导因子、干扰素、干扰素
‑
α、干扰素
‑
β、干扰素
‑
γ、集落刺激因子(“csf“)、巨噬细胞
‑
csf、粒细胞
‑
巨噬细胞
‑
csf、粒细胞
‑
csf、白介素(il)、il
‑
1、il
‑
1α、il
‑
2、il
‑
3、il
‑
4、il
‑
5、il
‑
6、il
‑
7、il
‑
8、il
‑
9、il
‑
10、il
‑
11、il
‑
12、肿瘤坏死因子、tnf
‑
α、tnf
‑
β、多肽因子、lif、kit配体，或任何前述的组合；
[0181]
(c)白喉毒素、肉毒毒素、破伤风毒素、痢疾毒素、霍乱毒素、鹅膏蕈碱、鹅膏蕈碱衍生物、α
‑
鹅膏蕈碱、吡咯并苯并二氮杂卓、吡咯并苯并二氮杂卓衍生物、河豚毒素、短裸甲藻毒素、雪卡毒素、篦麻毒素、am毒素、微管蛋白裂解素(tubulysin)、格尔德霉素、美登素类化合物、卡里奇霉素、柔红霉素、阿霉素、甲氨蝶呤、长春地辛、sg2285、多拉司他汀、多拉司他汀类似物、奥瑞他汀(auristatin)、念珠藻素、喜树碱、喜树碱衍生物和代谢物(sn
‑
38)、根霉素、根霉素衍生物、cc
‑
1065、cc
‑
1065类似物或衍生物、倍癌霉素、烯二炔抗生素、埃斯培拉霉素(esperamicin)、埃博霉素、阿咗那非得(azonafide)、阿普立定(aplidine)、类毒素，或任何前述的组合；
[0182]
(d)亲和配体，其中所述亲和配体是底物、抑制剂、刺激剂、神经递质、放射性同位素，或任何前述的组合；
[0183]
(e)放射性标记物、
32
p、
35
s、荧光染料、电子致密试剂、酶、生物素、链霉亲和素、洋地黄毒苷(dioxigenin)、半抗原、免疫原性蛋白质、具有与靶标互补的序列的核酸分子，或任何前述的组合；
[0184]
(f)免疫调节化合物、抗癌剂、抗病毒剂、抗菌剂、抗真菌剂和抗寄生虫剂，或任何前述的组合；
[0185]
(g)他莫昔芬、雷洛昔芬、屈洛昔芬、4
‑
羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、那洛昔芬、ly117018、奥那司酮或托瑞米芬；
[0186]
(h)4(5)
‑
咪唑、氨鲁米特、醋酸甲地孕酮、依西美坦、来曲唑或阿那曲唑；
[0187]
(i)氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林、戈舍瑞林或曲沙他滨；
[0188]
(j)芳香酶抑制剂；
[0189]
(k)蛋白激酶抑制剂；
[0190]
(l)脂质激酶抑制剂；
[0191]
(m)反义寡核苷酸；
[0192]
(n)核酶；
[0193]
(o)疫苗；和
[0194]
(p)抗血管生成剂。
[0195]
在本发明的一些实施方式中，所述活性剂是鹅膏蕈碱、奥瑞他汀、卡里奇霉素、喜树碱、喜树碱衍生物和代谢物(sn
‑
38)、念珠藻素、柔红霉素、多拉司他汀、阿霉素、倍癌霉素、埃博霉素、埃斯培拉霉素、格尔德霉素、美登素类化合物、甲氨蝶呤、单甲基奥瑞他汀e(“mmae”)、单甲基奥瑞他汀f(“mmaf”)、吡咯并苯并二氮杂卓、根霉素、sg2285、微管蛋白裂解素、长春地辛、类毒素、或前述任一种的衍生物。在一些实施方式中，所述活性剂是鹅膏蕈碱、mmae或mmaf，或前述任一种的衍生物。
[0196]
在本发明的一些实施方式中，所述活性剂是：
[0197]
[0198]
[0199]
[0200][0201]
其中y是1至10的整数。
[0202]
相关抗体
‑
药物缀合物的结构和组分公开于pct/kr2015/005299中，其特此通过引用以其整体被并入，特别是对于在其中公开的抗体
‑
药物缀合物的化学式和通用结构、它们的组成部分(例如接头、裂解基团等)、及其它们的制备和使用。在某些优选实施方式中，本发明的各种缀合物和其他方面与pct/kr2015/005299中公开的各种结构和方法具体不同。
[0203]
在一些实施方式中，本发明提供了包含如本文所述的抗体
‑
药物缀合物的药物组合物。药物组合物还可以包含治疗有效量的化疗剂。在一些实施方式中，本发明提供了治疗对象中的癌症的方法，所述方法包括将药物的药物组合物给药于所述对象。在一些实施方
式中，所述对象是哺乳动物，例如选自啮齿类动物、兔类动物、猫科动物、犬科动物、猪科动物、羊科动物、牛科动物、马科动物和灵长类动物。在一些实施方式中，所述对象优选是人类。
[0204]
在一些实施方式中，本发明提供了制备如本文所述的抗体
‑
药物缀合物的方法，所述方法包括使生物分子与前药反应，其中：
[0205]
所述生物分子包含抗体和酮或醛；
[0206]
所述前药包含烷氧基胺；并且
[0207]
所述反应产生肟，从而将所述抗体与所述前药共价联接。
[0208]
在一些实施方式中，所述方法还包含使所述抗体异戊二烯化，从而产生所述生物分子，其中：
[0209]
所述抗体包含异戊二烯化序列；
[0210]
异戊二烯化所述抗体包括将所述抗体与类异戊二烯转移酶和类异戊二烯转移酶底物一起温育；并且
[0211]
所述底物包含所述酮或醛。
[0212]
在一些实施方式中，所述类异戊二烯转移酶是法尼基转移酶或香叶基香叶基转移酶。
[0213]
在一些实施方式中，本发明提供了制造如本文所述的抗体
‑
药物缀合物的方法，所述方法包含使配体异戊二烯化，其中所述配体包含被类异戊二烯转移酶识别的氨基酸基序；所述使配体异戊二烯化包含将所述配体与类异戊二烯转移酶和类异戊二烯转移酶底物一起温育；并且所述底物包含所述活性剂。
[0214]
在一些实施方式中，本发明提供了制造如本文所述的配体
‑
药物缀合物的方法，所述方法包含使配体异戊二烯化，其中所述配体包含被类异戊二烯转移酶识别的氨基酸基序；所述使配体异戊二烯化包含将所述配体与类异戊二烯转移酶和类异戊二烯转移酶底物一起温育；并且所述底物包含所述活性剂。
[0215]
在其它实施方式中，本发明涉及抗体
‑
药物缀合物，其包含抗体；至少一个与所述抗体共价偶联的分支接头，所述分支接头包含通过一级接头与所述抗体共价偶联的支化单元；通过第一分支与所述支化单元共价偶联的活性剂；以及包含与所述支化单元共价偶联的聚乙二醇部分的第二分支。优选地，至少两个分支接头与所述抗体偶联，并且每个分支接头与正好一个活性剂偶联。三个或甚至四个这样的分支接头可以与所述抗体偶联。在一些这样的实施方式中，至少两个不同的活性剂与不同的分支接头偶联。在一些实施方式中，只有一个分支接头与所述抗体偶联。在某些优选实施方式中，每个分支接头与正好一个活性剂偶联。
[0216]
在一些实施方式中，所述活性剂通过可裂解的(例如可水解的)键，例如经由自牺牲基团，例如下文更详细描述的裂解基团，与所述第一分支偶联。
[0217]
在一些实施方式中，所述支化单元可以包含氮原子，例如胺或酰胺的氮原子。在某些优选实施方式中，所述支化单元是胺。在所述支化单元是酰胺的实施方式中，所述一级接头可以包含酰胺的羰基。在一些实施方式中，其中所述支化单元是酰胺并且所述第一分支或第二分支可以包含酰胺的羰基。在其它优选实施方式中，所述支化单元是赖氨酸单元。
[0218]
在一些实施方式中，一个或多个或甚至每个活性剂通过具有下式的裂解基团与第
一分支偶联：
[0219][0220]
其中：
[0221]
g表示糖或糖酸，优选葡糖醛酸；
[0222]
b表示所述活性剂；
[0223]
w表示吸电子基团，优选
‑
c(o)nr
’‑
，其中c(o)与苯环键合并且nr'(其可以是氨基酸、优选亲水性氨基酸的氨基)与l键合；
[0224]
每个z独立地表示氢、(c1‑
c8)烷基、或吸电子基团(例如酰胺、羧酸、羧酸酯、卤素、氰基或硝基)，优选氢、(c1‑
c8)烷基、卤素、氰基或硝基，最优选氢；
[0225]
n是1至3的整数；
[0226]
l表示与所述抗体的连键；
[0227]
r1和r2各自独立地是氢、(c1‑
c8)烷基、或(c3‑
c8)环烷基，优选氢，或者r1和r2与它们所连接的碳原子合起来形成(c3‑
c8)环烷基环。
[0228]
在一些实施方式中，活性剂通过具有下式的裂解基团与所述第一分支偶联：
[0229][0230]
其中：
[0231]
g表示糖、糖酸、或改性糖，优选糖或糖酸，最优选葡糖醛酸；
[0232]
w表示
‑
c(o)
‑
、
‑
c(o)nr
’‑
、
‑
c(o)o
‑
、
‑
s(o)2nr
’‑
、
‑
p(o)r”nr
’‑
、
‑
s(o)nr
’‑
、或
‑
po2nr
’‑
，在每种情况下其中c(o)、s或p优选与苯环直接结合，并且r'和r”各自独立地是氢、(c1‑
c8)烷基、单羧基(c1‑
c8)烷基或二羧基(c1‑
c8)烷基、(c3‑
c8)环烷基、(c1‑
c8)烷氧基、(c1‑
c8)烷硫基、单(c1‑
c8)烷氨基或二(c1‑
c8)烷氨基、(c3‑
c
20
)杂芳基、或(c6‑
c
20
)芳基并且w直接或间接地与所述支化单元偶联；
[0233]
每个z独立地表示氢、(c1‑
c8)烷基、或吸电子基团(例如酰胺、羧酸、羧酸酯、卤素、氰基或硝基)，优选氢、(c1‑
c8)烷基、卤素、氰基或硝基，最优选氢；
[0234]
n是1至3的整数；
[0235]
m是0或1，优选1；并且
[0236]
r1和r2各自独立地是氢、(c1‑
c8)烷基、或(c3‑
c8)环烷基，优选氢，或者r1和r2与它们所连接的碳原子合起来形成(c3‑
c8)环烷基环。
[0237]
在一些实施方式中，所述活性剂通过具有下式的裂解基团：
[0238][0239]
或其药学上可接受的盐与所述第一分支偶联，其中
[0240]
g表示糖、糖酸、或改性糖，优选糖或糖酸，最优选葡糖醛酸；
[0241]
b是与所述活性剂共价联接的单元，
[0242]
w表示
‑
c(o)
‑
、
‑
c(o)nr
’‑
、
‑
c(o)o
‑
、
‑
s(o)2nr
’‑
、
‑
p(o)r”nr
’‑
、
‑
s(o)nr
’‑
、或
‑
po2nr
’‑
，在每种情况下其中c(o)、s或p与苯环直接结合，并且r'和r”各自独立地是氢、(c1‑
c8)烷基、(c3‑
c8)环烷基、(c1‑
c8)烷氧基、(c1‑
c8)烷硫基、单(c1‑
c8)烷氨基或二(c1‑
c8)烷氨基、(c3‑
c
20
)杂芳基、或(c6‑
c
20
)芳基；
[0243]
每个z独立地表示氢、(c1‑
c8)烷基、或吸电子基团(例如酰胺、羧酸、羧酸酯、卤素、氰基或硝基)，优选氢、(c1‑
c8)烷基、卤素、氰基或硝基，最优选氢；
[0244]
n是1至3的整数，优选3；
[0245]
l表示与接头或支化单元的连键；
[0246]
r1和r2各自独立地是氢、(c1‑
c8)烷基、或(c3‑
c8)环烷基，优选氢，或者r1和r2与它们所连接的碳原子合起来形成(c3‑
c8)环烷基环。
[0247]
在一些实施方式中，w是
‑
c(o)
‑
、
‑
c(o)nr
’‑
、
‑
c(o)o
‑
、
‑
s(o)2nr
’‑
、
‑
p(o)r”nr
’‑
、
‑
s(o)nr
’‑
、或
‑
po2nr
’‑
，在每种情况下其中c(o)、s或p与苯环直接结合，并且r'和r”各自独立地是氢、(c1‑
c8)烷基、(c3‑
c8)环烷基、(c1‑
c8)烷氧基、(c1‑
c8)烷硫基、单(c1‑
c8)烷氨基或二(c1‑
c8)烷氨基、(c3‑
c
20
)杂芳基、或(c6‑
c
20
)芳基，优选氢。在某些优选实施方式中，w表示
‑
c(o)nr
’‑
，并且w的氮是氨基酸、优选亲水性氨基酸的氮。在一些实施方式中，w是
‑
c(o)nr
’‑
，其中c(o)与苯环键合并且nr'与l键合。
[0248]
在一些实施方式中，所述糖或糖酸是单糖。在一些实施方式中，所述糖包含：
[0249]
g是
[0250]
r3是氢或羧基保护基团；并且
[0251]
每个r4独立地是氢或羟基保护基团。
[0252]
在一些这样的实施方式中，r3是氢并且每个r4是氢。
[0253]
在一些实施方式中，每个z表示氢并且n是3。
[0254]
在某些优选实施方式中：
[0255]
g是葡糖醛酸；
[0256]
w是
‑
c(o)nr
’‑
，其中c(o)与苯环键合并且nr'与l键合；
[0257]
z表示氢；
[0258]
n是3；并且
[0259]
r1和r2各自表示氢。
[0260]
在本发明的一些实施方式中，所述抗体
‑
药物缀合物的一级接头包含具有1至100、优选1至50个碳原子的亚烷基，并且或是：
[0261]
所述亚烷基包括至少一个不饱和键；
[0262]
所述亚烷基包括至少一个杂亚芳基；
[0263]
所述亚烷基的碳原子被一个或多个选自氮(n)、氧(o)和硫(s)的杂原子替换；或是
[0264]
所述亚烷基进一步被一个或多个具有1至20个碳原子的烷基取代。在一些这样的实施方式中，所述亚烷基的所述至少一个碳原子被氮替换，所述一级接头包含亲水性氨基酸的至少两个原子，并且所述氮与所述亲水性氨基酸的骨架羰基形成肽键。所述亲水性氨基酸是精氨酸、天冬氨酸酯、天冬酰胺、谷氨酸酯、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、脯氨酸、丝氨酸或苏氨酸。
[0265]
在一些实施方式中，所述一级接头包含氨基酸，并且所述氨基酸包含侧链，所述侧链具有在中性ph下的水溶液中带电荷的部分，所述氨基酸优选精氨酸、天冬氨酸酯、谷氨酸酯、赖氨酸或鸟氨酸。该氨基酸可以存在于所述分支接头中的任何地方。例如，它可以共价联接所述分支接头的肟与所述分支接头的聚乙二醇单元。可替选地或附加地，这样的氨基酸可以存在于所述第一分支中。
[0266]
在某些优选实施方式中，所述抗体
‑
药物缀合物的一级接头通过硫醚键与所述抗体共价结合，并且所述硫醚键包含所述抗体的半胱氨酸的硫原子，最优选c
‑
端半胱氨酸，其可以是被类异戊二烯转移酶识别的氨基酸基序的一部分。
[0267]
例如，所述氨基酸基序可以是选自cxx、cxc、xcxc、xxcc和cyyx的序列；
[0268]
c表示半胱氨酸；
[0269]
y在每次出现时独立地表示脂族氨基酸；
[0270]
x在每次出现时独立地表示谷氨酰胺、谷氨酸酯、丝氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸或亮氨酸；并且
[0271]
所述硫醚键包含所述氨基酸基序的半胱氨酸的硫原子。
[0272]
在一些实施方式中，所述氨基酸基序是：
[0273]
序列cyyx；并且
[0274]
y在每次出现时独立地表示丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸或缬氨酸。
[0275]
在某些优选实施方式中，所述氨基酸基序是序列cvim或cvll。
[0276]
在一些实施方式中，所述氨基酸基序前面的七个氨基酸中的至少一个是甘氨酸。在一些实施方式中，所述氨基酸基序前面的七个氨基酸中的至少三个各自独立地选自甘氨酸和脯氨酸。在一些实施方式中，紧接在所述氨基酸基序前面的一至十个氨基酸是甘氨酸。在某些优选实施方式中，紧接在所述氨基酸基序前面的至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个氨基酸是甘氨酸，最优选至少五个是甘氨酸。在某些优选实施方式中，所述氨基酸基序前面的所述一、二、三、四、五、六、七、八、九或十个氨基酸中的每一个都是甘氨酸。在一些实施方式中，所述抗体的c
‑
端包含氨基酸序列gggggggcvim。
[0277]
在一些实施方式中，上述硫醚键包含至少一个由表示的异戊二烯基
单元的碳原子。在优选实施方式中，n是1或2，最优选2。
[0278]
在一些实施方式中，所述一级接头包含肟，并且所述至少一个异戊二烯基单元将所述肟与所述抗体共价联接。在一些实施方式中，所述接头包含：
[0279][0280]
在一些实施方式中，所述接头可以包含
[0281][0282]
在一些实施方式中，所述一级接头和/或所述第一分支包含至少一个由表示的聚乙二醇单元。所述聚乙二醇单元可以包含1至19个
‑
och2ch2‑
单元，优选4至20个
‑
och2ch2‑
单元。在一些优选实施方式中，所述接头可以包含1至20个
‑
och2ch2‑
单元。在某些优选实施方式中，所述接头可以包含1至12个
‑
och2ch2‑
单元。在其它优选实施方式中，所述接头可以包含3至12个
‑
och2ch2‑
单元。在一些实施方式中，所述接头包含肟，并且所述至少一个聚乙二醇单元将所述肟与所述肽共价联接。
[0283]
在本发明的一些实施方式中，所述一级接头、所述第一分支或二者包含由
‑
(ch2)
r
(v(ch2)
p
)
q
‑
表示的连接单元，其中：
[0284]
r是1至10的整数，优选2；
[0285]
p是0至12的整数，优选2；
[0286]
q是1至20的整数；
[0287]
v是单键、
‑
o
‑
、
‑
s
‑
、
‑
nr
21
‑
、
‑
c(o)nr
22
‑
、
‑
nr
23
c(o)
‑
、
‑
nr
24
so2‑
、或
‑
so2nr
25
‑
，优选
‑
o
‑
；并且
[0288]
r
21
至r
25
各自独立地是氢、(c1‑
c6)烷基、(c1‑
c6)烷基(c6‑
c
20
)芳基、或(c1‑
c6)烷基(c3‑
c
20
)杂芳基。
[0289]
在本发明的某些实施方式中，q是1至10的整数。在其它优选的实施方式中，q是2、5或11。
[0290]
在本发明的一些实施方式中，所述一级接头、所述第一分支或二者包含由
‑
(ch2)
r
(v(ch2)
p
)
q
‑
、
‑
((ch2)
p
v)
q
‑
、
‑
(ch2)
r
(v(ch2)
p
)
q
y
‑
、
‑
((ch2)
p
v)
q
(ch2)
r
‑
、
‑
y(((ch2)
p
v)
q
‑
或
‑
(ch2)
r
(v(ch2)
p
)
q
ych2‑
表示的连接单元
[0291]
其中：
[0292]
r是0至10的整数；
[0293]
p是1至10的整数；
[0294]
q是1至20的整数；
[0295]
v和y各自独立地是单键、
‑
o
‑
、
‑
s
‑
、
‑
nr
21
‑
、
‑
c(o)nr
22
‑
、
‑
nr
23
c(o)
‑
、
‑
nr
24
so2‑
、或
‑
so2nr
25
‑
；并且
[0296]
r
21
至r
25
各自独立地是氢、(c1‑
c6)烷基、(c1‑
c6)烷基(c6‑
c
20
)芳基或(c1‑
c6)烷基(c3‑
c
20
)杂芳基。
[0297]
在这些接头的某些优选实施方式中，q是4至20的整数。在一些实施方式中q是6至20的整数。在其他优选实施方式中，q是2至12的整数。在一些实施方式中，q是2、5或11。
[0298]
在这些接头的一些实施方式中，r优选是2。在这些接头的一些实施方式中，p优选是2。在这些接头的一些实施方式中，q是6至20的整数，在一些实施方式中，v和y各自独立地是
‑
o
‑
。
[0299]
在一些实施方式中：
[0300]
r是2；
[0301]
p是2；
[0302]
q是2、5或11，并且
[0303]
v是
‑
o
‑
。
[0304]
在本发明的一些实施方式中，所述至少一个支化单元是
[0305][0306]
其中l1、l2、l3各自独立地是直接键或
–
c
n
h
2n
‑
，其中n是1至30的整数，
[0307]
其中g1、g2、g3各自独立地是直接键、各自独立地是直接键、
[0308]
其中r3是氢或c1‑
c
30
烷基；
[0309]
其中r4是氢或
–
l4‑
coor5，其中l4是直接键或
‑
c
n
h
2n
‑
，其中n是1至10的整数，并且r5是氢或c1
‑
c30烷基。
[0310]
二级接头(例如，将活性剂与所述分支单元连接)可以包含通过1,3
‑
偶极环加成反应、杂diels
‑
alder反应、亲核取代反应、非醛醇缩合型羰基反应、与碳
‑
碳重键加成、氧化反应或点击反应形成的结合单元。结合单元可通过乙炔与叠氮化物之间的反应、或非醛醇缩合型羰基反应例如醛或酮基团与肼或烷氧基胺之间的反应形成，所述反应允许活性剂和/或裂解基团与所述支化单元轻度偶联。这样的结合单元可以由式(a)、(b)、(c)或(d)表示。
[0311][0312]
l1是单键或具有1
‑
30个碳原子、优选10、11、12、13、14、15或16个碳原子的亚烷基；
[0313]
r
11
是氢或具有1至10个碳原子的烷基，优选甲基；并且
[0314]
l2是具有1
‑
30个碳原子、优选10、11、12、13、14、15或16个碳原子的亚烷基。
[0315]
在本发明的一些实施方式中，所述一级接头、所述第一分支或二者包括由
‑
(ch2ch2x)
w
‑
表示的连接单元，其中：
[0316]
x表示
‑
o
‑
、(c1‑
c8)亚烷基、或
‑
nr
21
‑
，优选
‑
o
‑
；
[0317]
r
21
表示氢、(c1‑
c6)烷基、(c1‑
c6)烷基(c6‑
c
20
)芳基、或(c1‑
c6)烷基(c3‑
c
20
)杂芳基，优选氢；并且
[0318]
w是1至12的整数，优选1、3、6或12。
[0319]
在一些实施方式中，x是
‑
o
‑
并且w是6至12的整数。
[0320]
在本发明的一些实施方式中，所述一级接头包含通过1,3
‑
偶极环加成反应、杂diels
‑
alder反应、亲核取代反应、非醛醇缩合型羰基反应、与碳
‑
碳重键加成、氧化反应或点击反应形成的结合单元。在一些实施方式中，所述结合单元通过乙炔与叠氮化物之间的反应、或醛或酮基团与肼或烷氧基胺之间的反应形成。在一些实施方式中，所述结合单元由式a、b、c或d的任何一个表示，优选由d表示：
[0321][0322]
其中：
[0323]
l1是单键或具有1
‑
30个碳原子、优选12个碳原子的亚烷基；
[0324]
r
11
是氢或具有1至10个碳原子的烷基，优选甲基；并且
[0325]
l2是具有1
‑
30个碳原子、优选11个碳原子的亚烷基。
[0326]
在一些实施方式中所述一级接头包含
[0327][0328]
v是单键、
‑
o
‑
、
‑
s
‑
、
‑
nr
21
‑
、
‑
c(o)nr
22
‑
、
‑
nr
23
c(o)
‑
、
‑
nr
24
so2‑
、或
‑
so2nr
25
‑
，优选
‑
o
‑
；
[0329]
r
21
至r
25
各自独立地是氢、(c1‑
c6)烷基、(c1‑
c6)烷基(c6‑
c
20
)芳基、或(c1‑
c6)烷基(c3‑
c
20
)杂芳基；
[0330]
r是1至10的整数，优选2或3；
[0331]
p是0至10的整数，优选1或2；
[0332]
q是1至20的整数，优选1至6；并且
[0333]
l1是单键。
[0334]
在一些实施方式中，所述一级接头包含o
‑
取代的肟；其中
[0335]
a)所述肟的氧原子被将例如经由所述支化单元所述肟与所述活性剂共价联接的基团取代；并且
[0336]
所述肟的碳原子被将所述肟与所述抗体共价联接的基团取代；或者
[0337]
b)所述肟的氧原子被将所述肟与所述抗体共价联接的基团取代；并且
[0338]
所述肟的碳原子被将例如经由所述支化单元所述肟与所述活性剂共价联接的基团取代。
[0339]
在一些实施方式中，所述抗体
‑
药物缀合物包含式iii的结构：
[0340][0341]
其中：
[0342]
b表示活性剂，
[0343]
x表示1至3的整数；
[0344]
y表示0至20的整数；
[0345]
z表示1至20的整数；并且
[0346]
l表示与所述抗体的连键。
[0347]
在一些实施方式中，y和z独立地表示1至20的整数。在其它实施方式中，y和z独立地表示2至20的整数。在某些优选实施方式中，y和z独立地表示1至19、最优选4至20的整数。在某些优选实施方式中，y和z独立地表示小于或等于20的整数。
[0348]
在一些实施方式中，所述一级接头和/或所述第一分支包含至少一个包含1至20个
‑
och2ch2‑
单元、优选4至20个
‑
och2ch2‑
单元的聚乙二醇部分。在一些优选实施方式中，所述一级接头和/或所述第一分支包含至少一个包含3至12个
‑
och2ch2‑
单元的聚乙二醇部分。在一些实施方式中，所述聚乙二醇部分以羟基部分、氨基基团或烷基醚终止。
[0349]
在本发明的一些实施方式中，所述抗体是单克隆抗体、多克隆抗体、抗体片段、fab、fab'、fab'
‑
sh、f(ab')2、fv、单链fv(“scfv”)、双抗体、线性抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、或包含抗体的抗原结合部分的融合蛋白。
[0350]
在本发明的一些实施方式中，所述抗体选自莫罗单抗
‑
cd3、阿昔单抗、利妥昔单抗、达利珠单抗、帕利珠单抗、英夫利昔单抗、曲妥珠单抗、依那西普、巴利昔单抗、吉妥珠单抗、阿仑单抗、替伊莫单抗、阿达木单抗、阿法赛特、奥马珠单抗、依法利珠单抗、托西莫单抗、西妥昔单抗、abt
‑
806、贝伐单抗、那他珠单抗、雷珠单抗、帕尼单抗、依库丽单抗、利纳西
普、赛妥珠单抗、罗米司亭、amg
‑
531、戈利木单抗、优特克单抗、abt
‑
874、贝拉西普、贝利木单抗、阿塞西普、抗cd20抗体、卡纳单抗、托珠单抗、阿特珠单抗、美泊利单抗、帕妥珠单抗、humax cd20、曲美木单抗、替西木单抗、伊匹单抗、idec
‑
114、英妥珠单抗、humax egfr、阿柏西普、humax
‑
cd4、特普利珠单抗、奥特西珠单抗、卡妥索单抗、抗epcam抗体ign101、阿德木单抗、奥戈伏单抗、地妥西单抗、吉瑞妥昔单抗、地诺单抗、巴匹珠单抗、莫维珠单抗、依福谷单抗、瑞西巴库、ly2469298和维妥珠单抗。
[0351]
在一些实施方式中，所述一个活性剂选自化疗剂和毒素。
[0352]
在一些实施方式中，所述活性剂选自：
[0353]
(a)厄洛替尼、硼替佐米、氟维司群、索坦、来曲唑、甲磺酸伊马替尼、ptk787/zk222584、奥沙利铂、5
‑
氟尿嘧啶、亚叶酸、雷帕霉素、拉帕替尼、洛那法尼、索拉非尼、吉非替尼、ag1478、ag1571、噻替派、环磷酰胺、白消安、英丙舒凡、哌泊舒凡、苯并多巴、卡巴醌、美妥替哌、乌瑞替派、乙烯亚胺、六甲蜜胺、三乙烯三聚氰胺、三乙烯磷酰胺、三乙烯硫代磷酰胺、三羟甲基三聚氰胺、泡番荔枝辛、泡番荔枝辛酮、喜树碱、喜树碱衍生物和代谢产物(sn
‑
38)、拓扑替康、苔藓抑素、卡利斯汀、cc
‑
1065、阿多来新、卡折来新、比折来新、念珠藻素1、念珠藻素8、多拉司他汀、多卡米星、kw
‑
2189、cb1
‑
tm1、五加素、水鬼蕉碱、匍枝珊瑚醇、海绵抑制素、苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺、美法仑、新恩比兴、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥、卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀、卡里奇霉素、卡里奇霉素γ1、卡里奇霉素ω1、达内霉素、达内霉素a、氯膦酸盐、埃斯培拉霉素、新制癌菌素发色团、阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素、重氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素c、卡比柔星、洋红霉素、嗜癌素、色霉素、更生霉素、柔红霉素、地托比星、6
‑
重氮
‑5‑
氧代
‑
l
‑
正亮氨酸、阿霉素、吗啉代阿霉素、氰基吗啉代阿霉素、2
‑
吡咯啉代
‑
阿霉素、脂质体阿霉素、脱氧阿霉素、表柔比星、依索比星、麻西罗霉素、丝裂霉素c、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、派来霉素、泊非霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链霉黑素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他汀、佐柔比星、5
‑
氟尿嘧啶、二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤、三甲曲沙、氟达拉滨、6
‑
巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤、安西他滨、阿扎胞苷、6
‑
氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、卡鲁睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷、睾内酯、氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦、亚叶酸、醋葡醛内酯、醛磷酰胺糖苷、氨基乙酰丙酸、恩尿嘧啶、安吖啶、巴斯布西、比生群、依达曲沙、地磷酰胺、秋水仙胺、地吖醌、依氟鸟氨酸、依利醋铵、依托格鲁、硝酸镓、羟基脲、香菇多糖、氯尼达明、美登素、安丝菌素、米托胍腙、米托蒽醌、莫哌达醇、二胺硝吖啶、喷司他丁、蛋氨氮芥、吡柔比星、洛索蒽醌、2
‑
乙基酰肼、甲基苄肼、多糖
‑
k、雷佐生、根霉素、西佐糖、锗螺胺、细交链孢菌酮酸、三亚胺醌、2,2',2
”‑
三氯三乙胺、t
‑
2毒素、抚抱菌素a、杆孢菌素a、以及蛇形菌素(anguidine)、乌拉坦、长春地辛、达卡巴嗪、甘露醇氮芥、二溴甘露醇、二溴卫矛醇、哌泊溴烷、干胞嘧啶、阿拉伯糖苷、环磷酰胺、噻替派、紫杉醇、紫杉醇的白蛋白工程纳米粒子制剂、多烯紫杉醇、苯丁酸氮芥、吉西他滨、6
‑
硫鸟嘌呤、巯基嘌呤、顺铂、卡铂、长春花碱、铂、依托泊苷、异环磷酰胺、米托蒽醌、长春新碱、长春瑞滨、米托蒽醌、替尼泊苷、依达曲沙、道诺霉素、氨基喋呤、希罗达、伊班膦酸盐、cpt
‑
11、拓扑异构酶抑制剂rfs 2000、二氟甲基鸟氨酸、视黄酸、卡培他滨，或前述任一种的药学上可接受的盐、溶剂化物或酸；
[0354]
(b)单核因子、淋巴因子、传统多肽激素、甲状旁腺激素、甲状腺素、松弛素、松弛素
原、糖蛋白激素、促卵泡激素、促甲状腺激素、黄体生成素、肝生长因子、成纤维细胞生长因子、催乳素、胎盘催乳素、肿瘤坏死因子
‑
α、肿瘤坏死因子
‑
β、缪勒抑制物质、小鼠促性腺激素相关肽、抑制素、激活素、血管内皮生长因子、血小板生成素、红细胞生成素、骨诱导因子、干扰素、干扰素
‑
α、干扰素
‑
β、干扰素
‑
γ、集落刺激因子(“csf“)、巨噬细胞
‑
csf、粒细胞
‑
巨噬细胞
‑
csf、粒细胞
‑
csf、白介素(il)、il
‑
1、il
‑
1α、il
‑
2、il
‑
3、il
‑
4、il
‑
5、il
‑
6、il
‑
7、il
‑
8、il
‑
9、il
‑
10、il
‑
11、il
‑
12、肿瘤坏死因子、tnf
‑
α、tnf
‑
β、多肽因子、lif、kit配体，或任何前述的组合；
[0355]
(c)白喉毒素、肉毒毒素、破伤风毒素、痢疾毒素、霍乱毒素、鹅膏蕈碱、鹅膏蕈碱衍生物、α
‑
鹅膏蕈碱、吡咯并苯并二氮杂卓、吡咯并苯并二氮杂卓衍生物、河豚毒素、短裸甲藻毒素、雪卡毒素、篦麻毒素、am毒素、微管蛋白裂解素、格尔德霉素、美登素类化合物、卡里奇霉素、柔红霉素、阿霉素、甲氨蝶呤、长春地辛、sg2285、多拉司他汀、多拉司他汀类似物、奥瑞他汀、念珠藻素、喜树碱、喜树碱衍生物和代谢物(sn
‑
38)、根霉素、根霉素衍生物、cc
‑
1065、cc
‑
1065类似物或衍生物、倍癌霉素、烯二炔抗生素、埃斯培拉霉素、埃博霉素、阿咗那非得、阿普立定、类毒素，或任何前述的组合；
[0356]
(d)亲和配体，其中所述亲和配体是底物、抑制剂、刺激剂、神经递质、放射性同位素，或任何前述的组合；
[0357]
(e)放射性标记物、
32
p、
35
s、荧光染料、电子致密试剂、酶、生物素、链霉亲和素、洋地黄毒苷、半抗原、免疫原性蛋白质、具有与靶标互补的序列的核酸分子，或任何前述的组合；
[0358]
(f)免疫调节化合物、抗癌剂、抗病毒剂、抗菌剂、抗真菌剂和抗寄生虫剂，或任何前述的组合；
[0359]
(g)他莫昔芬、雷洛昔芬、屈洛昔芬、4
‑
羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、那洛昔芬、ly117018、奥那司酮或托瑞米芬；
[0360]
(h)4(5)
‑
咪唑、氨鲁米特、醋酸甲地孕酮、依西美坦、来曲唑或阿那曲唑；
[0361]
(i)氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林、戈舍瑞林或曲沙他滨；
[0362]
(j)芳香酶抑制剂；
[0363]
(k)蛋白激酶抑制剂；
[0364]
(l)脂质激酶抑制剂；
[0365]
(m)反义寡核苷酸；
[0366]
(n)核酶；
[0367]
(o)疫苗；和
[0368]
(p)抗血管生成剂。
[0369]
在一些实施方式中，所述至少一个活性剂是他托布林或阿咗那非得。
[0370]
在一些实施方式中，所述活性剂是鹅膏蕈碱、奥瑞他汀、卡里奇霉素、喜树碱、喜树碱衍生物和代谢物(sn
‑
38)、念珠藻素、柔红霉素、多拉司他汀、阿霉素、倍癌霉素、埃博霉素、埃斯培拉霉素、格尔德霉素、美登素类化合物、甲氨蝶呤、单甲基奥瑞他汀e(“mmae”)、单甲基奥瑞他汀f(“mmaf”)、吡咯并苯并二氮杂卓、根霉素、sg2285、微管蛋白裂解素、长春地辛、类毒素、或前述任一种的衍生物。在某些实施方式中，活性剂是鹅膏蕈碱、mmae或mmaf，或前述任一种的衍生物。
[0371]
在一些实施方式中，所述缀合物包含一个或多个包含选自以下的部分的分支接头：
[0372]
[0373]
[0374]
[0375]
[0376]
[0377]
[0378]
[0379]
[0380]
[0381][0382]
在一些实施方式中，所述活性剂是：
[0383]
[0384]
[0385]
[0386][0387]
其中y是1至10的整数。
[0388]
在其他实施方式中，本发明涉及接头化合物，例如，适合于与配体和一个或多个活性剂偶联以制备如本文中公开的配体
‑
药物缀合物的接头化合物，其中
[0389]
i)所述分支接头包含通过一级接头(pl)与所述配体共价偶联的支化单元(br)；
[0390]
ii)所述支化单元与第一分支(b1)共价偶联，其中裂解基团(cg)与二级接头(sl)共价偶联；以及
[0391]
iii)所述支化单元与第二分支(b2)共价偶联，所述第二分支包含a)与二级接头(sl)共价偶联的第二裂解基团(cg)或b)聚乙二醇部分。
[0392]
在一些实施方式中，本发明涉及接头化合物，例如，适合于与配体和一个或多个活性剂偶联以制备如本文中公开的接头
‑
活性剂缀合物的接头化合物，其中
[0393]
i)所述分支接头包含通过一级接头(pl)与所述配体共价偶联的支化单元(br)；
[0394]
ii)所述支化单元与第一分支(b1)共价偶联，所述第一分支具有能够与共价偶联二级接头(sl)的裂解基团(cg)反应的末端反应基团；以及
[0395]
iii)所述支化单元与第二分支(b2)共价偶联，所述第二分支包含a)能够与共价偶联二级接头(sl)的裂解基团(cg)反应的第二末端反应性基团或b)聚乙二醇部分。
[0396]
在这样的接头化合物的某些实施方式中，所述裂解基团具有下式：
[0397][0398]
其中：
[0399]
g表示糖、糖酸、或改性糖，优选糖或糖酸，最优选葡糖醛酸；
[0400]
w表示
‑
c(o)
‑
、
‑
c(o)nr
’‑
、
‑
c(o)o
‑
、
‑
s(o)2nr
’‑
、
‑
p(o)r”nr
’‑
、
‑
s(o)nr
’‑
、或
‑
po2nr
’‑
，在每种情况下其中c(o)、s或p优选与苯环直接结合，并且r'和r”各自独立地是氢、(c1‑
c8)烷基、单羧基(c1‑
c8)烷基或二羧基(c1‑
c8)烷基、(c3‑
c8)环烷基、(c1‑
c8)烷氧基、(c1‑
c8)烷硫基、单(c1‑
c8)烷氨基或二(c1‑
c8)烷氨基、(c3‑
c
20
)杂芳基、或(c6‑
c
20
)芳基并且w直接或间接地与所述支化单元偶联；
[0401]
每个z独立地表示氢、(c1‑
c8)烷基、或吸电子基团(例如酰胺、羧酸、羧酸酯、卤素、氰基或硝基)，优选氢、(c1‑
c8)烷基、卤素、氰基或硝基，最优选氢；
[0402]
n是1至3的整数；
[0403]
m是0或1，优选1；并且
[0404]
r1和r2各自独立地是氢、(c1‑
c8)烷基、或(c3‑
c8)环烷基，优选氢，或者r1和r2与它们所连接的碳原子合起来形成(c3‑
c8)环烷基环。
[0405]
在这样的接头化合物的其它实施方式中，所述裂解基团具有下式：
[0406][0407]
其中：
[0408]
g表示糖或糖酸，优选葡糖醛酸；
[0409]
b表示能够被活性剂替换的离去基团，例如卤素(特别是cl或br)，或包含能够与活性剂偶联的反应性部分的单元，例如异氰酸酯、酰基氯、氯甲酸酯等；
[0410]
w表示吸电子基团，优选
‑
c(o)nr
’‑
，其中c(o)与苯环键合并且nr'(其可以是氨基酸、优选亲水性氨基酸的氨基)与l键合；
[0411]
每个z独立地表示氢、(c1‑
c8)烷基、或吸电子基团(例如酰胺、羧酸、羧酸酯、卤素、氰基或硝基)，优选氢、(c1‑
c8)烷基、卤素、氰基或硝基，最优选氢；
[0412]
n是1至3的整数；
[0413]
l表示与所述支化单元的连键；
[0414]
r1和r2各自独立地是氢、(c1‑
c8)烷基、或(c3‑
c8)环烷基，优选氢，或者r1和r2与它们所连接的碳原子合起来形成(c3‑
c8)环烷基环。
[0415]
在这样的接头化合物的别的其它实施方式中，所述裂解基团具有下式：
[0416][0417]
或其药学上可接受的盐，其中
[0418]
g表示糖、糖酸、或改性糖，优选糖或糖酸，最优选葡糖醛酸；
[0419]
b是包含能够与所述活性剂偶联的反应性部分的单元，
[0420]
w表示
‑
c(o)
‑
、
‑
c(o)nr
’‑
、
‑
c(o)o
‑
、
‑
s(o)2nr
’‑
、
‑
p(o)r”nr
’‑
、
‑
s(o)nr
’‑
、或
‑
po2nr
’‑
，在每种情况下其中c(o)、s或p与苯环直接结合，并且r'和r”各自独立地是氢、(c1‑
c8)烷基、(c3‑
c8)环烷基、(c1‑
c8)烷氧基、(c1‑
c8)烷硫基、单(c1‑
c8)烷氨基或二(c1‑
c8)烷氨基、(c3‑
c
20
)杂芳基、或(c6‑
c
20
)芳基；
[0421]
每个z独立地表示氢、(c1‑
c8)烷基、或吸电子基团(例如酰胺、羧酸、羧酸酯、卤素、氰基或硝基)，优选氢、(c1‑
c8)烷基、卤素、氰基或硝基，最优选氢；
[0422]
n是1至3的整数，优选3；
[0423]
l表示与所述支化单元的连键；
[0424]
r1和r2各自独立地是氢、(c1‑
c8)烷基、或(c3‑
c8)环烷基，优选氢，或者r1和r2与它们所连接的碳原子合起来形成(c3‑
c8)环烷基环。
附图说明
[0425]
图1示出了活性药物从基于β
‑
葡糖苷酸的接头释放的机制。
[0426]
图2是描绘了根据实验例1的通过β
‑
葡糖醛酸糖苷酶水解接头的图。
[0427]
图3是描绘了根据实验例2的两个药物
‑
接头缀合物的血浆稳定性的图。
[0428]
图4是描绘了实施例68中描述的化合物47a的血浆稳定性的图。
[0429]
图5是描绘了实施例70中描述的化合物49a的血浆稳定性的图。
[0430]
图6是描绘了实施例69中描述的化合物48a的血浆稳定性的图。
[0431]
图7由两个图块组成，图7a和图7b。图7a显示了将药物与抗体(dar2)缀合的策略。图7b显示了将药物与抗体(dar4)缀合的策略。
[0432]
图8示出了接头中的peg长度变化的dar2 mmae
‑
缀合物针对jimt
‑
1(her2阳性)和mcf7细胞(her2阴性)的相对体外活性。
[0433]
图9示出了接头部分中具有不同peg长度的dar4 mmae
‑
缀合物针对jimt
‑
1(her2阳性)和mcf7细胞(her2阴性)的相对体外活性。
[0434]
图10示出了人β
‑
葡糖醛酸糖苷酶在具有各种接头类型的dar4 adc中的反应性。将12μm的adc在37℃与0.01μg的人β
‑
葡糖醛酸糖苷酶(r&d systems)一起温育3小时。
[0435]
图11示出了adc2和kadcyla在小鼠或人血浆中的血浆稳定性。
[0436]
图12示出了7天的adc33和adc34人血浆稳定性。
[0437]
图13示出了赫赛汀和adc2的大鼠pk曲线。
[0438]
图14示出了adc23和adc34的大鼠pk曲线。
[0439]
图15示出了通过将接头
‑
毒素从2g替换为11j，对基于mmae的adc的大鼠pk曲线改善。
[0440]
图16示出了通过分支接头单元的大鼠pk曲线改善。
[0441]
图17示出了在mmae adc中极性氨基酸对大鼠pk曲线的影响。
[0442]
图18示出了在具有dar2的adc中在有或没有极性氨基酸的情况下，通过分支接头
‑
毒素的大鼠pk曲线改善。
[0443]
图19示出了接头
‑
毒素单元中的asp对具有dar4的adc的大鼠pk曲线的作用。
[0444]
图20示出了接头
‑
毒素单元中的glu对具有dar4的adc的大鼠pk曲线的作用。
[0445]
图21示出了使用mmaf(adc23)或mmae(adc24)的代表性胺类型dar4 adc的体内功效。
[0446]
图22示出了使用mmaf(adc34)或mmae(adc33)的代表性酰胺类型dar4 adc的体内功效。
具体实施方式
[0447]
本发明涉及抗体
‑
药物缀合物(adc)，其中多个活性剂通过至少一个分支接头与抗体缀合。然而，正如本领域技术人员将认识到的，这样的缀合物的抗体部分可以被任何合适的配体替换，因此本发明同等地涉及配体
‑
药物缀合物。因此，本文中对抗体
‑
药物缀合物的引用和讨论应当被理解为，在与上下文不矛盾的情况下，同等地适用于配体
‑
药物缀合物以及它们相应中间体(例如配体
‑
接头缀合物)。然而，在与本文中公开的各种配体
‑
药物缀合物相关的所有方面中，所述配体优选是抗体。
[0448]
分支接头可以包含支化单元，两种活性剂通过二级接头与所述支化单元偶联，同时所述支化单元通过一级接头与所述抗体偶联。两个或更多个这样的分支接头(例如2
‑
4个分支接头)可以与抗体缀合，其可以各自与所述抗体的重链或轻链的不同c
‑
端半胱氨酸偶联，如本文中更详细描述的。任何分支接头上的活性剂可以是相同或不同的，并且在同一抗体上一个分支接头与另一个分支接头的活性剂可以不同。一个或多个所述一级接头和/或二级接头，可选地所有的一级接头和二级接头，可以包含至少一个聚乙二醇单元。
[0449]
分支接头可以包含通过第一分支和第二分支与支化单元偶联的一个活性剂，所述第二分支包含与支化单元偶联的聚乙二醇部分。两个或更多个这样的分支接头(例如2
‑
4个分支接头)可以与抗体缀合，其可以各自与所述抗体的重链或轻链的不同c
‑
端半胱氨酸偶联。
[0450]
与抗体的重链或轻链的不同c
‑
端半胱氨酸偶联的分支接头可以是相同的或不同的。一个可以是第一类型的分支接头，以活性剂与每个分支偶联；而另一个可以是第二类型的分支接头，其中一个分支具有聚乙二醇部分但不具有活性剂。所述活性剂在不同的分支接头之间或者甚至在相同的分支接头内可以是相同的或不同的。例如，包含与支化单元偶联的两个活性剂的一个分支接头可以与抗体的重链偶联，而包含通过第一分支和包含聚乙二醇部分第二分支与支化单元偶联的一个活性剂的第二分支接头可以与抗体的轻链偶联。这样的组合允许1至8个可以相同或不同的活性剂通过分支接头与抗体偶联。这继而又允许经抗体结合事件将更多数量的活性剂递送到靶细胞。
[0451]
分支接头的支化单元可以包含诸如氮的原子。支化单元可以包含允许三个链接键的任何原子或基团，例如胺、叔酰胺、或者叔碳或季碳。在某些优选实施方式中，支化单元是侧链上具有能够参与酰胺或酯(优选酰胺)键的基团的胺或氨基酸。在一些实施方式中，支化单元包含酰胺。当支化单元包含酰胺时，一级接头可以包含酰胺的羰基，或者羰基可以包括在其他分支之一中。
[0452]
例如，分支接头可具有两个活性剂，使得当支化单元为酰胺时，二级接头包含酰胺的羰基。所述支化单元可以仅具有一个活性剂，使得当支化单元是酰胺时，第一分支或第二分支包含酰胺的羰基。
[0453]
在一些实施方式中，支化单元是赖氨酸单元。赖氨酸单元可以包含修饰，例如ε
‑
氨基的甲基化，产生甲基赖氨酸、二甲基赖氨酸和三甲基赖氨酸，并且甚至乙酰化、类泛素化和/或泛素化。在本发明的多个实施方式中，支化单元可以包含许多其他氨基酸。例如，支化单元的氨基酸可以选自赖氨酸、5
‑
羟赖氨酸、4
‑
氧杂赖氨酸、4
‑
硫杂氨酸、4
‑
硒杂赖氨酸、4
‑
硫杂高赖氨酸、5,5
‑
二甲基赖氨酸、5,5
‑
二氟赖氨酸、反式
‑4‑
脱氢赖氨酸、2,6
‑
二氨基
‑4‑
己炔酸、顺式
‑4‑
脱氢赖氨酸、6
‑
n
‑
甲基赖氨酸、二氨基庚二酸、鸟氨酸、3
‑
甲基鸟氨酸、α
‑
甲
基鸟氨酸、瓜氨酸和高瓜氨酸。支化单元可以包含l
‑
氨基酸或d
‑
氨基酸。支化单元可以包含α
‑
氨基酸或β
‑
氨基酸。支化单元可以包含天然存在的氨基酸或非天然存在的氨基酸。代替赖氨酸或除赖氨酸之外，抗体
‑
药物缀合物的支化单元可以包含其他氨基酸。
[0454]
活性剂可以通过可裂解或不可裂解的键、可水解或不可水解的键与接头偶联。在某些优选实施方式中，活性剂通过可裂解的键与分支接头偶联。例如，抗体
‑
药物缀合物可以包含自牺牲基团，优选用于每个活性剂的自牺牲基团，例如，以从adc释放活性剂，这样的裂解基团具有下式：
[0455][0456]
其中
[0457]
g是糖或糖酸，优选葡糖醛酸或其衍生物；
[0458]
b表示活性剂，例如药物；
[0459]
w表示吸电子基团，优选
‑
c(o)nr
’‑
，其中c(o)与苯环键合并且nr'与l键合；
[0460]
每个z独立地表示(c1‑
c8)烷基、卤素、氰基或硝基，优选氢；
[0461]
n是1至3的整数，优选3；
[0462]
l包含将抗体与w共价联接的20至100个原子的链；并且
[0463]
r1和r2各自独立地是氢、(c1‑
c8)烷基、或(c3‑
c8)环烷基，优选氢，或者r1和r2与它们所连接的碳原子合起来形成(c3‑
c8)环烷基环。
[0464]
本文中公开的任何其他式的裂解基团能够类似地以这种方式使用。
[0465]
在一些实施方式中，l和/或分支接头包含亲水性氨基酸，例如，以增加抗体
‑
药物缀合物、接头、和/或抗体
‑
药物前体的前体的水溶性。例如在一级接头和/或二级接头中，优选在每个二级接头中，亲水性氨基酸可以置于邻近活性剂处、邻近抗体处、或者沿着分支接头被插入任何位置处。例如，亲水性氨基酸可以将l和/或一级接头的肟与l和/或一级接头的聚乙二醇单元共价链接。肽可以将l和/或一级接头的肟与l和/或一级接头的聚乙二醇单元共价联接。
[0466]
所述吸电子基团w可以是
‑
c(o)
‑
、
‑
c(o)nr
’‑
、
‑
c(o)o
‑
、
‑
s(o)2nr
’‑
、
‑
p(o)r”nr
’‑
、
‑
s(o)nr
’‑
、或
‑
po2nr
’‑
，优选
‑
c(o)nr
’‑
，并且r'和r”可以各自独立地是氢、(c1‑
c8)烷基、(c3‑
c8)环烷基、(c1‑
c8)烷氧基、(c1‑
c8)烷硫基、单(c1‑
c8)烷氨基或二(c1‑
c8)烷氨基、(c3‑
c
20
)杂芳基、或(c6‑
c
20
)芳基，优选氢。在这样的实施方式中，w优选是取向的，使得羰基、磷酰基、磺酰基或亚磺酰基基团直接与苯环结合。当z表示吸电子基团时，z可以表示本段中针对w所描述的任何部分。
[0467]
w可以表示
‑
c(o)nr
’‑
，并且w的氮可以是亲水性氨基酸的氮原子。亲水性氨基酸可以是天然存在的氨基酸或非天然存在的氨基酸。亲水性氨基酸可以是α
‑
氨基酸或β
‑
氨基酸。亲水性氨基酸可以是精氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸酯、谷氨酰胺、组氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、脯氨酸、丝氨酸或苏氨酸，并且可以是d
‑
氨基酸或l
‑
氨基酸。在某些优选实施方
式中，亲水性氨基酸是天冬氨酸酯或谷氨酸酯，如l
‑
天冬氨酸酯或l
‑
谷氨酸酯。在其它优选实施方式中，亲水性氨基酸是赖氨酸或鸟氨酸，例如l
‑
赖氨酸或l
‑
鸟氨酸。在某些实施方式中，亲水性氨基酸是精氨酸，例如l
‑
精氨酸。在某些实施方式中，亲水性氨基酸包含侧链，所述侧链具有在水溶液中在中性ph值下带有电荷的部分(例如胺、胍或羧基部分)。
[0468]
裂解基团(即前图中的g)的糖或糖酸通过例如易受酶裂解的键，例如至苯环上的氧取代基的糖苷键，与所述苯环连接。糖或糖酸优选是单糖，例如葡糖醛酸或其衍生物，其能够通过酶例如β
‑
葡糖醛酸糖苷酶、例如存在于被所述缀合物靶定的细胞中的酶从所述adc裂解。葡糖醛酸及其衍生物可以由下式表示：
[0469][0470]
其中r3是氢或羧基保护基团，优选氢，并且每个r4独立地是氢或羟基保护基团，优选氢。
[0471]
羧基保护基团可以是在例如有机合成中用于掩蔽羧酸的任何合适的保护基团，例如甲基、甲氧基甲基、甲硫基甲基、四氢吡喃基、苄氧基甲基、苯甲酰甲基、n
‑
邻苯二甲酰亚氨甲基、2,2,2
‑
三氯乙基、2
‑
卤代乙基、2
‑
(对甲苯磺酰基)乙基、叔丁基、肉桂基、苄基、三苯甲基、双(邻硝基苯基)甲基、9
‑
蒽基甲基、2
‑
(9,10
‑
二氧代)蒽基甲基、胡椒基、2
‑
三甲基甲硅烷基乙基、三甲基甲硅烷基或叔丁基二甲基甲硅烷基。在一些实施方式中，r3‑
oc(＝o)
‑
整个部分被羧基掩蔽部分例如2
‑
烷基
‑
1,3
‑
噁唑啉基替换。
[0472]
羟基保护基团可以是例如在有机合成中用于掩蔽羟基基团的任何合适的保护基团，例如乙酰基、甲基、乙氧基乙基、苯甲酰基、苄基、4
‑
甲氧基苄基、3,4
‑
二甲氧基苄基、四氢吡喃基(thp)、四氢呋喃基(thf)、叔丁基二甲基甲硅烷基(tbdms)、三甲基甲硅烷基(tms)、三乙基甲硅烷基(tes)、三异丙基甲硅烷基(tips)、叔丁基二苯基甲硅烷基(tbdps)、三异丙基甲硅烷氧基甲基(tom)、β
‑
甲氧基乙氧基甲基(mem)、甲氧基甲基(mom)、烯丙基、或三苯甲基。
[0473]
l和/或分枝接头可以包含具有1至100个碳原子、优选20至80个碳原子的取代或未取代的亚烷基，并满足以下(i)至(iv)中的至少一项、优选至少两项：
[0474]
(i)所述亚烷基包括至少一个不饱和键，优选3或4个双键且没有三键，
[0475]
(ii)所述亚烷基包括至少一个杂亚芳基，
[0476]
(iii)所述亚烷基的至少一个碳原子被选自氮(n)、氧(o)和硫(s)中的一个或多个杂原子、优选至少一个氮和至少一个氧替换(例如，如在肟中)，以及
[0477]
(iv)所述亚烷基被一个或多个具有1至20个碳原子的烷基、优选2或3个甲基取代。
[0478]
在优选实施方式中，抗体的半胱氨酸，优选在抗体的重链或轻链的c
‑
端，与异戊二烯基单元的碳原子形成硫醚键，从而将抗体与分支接头、例如一级接头共价联接。因此，在一些实施方式中，l和/或分支接头(例如一级接头)可以包含至少一个异戊二烯基单元，优选两个异戊二烯基单元，各由下式表示，其优选可被类异戊二烯转移酶识别，例如作为类异
戊二烯转移酶的产物或底物的一部分。
[0479][0480]
在某些这样的优选实施方式中，抗体包含能够被类异戊二烯转移酶识别的氨基酸基序。例如，抗体的至少一个c
‑
端可以包含能够被类异戊二烯转移酶识别的氨基酸基序(例如作为底物，例如在形成抗体
‑
药物缀合物之前，或者作为类异戊二烯转移酶的产物，例如在形成抗体
‑
药物缀合物之后)。抗体还可以包含间隔物，例如将抗体的肽链与氨基酸基序联接的氨基酸或一段氨基酸。所述间隔物可以由1至20个连续的氨基酸、优选7个或更多个氨基酸组成。甘氨酸和脯氨酸是所述间隔物的优选氨基酸，并且可以任何组合使用，例如一连串约7个甘氨酸。在一些实施方式中，抗体的c
‑
端包含氨基酸序列gggggggc vim。抗体可包含在羧基端的添加或缺失，例如相对于未包括在adc中的抗体的形式。
[0481]
类异戊二烯转移酶的例子包括法尼基蛋白转移酶(ftase)和香叶基香叶基转移酶(ggtase)，其能催化法尼基或香叶基
‑
香叶基基团到靶蛋白的至少一个c
‑
端半胱氨酸上的转移。ggtase可以分类为ggtase i或ggtase ii。ftase和ggtase i可以识别caax基序，并且ggtase ii可以识别xxcc、xcxc或cxx基序，其中c表示半胱氨酸，a表示脂族氨基酸(例如异亮氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸)，并且每个x独立地表示例如谷氨酰胺、谷氨酸酯、丝氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸或亮氨酸(参见nature rev.cancer，5(5)：405
‑
12(2005)；nature chemical biology 17：498
‑
506(2010)；lane kt，bees ls，j.lipid research，47：681
‑
699(2006)；kasey pj，seabra mc，j.biological chemistry，271(10)：5289
‑
5292(1996)，其各自特此通过引用以其整体被并入)。
[0482]
根据本发明的抗体
‑
药物缀合物可以包含氨基酸基序，例如cyyx、xxcc、xcxc或cxx，优选cyyx(其中，c表示半胱氨酸；y表示脂族氨基酸，例如亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸和/或甲硫氨酸；x表示决定类异戊二烯转移酶的底物特异性的氨基酸，例如谷氨酰胺、谷氨酸酯、丝氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、丙氨酸和/或亮氨酸)。
[0483]
来自各种来源的类异戊二烯转移酶均可以使用。例如，类异戊二烯转移酶可以从人类、动物、植物、细菌、病毒或其他来源获得。在一些实施方式中，使用天然存在的类异戊二烯转移酶。在一些实施方式中，可以使用天然修饰或人工修饰的类异戊二烯转移酶。例如，类异戊二烯转移酶可以包含一个或多个氨基酸取代、添加和/或缺失，和/或类异戊二烯转移酶可以通过添加下列中的至少一个来修饰：组氨酸标签，gst(谷胱甘肽s转移酶)，gfp(绿色荧光蛋白)，mbp(髓鞘碱性蛋白)，cbp，isopeptag，bccp(生物素羧基载体蛋白)，myc
‑
标签，钙调蛋白标签，flag标签，ha标签，麦芽糖结合蛋白标签，nus标签，谷胱甘肽
‑
s
‑
转移酶标签，绿色荧光蛋白标签，硫氧还蛋白标签，s标签，softag 1，softag 3，strep标签，sbp标签，ty标签，等。
[0484]
类异戊二烯转移酶识别异底物(isosubstrate)和/或底物。术语异底物是指包含化学修饰的底物类似物。类异戊二烯转移酶可在抗体的c
‑
端烷基化特定的氨基酸基序(例如，caax基序)(参见，例如，duckworth，bp等，chembiochem，8：98(2007)；uyen tt等，chembiochem，8：408(2007)；labadie，gr等，j.org.chem.，72(24)：9291(2007)；wollack，jw等，chembiochem，10：2934(2009)，其各自特此通过引用被并入)。利用可以烷基化c
‑
端半胱氨酸的类异戊二烯转移酶和异底物，可以产生官能化的抗体。
[0485]
所述异底物可以是，例如，具有下式的化合物：
[0486][0487]
c
‑
端caax基序的半胱氨酸可以利用类异戊二烯转移酶与异底物结合。在一些实施方式中，基序的一部分，例如aax，可以随后被蛋白酶除去，例如仅留下与类异戊二烯结合的半胱氨酸。半胱氨酸可以可选地在羧基端被甲基化，例如通过酶(参见，例如，bell，im，j.med.chem.，47(8)：1869(2004)，其特此通过引用被并入)。
[0488]
l和/或分支接头，例如一级接头，可以包含通过1,3
‑
偶极环加成反应、杂diels
‑
alder反应、亲核取代反应、非醛醇缩合型羰基反应、与碳
‑
碳重键加成、氧化反应或点击反应形成的结合单元。结合单元可通过乙炔与叠氮化物之间的反应、或非醛醇缩合型羰基反应例如醛或酮基团与肼或烷氧基胺之间的反应形成，这样的结合单元可以由式(a)、(b)、(c)或(d)表示。
[0489][0490]
l1是单键或具有1
‑
30个碳原子、优选12个碳原子的亚烷基；
[0491]
r
11
是氢或具有1至10个碳原子的烷基，优选甲基；并且
[0492]
l2是具有具有1
‑
30个碳原子，例如10或11个，优选11个碳原子的亚甲基。
[0493]
在一些实施方式中，l1和/或l2可以包含至少一个异戊二烯基单元，优选两个异戊二烯基单元。l2可以由至少一个异戊二烯基单元、优选两个异戊二烯基单元组成。在优选实施方式中，异戊二烯基单元的碳原子与抗体的半胱氨酸的硫原子形成硫醚键，最优选在重链或轻链的c
‑
端，由此将抗体与分支接头、例如一级接头共价联接。
[0494]
抗体
‑
药物缀合物可以包含由上述式(d)表示的结合单元，其中l2由至少一个异戊二烯基单元、优选两个异戊二烯基单元组成。结合单元可以是o
‑
取代的肟，即结合单元的氮可以与取代的氧共价结合。异戊二烯基单元的碳原子可以与抗体的半胱氨酸的硫原子形成硫醚键，最优选在重链或轻链的c末端，由此共价联接结合单元和抗体。
[0495]
l和/或分支接头，例如一级接头，可以包含由下式表示的异戊二烯基基团
[0496][0496]
例如，其中异戊二烯基基团的碳原子与抗体的半胱氨酸的硫原子形成硫醚键，由此共价联接异戊二烯基基团和抗体。异戊二烯基基团的氮可以将异戊二烯基基团与l和/或分支接头、例如一级接头的聚乙二醇单元共价联接。
[0497]
l和/或分支接头，例如一级接头，可以包含由下式表示的异戊二烯基基团
[0498][0498]
例如，其中异戊二烯基基团的碳原子与抗体的半胱氨酸的硫原子形成硫醚键，由此共价联接异戊二烯基基团和抗体。异戊二烯基基团的氮可以将异戊二烯基基团与l和/或分支接头、例如一级接头的聚乙二醇单元共价联接。
[0499]
点击化学反应可以在温和条件下进行，其可以在抗体存在下进行而不使所述抗体变性。点击化学反应显示出高反应特异性。因此，例如，即使抗体具有各种官能团(例如，胺、羧基、甲酰胺和胍鎓)，也可以进行点击化学反应，而不影响抗体的氨基酸侧链。叠氮基团和乙炔基团之间的点击化学反应，例如，可以在抗体存在下发生，而不修饰抗体的氨基酸侧链官能团。此外，无论反应物的性质如何，点击化学反应都可以精确地靶向特定官能团，例如在自然界中很少发现的官能团。在一些情况下，选择反应物来改善整体反应效率。例如，叠氮化物
‑
乙炔点击化学反应可以高收率生成三唑(参见，例如，hia，rk等，chem.rev.，109：5620(2009)；meldal，m&tornoe，cw，chem rev.，108：2952(2008)；kolb，hc等，angew.chemie int.ed.engl.，40：2004(2001)，其各自特此通过引用被并入)。
[0500]
天然蛋白质中不存在叠氮化物和乙炔官能团。因此，氨基酸侧链、n
‑
端胺或c
‑
端羧基都不应该受到利用这些官能团的点击化学反应的影响。
[0501]
连接单元可以由
‑
(ch2)
r
(v(ch2)
p
)
q
‑
或
‑
(ch2ch2x)
w
‑
表示，其中
[0502]
v是单键、
‑
o
‑
、
‑
s
‑
、
‑
nr
21
‑
、
‑
c(o)nr
22
‑
、
‑
nr
23
c(o)
‑
、
‑
nr
24
so2‑
、或
‑
so2nr
25
‑
，优选是
‑
o
‑
；
[0503]
x是
‑
o
‑
、(c1‑
c8)亚烷基或
‑
nr
21
‑
，优选是
‑
o
‑
；
[0504]
r
21
至r
25
各自独立地是氢、(c1‑
c6)烷基、(c1‑
c6)烷基(c6‑
c
20
)芳基、或(c1‑
c6)烷基(c3‑
c
20
)杂芳基，优选是氢；
[0505]
r是1至10的整数，优选是2或3；
[0506]
p是0至12的整数，优选是1或2；
[0507]
q是1至20的整数；并且
[0508]
w是1至20的整数，优选是4至20。
[0509]
在一些优选实施方式中，q是2至12的整数。在其它优选实施方式中，q是4至20的整数。
[0510]
l和/或分支接头，例如一级接头，可以包含由式(a)、(b)、(c)或(d)表示的结合单元和由
‑
(ch2)
r
(v(ch2)
p
)
q
‑
或
‑
(ch2ch2x)
w
‑
表示的连接单元。
[0511]
在优选实施方式中，l和/或分支接头，例如一级接头或二级接头，或两者的组合，包含至少一个由表示的聚乙二醇单元。在某些实施方式中，抗体
‑
药物缀合物可以包含1至20个
‑
och2ch2‑
单元，例如，1至19个
‑
och2ch2‑
单元，如1至12个
‑
och2ch2‑
单元、5至12个
‑
och2ch2‑
单元、6至12个
‑
och2ch2‑
单元、5至20个
‑
och2ch2‑
单元、6至20个
‑
och2ch2‑
单元、或4至20个
‑
och2ch2‑
单元。在一级接头和二级接头中这样的单元可以在数量上变化。在其中一级接头包含肟的实施方式中，聚乙二醇单元优选将所述肟
与肽例如肽的n
‑
端、肽的c
‑
端或肽的侧链共价联接。
[0512]
l和/或分支接头，例如一级接头，优选包含至少一个由
‑
(ch2ch2o)
n
‑
表示的聚乙二醇基团，其中n是1至20，例如1至12、5至12、6至12、5至20、或6至20。二级接头优选包含由
‑
(ch2ch2o)
n
‑
表示的聚乙二醇基团，其中n是1至20，例如1至12、5至12、6至12、5至20、或6至20。在其中一级接头包含肟实施方式中，聚乙二醇基团优先将所述肟与肽共价联接。在其中一级接头包含肟实施方式中，聚乙二醇基团优先将所述肟与w共价联接，例如，其中w由表达式
‑
c(o)nr
’‑
表示。聚乙二醇基团的碳可以与w的原子(例如，
‑
c(o)nr
’‑
的氮)形成共价键，和/或聚乙二醇基团的氧可以是肟的氧。
[0513]
在一些实施方式中，一级接头优选由以下两种结构之一表示，因此接头可以包含以下两种结构之一：
[0514][0515]
其中n是1至20的整数，例如4至20。
[0516]
l和/或接头可以包含l和/或接头可以包含其中
[0517]
v表示单键、
‑
o
‑
、
‑
s
‑
、
‑
nr
21
‑
、
‑
c(o)nr
22
‑
、
‑
nr
23
c(o)
‑
、
‑
nr
24
so2‑
、或
‑
so2nr
25
‑
，优选
‑
o
‑
；
[0518]
r
21
至r
25
各自独立地表示氢、(c1‑
c6)烷基、(c1‑
c6)烷基(c6‑
c
20
)芳基、或(c1‑
c6)烷基(c3‑
c
20
)杂芳基；
[0519]
r是1至10的整数，优选是2或3；
[0520]
p是0至10的整数，优选是1或2；
[0521]
q是1至20的整数，优选是1至6；并且
[0522]
l1是单键。
[0523]
在一些实施方式中，抗体
‑
药物缀合物包含以下结构：
[0524][0525]
其中：
[0526]
b和b'表示活性剂，其可以相同或不同；
[0527]
n在每次出现时独立地表示0至30的整数；
[0528]
f在每次出现时独立地表示0至30的整数；并且
[0529]
l表示与所述抗体的连键。
[0530]
在某些优选实施方式中，每个n是1
‑
20的整数，优选1
‑
10。在某些优选实施方式中，f是1
‑
20的整数，优选1
‑
10。最优选地，选择每个n和f，使得f+n小于20，例如小于15。
[0531]
在一些实施方式中，抗体
‑
药物缀合物包含以下结构：
[0532][0533]
其中：
[0534]
b表示活性剂，
[0535]
x表示1至3的整数；
[0536]
y表示0至20的整数；
[0537]
z表示1至20的整数；并且
[0538]
l表示与所述抗体的连键。
[0539]
在一些实施方式中，y和z独立地表示2至20的整数。在优选实施方式中，y和z独立地表示1至19、优选4至20的整数。在某些优选实施方式中，y和z独立地表示小于或等于20的整数。
[0540]
本发明的抗体
‑
药物缀合物可以使用本领域已知的任何方法、包括分子生物学方法和细胞生物学方法制备。例如，可以使用瞬时或稳定转染方法。编码能够被类异戊二烯转
移酶识别的特定氨基酸基序的遗传序列可以使用标准pcr和/或连接技术被插入到已知的质粒载体中，从而表达在其c
‑
端具有特定氨基酸基序的抗体。具有至少一个能够被类异戊二烯转移酶识别的氨基酸基序的抗体因此可以在合适的宿主例如cho细胞或大肠杆菌(e coli)中表达。
[0541]
术语“酰基”是本领域公认的，并且是指由通式烃基c(o)
‑
、优选烷基c(o)
‑
表示的基团。
[0542]
术语“酰氨基”是本领域公认的并且是指被酰基基团取代的氨基基团，并且可以例如由式烃基c(o)nh
‑
表示。
[0543]
术语“酰氧基”是本领域公认的，并且是指由通式烃基c(o)o
‑
、优选烷基c(o)o
‑
表示的基团。
[0544]
术语“烷氧基”是指具有与其相连的氧的烷基基团，优选低级烷基基团。代表性的烷氧基基团包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、叔丁氧基等。
[0545]
术语“烷氧基烷基”是指被烷氧基基团取代的烷基基团并且可以由通式烷基
‑
o
‑
烷基表示。
[0546]
术语“烯基”，在本文中使用时，是指含有至少一个双键的脂族基团，并且旨在包括“未取代烯基”和“取代烯基”两者，后者是指烯基部分具有替换所述烯基基团的一个或多个碳上的氢的取代基。这样的取代基可以出现在包含或不包含在一个或多个双键中的一个或多个碳上。此外，这样的取代基包括如下所述针对烷基基团所预期的所有那些取代基，除非稳定性不过关。例如，预期烯基基团被一个或多个烷基、碳环基，芳基、杂环基或杂芳基基团取代。
[0547]“烷基”基团或“烷烃”是完全饱和的直链或支链非芳烃。通常，直链或支链烷基基团具有1至约20个碳原子，优选1至约10个碳原子，除非另有定义。直链和支链烷基基团的例子包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、戊基、己基、戊基和辛基。c1‑
c6直链或支链烷基基团也被称为“低级烷基”基团。
[0548]
此外，术语“烷基”(或“低级烷基”)在整个说明书、实施例和权利要求书中使用时，旨在包括“未取代烷基”和“取代烷基”两者，后者是指烷基部分具有替换烃骨架的一个或多个碳上的氢的取代基。这样的取代基，如果没有另外说明，可包括，例如，卤素、羟基、羰基(例如羧基、烷氧基羰基、甲酰基或酰基)、硫代羰基(例如硫酯、硫代乙酸酯、或硫代甲酸酯)、烷氧基、磷酰基、磷酸酯、膦酸酯、亚膦酸酯、氨基、酰胺基、脒、亚胺、氰基、硝基、叠氮基、巯基、烷硫基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰基、磺酰胺基、磺酰基、杂环基、芳烷基、或者芳族或杂芳族部分。本领域技术人员将会理解，如果适当的话，在烃链上取代的部分本身可被取代。例如，取代烷基的取代基可以包括氨基、叠氮基、亚氨基、酰胺基、磷酰基(包括膦酸酯和亚膦酸酯)、磺酰基(包括硫酸酯、磺酰氨基、氨磺酰基和磺酸酯)和甲硅烷基基团的取代和未取代形式，以及醚、烷硫基、羰基(包括酮、醛、羧酸酯、和酯)，
‑
cf3、
‑
cn等。示例性的取代烷基在下面描述。环烷基可以进一步被烷基、烯基、烷氧基、烷硫基、氨基烷基、羰基取代的烷基、
‑
cf3、
‑
cn等取代。
[0549]
术语“c
x
‑
y”当结合化学部分例如酰基、酰氧基、烷基、烯基、炔基或烷氧基使用时，意指包括在链中含有x至y个碳的基团。例如，术语“c
x
‑
y
烷基”是指取代或未取代的饱和烃基团，包括在链中含有x至y个碳的直链烷基和支链烷基基团，包括卤代烷基例如三氟甲基和
2,2
‑2‑
三氟乙基等。c0烷基在所述基团处于末端位置时指示氢，如果在内部则指示键。术语“c2‑
y
烯基”和“c2‑
y
炔基”是指取代或未取代的不饱和脂族基团，其长度和可能的取代与上述烷基相似，但分别含有至少一个双键或三键。
[0550]
术语“烷氨基”在本文中使用时，是指被至少一个烷基基团取代的氨基基团。
[0551]
术语“烷硫基”，在本文中使用时，是指被烷基取代的硫醇基并可以由通式烷基s
‑
表示。
[0552]
术语“炔基”，在本文中使用时，是指含有至少一个三键的脂族基团，并且旨在包括“未取代炔基”和“取代炔基”二者，后者是指炔基部分具有替换所述炔基基团的一个或多个碳上的氢的取代基。这样的取代基可以出现在包含或不包含在一个或多个三键中的一个或多个碳上。此外，这样的取代基包括如上所述针对烷基基团预期的所有那些取代基，除非稳定性不过关。例如，预期炔基基团被一个或多个烷基、碳环基，芳基、杂环基或杂芳基基团取代。
[0553]
术语“酰胺”，在本文中使用时，是指基团
[0554][0555]
其中每个r
10
独立地表示氢或烃基基团，或者两个r
10
与它们所连接的n原子合起来完成在环结构中具有4至8个原子的杂环。
[0556]
术语“胺”和“氨基”是本领域公认的并且是指未取代和取代的胺及其盐，例如，可以由下式表示的部分
[0557][0558]
其中每个r
10
独立地表示氢或烃基基团，或者两个r
10
与它们所连接的n原子合起来完成在环结构中具有4至8个原子的杂环。
[0559]
术语“氨基烷基”在本文中使用时，是指被氨基基团取代的烷基基团。
[0560]
术语“羧基”在本文中使用时，是指由式
‑
co2h表示的基团。
[0561]
术语“杂芳烷基”在本文中使用时是指被杂芳基基团取代的烷基基团。
[0562]
术语“杂烷基”在本文中使用时，是指碳原子和至少一个杂原子的饱和或不饱和链，其中没有两个杂原子是相邻的。
[0563]
术语“杂芳基”包括取代或未取代的芳族单环结构，优选5
‑
元环至7
‑
元环，更优选5
‑
元环至6
‑
元环，其环结构包含至少一个杂原子、优选一至四个杂原子、更优选一或两个杂原子。术语“杂芳基”也包括具有两个或更多个环的多环体系，其中两个或更多个碳是两个相邻环共有的，其中至少一个环是杂芳族的，例如其它环可以是环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基和/或杂环基。杂芳基基团包括，例如，吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、噁唑、噻唑、吡唑、吡啶、吡嗪、哒嗪和嘧啶等。
[0564]
术语“杂原子”在本文中使用时，是指除碳或氢以外的任何元素的原子。优选的杂原子是氮、氧和硫。
[0565]
术语“杂环基”、“杂环”和“杂环的”是指取代或未取代的非芳族环结构，优选3
‑
元环至10
‑
元环，更优选3
‑
元环至7
‑
元环，其环结构包含至少一个杂原子，优选一至四个杂原子，更优选一个或两个杂原子。术语“杂环基”和“杂环的”也包括具有两个或更多个环的多环体系，其中两个或更多个碳是两个相邻环共有的，其中至少一个环是杂环的，例如其它环可以是环烷基、环烯基、环炔基、芳基、杂芳基和/或杂环基。杂环基基团包括例如哌啶、哌嗪、吡咯烷、吗啉、内酯、内酰胺等。杂环基基团也可以被氧代基团取代。例如，“杂环基”包括吡咯烷和吡咯烷酮二者。
[0566]
术语“羟烷基”在本文中使用时，是指被羟基取代的烷基。
[0567]
术语“取代的”是指具有替换一个或多个骨架碳上的氢的取代基的部分。要理解，“取代”或“被...取代”包括隐含的条件，即这样的取代与被取代的原子和取代基的允许的化合价相符，并且所述取代产生稳定的化合物，例如其不自发进行例如通过重排、环化、消除等的转变。在本文中使用时，术语“取代的”预期包括有机化合物的所有可允许的取代基。在广泛的方面，所述可允许的取代基包括有机化合物的非环状和环状、分支和不分支、碳环和杂环、芳族和非芳族的取代基。对于适当的有机化合物，可允许的取代基可以是一个或多个并且是相同或不同的。就本发明而言，杂原子例如氮可以具有满足杂原子化合价的氢取代基和/或本文所述的任何可允许的有机化合物取代基。取代基可包括本文中所述的任何取代基，例如，卤素、羟基、羰基(例如羧基、烷氧基羰基、甲酰基或酰基)、硫代羰基(例如硫酯、硫代乙酸酯、或硫代甲酸酯)、烷氧基、磷酰基、磷酸酯、膦酸酯、亚膦酸酯、氨基、酰胺基、脒、亚胺、氰基、硝基、叠氮基、巯基、烷硫基、硫酸酯、磺酸酯、氨磺酰基、磺酰胺基、磺酰基、杂环基、芳烷基、或者芳族部分或杂芳族部分。本领域技术人员将会理解，如果适当的话，取代基可本身被取代。除非特别声明为“未取代的”，否则所提及的本文中的化学部分被理解为包括取代的变体。例如，所提及的“芳基”基团或部分隐含包括取代的和未取代的变体二者。
[0568]
术语“硫代烷基”在本文中使用时，是指被硫醇基团取代的烷基。
[0569]
术语“硫酯”在本文中使用时，是指基团
‑
c(o)sr
10
或
‑
sc(o)r
10
，其中r
10
表示烃基。
[0570]
术语“硫醚”在本文中使用时，相当于醚，其中氧被硫取代。
[0571]“保护基团”是指当与分子中的反应性官能团连接时，掩蔽、减少或阻止所述官能团的反应性的原子团。通常，可以在合成过程中根据需要选择性地除去保护基团。保护基团的例子可以参见greene和wuts，有机化学中的保护基团(protective groups in organic chemistry)，第三版，1999；john wiley&sons，ny以及harrison等，合成有机方法纲要(compendium of synthetic organic methods)，1
‑
8卷，1971
‑
1996，john wiley&sons，ny。代表性的氮保护基团包括但不限于，甲酰基、乙酰基、三氟乙酰基、苄基、苄氧基羰基(“cbz”)、叔丁氧基羰基(“boc”)、三甲基甲硅烷基(“tms”)、2
‑
三甲基甲硅烷基
‑
乙磺酰基(“tes”)、三苯甲基和取代的三苯甲基基团、烯丙氧基羰基、9
‑
芴基甲氧基羰基(“fmoc”)、硝基
‑
藜芦氧基羰基(“nvoc”)等。代表性的羟基保护基团包括但不限于其中羟基基团被酰化(酯化)或烷基化的那些，例如苄基和三苯甲基醚，以及烷基醚、四氢吡喃基醚、三烷基甲硅烷基醚(例如tms或tips基团)、二醇醚例如乙二醇衍生物和丙二醇衍生物和烯丙基醚。
[0572]“共价偶联”包括两个化学物种的直接键合和间接键合(例如，通过一连串居间原子)二者。例如，氨基酸可以直接与聚乙二醇共价偶联，例如通过在氨基酸的羧基和聚乙二
醇的羟基之间形成酯，或间接地，例如通过使聚乙二醇与表氯醇反应形成环氧丙基醚并使所得到的环氧化物与所述氨基酸的氨基基团反应，由此通过2
‑
羟丙基接头使氨基酸和聚乙二醇共价联接。用于直接或间接偶联多种部分的各种部分和反应在本领域中是公知的。在某些优选实施方式中，除非上下文另外指出，否则间接键合仅包含1
‑
10个居间原子(例如亚甲基、二丁基醚、三肽等)，最优选1
‑
6个居间原子。
[0573]
在本文中使用时，“预防”病症或病状的治疗剂是指在统计样本中相对于未治疗的对照样本减少经治疗的样本中病症或病状的发生，或相对于未治疗的对照样品延迟病症或病状的一种或多种症状的发作或降低其严重度。
[0574]
术语“治疗”包括预防性和/或治疗性治疗。术语“预防性或治疗性”治疗是本领域公认的，并且包括向宿主给药一种或多种主题组合物。如果它在不想要的病状(例如宿主动物的疾病或其它不想要的病状)临床表现之前给药，则治疗是预防性的(即，它保护宿主免于出现所述不想要的病状)，而如果它在表现出不想要的病状之后给药，则所述治疗是治疗性的(即意图减轻、缓解或稳定现有的不想要的病状或其不良反应)。
[0575]
术语“前药”旨在包涵在生理条件下转化成本发明的治疗活性剂的化合物。制造前药的常用方法是要包括一个或多个选定的部分，其在生理条件下水解以显露所需的分子。在其他实施方式中，前药通过宿主动物的酶活性转化。例如，酯或碳酸酯(例如醇或羧酸的酯或碳酸酯)是优选的前药。
[0576]
术语“抗体”是指通过免疫球蛋白分子的可变区内的至少一个抗原识别位点识别并特异性结合不同分子的免疫球蛋白分子。在本文中使用时，术语“抗体”包括完整多克隆抗体、完整单克隆抗体、抗体片段(例如fab片段、fab'片段、f(ab')2片段、fd片段和fv片段)、单链fv(scfv)突变体、多特异性抗体例如由两种或更多种完整抗体生成的双特异性抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、包含抗体的抗原决定部分的融合蛋白、以及包括抗原识别位点的任何其它修饰的免疫球蛋白分子。抗体可以是免疫球蛋白的五大类中的任何一类：iga、igd、ige、igg和igm，或其亚类(同种型)(例如，igg1、igg2、igg3、igg4、iga1和iga2)，基于其重链恒定域的身份，分别被称为α、δ、ε、γ和μ。不同类别的免疫球蛋白具有不同的和众所周知的亚基结构和三维构型。术语“抗体”不是指与免疫球蛋白序列不享有同源性的分子。例如，如本文中使用的术语“抗体”不包括“repebodies”。
[0577]
术语“抗体片段”是指完整抗体的一部分，并且是指完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的例子包括fab片段、fab'片段、f(ab')2片段、fd片段和fv片段，由抗体片段形成的线性抗体、单链抗体和多特异性抗体。
[0578]
术语“单克隆抗体”是指参与高度特异性识别和结合单一抗原决定簇或抗原决定表位的同质性抗体群。这与通常包括针对多种不同抗原决定簇的不同抗体的多克隆抗体相反。术语“单克隆抗体”包括抗体片段(例如fab、fab
′
、f(ab
′
)2、fd、fv)、单链(scfv)突变体、包括抗体部分的融合蛋白、和包括抗原识别位点的任何其他修饰的免疫球蛋白分子，以及完整和全长的单克隆抗体，但不限于此。另外，“单克隆抗体”是指通过许多方法制造的这样的抗体，所述方法包括但不限于杂交瘤、噬菌体选择、重组表达和转基因动物。
[0579]
术语“人源化抗体”是指非人(例如鼠科动物)抗体的形式，其是含有极少的非人(例如，鼠科动物)序列的特异性免疫球蛋白链、嵌合免疫球蛋白、或其片段。一般而言，人源化抗体是人免疫球蛋白，其中来自互补决定区(cdr)的残基被来自具有所需特异性、亲和性
和能力的非人物种(例如，小鼠、大鼠、兔和仓鼠)的cdr的残基替换(参见，例如，jones等，nature，321：522
‑
525(1986)；riechmann等，nature，332：323
‑
327(1988)；verhoeyen等，science，239：1534
‑
1536(1988))。在一些情况下，人免疫球蛋白的fv框架区(fr)残基被来自具有所需特异性、亲和力和/或结合能力的非人物种的抗体中的相应残基替换。人源化抗体还可以通过取代fv构架区中和/或所替换的非人残基内的其他残基来进一步修饰，以改进和优化抗体特异性、亲和力和/或结合能力。一般而言，人源化抗体包括基本上全部的至少一个、并且通常两个或三个可变结构域，该可变结构域含有全部或基本上全部的对应于非人免疫球蛋白的cdr，而全部或基本上全部的框架区(fr)具有人免疫球蛋白共有序列的那些框架区。人源化抗体也可以包括免疫球蛋白恒定区或结构域(fc)的至少一部分(通常是人免疫球蛋白的)。用于产生人源化抗体的方法的例子在美国专利号5,225,539中描述，其特此通过引用被并入。
[0580]
术语“人抗体”在本文中使用时是指使用本领域已知的任何技术通过人核苷酸序列编码的抗体或具有对应于由人产生的抗体的氨基酸序列的抗体。人抗体的该定义包括完整的全长抗体和/或其片段。
[0581]
术语“嵌合抗体”是指其中免疫球蛋白分子的氨基酸序列来源于两个或更多个物种(其中一种优选是人类)的一种抗体。一般而言，轻链和重链二者的可变区与来源于具有期望的特异性、亲和力和能力的一个哺乳动物物种(例如，小鼠、大鼠、兔等)的抗体的可变区对应，而恒定区与来源于另一个物种(通常是人类)的抗体中的序列同源，例如以避免在该物种中引起免疫应答。
[0582]
术语“表位”和“抗原决定簇”在本文中可互换使用，是指能够被特定抗体识别和特异性结合的抗原部分。当抗原是或包含多肽或蛋白质时，表位可由连续和/或非连续的氨基酸形成，例如通过蛋白质的二级、三级和/或四级折叠并置。由连续氨基酸形成的表位通常在蛋白质变性时被保留，而由三级折叠形成的表位在蛋白质变性时可能会丢失。表位通常以独特的空间构象包括3个或更多个、5个或更多个、或8至10个或更多个氨基酸。
[0583]
抗体与表位或抗原性分子“特异性结合”，这意味着与替代物质、包括无关蛋白质相比，抗体更频繁、更快速、持续时间更久、亲和力更高或以前述的一些组合与表位或抗原性分子相互作用或缔合。在具体实施方式中，“特异性结合”是指，例如，抗体以约0.1mm或更小、但更通常地小于约1μm的k
d
与蛋白质结合。在具体实施方式中，“特异性结合”是指抗体有时以约0.1μm或更小的k
d
、而有时以约0.01μm或更小的k
d
与蛋白质结合。因为不同物种中同源蛋白质之间的序列一致性，特异性结合可以包括识别超过一个物种中的特定蛋白质的抗体。应理解，特异性结合第一靶标的抗体或结合残基可以或可以不特异性结合第二靶标。如上所述，“特异性结合”不一定需要(尽管可以包括)独占性结合，即与单个靶标结合。通常，但不一定，本文中使用的术语结合是指特异性结合。
[0584]
抗体，包括其片段/衍生物以及单克隆抗体，可以使用本领域已知的方法获得(参见，例如，mccafferty等，nature 348：552
‑
554(1990)；clackson等，nature352：624
‑
628；marks等，j.mol.biol.222：581
‑
597(1991)；marks等，bio/technology 10：779
‑
783(1992)；waterhouse等，nucleic acids res.21：2265
‑
2266(1993)；morimoto等，j biochemical&biophysical methods 24：107
‑
117(1992)；brennan等，science 229：81(1985)；carter等，bio/technology 10：163
‑
167(1992)；kohler等，nature 256：495(1975)；kilpatrick等，
hybridoma 16(4)：381
‑
389(1997)；wring等，j.pharm.biomed.anal.19(5)：695
‑
707(1999)；bynum等，hybridoma 18(5)：407
‑
411(1999)，jakobovits等，proc.natl.acad.sci.usa，90：2551(1993)；jakobovits等，nature，362：255
‑
258(1993)；bruggemann等，year immuno.7：33(1993)；barbas等，proc.nat.acad.sci.usa 91：3809
‑
3813(1994)；schier等，gene 169：147
‑
155(1995)；yelton等，j.immunol.155：1994
‑
2004(1995)；jackson等，j.immunol.154(7)：3310
‑
9(1995)；hawkins等，j.mol.biol.226：889
‑
896(1992)，美国专利no.4,816,567、5,514,548、5,545,806、5,569,825、5,591,669、5,545,807；pct专利申请公布no.wo 97/17852，其各自特此以其整体通过引用被并入)。
[0585]
所述抗体可以是莫罗单抗
‑
cd3、阿昔单抗、利妥昔单抗、达利珠单抗、帕利珠单抗、英夫利昔单抗、曲妥珠单抗、依那西普、巴利昔单抗、吉妥珠单抗、阿仑单抗、替伊莫单抗、阿达木单抗、阿法赛特、奥马珠单抗、依法利珠单抗、托西莫单抗、西妥昔单抗、abt
‑
806、贝伐单抗、那他珠单抗、雷珠单抗、帕尼单抗、依库丽单抗、利纳西普、赛妥珠单抗、罗米司亭、amg
‑
531、戈利木单抗、优特克单抗、abt
‑
874、贝拉西普、贝利木单抗、阿塞西普、抗cd20抗体、卡纳单抗、托珠单抗、阿特珠单抗、美泊利单抗、帕妥珠单抗、humax cd20、曲美木单抗、替西木单抗、伊匹单抗、idec
‑
114、英妥珠单抗、humax egfr、阿柏西普、humax
‑
cd4、特普利珠单抗、奥特西珠单抗、卡妥索单抗、抗epcam抗体ign101、阿德木单抗(adecatumomab)、奥戈伏单抗、地努图希单抗、吉瑞昔单抗、地诺单抗、巴匹珠单抗、莫维珠单抗、依福谷单抗、瑞西巴库、ly2469298和维妥珠单抗。
[0586]
当抗体包含至少一条轻链和至少一条重链时，抗体的至少一条轻链、或抗体的至少一条重链、或二者可以包含具有能够被类异戊二烯转移酶识别的氨基酸基序的氨基酸区。由于抗体可以包含四条多肽链(例如两条重链和两条轻链)，所以抗体可以包含四个异戊二烯化序列，其中每一个都可以用于经由接头将活性剂与抗体缀合。因此，抗体
‑
药物缀合物可以包含4个接头，各与活性剂缀合。因此，抗体
‑
药物缀合物可以包含至少一个接头和至少一个活性剂。抗体
‑
药物缀合物可以包含至少两个接头，并且抗体
‑
药物缀合物可以包含至少两个活性剂。抗体
‑
药物缀合物可以包含1、2、3或4个接头。抗体
‑
药物缀合物可以包含1、2、3或4个活性剂。
[0587]
活性剂可以是药物、毒素、亲和配体、检测探针或任何上述的组合。
[0588]
活性剂可以选自：厄洛替尼；硼替佐米；氟维司群；索坦；来曲唑；甲磺酸伊马替尼；ptk787/zk222584；奥沙利铂；5
‑
氟尿嘧啶；亚叶酸；雷帕霉素(sirolimus)；拉帕替尼；洛那法尼；索拉非尼；吉非替尼；ag1478；ag1571；烷基化剂(例如噻替派或环磷酰胺)；烷基磺酸酯(例如白消安、英丙舒凡或哌泊舒凡)；氮丙啶(例如苯并多巴、卡巴醌、甲基多巴或脲多巴(乌瑞替派))；亚乙基亚胺，甲基三聚氰胺，六甲蜜胺，三亚乙基三聚氰胺；三亚乙基磷酰胺，三亚乙基硫代磷酰胺，三羟甲基三聚氰胺；内酯(acetogenins)(例如，布拉它辛或布拉它辛酮)；喜树碱以及喜树碱衍生物和代谢产物(sn
‑
38)；拓扑替康；苔藓抑素；卡利他汀；cc
‑
1065(包括它的阿多来新、卡折来新或比折来新合成类似物)；念珠藻素(例如，念珠藻素1或念珠藻素8)；多拉司他汀；多卡米星(包括合成类似物，例如kw
‑
2189和cb1
‑
tm1)；五加素；水鬼蕉碱；匍枝珊瑚醇；海绵抑制素；氮芥(例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、二氯甲基二乙胺、二氯甲基二乙胺氧化物盐酸盐、美法仑、新恩比兴、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥)；亚硝基脲(例如，卡莫司汀、氯脲霉素、福莫司汀、洛
莫司汀、尼莫司汀或雷莫司汀)；抗生素(例如烯二炔类抗生素，例如选自卡里奇霉素γ1i；卡里奇霉素ω1i的卡里奇霉素，或包括达内霉素(dynemicin)a的达内霉素)；双膦酸盐(例如氯膦酸盐；埃斯培拉霉素，新制癌菌素发色团，或相关的色蛋白烯二炔类抗生素的发色团，阿克拉霉素，放线菌素，安曲霉素，重氮丝氨酸，博来霉素，放线菌素c，卡比柔星，洋红霉素，嗜癌菌素，色霉素，更生霉素，柔红霉素，地托比星，6
‑
重氮
‑5‑
氧代
‑
l
‑
正亮氨酸，阿霉素(例如吗啉代阿霉素、氰基吗啉代阿霉素、2
‑
吡咯啉代
‑
阿霉素、脂质体阿霉素或脱氧阿霉素)，表柔比星，依索比星，麻西罗霉素，丝裂霉素(例如丝裂霉素c，霉酚酸，诺加霉素，橄榄霉素，派来霉素，泊非霉素(potfiromycin)，嘌呤霉素，三铁阿霉素，罗多比星，链霉黑素，链佐星，杀结核菌素，乌苯美司，净司他汀或佐柔比星)；抗代谢物(例如5
‑
氟尿嘧啶)；叶酸类似物(例如二甲叶酸、甲氨蝶呤、蝶罗呤或三甲曲沙)；嘌呤类似物(例如氟达拉滨、6
‑
巯基嘌呤、硫咪嘌呤或硫鸟嘌呤)；嘧啶类似物(例如安西他滨、阿扎胞苷、6
‑
氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨或氟尿苷)；雄激素(例如卡鲁睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷或睾内酯)；抗肾上腺物(例如氨鲁米特、米托坦或曲洛司坦)；叶酸补充剂(例如亚叶酸)；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；恩尿嘧啶；安吖啶；巴斯布西；比生群；依达曲沙；地磷酰胺；秋水仙胺；地吖醌；依氟鸟氨酸；依利醋铵；埃博霉素；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；美登素类化合物(例如美登素或安丝菌素)；单端孢霉烯类(特别是t
‑
2毒素、抚抱菌素a、杆孢菌素a或蛇形菌素)；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；二胺硝吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；洛索蒽醌；2
‑
乙基酰肼；甲基苄肼；多糖
‑
k复合物；雷佐生；根霉素；西佐糖；锗螺胺；细交链孢菌酮酸；三亚胺醌；2,2',2
”‑
三氯三乙胺；单端孢霉烯类(特别是t
‑
2毒素、抚抱菌素a、杆孢菌素a和蛇形菌素)；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；干胞嘧啶；阿拉伯糖苷；环磷酰胺；噻替派；紫衫烷类(例如紫杉醇)，无聚氧乙烯蓖麻油的abraxanetm(abraxanetm cremophor
‑
free)，紫杉醇的白蛋白工程纳米粒子制剂，多烯紫杉醇；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6
‑
硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；铂类似物(例如顺铂或卡铂)；长春花碱；铂；依托泊苷；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；米托蒽醌；替尼泊苷；依达曲沙；道诺霉素；氨基喋呤；希罗达；伊班膦酸盐；cpt
‑
11；拓扑异构酶抑制剂rfs 2000；二氟甲基鸟氨酸；类视色素(例如视黄酸)；卡培他滨，及其药学上可接受的盐、溶剂化物、酸或其衍生物，但不一定限于此。
[0589]
所述活性剂可以选自(i)用于调节或抑制激素对肿瘤的作用的抗激素剂，例如抗雌激素调节剂和选择性雌激素受体调节剂，包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬、屈洛昔芬、4
‑
羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、那洛昔芬、ly117018、奥那司酮和托瑞米芬；(ii)抑制芳香化酶的芳香化酶抑制剂，其调节肾上腺中的雌激素产生，例如4(5)
‑
咪唑、氨鲁米特、醋酸甲地孕酮、依西美坦、来曲唑和阿那曲唑；(iii)抗雄激素物例如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；以及曲沙他滨(一种1,3
‑
二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；(iv)芳香化酶抑制剂；(v)蛋白激酶抑制剂；(vi)脂质激酶抑制剂；(vii)反义寡核苷酸，特别是抑制粘连细胞中牵涉的信号通路中基因的表达的那些，例如，pkc
‑
α、raf、h
‑
ras；(viii)核酶，例如，vegf抑制剂例如核酶和her2表达抑制剂；(ix)疫苗例如基因疗法疫苗；疫苗、leuvectin疫苗、vaxid疫苗；苗、leuvectin疫苗、vaxid疫苗；拓扑异构酶1抑制剂；rmrh；(x)抗血管生成剂例如贝伐单抗；和(xi)其药学上可接受的
盐、溶剂化物、酸或衍生物。
[0590]
此外，细胞因子可以用作所述活性剂。细胞因子是由许多细胞分泌的小细胞信号蛋白分子，并且是广泛用于细胞间通讯的一类信号分子。细胞因子包括单核因子、淋巴因子、传统多肽激素等。细胞因子的例子包括生长激素(例如人生长激素、n
‑
甲硫氨酰基人生长激素或牛生长激素)；甲状旁腺素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素(例如促卵泡激素(fsh)、促甲状腺激素(tsh)或黄体化激素(lh))；肝生长因子；成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳素；肿瘤坏死因子
‑
α；肿瘤坏死因子
‑
β；缪勒抑制物质；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整合素，血小板生成素(tpo)；神经生长因子(例如，ngf
‑
β)；血小板生长因子；转化生长因子(tgf)(例如，tgf
‑
α或tgf
‑
β)；胰岛素样生长因子
‑
i，胰岛素样生长因子
‑
ii；红细胞生成素(epo)；骨诱导因子；干扰素(例如干扰素
‑
α、干扰素
‑
β或干扰素
‑
γ)；集落刺激因子(csf)(例如巨噬细胞
‑
csf(m
‑
csf)、粒细胞巨噬细胞
‑
csf(gm
‑
csf)或粒细胞
‑
csf(g
‑
csf))；白介素(il)(例如il
‑
1、il
‑
1α、il
‑
2、il
‑
3、il
‑
4、il
‑
5、il
‑
6、il
‑
7、il
‑
8、il
‑
9、il
‑
10、il
‑
11或il
‑
12)；肿瘤坏死因子(tnf)(例如，tnf
‑
α或tnf
‑
β)；以及多肽因子(例如lif或kit配体)，但不限于此。此外，术语“细胞因子”还包括来自天然来源或重组细胞培养物的细胞因子以及天然序列细胞因子的生物活性等同物。
[0591]
术语“毒素”是指对活细胞或生物体有毒的物质。毒素可以是能够在接触身体组织或被身体组织吸收之后，例如，通过与一种或多种生物大分子例如酶或细胞受体相互作用而引起细胞功能障碍或细胞死亡的小分子、肽或蛋白质。毒素包括植物毒素和动物毒素。动物毒素的例子包括白喉毒素、肉毒毒素、破伤风毒素、痢疾毒素、霍乱毒素、河豚毒素、短裸甲藻毒素和雪卡毒素，但不限于此。植物毒素的例子包括篦麻毒素和am
‑
毒素，但不限于此。
[0592]
小分子毒素的例子包括奥瑞他汀、微管蛋白裂解素、格尔德霉素(kerr等，1997，bioconjugate chem.8(6)：781
‑
784)、美登素类化合物(ep 1391213，acr2008，41，98
‑
107)、卡里奇霉素(美国专利公布no.2009/0105461，cancer res.1993，53，3336
‑
3342)、柔红霉素、阿霉素、甲氨蝶呤、长春地辛、sg2285(cancer res.2010，70(17)，6849
‑
6858)、多拉司他汀、多拉司他汀类似物奥瑞他汀(美国专利no.5,635,483)、念珠藻素、喜树碱、根霉素衍生物、cc 1065类似物或衍生物、倍癌霉素、烯二炔抗生素、埃斯培拉霉素、埃博霉素、吡咯并苯并二氮杂卓(pbd)衍生物、α
‑
鹅膏菌素、和类毒素，但不限于此。毒素可以通过微管蛋白结合、dna结合、拓扑异构酶抑制等展现细胞毒性和细胞生长抑制活性。
[0593]
术语“配体”是指能够与靶生物分子形成复合物的分子。配体的例子是与靶蛋白的预定位置结合以发送信号的分子。配体可以是底物、抑制剂、刺激剂、神经递质或放射性同位素。
[0594]“可检测部分”或“标记物”是指可通过光谱手段、光化学手段、生物化学手段、免疫化学手段、放射性手段或化学手段检测的组合物。例如，有用的标记物包括32p、35s、荧光染料、电子致密试剂、酶(例如elisa中常用的酶)、生物素
‑
链霉亲和素、洋地黄毒苷、半抗原、和可得到抗血清或单克隆抗体的蛋白质，或具有与靶标互补的序列的核酸分子。所述可检测部分通常产生可测量的信号，例如放射性、显色或荧光信号，其可用于量化样品中被结合的可检测部分的量。信号的定量可以通过例如闪烁计数、密度测定、流式细胞术、elisa(酶联免疫吸附测定)、或通过质谱直接分析完整的或随后消化的肽(可以评估一种或多种肽)
来实现。
[0595]
术语“探针”在本文中使用时是指一种材料，其可以(i)提供可检测信号，(ii)与第一探针或第二探针相互作用以修改由所述第一探针或第二探针提供的可检测信号，例如荧光共振能量传递(fret)，(iii))稳定与抗原或配体的相互作用或提高结合亲和力；(iv)通过物理参数例如电荷、疏水性等影响电泳迁移率或细胞侵入活性，或(v)控制配体亲和力、抗原
‑
抗体结合、或离子复合物形成。
[0596]
所述活性剂可以是免疫调节化合物、抗癌剂、抗病毒剂、抗细菌剂、抗真菌剂、抗寄生虫剂或其组合。
[0597]
免疫调节化合物可以选自氨基己酸、硫唑嘌呤、溴隐亭、苯丁酸氮芥、氯喹、环磷酰胺、环孢素、环孢素a、达那唑、脱氢表雄酮、地塞米松、依那西普、氢化可的松、羟氯喹、英夫利昔单抗、美洛昔康、甲氨喋呤、霉酚酸酯、泼尼松、西罗莫司和他克莫司。抗癌剂可以选自1
‑
甲基
‑4‑
苯基吡啶鎓离子、5
‑
乙炔基
‑1‑
β
‑
d
‑
呋喃核糖基咪唑
‑4‑
甲酰胺(eicar)、5
‑
氟尿嘧啶、9
‑
氨基喜树碱、放线菌素d、天冬酰胺酶、比卡鲁胺、双氯乙基亚硝基脲(bcnu)、博莱霉素、博来霉素a2、博来霉素b2、白消安、喜树碱、卡铂、卡莫司汀、cb1093、苯丁酸氮芥、顺铂、克立那托、环磷酰胺、阿糖胞苷、胞嘧啶阿拉伯糖苷、环磷酰胺、达卡巴嗪、更生霉素、柔红霉素、鸨烯咪胺、去铁胺、去甲氧基竹红菌素a、多西紫杉醇、去氧氟尿苷、阿霉素、eb1089、表柔比星、依托泊苷、氟尿苷、氟达拉滨、氟他胺、吉西他滨、戈舍瑞林、羟基脲、伊达比星、异环磷酰胺、干扰素
‑
α、干扰素
‑
γ、伊立替康、kh1060、醋酸亮丙瑞林、洛莫司汀、洛伐他汀、甲地孕酮、美法仑、巯基嘌呤、氨甲喋呤、丝裂霉素、丝裂霉素c、米托蒽醌、霉酚酸、氮芥、亚硝基脲、紫杉醇、培洛霉素、光敏剂pe4、酞菁、吡柔比星、普卡霉素、甲基苄肼、雷洛昔芬、雷替曲塞、雷利度胺、利巴韦林、星形孢菌素、他莫昔芬、替尼泊苷、沙利度胺、毒胡萝卜素、硫鸟嘌呤、噻唑羧胺核苷、拓扑替康、曲奥舒凡、曲美沙特、肿瘤坏死因子、万珂、维拉帕米、维替泊芬、长春碱、长春新碱、长春瑞滨和佐柔比星。抗病毒剂可选自盆尼西洛韦(pencicyclovir)、伐昔洛韦、甘兹可洛韦(gancicyclovir)、膦甲酸、利巴韦林、碘苷、阿糖腺苷、曲氟尿苷、阿昔洛韦、伐兹可洛韦(famcicyclovir)、金刚烷胺、金刚烷乙胺、西多福韦、反义寡核苷酸、免疫球蛋白和干扰素。抗细菌剂可选自氯霉素、万古霉素、甲硝唑、甲氧苄啶、磺胺二甲恶唑、奎奴普丁、达福普汀、利福平、壮观霉素和硝基呋喃妥英。抗真菌剂可选自两性霉素b、杀念珠菌素、菲律宾菌素、哈霉素(hamycin)、那他霉素、制霉菌素、龟裂霉素、联苯苄唑、布康唑、克霉唑、益康唑、芬替康唑、异康唑、酮康唑、卢立康唑、咪康唑、奥莫康唑、奥昔康唑、舍他康唑、硫康唑、噻康唑、阿巴康唑、氟康唑、艾沙康唑、伊曲康唑、泊沙康唑、雷夫康唑、特康唑、伏立康唑、阿巴芬净、阿莫洛芬、布替那芬、萘替芬、特比萘芬、阿尼芬净、卡泊芬净、米卡芬净、苯甲酸、环匹罗司、氟胞嘧啶、灰黄霉素、卤丙炔氧苯、托萘酯、十一碳烯酸、结晶紫、秘鲁香脂、环吡酮胺、吡罗克酮乙醇胺盐、巯氧吡啶锌和硫化硒。抗寄生虫剂可选自甲苯达唑、双羟萘酸噻嘧啶、噻苯达唑、乙胺嗪、伊维菌素、氯硝柳胺、吡喹酮、阿苯达唑、利福平、两性霉素b、美拉胂醇、依氟鸟氨酸、甲硝唑、替硝唑和米替福新。
[0598]
抗体可以包含选自ab
‑
hc
‑
(g)
z
cvim,ab
‑
hc
‑
(g)
z
cvll,ab
‑
lc
‑
(g)
z
cvim,和ab
‑
lc
‑
(g)
z
cvll的氨基酸基序，其中ab表示抗体，
‑
hc
‑
表示重链，
‑
lc
‑
表示轻链，g表示甘氨酸，c表示半胱氨酸，v表示缬氨酸，i表示异亮氨酸，m表示甲硫氨酸，l表示亮氨酸，并且z是0至20的整数。
[0599]
抗体
‑
药物缀合物的活性剂可以选自以下任何一种结构：
[0600]
[0601]
[0602][0603]
其中y是1至10的整数。
[0604]
抗体
‑
药物缀合物可以用于将活性剂转移到对象的靶细胞，从而利用本领域技术人员已知的制备组合物的方法来治疗对象。在一些方面，本发明涉及包含如本文所述的抗体
‑
药物缀合物的组合物(例如药物组合物)。
[0605]
组合物可以制备成可注射的形式，作为液体溶液或作为悬液。也可以制备适于注射的固体形式，例如作为乳液，或者将抗体
‑
药物缀合物囊封在脂质体中。抗体
‑
药物缀合物可以与药学上可接受的载体组合，其包括不诱导产生对接受载体的对象有害的抗体的任何载体。合适的载体通常包含代谢缓慢的大的巨分子，例如蛋白质、多糖、聚乳酸、聚乙醇酸、
聚合氨基酸、氨基酸共聚物、脂质聚集体等。
[0606]
组合物也可以含有稀释剂，例如水、盐水、甘油和乙醇。辅助物质，例如润湿剂或乳化剂、ph缓冲物质等，也可以存在于其中。组合物可以通过注射不经肠道给药，其中这种注射可以是皮下注射或肌内注射。在一些实施方式中，组合物可以被给药到肿瘤中。所述组合物可以插入(例如注射)到肿瘤中。另外的制剂适用于其他形式的给药，例如栓剂或口服给药。口服组合物可以作为溶液、悬液、片剂、丸剂、胶囊剂或缓释制剂给药。
[0607]
组合物可以按与剂量和制剂相容的方式给药。组合物优选包含治疗有效量的抗体
‑
药物缀合物。术语“治疗有效量”是指以有效治疗或预防疾病或病症的单一剂量或以多剂量方案给药的组合物。剂量可以取决于要治疗的对象、对象的健康和身体状况、想要的保护程度以及其他相关因素而变化。活性成分(例如抗体
‑
药物缀合物)的确切量可以取决于医生的判断。例如，治疗有效量的抗体
‑
药物缀合物或含有它的组合物可以被给药于患有癌症或肿瘤的患者以治疗所述癌症或肿瘤。
[0608]
根据本发明的抗体
‑
药物缀合物或含有它的组合物可以用其药学上可接受的盐或溶剂化物的形式给药。在一些实施方式中，根据本发明的抗体
‑
药物缀合物或含有它的组合物可以与药学上可接受的载体、药学上可接受的赋形剂和/或药学上可接受的添加剂一起给药。所述药学上可接受的盐或溶剂化物、赋形剂和添加剂的有效量和类型可以使用标准方法测量(参见，例如，雷氏药物科学(remington's pharmaceutical sciences)，mack publishing co.，easton，pa，18th edition，1990)。
[0609]
术语“治疗有效量”在关于癌症或肿瘤时是指可以减少癌细胞数量、减小癌细胞尺寸、抑制癌细胞侵入外周系统或减少侵入、抑制癌细胞扩散到其他系统或减少扩散、抑制癌细胞生长、和/或缓解至少一种与癌症相关的症状的量。在癌症治疗中，药物的有效性可以通过肿瘤进展时间(ttp)和/或反应率(rr)来评估。
[0610]
在本文中使用的术语“药学上可接受的盐”包括有机盐和无机盐。其例子包括盐酸盐，氢溴酸盐，氢碘酸盐，硫酸盐，柠檬酸盐，乙酸盐，草酸盐，氯化物，溴化物，碘化物，硝酸盐，硫酸氢盐，磷酸盐，酸式磷酸盐，异烟酸盐，乳酸盐，水杨酸盐，酸式柠檬酸盐，酒石酸盐，油酸盐，丹宁酸盐，pantonate，酒石酸氢盐，抗坏血酸盐，琥珀酸盐，马来酸盐，龙胆酸盐，富马酸盐，葡糖酸盐，葡糖醛酸盐，糖酸盐，甲酸盐，苯甲酸盐，谷氨酸盐，甲磺酸盐，乙磺酸盐，苯磺酸盐，对甲苯磺酸盐，和双羟萘酸盐(即1,1'
‑
亚甲基双
‑
(2
‑
羟基
‑3‑
萘甲酸盐))。药学上可接受的盐可以包括另一种分子(例如，乙酸根离子、琥珀酸根离子和/或其它反离子)。
[0611]
可用于本文所述的抗体
‑
药物缀合物的药学上可接受的溶剂化物的示例性溶剂包括水、异丙醇、乙醇、甲醇、二甲基亚砜、乙酸乙酯、乙酸和乙醇胺。
[0612]
在一些实施方式中，本发明涉及治疗对象的癌症的方法，其包括向所述对象给药包含如本文所述的抗体
‑
药物缀合物的药物组合物。药物组合物还可以包含治疗有效量的化疗剂。在优选实施方式中，所述对象是哺乳动物。例如，所述对象可以选自啮齿类动物、兔类动物、猫科动物、犬科动物、猪科动物、羊类动物、牛科动物、马科动物和灵长类动物。在某些优选实施方式中，所述对象是人类。
[0613]
示例
[0614]
下表列出了在以下所有实施例中使用的缩写：
[0615]
[0616]
[0617][0618]
实施例1.化合物1i的制备
[0619][0620]
化合物1b的制备
[0621]
在室温下，向5
‑
甲酰基水杨酸1a(10.0g，60.1mmol)在thf(30ml)中的悬液添加dipea(29.8ml，180mmol)和苄基溴(7.15ml，60.1mmol)。然后将反应混合物在回流下加热。在回流下18小时后，将反应混合物用2n hcl水溶液(100ml)稀释。将所得混合物用etoac(2
×
100ml)提取。将合并的有机层经无水mgso4干燥，过滤并浓缩。将剩余物通过柱色谱纯化而产生化合物1b(12.9g，83％)。1b(12.9g,83％).1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ11.38(s,1h),9.86(s,1h),8.40(s,1h),8.01(d,j＝8.8hz,1h),7.44(m,5h),7.12(d,j＝8.0hz,1h),5.42(s,2h)。
[0622]
化合物1c的制备
[0623]
向化合物1b(5.0g，19.5mmol)和化合物m(8.5g，21.4mmol，参见实施例66)在mecn(100ml)中的溶液添加分子筛(10g)和ag2o(18.0g，78.0mmol)。在n2下于室温搅拌12小时后，浓缩所述反应混合物。然后将浓缩的反应混合物用h2o(100ml)稀释并用etoac(2
×
200ml)提取。将合并的有机层经无水mgso4干燥，过滤并浓缩。将剩余物通过柱色谱纯化而产生化合物1c(8.63g，77％)。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ9.94(s,1h),8.28(s,1h),8.02(d,j＝8.8hz,1h),7.46
‑
7.28(m,6h),5.41
‑
5.32(m,6h),4.27(d,j＝9.2hz,1h),3.71(s,3h),2.05(m,9h)。
[0624]
化合物1d的制备
[0625]
在0℃下，向化合物1c(3.10g，5.41mmol)在i
‑
proh/chcl3(9ml/45ml)中的溶液添加硅胶(3g)和nabh4(0.41g，10.82mmol)。在n2下于0℃搅拌2小时后，用h2o(100ml)淬灭所述反应混合物并用etoac(200ml)提取。将有机层经无水mgso4干燥，将过滤并浓缩。粗产物通过柱色谱纯化以产生为白色固体的化合物1d(2.73g，87％)。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ7.74(s,1h),7.48
‑
7.34(m,6h),7.16(d,j＝8.8hz,1h),5.35
‑
5.26(m,5h),5.15(m,1h),4.17(m,1h),3.73(s,3h),2.04(s,9h),1.73(t,1h)。
[0626]
化合物1e的制备
[0627]
向化合物1d(2.40g，4.17mmol)在etoh(150ml)中的溶液添加pd/c(10wt.％，240mg)。在氢气下，将反应混合物在室温下搅拌10分钟。然后将所述反应混合物通过硅藻土垫过滤并用etoh(100ml)洗涤。将滤液浓缩以提供粗产物1e，为白色固体(2.10g)，其不经进一步纯化即使用。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ8.06(s,1h)7.61(dd,j＝8.8hz,1h),7.23(d,j＝8.0hz 1h),5.43
‑
5.29(m,5h),4.17(s,2h),4.32(d,j＝8.4hz,1h)3.69(s,3h),2.11
‑
2.08(t,9h),1.24(t,1h)。
[0628]
化合物1f的制备
[0629]
在室温下，向粗化合物1e(2.10g，4.33mmol)在dmf(50ml)中的溶液添加k2co3(1.79g，13.01mmol)和烯丙基溴(0.41ml，4.76mmol)。在室温下搅拌3小时后，将反应混合物用2n hcl水溶液(100ml)稀释。将所得混合物用etoac(200ml)提取。将有机层经无水mgso4干燥，过滤并浓缩。将剩余物通过柱色谱纯化而产生化合物1f(1.55g，2步骤下70％)。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ7.74(s,1h),7.45(dd,j＝8.0hz,2.0hz,1h),7.16(d,j＝8.8hz,1h),6.02(m,1h),5.40
‑
5.26(m,5h),5.16(m,1h),4.76(m,2h),4.66(s,2h),4.19(m,1h),3.73(s,3h),2.07
‑
2.05(m,9h),1.68(t,1h)。
[0630]
化合物1g的制备
[0631]
在n2下于0℃向化合物1f(2.50g，4.77mmol)在dmf(20ml)中的溶液添加碳酸双(4
‑
硝基苯基)酯(1.30g，4.29mmol)和dipea(0.80ml，4.77mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌30分钟，并使其升温至室温达1小时。将所述反应混合物用h2o(100ml)稀释并用etoac(200ml)提取。将有机层用浓盐水(100ml)洗涤并经无水mgso4干燥。过滤和减压浓缩后，将得到的粗产物通过柱色谱纯化而产生化合物1g(2.80g，85％)。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ8.28(d,j＝15.2hz,2h),7.85(d,j＝2.4hz,1h),7.55(dd,j＝3.2hz,2.4hz,1h),7.38(d,j＝15.2hz,2h),7.20(d,j＝8.8hz,1h)6.03(m,1h),5.42
‑
5.19(m,8h),4.78(d,j＝5.2hz,2h),4.12(d,j＝7.2hz,1h),3.74(s,3h)。
[0632][0633]
化合物1h的制备
[0634]
在0℃下将化合物1g(528mg，0.77mmol)、mmae(500mg，0.7mmol)和无水hobt(19mg，0.14mmol)溶解在dmf(3ml)中。然后添加吡啶(0.7ml)和dipea(0.24ml，1.39mmol)。在n2下于室温搅拌24小时后，将反应混合物用h2o/饱和nh4cl水溶液(100ml/50ml)稀释并用etoac(2
×
100ml)提取。将合并的有机层经无水mgso4干燥，过滤并浓缩。将剩余物通过柱色谱纯化而产生化合物1h(600mg，67％)。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1269.5，[m+na]
+
1291.5。
[0635]
化合物1i的制备
[0636]
在室温向化合物1h(600mg，0.47mmol)和三苯基膦(31mg，0.12mmol)在dcm(10ml)中的溶液添加吡咯烷(0.047ml，0.57mmol)和pd(pph3)4(27mg，0.02mmol)。搅拌2小时后，将
反应混合物用h2o/1n hcl水溶液(50ml/50ml)稀释并用etoac(3
×
50ml)提取。将合并的有机层经无水mgso4干燥，过滤并浓缩。将剩余物通过柱色谱(hex/etoac 1/1到etoac)纯化而产生化合物1i(480mg，82％)，为白色固体。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1228.4，[m+na]
+
1250.4。
[0637]
实施例2.化合物1j的制备
[0638][0639]
化合物1j通过制备实施例1中的化合物1i的类似方法从mmaf
‑
ome制备。
[0640]
实施例3.化合物2g的制备
[0641][0642]
化合物2a的制备
[0643]
在室温下将2
‑
(2
‑
(2
‑
氯乙氧基)乙氧基)乙醇(10g，59.3mmol)在氮气下溶解在dmf(90ml)中，然后向其中添加nan3(5.78g，88.9mmol)。在100℃下搅拌13小时后，向其中添加氯仿(200ml)和蒸馏水(300ml)以提取有机层，并将提取的有机层经无水na2so4干燥并减压浓缩。将剩余物进行柱色谱层析，产生化合物2a(10.3g，99％)。1h
‑
nmr(600mhz,cdcl3)δ3.75
‑
3.73(m,2h),3.70
‑
3.68(m,6h),3.63
‑
3.61(m,2h),3.40(t,j＝5.4hz,2h),2.20(t,j＝6.0hz,1h)。
[0644]
化合物2b的制备
[0645]
在氮气下于0℃将cbr4(21.4g，64.6mmol)溶解在dcm(100ml)中，然后向其中添加在dcm(100ml)中的三苯基膦(16.9g，64.6mmol)和化合物2a(10.3g，58.7mmol)，并将混合物在室温下搅拌13小时。反应结束后，向其中添加dcm(300ml)和蒸馏水(300ml)以提取有机层，并将提取的有机层经无水na2so4干燥并减压浓缩。将剩余物进行柱色谱层析，产生化合物2b(12g，85％)。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ3.83(t,j＝6.4hz,2h),3.72
‑
3.67(m,6h),3.48(t,j＝6.0hz,2h),3.40(t,j＝4.8hz,2h)。
[0646]
化合物2c的制备
[0647]
在室温下，将化合物2b(1g，4.20mmol)在氮气下溶解在mecn中，然后向其中添加n
‑
boc
‑
羟胺(643mg，4.82mmol)和dbu(0.66ml，4.41mmol)。在60℃下搅拌13小时后，向其中添加dcm(300ml)和蒸馏水(300ml)以提取有机层，并将提取的有机层经无水na2so4干燥并减压浓缩。将剩余物进行柱色谱层析，产生化合物2c(748mg，70％)。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ7.55(s,1h),4.05
‑
4.03(m,2h),3.76
‑
3.74(m,2h),3.74
‑
3.69(m,6h),3.42(t,j＝4.8hz,2h),1.49(s,9h)。
[0648]
化合物2d的制备
[0649]
将化合物2c(200mg，0.688mmol)溶解在meoh(5ml)中，然后向其中添加pd/c(10wt％，70mg)并在氢气下搅拌3小时。反应完成后，将反应混合物进行硅藻土过滤和减压浓缩，产生化合物2d(180mg，98％)。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ4.04
‑
4.01(m,2h),3.74
‑
3.62
(m,7h),3.55(t,j＝5.2hz,1h),2.88(t,j＝5.2hz,1h),2.81(t,j＝5.2hz,1h),1.64(s,2h),1.48(s,9h)。
[0650][0651]
化合物2e的制备
[0652]
向化合物1i(200mg，0.16mmol)和化合物2d(51mg，0.19mmol)在dmf(4ml)中的搅拌过的混合物添加dipea(0.042ml，0.32mmol)和pybop(126mg，0.24mmol)。在n2下于室温搅拌4小时后，将反应混合物用h2o(100ml)稀释并用etoac(2
×
100ml)提取。将合并的有机层经无水mgso4干燥，过滤并浓缩。将所得剩余物通过柱色谱纯化而产生化合物2e(142mg，60％)。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1474.7。
[0653]
化合物2f的制备
[0654]
在
‑
20℃向化合物2e(142mg，0.096mmol)在meoh(2ml)中的溶液添加在h2o(2ml)中的lioh一水合物(36mg，0.86mmol)。在0℃搅拌1小时后，将反应混合物用h2o/2n hcl水溶液(50ml/2ml)稀释并用chcl3(2
×
100ml)提取。将合并的有机层经无水mgso4干燥，过滤并浓缩以产生粗化合物2f(128mg)，其不经进一步纯化即使用。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1334.5。
[0655]
化合物2g的制备
[0656]
在0℃下，向粗化合物2f(105mg，0.08mmol)在dcm(3ml)中的溶液添加hcl(在1,4
‑
二噁烷中为4m，1ml)。1小时后，通过n2流除去溶剂和过量的hcl，然后将剩余物通过hplc纯化，产生化合物2g(47mg，46％)，为白色固体。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1234.4。
[0657]
实施例4.化合物2h的制备
[0658][0659]
通过实施例3中制备化合物2g的类似方法，从化合物1j和化合物2d制备化合物2h。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1248.9。
[0660]
实施例5.化合物3f的制备
[0661][0662]
化合物3a的制备
[0663]
将六乙二醇(1.0g，3.54mmol)、ag2o(1.23g，5.31mmol)和ki(117mg，0.71mmol)在dcm(10ml)中的混合物超声处理15min。将悬液冷却至
‑
30℃，逐滴添加对甲苯磺酰氯(688mg，3.61mmol)在dcm(13ml)中的溶液。然后将所述混合物逐渐升温至0℃并在此温度下保持15分钟。然后将所述反应混合物经无水mgso4干燥，过滤并浓缩以产生糖浆状剩余物。然后，通过柱色谱(etoac到etoac/meoh 10/1)纯化所述糖浆状剩余物。将纯级分蒸发而产生化合物3a(1.18g，77％)。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ7.80(d,j＝8.4hz,2h),7.34(d,j＝8.4hz,2h),4.16(m,2h),3.72
‑
3.58(m,22h),2.97(br,1h),2.45(s,3h)。
[0664]
化合物3b的制备
[0665]
将化合物3a(1.18g，2.71mmol)和nan3(264mg，4.07mmol)溶解在dmf(3ml)中。然后将反应混合物在100℃下加热。在100℃下15小时后，将反应混合物过滤并浓缩。将剩余物通过柱色谱(etoac到etoac/meoh 10/1)纯化而产生化合物3b(728mg，87％)。1h
‑
nmr(400mhz，cdcl3)δ3.75
‑
3.70(m，2h)，3.69
‑
3.63(m，18h)，3.62
‑
3.60(m，2h)，3.39(d，j＝5.2hz，2h)，3.07(br，1h)。
[0666]
化合物3c的制备
[0667]
在0℃向化合物3b(728mg，2.36mmol)在thf(10ml)中的搅拌过的溶液添加三乙胺(0.73ml，5.21mmol)和甲磺酸酐(619mg，3.55mmol)。2小时后，将libr(1.03g，11.8mmol)添加到所述搅拌过的溶液中，并将所得的反应混合物回流5小时。冷却至室温后，将反应混合物减压浓缩。将剩余物通过柱色谱(etoac到etoac/meoh 10/1)纯化而产生化合物3c(810mg，92％)。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ3.81(t,j＝6.4hz,2h),3.69
‑
3.65(m,18h),3.47(t,j＝6.4hz,2h),3.39(t,j＝5.2hz,2h)。
[0668]
化合物3d的制备
[0669]
在0℃下，将nah(在油中60％，564mg，12.9mmol)添加到化合物3c(3.42g，9.24mmol)和n,n
‑
二boc
‑
羟胺(2.80g，12.0mmol，通过pct公布no.wo2004/018466a2中的过程合成，所述pct公布特此通过参考被并入)在dmf(20ml)中的搅拌过的混合物中。将所述反应混合物升温至室温并在此温度下保持2小时。减压蒸发溶剂，将剩余物通过柱色谱(etoac/hex 1/20到1/5)纯化，产生化合物3d(3.51g，73％)。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ4.08(t,j＝4.8hz,2h),3.73(t,j＝4.8hz,2h),3.69
‑
3.62(m,18h),3.39(t,j＝5.6hz,2h),1.53(s,18h)。
[0670]
化合物3e的制备
[0671]
在0℃向化合物3d(123mg，0.23mmol)和在meoh(5ml)中的pd/c(10wt％，25mg)的搅拌过的混合物添加hcl(在1,4
‑
二噁烷中4n，0.05ml，0.21mmol)。在氢气下于室温搅拌5小时后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用meoh(100ml)洗涤。将滤液浓缩而产生化合物3e(118mg，95％)，为无色油，其不经进一步纯化即使用。1h
‑
nmr(400mhz,dmso
‑
d6)δ3.98(t,j＝4.4hz,2h),3.61
‑
3.51(m,22h),2.95(br,3h),1.46(s,18h).ei
‑
ms m/z:[m+h]
+
497.6。
[0672]
化合物3f的制备
[0673][0674]
通过与实施例3中制备化合物2g类似的方法，从化合物1i和化合物3e制备化合物3f。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1366.6，[m+na]
+
1389.6。
[0675]
实施例6.化合物3g的制备
[0676][0677]
通过与实施例3中制备化合物2g类似的方法，从化合物1i和化合物3e制备化合物3g。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1380.6，[m+na]
+
1403.6.
[0678]
实施例7.化合物4f的制备
[0679][0680]
化合物4a的制备
[0681]
向十二乙二醇(1.8g，3.2mmol)在dcm(18ml)中的搅拌过的溶液添加对甲苯磺酰氯(656mg，3.4mmol)、ag2o(1.13g，4.9mmol)和ki(108mg，0.65mmol)。在室温下搅拌30分钟后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用dcm(50ml)洗涤。将滤液浓缩。将所得剩余物通过柱色谱纯化而产生化合物4a(490mg，21％)，为浅黄色油。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ7.81(d,2h),7.35(d,2h),4.16(t,2h),3.72
‑
3.58(m,46h),2.82(br s,1h),2.45(s,3h)。
[0682]
化合物4b的制备
[0683]
将化合物4a(490mg，0.69mmol)和nan3(68mg，1.04mmol)溶解在dmf(16ml)中并将所述反应混合物在100℃加热3小时。将所述反应混合物过滤并浓缩。将粗产物通过柱色谱纯化而产生化合物4b(267mg，67％)。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ3.72
‑
3.60(m,46h),3.39(t,
2h),2.84(t,1h),3.40(m,2h)。
[0684]
化合物4c的制备
[0685]
在0℃向化合物4b(265mg，0.46mmol)在thf(10ml)中的搅拌过的溶液添加4
‑
甲基吗啉(0.066ml，0.60mmol)和甲磺酸酐(121mg，0.69mmol)。2小时后，将libr(120mg，1.38mmol)添加到搅拌过的溶液中，并将所得反应混合物回流6小时。冷却至室温后，将反应混合物减压浓缩。将剩余物通过柱色谱(etoac到etoac/meoh 10/1)纯化而产生化合物4c(178mg，60％)。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ3.81(t,2h),3.65(m,42h),3.47(t,2h),3.39(t,2h)。
[0686]
化合物4d的制备
[0687]
在0℃向化合物4c(175mg，0.27mmol)和在dmf(5ml)中的n
‑
boc
‑
羟胺(47mg，0.35mmol)的搅拌过的混合物添加nah(在油中60％，14mg，0.33mmol)。将所述反应混合物升温至室温并在此温度下保持12小时。减压蒸发除去溶剂，将剩余物通过柱色谱(meoh/chcl
3 1/20到1.5/20)纯化，产生化合物4d(148mg，78％)。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ4.00(t,2h),3.66(m,44h),3.39(t,2h),1.47(d,9h)。
[0688]
化合物4e的制备
[0689]
在0℃向化合物4d(148mg，0.21mmol)和在meoh(5ml)中的pd/c(10wt％，28mg)的搅拌过的混合物添加hcl(，在1,4
‑
二噁烷中4n，0.053ml，0.21mmol)。在氢气下于室温搅拌30分钟后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用meoh(30ml)洗涤。将滤液浓缩而产生化合物4e(142mg，96％)，为无色油，其不经进一步纯化即使用。1h
‑
nmr(400mhz,dmso
‑
d6)δ4.00(t,2h),3.92(t,2h),3.76
‑
3.64(m,42h),3.18(t,2h)1.47(s,9h)。
[0690]
化合物4f的制备
[0691][0692]
通过与实施例3中制备化合物2g类似的方法，从化合物1i和化合物4e制备化合物4f。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1631.9。
[0693]
实施例8.化合物4g的制备
[0694][0695]
通过与实施例3中制备化合物2g类似的方法，从化合物1j和化合物4e制备化合物4g。ei
‑
ms m/z：ei
‑
ms m/z[m+h]
+
1645.3。
[0696]
实施例9.化合物5e的制备
[0697][0698]
化合物5a的制备
[0699]
在n2下于0℃向2
‑
氨基乙醇(10g，164mmol)在dcm(70ml)中的溶液添加在dcm(30ml)中的三乙胺(3.9ml，28.1mmol)和氯甲酸苄酯(30ml，213mmol)。24小时后，浓缩所述反应混合物。将所得剩余物用h2o(50ml)稀释并用etoac(3
×
100ml)提取。将有机层合并，经无水mgso4干燥，过滤并浓缩。将粗产物通过柱色谱纯化而产生化合物5a(17g，53％)。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ7.40
‑
7.27(m,5h),5.11(s,2h),3.72(s,2h),3.56(s,2h),2.13(br s,1h)。
[0700]
化合物5b的制备
[0701]
在n2下于0℃向化合物5a(5.0g，25.6mmol)在dcm(70ml)三乙胺(3.9ml，28.1mmol)中的溶液添加在dcm(30ml)中的dmap(100mg，5.12mmol)和对甲苯磺酰氯(5.4g，28.1mmol)。在0℃下15小时后，将反应混合物用饱和nh4cl水溶液(100ml)稀释并用dcm(2
×
100ml)提取。将有机层合并，经无水mgso4干燥，过滤并浓缩。将粗产物通过柱色谱纯化而产生化合物5b(8.29g，92％)。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ7.77(d,j＝7.6hz,2h),7.40
‑
7.28(m,7h),5.07(s,3h),4.09(s,2h),3.45(s,2h),2.43(s,3h)。
[0702]
化合物5c的制备
[0703]
在n2下于0℃向化合物5b(2.0g，7.23mmol)在thf(20ml)中的溶液添加n,n
‑
二boc
‑
羟胺(1.7g，7.44mmol)和nah(300mg，6.86mmol)。在室温下搅拌17小时后，将反应混合物用饱和nh4cl水溶液(50ml)稀释并用etoac(3
×
50ml)提取。将有机层合并，经无水mgso4干燥，过滤并浓缩。将粗产物通过柱色谱纯化而产生化合物5c(375mg，16％)。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ7.45
‑
7.27(m,5h),5.11(s,2h),4.01(br s,2h),3.44(d,j＝4.8hz,2h),1.52(s,18h).ei
‑
ms m/z:[m+h]
+
410.7。
[0704]
化合物5d的制备
[0705]
向化合物5c(187mg，0.45mmol)在meoh(20ml)中的溶液添加pd/c(10％wt％，20mg)，然后将反应混合物在氢气下于室温搅拌4小时。将所述反应混合物通过硅藻土垫过滤并用meoh(20ml)洗涤。将滤液浓缩而产生化合物5d(120mg)，为无色油，其不经进一步纯化即使用。
[0706]
化合物5e的制备
[0707][0708]
通过与实施例3中制备化合物2g类似的方法，从化合物1i和化合物5d制备化合物5e。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1146.4。
[0709]
实施例10.化合物5f的制备
[0710][0711]
通过与实施例3中制备化合物2g类似的方法，从化合物1j和化合物5d制备化合物5f。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1160.3。
[0712]
实施例11.化合物6e的制备
[0713][0714]
化合物6a的制备
[0715]
向z
‑
asp(ome)
‑
oh(500mg，1.78mmol)和化合物2d(642mg，2.98mmol)在dmf(5ml)中的搅拌过的混合物添加dipea(1.2ml，9.96mmol)和hbtu(1.69g，6.22mmol)。将所述反应混合物在n2下于室温搅拌22小时。将所述反应混合物用h2o(100ml)稀释并用etoac(2
×
100ml)提取。将合并的有机层经无水na2so4干燥，过滤并浓缩。将所得剩余物通过柱色谱提纯而产生化合物6a(368mg，40％)。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ7.85
‑
7.70(m,1h),7.45
‑
7.28(m,5h),7.04(s,1h),6.02(d,j＝8.4hz,1h),5.11(s,2h),4.65
‑
4.50(m,1h),4.00(d,j＝3.6hz,2h),3.72
‑
3.30(m,10h),2.80(dd,j＝5.6hz,2h),1.46(s,9h)。
[0716]
化合物6b的制备
[0717]
在0℃向化合物6a(150mg，0.28mmol)和pd/c(10wt％，20mg)在meoh(5ml)中的搅拌过的混合物添加hcl(在1,4
‑
二噁烷中4n，0.07ml，0.28mmol)。在氢气下于室温搅拌2小时后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用meoh(20ml)洗涤。将滤液浓缩而产生化合物6b(169mg)，为无色油，其不经进一步纯化即使用。ei
‑
ms m/z：[m+1]
+
393.7。
[0718][0719]
化合物6c的制备
[0720]
向化合物1i(50mg，0.04mmol)和化合物6b(22mg，0.05mmol)在dmf(1ml)中的搅拌
过的混合物添加dipea(0.022ml，0.12mmol)和hbtu(20mg，0.05mmol)。将所述反应混合物在n2下于室温搅拌14小时。然后，将反应混合物用h2o(10ml)稀释并用etoac(2
×
20ml)提取。将合并的有机层经无水na2so4干燥，过滤并浓缩。将所得剩余物通过柱色谱提纯而产生化合物6c(38mg，60％)。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1604.5。
[0721]
化合物6d的制备
[0722]
在0℃向化合物6c(38mg，0.023mmol)在meoh(1ml)中的溶液添加在h2o(1ml)中的lioh一水合物(5mg，0.118mmol)。在0℃2小时后，用acoh将溶液的ph调节到4～5，并减压浓缩。将剩余物溶解在dmso(1.5ml)中并通过hplc纯化而产生化合物6d(26mg，78％)。
[0723]
ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1450.5。
[0724]
化合物6e的制备
[0725]
向化合物6d(26mg，0.018mmol)在dcm(1.5ml)中的搅拌过的溶液添加tfa(0.3ml)。在0℃下搅拌2小时后，通过n2流除去溶剂和过量的tfa。然后剩余物溶解在dmso(1ml)中并通过hplc纯化。将具有相同保留时间的纯级分合并并冻干而产生化合物6e(19.5mg，80％)，为白色固体。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1350.6。
[0726]
实施例12.化合物7e的制备
[0727][0728]
化合物7a的制备
[0729]
在0℃向化合物4c(6.10g，9.61mmol)和n,n
‑
二boc
‑
羟胺(2.69g，11.53mmol)在dmf(90ml)中的搅拌过的混合物添加nah(60wt％，500mg，12.49mmol)。将所述反应混合物加热至室温并在此温度下保持12小时。将所述反应混合物减压蒸发，并将所得剩余物通过柱色谱提纯。将纯级分真空蒸发而产生化合物7a(5.70g，75％)。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ4.05(t,2h),3.71(t,2h),3.64(m,42h),3.37(t,2h),1.51(d,18h)。
[0730]
化合物7b的制备
[0731]
在0℃向化合物7a(5.70g，7.21mmol)和pd/c(10wt％，570mg)在meoh(100ml)中的搅拌过的混合物添加hcl(在1,4
‑
二噁烷中4n，1.9ml，7.2mmol)。在氢气下于室温搅拌30分钟后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用meoh(30ml)洗涤。浓缩滤液而产生化合物7b(5.10g，87％)，为无色油，其不经进一步纯化即使用。1h
‑
nmr(400mhz,dmso
‑
d6)δ4.21(t,2h),4.07(s,2h),3.95
‑
3.78(m,42h),3.32(s,2h)1.63(s,18h)。
[0732][0733]
化合物7c的制备
[0734]
向在dmf(10ml)中的z
‑
asp(ome)
‑
oh(100mg，0.36mmol)和化合物7b(340mg，0.43mmol)的搅拌过的混合物添加dipea(0.25ml，1.42mmol)和hbtu(337g，0.89mmol)。将所述反应混合物在n2下于室温搅拌20小时。然后，将反应混合物用h2o(100ml)稀释并用etoac(2
×
100ml)提取。将合并的有机层经无水na2so4干燥，过滤并浓缩。将所得剩余物通过柱色谱提纯而产生化合物7c(123mg，58％)。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1024.2。
[0735]
化合物7d的制备
[0736]
在0℃向化合物7c(120mg，0.12mmol)和pd/c(10wt％，20mg)在meoh(5ml)中的搅拌过的混合物添加hcl(在1,4
‑
二噁烷中4n，0.03ml，0.12mmol)。在氢气下于室温搅拌2小时后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用meoh(20ml)洗涤。浓缩滤液而产生化合物7d(120mg)，为无色油，其不经进一步纯化即使用。
[0737]
化合物7e的制备
[0738][0739]
通过与实施例11中制备化合物6e类似的方法，从化合物1i和化合物7d制备化合物7e。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1747.1。
[0740]
实施例13.化合物8f的制备
[0741][0742]
化合物8a的制备
[0743]
向2
‑
(2
‑
(2
‑
氯乙氧基)乙氧基)乙醇(5.0g，29.6mmol)在丙酮(30ml)中的溶液添加nai(13.3g，88.9mmol)。将反应混合物回流12小时。反应结束后，将反应混合物过滤并浓缩。将粗产物通过柱色谱纯化而产生化合物8a(7.0g，91％)。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ3.80
‑
3.73(m,4h),3.72
‑
3.65(m,4h),3.63
‑
3.61(m,2h),3.27(t,j＝6.4hz,2h)。
[0744]
化合物8b的制备
[0745]
在n2下于0℃向化合物8a(2.0g，7.69mmol)和n,n
‑
二boc
‑
羟胺(2.33g，10.00mmol)在dmf(20ml)中的搅拌过的混合物添加nah(500mg，12.49mmol)。在室温下搅拌17小时后，将反应混合物用饱和nh4cl水溶液(50ml)稀释并用etoac(3
×
50ml)提取。将有机层合并，经无水mgso4干燥，过滤并浓缩。将粗产物通过柱色谱纯化而产生化合物8b(1.54g，54％)。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ7.45
‑
7.27(m,5h),5.11(s,2h),4.01(br s,2h),3.44(d,j＝4.8hz,2h),1.52(s,18h).ei
‑
ms m/z:[m+h]
+
410.7。
[0746]
化合物8c的制备
[0747]
在n2下于0℃向化合物8b(123mg，0.242mmol)在dmso(2ml)和dcm(2ml)中的搅拌过的溶液添加so3‑
吡啶复合物(116mg，0.726mmol)和三乙胺(0.17ml，1.21mmol)。1小时后，将反应混合物用饱和nh4cl水溶液(10ml)稀释并用dcm(2
×
10ml)提取。合并有机层，经无水mgso4干燥，并过滤。减压浓缩提供化合物8c(88mg)，其不经进一步纯化即使用。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ9.74(s,1h),4.19(s,2h),3.77
‑
3.69(m,6h),3.42(m,2h)。
[0748][0749]
化合物8d的制备
[0750]
在n2下于0℃向
‑
谷氨酸(500mg，0.339mmol)在meoh(10ml)中的溶液添加亚硫酰氯(0.148ml，2.04mmol)。24小时后，浓缩反应混合物而产生化合物8d(697mg)，其不经进一步纯化即使用。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ7.40
‑
7.27(m,5h),5.11(s,2h),3.72(s,2h),3.56(s,2h),2.13(br s,1h)。
[0751]
化合物8e的制备
[0752]
在n2下于室温向化合物8d(34mg，0.16mmol)和化合物8c(88mg，0.24mmol)在meoh(5ml)中的溶液添加nacnbh3(10mg，0.16mmol)。3小时后，将反应混合物过滤并浓缩。将粗产物通过柱色谱纯化而产生化合物8e(53mg，63％)。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ7.45
‑
7.25(m,10h),5.60(br s,2h),5.03(s,4h),3.80
‑
3.25(m,20h),2.81(s,4h)。
[0753]
化合物8f的制备
[0754][0755]
通过与实施例11中制备化合物6e类似的方法，从化合物1i和化合物8e制备化合物8f。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1365.0。
[0756]
实施例14.化合物9j的制备
[0757][0758]
化合物9a的制备
[0759]
在n2下于0℃向六乙二醇(10.48g，37.12mmol)在dcm(400ml)中的溶液中添加咪唑
(3.20g，44.54mmol)。5分钟后，在相同温度和n2气氛下将所述反应混合物滴加到tbscl(5.60g，37.12mmol)在dcm(50ml)中的溶液。将所述反应混合物在0℃下搅拌并在n2下升温至室温21小时。反应完成后，将反应混合物用水(200ml)稀释并用dcm(2
×
100ml)提取。将有机层经无水na2so4干燥并减压浓缩。将所得剩余物通过柱色谱提纯。将纯级分真空蒸发而产生化合物9a(6.70g，46％)。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ3.77
‑
3.71(m,4h),3.66
‑
3.60(m,18h),3.56
‑
3.54(t,2h),0.89(s,9h),0.06(s,6h)。
[0760]
化合物9b的制备
[0761]
在n2下于0℃向化合物9a(3.32g，8.37mmol)在无水thf(40ml)中的溶液添加nah(在油中55％，438mg，10.05mmol)。30分钟后，在n2下于相同温度将mei(0.78ml，12.56mmol)添加到所述反应混合物中。在n2下搅拌所述反应混合物并升温至室温达18小时。反应完成后，用h2o(10ml)猝灭并用ea(3
×
10ml)提取。合并有机层，用饱和nh4cl水溶液(5ml)和盐水(10ml)洗涤，经无水na2so4干燥并减压蒸发。将所得剩余物通过柱色谱提纯。将纯级分真空蒸发而产生化合物9b(3.16g，92％)。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ3.78
‑
3.75(t,2h),3.65(s,20h),3.57
‑
3.54(t,4h),3.38(s,3h),0.89(s,9h),0.06(s,6h)。
[0762]
化合物9c的制备
[0763]
在n2下于0℃向化合物9b(3.16g，7.69mmol)在丙酮(100ml)中的溶液添加jones试剂(10ml)。在n2下搅拌所述反应混合物并升温至室温达17小时。反应完成后，将反应混合物过滤并减压蒸发。将剩余物用h2o(100ml)稀释并用chcl3(3
×
50ml)提取。合并有机层，经无水na2so4干燥并减压蒸发。所得粗化合物9c(2.28g，95％)不经进一步纯化即使用。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ4.16(s,2h),3.76
‑
3.75(t,2h),3.69
‑
3.67(m,16h),3.57
‑
3.55(t,2h),3.38(s,3h)。
[0764]
化合物9d的制备
[0765]
将dipea(3.8ml，22.03mmol)、hobt(1.29g，9.55mmol)和edc
·
hcl(1.83g，9.55mmol)添加到化合物9c(2.28g，7.34mmol)和h
‑
lys(z)
‑
ome盐酸盐(2.91g，8.81mmol)在dmf(30ml)中的搅拌过的混合物中。在n2下于室温搅拌14小时后，浓缩所述反应混合物。通过柱色谱纯化提供化合物9d(1.23g，72％)。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ7.38
‑
7.31(m,5h),5.10(s,2h),5.00(s,1h)4.68
‑
4.62(m,1h),4.03(s,2h),3.75(s,3h),3.68
‑
3.64(m,16h),3.56(t,2h),3.39(s,3h),3.20(m,2h),1.89(m,1h),1.74(m,1h),1.55(m,1h),1.40(m,1h).ei
‑
ms m/z:[m+h]
+
586.8,[m+na]
+
608.9。
[0766]
化合物9e的制备
[0767]
在n2下于0℃向化合物9d(2.16g，3.68mmol)在thf/meoh/h2o(18ml/6ml/6ml)中的溶液添加lioh一水合物(307mg，7.31mmol)。将所述反应混合物在室温下搅拌1小时。然后用1n hcl水溶液将所述溶液的ph调节到2～3。将所述反应混合物倒入h2o(20ml)并用dcm(3
×
50ml)提取。合并有机层，经na2so4干燥。过滤和浓缩产生化合物9e(2.28g，99％)，其不经进一步纯化即使用。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ7.34
‑
7.30(m,5h),5.08(s,2h),4.66
‑
4.60(q,1h),4.01(s,2h),3.67
‑
3.55(m,18h),3.37(s,3h),3.20(m,2h),1.87(m,1h),1.72(m,1h),1.53(m,1h),1.38(m,1h)。
[0768]
化合物9f的制备
[0769]
将dipea(0.45ml，2.63mmol)、hobt(154mg，0.11mmol)和edc
·
hcl(218mg，
0.11mmol)添加到化合物9e(502mg，0.88mmol)和化合物7b(700mg，0.88mmol)在dmf(8ml)中的搅拌过的混合物中。在n2下于室温搅拌14小时后，将反应混合物倒入h2o(20ml)中并用etoac(3
×
20ml)提取。将合并的有机层用nahco3水溶液(20ml)和浓盐水(20ml)洗涤并经无水na2so4干燥。过滤和减压浓缩后，将所得剩余物通过柱色谱提纯而产生化合物9f(499mg，43％)。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ7.35
‑
7.30(m,5h),6.83(s,1h),5.15(s,1h),5.08(s,2h),4.43(q,1h)4.07(t,1h),3.65
‑
3.60(m,54h),3.55
‑
3.53(m,4h),3.37(s,3h),3.16(m,2h),1.85(m,1h),1.53
‑
1.52(d,19h),1.38(m,2h).ei
‑
ms m/z:[m+h]
+
1337.5。
[0770]
化合物9g的制备
[0771]
在0℃向化合物9f(499mg，0.37mmol)和pd/c(10wt％，50mg)在meoh(20ml)中的搅拌过的混合物添加hcl(在1,4
‑
二噁烷中4n，0.1ml，0.37mmol)。在氢气下于室温搅拌90分钟后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用meoh(10ml)洗涤。浓缩滤液而产生化合物9g(458mg，98％)，为无色油，其不经进一步纯化即使用。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1218.6。
[0772][0773]
化合物9h的制备
[0774]
将dipea(0.019ml，0.11mmol)和hbtu(18mg，0.05mmol)添加到化合物1i(45mg，0.04mmol)和化合物9g(57mg，0.05mmol)在dmf(0.5ml)中的搅拌过的混合物中。将所述反应混合物在n2下于室温搅拌14小时。将所述反应混合物用h2o/dmso(1.5ml/1.5ml)稀释并通过hplc纯化，产生化合物9h(65mg，57％)。ei
‑
ms m/z：1/2[m+h]
+
1181.7。
[0775]
化合物9i的制备
[0776]
在0℃向化合物9h(65mg，0.03mmol)在meoh(1.5ml)中的溶液添加在h2o(1.5ml)中的lioh一水合物(10mg，0.24mmol)。在0℃下1小时后，用acoh将溶液的ph调节到4～5并减压浓缩。然后将所述反应混合物溶解在h2o/dmso(1.5ml/1.5ml)中并通过hplc纯化，产生化合物9i(45mg，55％)。ei
‑
ms m/z：1/2[m+na]
+
1098.7。
[0777]
化合物9j的制备
[0778]
将tfa(0.2ml)添加到化合物9i(45mg，0.02mmol)在dcm(1ml)中的搅拌过的溶液中。在0℃搅拌30分钟后，通过n2流除去溶剂和过量的tfa。然后将剩余物溶解在h2o/dmso(1ml/1ml)中并通过hplc纯化。将具有相同保留时间的纯级分合并并冻干而产生化合物9j
(14mg，32％)，为白色固体。ei
‑
ms m/z：1/2[m+h]
+
1026.3。
[0779]
实施例15.化合物10c的制备
[0780][0781]
化合物10a的制备
[0782]
将dipea(0.03ml，0.17mmol)、hobt(10mg，0.075mmol)和edc
·
hcl(14mg，0.075mmol)添加到化合物9e(33mg，0.058mmol)和化合物7d(54mg，0.058mmol)在dmf(3ml)中的搅拌过的混合物中。在n2下于室温搅拌14小时后，将反应混合物倒入h2o(10ml)并用etoac(3
×
10ml)提取。将合并的有机层用1n hcl水溶液(8ml)、饱和nahco3水溶液(8ml)和浓盐水(8ml)洗涤，并经无水na2so4干燥。过滤和浓缩后，将剩余物通过柱色谱纯化，产生化合物10a(61mg，73％)。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1445.0，[m+h
‑
boc]
+
1344.9。
[0783]
化合物10b的制备
[0784]
在0℃向化合物10a(60mg，0.04mmol)和pd/c(10wt％，30mg)在meoh(10ml)中的搅拌过的混合物添加hcl(在1,4
‑
二噁烷中4n，0.01ml，0.01mmol)。在氢气下于室温搅拌3小时后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用meoh(40ml)洗涤。浓缩滤液而产生化合物10b(56mg，100％)，为无色油，其不经进一步纯化即使用。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1311.0，[m+na+]
+
1332.9。
[0785]
化合物10c的制备
[0786][0787]
通过与实施例14中制备化合物9j类似的方法，从化合物1i和化合物10b制备化合物10c。ei
‑
ms m/z：1/2[m+h]
+
1083.8。
[0788]
实施例16.化合物10d的制备
[0789][0790]
通过与实施例14中制备化合物9j类似的方法，从化合物1j和化合物10b制备化合物10d。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
2181.3，1/2[m+h]
+
1091.3。
[0791]
实施例17.化合物11j的制备
[0792][0793]
化合物11a的制备
[0794]
在室温向化合物3a(8.0g，18.3mmol)在thf(50ml)中的溶液添加libr(7.9g，91.6mmol)。在回流下搅拌17小时后，将反应混合物过滤并浓缩。将粗产物通过柱色谱纯化而产生化合物11a(3.2g，50％)。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ3.95
‑
3.50(m,24h)。
[0795]
化合物11b的制备
[0796]
在0℃向化合物11a(3.2g，12.3mmol)在丙酮(20ml)中的溶液添加jones试剂(20ml)。在0℃下15小时后，将反应混合物过滤并浓缩。将剩余物用h2o(50ml)稀释并用etoac(2
×
100ml)提取。合并有机层，经无水mgso4干燥，过滤并浓缩。将粗产物通过柱色谱纯化而产生化合物11b(3.2g，72％)。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ4.16(s,2h),3.95
‑
3.30(m,20h)。
[0797]
化合物11c的制备
[0798]
在n2下于0℃向化合物11b(3.2g，8.90mmol)在meoh(30ml)中的溶液添加草酰氯(1.15ml，13.3mmol)。16小时后，将反应混合物浓缩并通过柱色谱纯化，产生化合物11c(2.7g，81％)。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ4.17(s,2h),3.80
‑
3.60(m,21h),3.47(t,j＝6.4hz,2h)。
[0799]
化合物11d的制备
[0800]
将化合物11c(1.0g，2.67mmol)和nan3(261mg，4.01mmol)溶解在dmf(3ml)中。将反应混合物在100℃加热5小时。反应完成后，将反应混合物过滤并浓缩。将剩余物通过柱色谱(etoac到etoac/meoh 10/1)纯化，产生化合物11d(854mg，95％)。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ4.17(s,2h),3.76
‑
3.64(m,21h),3.39(t,j＝5.2hz,2h)。
[0801]
化合物11e的制备
[0802]
在0℃向化合物11d(854mg，2.54mmol)在meoh(25ml)中的搅拌过的溶液添加2m naoh水溶液(6.3ml，12.64mmol)。将反应混合物在室温下搅拌3小时。然后将所述溶液减压浓缩。将所得的悬液在0℃冷却的同时，用2n hcl水溶液酸化。将剩余物通过chcl3(8
×
50ml)提取。合并有机层，经na2so4干燥并浓缩，产生化合物11e(783mg，96％)。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ4.16(s,2h),3.76
‑
3.65(m,18h),3.40(t,j＝5.2hz,2h)。
[0803][0804]
化合物11f的制备
[0805]
将dipea(0.47ml，2.72mmol)、hobt(160mg，1.18mmol)和edc
·
hcl(226mg，1.18mmol)添加到化合物9e(520mg，0.91mmol)和化合物2d(270mg，0.91mmol)在dmf(5ml)中的搅拌过的混合物中。在n2下于室温搅拌14小时后，将反应混合物倒入h2o(20ml)中并用etoac(3
×
10ml)提取。将合并的有机层用1n hcl水溶液(15ml)、饱和nahco3水溶液(15ml)和浓盐水(15ml)洗涤，并经无水na2so4干燥。过滤并浓缩后，剩余物通过柱色谱纯化，产生化合物11f(631mg，85％)。
[0806]
ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
819.1，[m+h
‑
boc]
+
719.1[m+na+]
+
841.1。
[0807]
化合物11g的制备
[0808]
在0℃向化合物11f(300mg，0.36mmol)和pd/c(10wt％，70mg)在meoh(20ml)中的搅拌过的混合物添加hcl(在1,4
‑
二噁烷中4n，0.08ml，0.08mmol)。在氢气下于室温搅拌3小时后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用meoh(40ml)洗涤。浓缩滤液而产生化合物11g(200mg，99％)，为无色油，其不经进一步纯化即使用。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
685.1，[m+na]
+
707.1。
[0809]
化合物11h的制备
[0810]
将dipea(0.024ml，0.41mmol)、hobt(24mg，0.18mmol)和edc
·
hcl(34mg，0.18mmol)添加到化合物11g(100mg，0.14mmol)和化合物11e(44mg，0.14mmol)在dmf(5ml)中的搅拌过的混合物中。在n2下于室温搅拌14小时后，将反应混合物倒入h2o(10ml)中并用etoac(3
×
10ml)提取。将合并的有机层经无水na2so4干燥。过滤并浓缩后，将剩余物通过柱
色谱纯化，产生化合物11h(73mg，53％)。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
988.4，[m+na
‑
boc]
+
888.2，[m+na]
+
1010.4。
[0811]
化合物11i的制备
[0812]
在0℃向化合物11h(73mg，0.07mmol)和pd/c(10wt％，10mg)在meoh(7ml)中的搅拌过的混合物添加hcl(在1,4
‑
二噁烷中4n，0.018ml，0.018mmol)。在氢气下于室温搅拌2小时后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用meoh(30ml)洗涤。浓缩滤液而产生化合物11i(72mg，99％)，为无色油，其不经进一步纯化即使用。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
962.4，[m+na]
+
984.4。
[0813]
化合物11j的制备
[0814][0815]
通过与实施例14中制备化合物9j类似的方法，从化合物1i和化合物11i制备化合物11j。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1932.5。
[0816]
实施例18.化合物11k的制备
[0817][0818]
通过与实施例14中制备化合物9j类似的方法，从化合物1j和化合物11i制备化合物11k。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1947.1。
[0819]
实施例19.化合物12c的制备
[0820][0821]
化合物12a的制备
[0822]
将dipea(0.13ml，0.77mmol)和hbtu(110mg，0.35mmol)添加到化合物9g(235mg，0.1929mmol)和z
‑
asp(ome)
‑
oh(54mg，0.212mmol)在dmf(5ml)中的搅拌过的混合物中。在n2下于室温搅拌14小时后，将反应混合物倒入h2o(20ml)中并用etoac(3
×
10ml)提取。将合并的有机层用1n hcl水溶液(7ml)、饱和水溶液nahco3(7ml)和浓盐水(7ml)洗涤，并经无水na2so4干燥。过滤并浓缩后，将剩余物通过柱色谱纯化，产生化合物12a(260mg，93％)。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ8.07(t,1h),7.62(t,1h),7.54
‑
7.52(m,1h),5.73(s,2h),4.27
‑
4.25(q,1h),3.96(t,2h),3.88(s,2h),3.82(s,2h),3.58
‑
3.48(m,52h),3.19
‑
3.18(m,3h),3.04
‑
3.03(m,3h),1.44(s,18h),1.39
‑
1.37(m,3h),1.21
‑
1.19(m,3h).ei
‑
ms m/z:[m+h
‑
2boc]
+
1031.6。
[0823]
化合物12b的制备
[0824]
在0℃向化合物12a(260mg，0.179mmol)和pd/c(10wt％，72mg)在meoh(20ml)中的搅拌过的混合物添加hcl(在1,4
‑
二噁烷中4n，0.040ml，0.179mmol)。在氢气下于室温搅拌3小时后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用meoh(40ml)洗涤。浓缩滤液而产生化合物12b(242mg，100％)，为无色油，其不经进一步纯化即使用。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
625.0，[m+h
‑
boc]
+
525.0，[m+h
‑
2boc]
+
424.9。
[0825]
化合物12c的制备
[0826][0827]
通过与实施例14中制备化合物9j类似的方法，从化合物1i和化合物12b制备化合物12c。ei
‑
ms m/z：1/2[m+h]
+
1083.5。
[0828]
实施例20.化合物12d的制备
[0829][0830]
通过与实施例14中制备化合物9j类似的方法，从化合物1j和化合物12b制备化合物12d。ei
‑
ms m/z：1/2[m+h]
+
1090.5.
[0831]
实施例21.化合物13e的制备
[0832][0833]
化合物13a的制备
[0834]
将dipea(0.22ml，1.25mmol)和hbtu(356mg，0.94mmol)添加到z
‑
glu(ome)
‑
oh(222mg，0.75mmol)和化合物7b(500mg，0.62mmol)在dmf(5.0ml)中的搅拌过的混合物中。将反应混合物在n2下于室温搅拌14小时。将所述反应混合物用水(200ml)稀释并用ea(3
×
100ml)提取。将有机层经无水mgso4干燥，过滤并减压浓缩。将所得剩余物通过柱色谱提纯而产生化合物13a(370mg，57％)。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ7.34(br,5h),6.73(br,1h),5.72(d,j＝7.6hz,1h),5.06(br,2h),4.28
‑
4.18(m,1h),4.07(t,j＝4.4hz,2h),3.76
‑
3.71(m,2h),3.70
‑
3.50(m,45h),3.48
‑
3.42(m,2h),2.53
‑
2.36(m,2h),2.20
‑
2.08(m,1h),2.00
‑
1.88(m,1h),1.53(s,18h).ei
‑
ms m/z:[m+na]
+
1061.2。
[0835]
化合物13b的制备
[0836]
将在1,4
‑
二噁烷中的4n hcl(0.08ml，0.32mmol)在0℃下添加到化合物13a(370mg，0.35mmol)、和pd/c(38mg)在meoh(8ml)中的搅拌过的混合物中。在氢气下于室温搅拌20小时后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用meoh(400ml)洗涤。浓缩滤液，产生化合物13b(301mg，90％)，为黄色液体，其不经进一步纯化即使用。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ8.41
(br,1h),8.09(br,3h),4.13(br,1h),3.85
‑
3.56(m,51h),2.55(br,2h),2.38
‑
2.18(m,2h),1.53(s,18h).ei
‑
ms m/z:[m+h]
+
905.0。
[0837]
化合物13c的制备
[0838]
将dipea(0.165ml，0.96mmol)和hbtu(279mg，0.74mmol)添加到化合物13b(300mg，0.32mmol)和化合物9e(366mg，0.64mmol)在dmf(5.0ml)中的搅拌过的混合物中。将反应混合物在n2下于室温搅拌14小时。将所述反应混合物用水(200ml)稀释并用etoac(3
×
100ml)提取。将有机层经无水mgso4干燥，过滤并减压浓缩。将所得剩余物通过柱色谱提纯而产生化合物13c(290mg，62％)。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ7.40
‑
7.32(m,7h),7.00(br,1h),6.73(br,1h),5.07(br,2h),4.44
‑
4.36(m,2h),4.07(t,j＝4.8hz,2h),4.02(br,2h),3.73(t,j＝5.2hz,2h),3.71
‑
3.52(m,68h),3.24
‑
3.14(m,2h),2.52
‑
2.34(m,3h),2.18
‑
2.06(m,2h),1.98
‑
1.82(m,4h),1.76
‑
1.64(m,3h),1.53(s,18h).ei
‑
ms m/z:[m+h]
+
1459.7。
[0839]
化合物13d的制备
[0840]
将pd/c(21mg)在0℃下添加到化合物13c(290mg，0.19mmol)在meoh(5ml)中的搅拌过的混合物中。在氢气下于室温搅拌20小时后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用meoh(400ml)洗涤。浓缩滤液，产生化合物13c(247mg，94％)，为黄色液体，其不经进一步纯化即使用。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ8.20(d,j＝8.4hz,1h),7.74(br,1h),7.30(br,1h),4.66
‑
4.48(m,2h),4.07(t,j＝5.2hz,2h),4.01(br,2h),3.74
‑
3.62(m,70h),3.57
‑
3.53(m,2h),3.04
‑
2.98(m,2h),2.24
‑
2.15(m,2h),2.14
‑
2.06(m,2h),1.99
‑
1.86(m,4h),1.84
‑
1.74(m,2h),1.53(s,18h).ei
‑
ms m/z:[m+h]
+
1325.5。
[0841]
化合物13e的制备
[0842][0843]
通过与实施例14中制备化合物9j类似的方法，从化合物1i和化合物13d制备化合物13e。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
2181.5。
[0844]
实施例22.化合物13f的制备
[0845][0846]
通过与实施例14中制备化合物9j类似的方法，从化合物1j和化合物13d制备化合物13f。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
2195.5。
[0847]
实施例23.化合物14m的制备
[0848][0849]
化合物14a的制备
[0850]
在室温向6
‑
氨基
‑1‑
己醇(5.0g，42.6mmol)在dcm(30ml)中的溶液中添加二碳酸二叔丁酯(9.3g，42.6mmol)。搅拌18小时后，在0℃向反应混合物添加三乙胺(8.7ml，63.9mmol)和叔丁基二甲基氯硅烷(7.7g，51.2mmol)。在室温下24小时后，将反应混合物用饱和nh4cl水溶液(200ml)稀释。将所得混合物用etoac(100ml)提取。将有机层用浓盐水(100ml)洗涤并用无水mgso 4
干燥，过滤并浓缩。将剩余物通过柱色谱纯化而产生化合物14a(12g，84％)。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ4.50(br s,1h),3.58(t,j＝6.8hz,2h),3.10(d,j＝6.4hz,2h),1.72
‑
1.20(m,17h),0.88(s,9h),0.04(s,6h)。
[0851]
化合物14b的制备
[0852]
在n2下于0℃向化合物14a(6.0g，18.1mmol)在thf(30ml)中的溶液添加nah(在油中60％，2.4g，54.2mmol)和碘甲烷(3.4ml，54.2mmol)。14小时后，将反应混合物用h2o(50ml)稀释并用etoac(2
×
100ml)提取。合并有机层，经无水mgso4干燥，过滤并浓缩。将粗产物通过柱色谱纯化而产生化合物14b(4.3g，69％)。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ3.59(t,j＝6.4hz,2h),3.17(br s,2h),2.82(s,3h),1.62
‑
1.21(m,17h),0.88(s,9h),0.04(s,6h)。
[0853]
化合物14c的制备
[0854]
在n2下于0℃向化合物14b(4.3g，12.4mmol)在thf(15ml)中的溶液添加tbaf(在thf中1m，15ml，14.9mmol)。5小时后，将反应混合物用h2o(50ml)稀释并用乙醚(2
×
100ml)提取。合并有机层，经无水mgso4干燥，过滤并浓缩。将粗产物通过柱色谱纯化而产生化合物14c(3.0g，98％)。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ3.63(br s,2h),3.20(br s,2h),2.82(s,3h),1.65
‑
1.23(m,17h)。
[0855]
化合物14d的制备
[0856]
在n2下于0℃向化合物14c(3.0g，12.9mmol)在thf(30ml)中的溶液添加四溴化碳
(6.4g，19.4mmol)和三苯基膦(5.1g，19.4mmol)。2小时后，将反应混合物通过硅胶过滤并用乙醚(100ml)洗涤。浓缩滤液并通过柱色谱纯化而产生化合物14d(3.3g，86％)。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ3.40(t,j＝6.8hz,2h),3.19(br s,2h),2.83(s,3h),1.90
‑
1.70(m,2h),1.65
‑
1.40(m,13h),1.38
‑
1.25(m,2h)。
[0857][0858]
化合物14e的制备
[0859]
将dipea(53.0ml，302.5mmol)和edc.hcl(35.7g，186.2mmol)在0℃下添加到化合物2d(35.0g，116.4mmol)和5
‑
甲酰水杨酸(21.3g，128.0mmol)在dcm(1.6l)中的搅拌过的混合物中。将反应混合物在n2下于室温搅拌20小时。将所述反应混合物用饱和nh4cl水溶液(1.5l)稀释并用dcm(2
×
1.5l)提取。将合并的有机层用浓盐水(1.5l)洗涤并经无水mgso4干燥，过滤并浓缩。将粗产物通过柱色谱纯化而产生化合物14e(28.2g，59％)。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ13.37(br s,1h),9.86(s,1h),8.20(s,1h),8.07(br s,2h),7.90(d,j＝8.4hz,1h),7.07(d,j＝8.4hz,1h),4.06
‑
4.01(m,2h),3.79
‑
3.66(m,10h),1.47(s,9h)。
[0860]
化合物14f的制备
[0861]
向化合物14e(28.0g，67.9mmol)在mecn(500ml)中的溶液添加化合物m(29.7g，74.7mmol)、分子筛(30g)和ag2o(62.9g，272mmol)。将反应混合物在n2下于室温搅拌12小时后，将反应混合物浓缩，用h2o(800ml)稀释并用etoac(1l)提取。将合并的有机层经无水mgso4干燥，过滤并浓缩。将剩余物通过柱色谱纯化而产生化合物14f(30.1g，61％)。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ9.99(s,1h),8.54(s,1h),7.99(d,j＝8.8hz,1h),7.68(s,1h),7.44(br s,1h),7.18(d,j＝8.8hz,1h),5.45
‑
5.30(m,4h),4.26(d,j＝9.2hz,1h),4.02
‑
3.97(m,2h),3.80
‑
3.55(m,13h),2.06(s,9h),1.46(s,9h)。
[0862]
化合物14g的制备
[0863]
在0℃向化合物14f(29.0g，39.8mmol)在i
‑
proh/chcl3(90ml/450ml)中的溶液添加硅胶(16.7g)和nabh4(3.70g，99.5mmol)。在n2下于0℃搅拌2小时后，将反应混合物用h2o(500ml)淬灭并用etoac(1l)提取。将有机层经无水mgso4干燥，过滤并浓缩。将粗产物通过柱色谱纯化而产生化合物14g(24.1g，83％)。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ7.98(s,1h),7.72(s,1h),7.46(d,j＝8.8hz,1h),7.41(br,1h),7.04(d,j＝8.8hz,1h),5.41
‑
5.24(m,4h),4.67(d,j＝6.6hz,2h),4.19(d,j＝8.8hz,1h),3.99
‑
3.93(m,2h),3.79
‑
3.65(m,12h),3.59
‑
3.50(m,1h),2.08
‑
2.00(m,10h),1.46(s,9h)。
[0864]
化合物14h的制备
[0865]
在n2下于0℃向化合物14g(23.7g，31.5mmol)在dmf(50ml)中的溶液添加双(4
‑
硝基苯基)碳酸酯(8.9g，29.3mmol)和dipea(5.65ml，31.5mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌
30分钟，并使其升温至室温达1小时。将所述反应混合物用h2o(500ml)稀释并用etoac(500ml)提取。将有机层用浓盐水(2
×
200ml)洗涤，经无水mgso4干燥，过滤并浓缩。将粗产物通过柱色谱纯化而产生化合物14h(22.4g，77％)，为白色泡沫。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ8.28(d,j＝7.2hz,2h),8.13(s,1h),7.68(br s,1h),7.52(d,j＝8.8hz,1h),7.47(br,1h),7.38(d,j＝7.2hz,2h),7.08(d,j＝8.8hz,1h),5.44
‑
5.24(m,6h),4.21(d,j＝9.6hz,1h),4.00(br s,2h),3.80
‑
3.64(m,12h),3.64
‑
3.54(m,1h),2.06(s,9h),1.47(s,9h)。
[0866][0867]
化合物14i的制备
[0868]
将α
‑
鹅膏覃碱(60.0mg，0.065mmol)溶解在dmso(2ml)中并在n2下于0℃添加化合物14d(114mg，0.39mmol)和叔丁醇钾(0.065ml，0.065mmol)。在0℃下4小时后，用乙酸将所述溶液的ph调节到4～5。将剩余物溶解在dmso(1ml)并通过hplc纯化，产生化合物14i(29mg，39％)，为白色固体。ei
‑
ms m/z：[m
‑
boc]
+
1032.4。
[0869]
化合物14j的制备
[0870]
在0℃向化合物14i(29mg，0.026mmol)在dcm(3ml)中的溶液添加tfa(0.5ml)。在0℃下2小时后，通过n2流除去溶剂和过量的tfa，并将所得的剩余物通过hplc纯化，产生化合物14j(26mg，99％)，为白色固体。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1032.3，[m+na]
+
1054.3。
[0871]
化合物14k的制备
[0872]
在0℃将化合物14j(13mg，0.011mmol)、化合物14h(10mg，0.011mmol)和无水hobt(0.3mg，0.002mmol)溶解在dmf(0.5ml)中。然后添加吡啶(0.2ml)和dipea(0.004ml，0.023mmol)。在n2下于室温搅拌24小时后，将反应混合物溶解在dmso(1ml)中并通过hplc纯化，产生化合物14k(11mg，54％)。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1788.1。
[0873]
化合物14l的制备
[0874]
在
‑
20℃向化合物14k(11mg，0.006mmol)在meoh(0.2ml)中的溶液添加在h2o(0.2ml)中的lioh一水合物(1.3mg，0.03mmol)。在0℃下1小时后，用乙酸将所述溶液的ph调
节到4～5。将所得的溶液溶解在dmso(1ml)中并通过hplc纯化，产生化合物14l(7.5mg，75％)，为白色固体。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1648.6.
[0875]
化合物的制备14m
[0876]
在0℃向化合物14l(7.5mg，0.0045mmol)在dcm(3ml)中的溶液添加tfa(0.5ml)。在0℃下2小时后，通过n2流除去溶剂和过量的tfa。然后将剩余物通过hplc纯化，产生化合物14m(6.2mg，85％)，为白色固体。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
：1548.5。
[0877]
实施例24.化合物15b的制备
[0878][0879]
化合物15a的制备
[0880]
通过与实施例23中制备化合物14h类似的方法，从化合物3e制备化合物15a。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
2195.5。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1128.3，[m+h
‑
boc]
+
1028.3，[m+h
‑
2boc]
+
928.2。
[0881][0882]
化合物15b的制备
[0883]
通过与实施例23中制备化合物14m类似的方法，从化合物14j和化合物15a制备化合物15b。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1681.6。
[0884]
实施例25.化合物16f的制备
[0885][0886]
化合物16a的制备
[0887]
向草酰氯(2.8ml，32.5mmol)在dcm(5ml)中的搅拌过的溶液添加在dcm(15ml)中的dmso(3.08ml，43.4mmol)，然后将反应混合物在
‑
78℃搅拌30分钟。在
‑
78℃向该溶液添加化合物2a(3.8g，21.7mmol)并搅拌1小时。添加在dcm(20ml)中的三乙胺(15.1ml，108mmol)，然后使反应混合物升温至室温，用h2o(100ml)稀释并用dcm(2
×
100ml)提取。合并有机层，经
无水mgso4干燥，过滤并浓缩。将剩余物通过柱色谱纯化而产生化合物16a(1.8g，48％)。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ9.74(s,1h),4.19(s,2h),3.77
‑
3.69(m,6h),3.42(m,2h)。
[0888]
化合物16b的制备
[0889]
在0℃向化合物16a(1.0g，3.32mmol)和化合物2d(1.72g，9.96mmol)在meoh(15ml)中的溶液添加acoh(0.19ml，3.32mmol)。在0℃搅拌30分钟后，添加nacnbh3(658mg，9.96mmol)并使其经2小时升温至室温。反应完成后，将反应混合物用h2o(50ml)稀释并用dcm(3
×
100ml)提取。合并有机层，经无水mgso4干燥，过滤并浓缩。将剩余物通过柱色谱纯化而产生化合物16b(800mg，41％)，为浅黄色油。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ7.78(brs,1h),4.01(m,2h),3.69
‑
3.65(m,24h),3.39(m,4h),3.04(m,6h),1.47(s,9h)。
[0890]
化合物16c的制备
[0891]
向化合物16b(350mg，0.60mmol)在meoh中(10ml)的溶液添加pd/c(10wt％，300mg)。在氢气下于室温搅拌8小时后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用meoh(100ml)洗涤。浓缩提供化合物16c，为无色油(300mg，94％)，其不经进一步纯化即使用。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ4.02(m,2h),3.71(m,2h),3.65
‑
3.55(m,22h),2.92(m,4h),2.76(t,j＝5.2hz,6h),1.47(s,9h).ei
‑
ms m/z:[m+h]
+
527.6。
[0892][0893]
化合物16d的制备
[0894]
将dipea(0.40ml，2.24mmol)和pybop(711mg，1.34mmol)添加到化合物1j(1.57g，1.23mmol)和化合物16c(300mg，0.56mmol)在dmf(15ml)中的搅拌过的混合物中。在n2下于室温搅拌4小时后，将反应混合物用h2o(200ml)稀释并用etoac(3
×
100ml)提取。将合并的有机层经无水na2so4干燥，过滤并减压浓缩。将剩余物溶解在h2o/dmso(5ml/5ml)中并通过hplc纯化，产生化合物16d(1.57g，91.8％)。ei
‑
ms m/z：1/2[m+h]
+
1502.7。
[0895]
化合物16f的制备
[0896]
在0℃向化合物16d(1.10g，0.36mmol)在meoh/thf(5ml/10ml)中的溶液滴加在h2o(3ml)中的naoh(175mg，4.32mmol)。在0℃下3小时后，用2n hcl水溶液将溶液的ph调节到ph4并浓缩。将剩余物在0℃下用dcm(12ml)和tfa(3ml)稀释。在0℃下2小时后，通过n2流除去溶剂和过量的tfa。将剩余物溶解在h2o/mecn(7.5ml/7.5ml)中并通过hplc纯化，产生化合物16f(432mg，46％)，为白色固体。ei
‑
ms m/z：1/2[m+h]
+
1298.5。
[0897]
实施例26.化合物16g的制备
[0898][0899]
通过与实施例25中制备化合物16f类似的方法，从化合物1i和化合物16c制备化合物16g。ei
‑
ms m/z：1/2[m+h]
+
1284.5。
[0900]
实施例27.化合物17d的制备
[0901][0902]
化合物17a的制备
[0903]
向草酰氯(0.62ml，7.3mmol)在dcm(4ml)中的搅拌过的溶液添加在dcm(10ml)中的dmso(1.04ml，14.6mmol)，然后将反应混合物在
‑
78℃搅拌30分钟。在
‑
78℃向该溶液添加化合物3b(1.5g，4.88mmol)并搅拌1小时。添加在dcm(7ml)中的三乙胺(2.72ml，19.50mmol)，然后使反应混合物升温至室温。减压浓缩后，将剩余物通过柱色谱纯化(etoac到etoac/meoh 10/1)，产生化合物17a(1.23g，82％)。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ9.73(s,1h),4.16(s,2h),3.75
‑
3.61(m,18h),3.39(t,j＝5.2hz,2h)。
[0904]
化合物17b的制备
[0905]
在0℃下将nacnbh3(257mg，4.09mmol)添加到化合物17a(1.30g，4.25mmol)和化合物2d(492mg，1.63mmol)在meoh(5ml)中的搅拌过的混合物中。所述反应混合物然后经2小时逐渐变热至室温。反应完成后，将反应混合物减压浓缩。将剩余物通过柱色谱纯化(etoac到etoac/meoh 10/1)，产生化合物17b(620mg，45％)。
[0906]1h
‑
nmr(400mhz,dmso
‑
d6)δ9.96(br,1h),3.79(t,j＝4.8hz,2h)3.59(t,j＝4.8hz,
4h),3.56
‑
3.46(m,38h),3.44
‑
3.37(m,10h),2.66
‑
2.56(m,6h),1.39(s,9h)。
[0907]
化合物17c的制备
[0908]
向化合物17b(300mg，0.35mmol)在meoh(7ml)中的溶液添加pd/c(10wt％，38mg)。在氢气下于室温搅拌4小时后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用meoh(400ml)洗涤。浓缩提供化合物17c，为无色油(253mg，90％)，其不经进一步纯化即使用。1h
‑
nmr(400mhz,dmso
‑
d6)δ3.79(t,j＝4.4hz,2h),3.55
‑
3.45(m,38h),3.42(t,j＝6.0hz,10h),2.66
‑
2.56(m,10h),1.39(s,9h).ei
‑
ms m/z:[m+h]
+
791.0。
[0909]
化合物17d的制备
[0910][0911]
通过与实施例25中制备化合物16f类似的方法，从化合物1i和化合物17c制备化合物17d。ei
‑
ms m/z：1/2[m+h]
+
1415.6。
[0912]
实施例28.化合物18c的制备
[0913][0914]
化合物18a的制备
[0915]
在0℃将nacnbh3(197mg，3.14mmol)添加到化合物17a(998mg，3.26mmol)和化合物3e(670mg，1.25mmol)在meoh(4ml)中的搅拌过的混合物中。所述反应混合物然后经2小时逐渐变热至室温。反应完成后，将反应混合物减压浓缩。将剩余物通过柱色谱纯化(etoac到etoac/meoh 10/1)，产生化合物18a(668mg，49％)。1h
‑
nmr(400mhz,dmso
‑
d6)δ3.97(m,2h)3.63
‑
3.57(m,6h),3.56
‑
3.44(m,46h),3.44
‑
3.36(m,12h),2.66
‑
2.61(m,6h),1.45(s,18h)。
[0916]
化合物18b的制备
[0917]
向化合物18a(60mg，0.055mmol)在meoh(1.2ml)中的溶液添加pd/c(10wt％，6mg)。在氢气下于室温搅拌4小时后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用meoh(400ml)洗涤。浓缩提供化合物18b(55mg，96％)，为无色油，其不经进一步纯化即使用。1h
‑
nmr(400mhz,dmso
‑
d6)δ3.97(m,2h),3.62
‑
3.57(m,4h),3.54
‑
3.45(m,50h),3.45
‑
3.39(m,10h),2.66
‑
2.61(m,10h),1.46(s,18h).ei
‑
ms m/z:1/2[m+h]
+
1023.3。
[0918][0919]
通过与实施例25中制备化合物16f类似的方法，从化合物1i和化合物18b制备化合物18c。ei
‑
ms m/z：1/2[m+h]
+
1481.7。
[0920]
实施例29.化合物19c的制备
[0921][0922]
化合物19a的制备
[0923]
在0℃将nacnbh3(197mg，3.14mmol)添加到化合物17a(118mg，0.16mmol)和化合物4e(232mg，0.76mmol)在meoh(1ml)中的搅拌过的混合物中。所述反应混合物然后经2小时逐渐变热至室温。反应完成后，减压蒸发所述反应混合物。将剩余物通过柱色谱纯化(etoac到etoac/meoh 10/1)，产生化合物19a(135mg，68％)。1h
‑
nmr(400mhz,dmso
‑
d6)δ7.72(br s,1h)4.02(t,2h),3.72
‑
3.53(m,86h),3.39(t,4h),2.77(bs,4h),1.47(s,9h).ei
‑
ms m/z:[m+h]
+
1239.6。
[0924]
化合物19b的制备
[0925]
在0℃向化合物19a(133mg，0.107mmol)在meoh(2ml)中的溶液添加pd/c(10wt％，26mg)和hcl(在1,4
‑
二噁烷中4n，0.054ml，0.21mmol)。在氢气下于室温搅拌40分钟后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用meoh(40ml)洗涤。浓缩提供化合物19b(132mg，97％)，为无色油，其不经进一步纯化即使用。1h
‑
nmr(400mhz,dmso
‑
d6)δ7.79(s,1h),4.06
‑
4.02(m,8h),3.88(m,2h),3.73
‑
3.64(m,80h),3.22(s,4h),1.47(s,9h).ei
‑
ms m/z:[m+h]
+
:1187.5。
[0926]
化合物19c的制备
[0927][0928]
通过与实施例25中制备化合物16f类似的方法，从化合物1i和化合物19b制备化合物19c。ei
‑
ms m/z：1/2[m+h]
+
1614.5。
[0929]
实施例30.化合物20q的制备
[0930][0931]
化合物20a的制备
[0932]
向2
‑
(2
‑
(2
‑
氯乙氧基)乙氧基)乙醇(5.0g，29.6mmol)在丙酮(30ml)中的溶液添加nai(13.3g，88.9mmol)。将所述反应混合物回流12小时。反应完成后，将反应混合物过滤并浓缩。将粗产物通过柱色谱纯化而产生化合物20a(7.0g，91％)。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ3.80
‑
3.73(m,4h),3.72
‑
3.65(m,4h),3.63
‑
3.61(m,2h),3.27(t,j＝6.4hz,2h)。
[0933]
化合物20b的制备
[0934]
在0℃向化合物20a(7.0g，26.9mmol)在丙酮(200ml)中的溶液添加jones试剂(20ml)。在0℃下15小时后，将反应混合物过滤并浓缩。将剩余物用h2o(150ml)稀释并用etoac(2
×
100ml)提取。合并有机层，经无水mgso4干燥，过滤并浓缩。将粗产物通过柱色谱纯化而产生化合物20b(7.0g，94％)。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ4.22(s,2h),3.85
‑
3.70(m,6h),3.35
‑
3.25(m,2h)。
[0935]
化合物20c的制备
[0936]
在n2下于0℃向化合物20b(7.0g，25.5mmol)在meoh(70ml)中的溶液添加草酰氯(3.2ml，38.3mmol)。16小时后，将反应混合物浓缩并通过柱色谱纯化，产生化合物20c(5.7g，77％)。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ4.19(s,2h),3.80
‑
3.67(m,9h),3.27(t,j＝6.8hz,2h)。
[0937]
化合物20d的制备
[0938]
在n2下于0℃向化合物20c(2.5g，8.67mmol)和n,n
‑
二boc
‑
羟胺(2.6g，11.2mmol)在dmf(30ml)中的溶液添加nah(在油中60％，454mg，10.4mmol)。15小时后，将反应混合物用h2o(50ml)稀释并用etoac(3
×
100ml)提取。合并有机层，经无水mgso4干燥，过滤并浓缩。将粗产物通过柱色谱纯化而产生化合物20d(1.87g，73％)。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ4.17(s,
2h),4.08(m,2h),3.78
‑
3.65(m,9h),1.53(s,18h)。
[0939]
化合物20e的制备
[0940]
在n2下于0℃向化合物20d(1.87g，6.38mmol)在thf/meoh/h2o(45ml/15ml/15ml)中的溶液添加naoh(600mg，15.9mmol)。将反应混合物在室温下搅拌3小时。然后用1n hcl水溶液将所述溶液的ph调节到4～5。将所述反应混合物倒入h2o(100ml)中并用etoac(2
×
100ml)提取。合并有机层，用mgso4干燥，过滤并浓缩。产生化合物20e(1.6g，90％)，为无色油，其不经进一步纯化即使用。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ4.17(s,2h),4.08
‑
4.02(m,2h),3.80
‑
3.67(m,6h),1.48(s,9h)。
[0941][0942]
化合物20f的制备
[0943]
将pd/c(10wt％，1.0g)添加到化合物2a(6.7g，38.2mmol)在meoh(38ml)中的溶液。在氢气下于室温搅拌8小时后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用meoh(100ml)洗涤。浓缩提供化合物20f(5.6g，99％)，为无色油，其不经进一步纯化即使用。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ3.95
‑
3.25(m,12h),2.90(s,2h)。
[0944]
化合物20g的制备
[0945]
在n2下，将氯甲酸苄酯(6ml，42.2mmol)在0℃用30分钟缓慢添加到化合物20f(5.6g，38.2mmol)和三乙胺(8ml，57.6mmol)在thf(200ml)中的溶液中。在0℃下搅拌1小时后，浓缩反应混合物，并将粗产物通过柱色谱纯化，产生化合物20g(5.7g，53％)。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ7.45
‑
7.20(m,5h),5.61(br s,1h),5.07(s,2h),3.85
‑
3.20(m,12h)。
[0946]
化合物20h的制备
[0947]
在n2下于室温向化合物20g(2.7g，9.53mm)在dcm(30ml)中的溶液添加三乙胺(1.9ml，12.3mmol)和对甲苯磺酰氯(2.3g，10.4mmol)。8小时后，将反应混合物用h2o(50ml)稀释并用dcm(3
×
100ml)提取。合并有机层，经无水mgso4干燥，过滤并浓缩。将粗产物通过柱色谱纯化而产生化合物20h(3.51g，84％)。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ7.78(d,j＝7.2hz,2h),7.45
‑
7.25(m,7h),5.20(br s,1h),5.09(s,2h),4.20
‑
4.05(m,2h),3.75
‑
3.25(m,10h),2.43(s,3h)。
[0948]
化合物20i的制备
[0949]
将化合物20h(3.51g，8.02mmol)和nan3(3.8g，57.6mmol)在dmf(27ml)中的溶液在100℃加热15小时。反应完成后，将反应混合物过滤并浓缩。将剩余物用h2o(50ml)稀释并用etoac(2
×
100ml)提取。合并有机层，经无水mgso4干燥，过滤并浓缩。将粗产物通过柱色谱纯化而产生化合物20i(2.05g，83％)。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ7.45
‑
7.25(m,5h),5.20(br s,1h),5.10(s,2h),3.80
‑
3.25(m,12h)。
[0950]
化合物20j的制备
[0951]
在室温下将三苯基膦(2.09g，7.97mmol)添加到化合物20i(2.05g，6.64mmol)在thf(27ml)中的溶液中。在n2下搅拌2小时后，添加h2o(0.6ml，33.2mmol)并将反应混合物回
流3小时。然后将反应混合物浓缩并通过柱色谱纯化，产生化合物20j(1.78g，95％)。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ7.45
‑
7.25(m,5h),5.63(br s,1h),5.10(s,2h),3.80
‑
3.25(m,10h),2.88(s,2h)。
[0952][0953]
化合物20k的制备
[0954]
向草酰氯(1.4ml，15.9mmol)在dcm(14ml)中的搅拌过的溶液添加在dcm(28ml)中的dmso(2.3ml，31.9mmol)，然后将反应混合物在
‑
78℃下搅拌30分钟。在
‑
78℃向该溶液添加化合物20g(3.01g，10.6mmol)。在
‑
78在0℃搅拌1小时后，添加三乙胺(7.4ml，53.1mmol)并使所述反应升温至室温。将反应混合物倒入h2o(100ml)中并用etoac(2
×
100ml)提取。合并有机层，经mgso4干燥。过滤并浓缩产生化合物20k(2.6g)，其不经进一步纯化即使用。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ9.70(s,1h),7.45
‑
7.25(m,5h),5.25(br s,1h),5.10(s,2h),3.80
‑
3.25(m,10h)。
[0955]
化合物20l的制备
[0956]
在n2下于室温向化合物20j(1.78g，6.30mmol)和化合物20k(2.13g，7.56mmol)在meoh(63ml)中的溶液添加nacnbh3(674mg，10.7mmol)。3小时后，将反应混合物过滤并浓缩。将粗产物通过柱色谱纯化而产生化合物20l(2.01g，58％)。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ7.45
‑
7.25(m,10h),5.60(br s,2h),5.03(s,4h),3.80
‑
3.25(m,20h),2.81(s,4h)。
[0957]
化合物20m的制备
[0958]
将dipea(0.4ml，2.28mmol)和pybop(713mg，1.36mmol)添加到化合物20l(500mg，0.91mmol)和化合物20e(306mg，1.09mmol)在dmf(10ml)中的搅拌过的溶液中。在n2下于室温搅拌6小时后，将反应混合物用水(100ml)稀释并用etoac(3
×
100ml)提取。将合并的有机层经无水na2so4干燥，过滤并减压浓缩。将粗产物通过柱色谱纯化而产生化合物20m(318mg，43％)。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ7.45
‑
7.25(m,10h),5.47(br s,1h),5.37(br s,1h),5.09(s,4h),3.80
‑
3.25(m,34h),1.46(s,9h).ei
‑
ms m/z:[m+h]
+
808.9。
[0959]
化合物20n的制备
[0960]
向化合物20m(318mg，0.39mmol)在meoh(30ml)中的溶液添加pd/c(10wt％，1.0g)。在氢气下于室温搅拌3小时后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用meoh(100ml)洗涤。浓缩提供化合物20n(180mg)，为无色油，其不经进一步纯化即使用。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
541.2。
[0961][0962]
化合物20o的制备
[0963]
在0℃下将dipea(0.034ml，0.19mmol)和pybop(63mg，0.12mmol)添加到化合物1i(130mg，0.10mmol)和化合物20n(26mg，0.04mmol)在dmf(3ml)中的搅拌过的溶液中。在0℃下搅拌30分钟后，使所述反应在n2下经20小时升温至室温。将反应混合物倒入h2o(50ml)中并用etoac(3
×
50ml)提取。合并有机层，过滤并减压浓缩。将剩余物溶解在dmso(1ml)中并通过hplc纯化，产生化合物20o(28mg，10％)，为白色固体。ei
‑
ms m/z：1/2[m+h]
+
1481.5，1/2[m+na]
+
1503.8。
[0964]
化合物20p的制备
[0965]
在
‑
5℃向化合物20o(28mg，0.009mmol)在meoh(1ml)中的溶液添加在h2o(1ml)中的lioh一水合物(2mg，0.047mmol)。将反应混合物在
‑
5℃下搅拌1小时。反应完成后，用乙酸将溶液的ph调节到4～5。将剩余物溶解在dmso(1ml)中并通过hplc纯化，产生化合物20p(16mg，67％)，为白色固体。ei
‑
ms m/z：1/2[m+h]
+
：1341.4.
[0966]
化合物20q的制备
[0967]
在0℃向化合物20p(16mg，0.0059mmol)在dcm(2ml)中的溶液添加tfa(0.2ml)。在0℃下2小时后，通过n2流除去溶剂和过量的tfa。将剩余物溶解在dmso(1ml)中并通过hplc纯化，产生化合物20q(8.5mg，56％)，为白色固体。ei
‑
ms m/z：1/2[m+h]
+
：1291.3。
[0968]
实施例31.化合物21i的制备
[0969][0970]
化合物21a的制备
[0971]
向化合物3b(9.0g，29.2mmol)在meoh(146ml)中的溶液添加pd/c(10wt％，3.0g)，
并将反应混合物在氢气下于室温搅拌5小时。然后将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用meoh(100ml)洗涤。浓缩提供化合物21a(8.2g，100％)，为无色油，其不经进一步纯化即使用。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ3.80
‑
3.60(m,24h),3.01(t,j＝4.8hz,2h)。
[0972]
化合物21b的制备
[0973]
在n2下于0℃向化合物21a(8.24g，29.2mmol)在thf(190ml)中的溶液添加三乙胺(6.1ml，43.9mmol)和氯甲酸苄酯(4.6ml 32.2mmol)。将反应混合物浓缩并将粗产物通过柱色谱纯化而产生化合物21b(5.59g，46％)。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ7.45
‑
7.20(m,5h),5.61(br s,1h),5.09(s,2h),3.85
‑
3.50(m,22h),3.39(m,2h)。
[0974]
化合物21c的制备
[0975]
在n2下于0℃向化合物21b(3.09g，7.43mmol)在thf(75ml)中的溶液添加4
‑
甲基吗啉(1.1ml，9.66mmol)和甲磺酸酐(1.43g，8.18mmol)。在0℃下5小时后，添加nan3(969mg，14.9mmol)和dmf(20ml)。回流16小时后，将反应混合物过滤并浓缩。将剩余物用h2o(50ml)稀释并用etoac(2
×
100ml)提取。合并有机层，经无水mgso4干燥，过滤并浓缩。将粗产物通过柱色谱纯化而产生化合物21c(2.62g，80％)。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ7.45
‑
7.20(m,5h),5.45(br s,1h),5.09(s,2h),3.85
‑
3.25(m,24h)。
[0976]
化合物21d的制备
[0977]
在室温下将三苯基膦(1.87g，7.13mmol)添加到化合物21c(2.62g，5.94mmol)在thf(30ml)中的溶液中。在n2下搅拌2小时后，添加h2o(0.54ml，29.7mmol)并将反应混合物回流3小时。将反应混合物浓缩并通过柱色谱纯化，产生化合物21d(2.47g，95％)。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ7.45
‑
7.25(m,5h),5.63(br s,1h),5.09(s,2h),3.80
‑
3.25(m,22h),3.00
‑
2.80(m,2h)。
[0978][0979]
化合物21e的制备
[0980]
向草酰氯(0.78ml，9.02mmol)在dcm(14ml)中的搅拌过的溶液添加在dcm(6ml)中的dmso(1.3ml，18.1mmol)，然后将反应混合物在
‑
78℃搅拌30分钟。在
‑
78℃向该溶液添加化合物21b(2.5g，6.01mmol)。在
‑
78℃下搅拌1小时后，添加三乙胺(4.2ml，30.1mmol)并使反应升温至室温。将反应混合物倒入h2o(100ml)中并用etoac(2
×
100ml)提取。合并有机层，经mgso4干燥。过滤并浓缩产生化合物21e(2.29g)，其不经进一步纯化即使用。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ9.70(s,1h),7.45
‑
7.25(m,5h),5.25(br s,1h),5.10(s,2h),3.80
‑
3.25(m,24h)。
[0981]
化合物21f的制备
[0982]
在n2下于室温向化合物21d(2.47g，5.95mmol)和化合物21e(2.29g，5.52mmol)在meoh(50ml)中的溶液添加nacnbh3(530mg，8.44mmol)。3小时后，将反应混合物过滤并浓缩。将粗产物通过柱色谱纯化而产生化合物21f(2.05g，51％)。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ7.45
‑
7.25(m,10h),5.47(br s,1h),5.37(br s,1h),5.09(s,4h),3.80
‑
3.25(m,48h)。
[0983]
化合物21g的制备
[0984]
将dipea(0.27ml，1.53mmol)和hbtu(350mg，0.92mmol)添加到化合物21f(380mg，0.61mmol)和化合物20e(206mg，0.73mmol)在dmf(6ml)中的搅拌过的溶液中。在n2下于室温搅拌6小时后，将反应混合物用水(100ml)稀释并用etoac(3
×
100ml)提取。将合并的有机层经无水na2so4干燥，过滤并减压浓缩。将粗产物通过柱色谱纯化而产生化合物21g(210mg，42％)。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ7.45
‑
7.25(m,10h),5.47(br s,1h),5.37(br s,1h),5.09(s,4h),3.80
‑
3.25(m,34h),1.46(s,9h)。
[0985]
化合物21h的制备
[0986]
向化合物21g(210mg，0.19mmol)在meoh(30ml)中的溶液添加pd/c(10wt％，1.0g)，然后将所述反应混合物在氢气下于室温搅拌4小时。将所述反应混合物通过硅藻土垫过滤并用meoh(50ml)洗涤。浓缩提供化合物21h(30mg)，为无色油，其不经进一步纯化即使用。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
805.2，[m+na]
+
827.2。
[0987]
化合物21i的制备
[0988][0989]
通过与实施例30中制备化合物20q类似的方法，从化合物1i和化合物21h制备化合物21i。ei
‑
ms m/z：1/2[m+h]
+
1423.7，1/2[m+na]
+
1445.2。
[0990]
实施例32.化合物22h的制备
[0991][0992]
化合物22a的制备
[0993]
在室温向化合物3a(8.0g，18.3mmol)在thf(50ml)中的溶液添加libr(7.9g，
91.6mmol)。在回流下搅拌17小时后，将反应混合物过滤并浓缩。将粗产物通过柱色谱纯化而产生化合物22a(3.2g，50％)。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ3.95
‑
3.50(m,24h)。
[0994]
化合物22b的制备
[0995]
在0℃向化合物22a(3.2g，12.3mmol)在丙酮(20ml)中的溶液添加jones试剂(20ml)。在0℃下15小时后，将反应混合物过滤并浓缩。将剩余物用h2o(50ml)稀释并用etoac(2
×
100ml)提取。合并有机层，经无水mgso4干燥，过滤并浓缩。将粗产物通过柱色谱纯化而产生化合物22b(3.2g，72％)。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ4.16(s,2h),3.95
‑
3.30(m,20h)。
[0996]
化合物22c的制备
[0997]
在n2下于0℃向化合物22b(3.2g，8.90mmol)在meoh(30ml)中的溶液添加草酰氯(1.15ml，13.3mmol)。16小时后，将反应混合物浓缩并通过柱色谱法纯化，产生化合物22c(2.7g，81％)。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ4.17(s,2h),3.80
‑
3.60(m,21h),3.47(t,j＝6.4hz,2h)。
[0998]
化合物的22d制备
[0999]
将nah(在油中60％，378mg，8.63mmol)在n2下于0℃添加到化合物22c(2.7g，7.23mmol)和n,n
‑
二boc
‑
羟胺(2.2g，9.4mmol)在dmf(30ml)中的溶液。17小时后，将反应混合物浓缩。剩余物用h2o(50ml)稀释并用etoac(3
×
100ml)提取。合并有机层，经无水mgso4干燥，过滤并浓缩。将粗产物通过柱色谱纯化而产生化合物22d(2.1g，55％)。1h
‑
nmr(400mhz,cdcl3)δ4.17(s,2h),4.08(t,j＝5.2hz,2h),3.78
‑
3.60(m,21h),1.53(s,18h)。
[1000]
化合物22e的制备
[1001]
在n2下于0℃向化合物22d(2.1g，3.99mmol)在thf/meoh/h2o(30ml/10ml/10ml)中的溶液添加naoh(400mg，9.98mmol)。将反应混合物在室温下搅拌3小时。然后用1n hcl水溶液将所述溶液的ph调节到4～5。将所述反应混合物倒入h2o(50ml)中并用etoac(2
×
100ml)提取。合并有机层，经mgso4干燥。过滤并浓缩产生化合物22e(1.6g)，为无色油，其不经进一步纯化即使用。1h
‑
nmr(400mhz，cdcl3)δ7.90(s，1h)，4.15(s，2h)，4.03(br s，2h)，3.80
‑
3.60(m，18h)，1.47(s，9h)。
[1002][1003]
化合物22f的制备
[1004]
将dipea(0.13ml，0.73mmol)和hbtu(187mg，0.49mmol)添加到化合物21f(200mg，0.24mmol)和化合物22e(152mg，0.36mmol)在dmf(5ml)中的搅拌过的溶液中。在n2下将反应混合物在室温下搅拌6小时。将所述反应混合物用h2o(100ml)稀释并用etoac(3
×
100ml)提取。将合并的有机层经无水干燥na2so4，过滤并减压浓缩。将粗产物通过柱色谱纯化而产生
化合物22f(100mg，34％)。ei
‑
ms m/z：1/2[m+h]
+
1205.6。
[1005]
化合物22g的制备
[1006]
向化合物22f(100mg，0.08mmol)在meoh(20ml)中的溶液中添加pd/c(10wt％，20mg)，然后在氢气下将反应混合物在室温下搅拌4小时。将所述反应混合物通过硅藻土垫过滤并用meoh(20ml)洗涤。浓缩提供化合物22g，为无色油(70mg)，其不经进一步纯化即使用。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
937.4，[m+na]
+
959.3。
[1007]
化合物22h的制备
[1008][1009]
通过与实施例30中制备化合物20q类似的方法，从化合物1i和化合物22g制备化合物22h。ei
‑
ms m/z：1/2[m+h]
+
1489.4。
[1010]
实施例33.化合物23h的制备
[1011][1012]
化合物23a的制备
[1013]
向化合物4a(483mg，0.69mmol)在thf(10ml)中的溶液添加libr(180mg，2.06mmol)。将反应混合物在n2下回流12小时。然后将反应混合物减压浓缩。将剩余物通过柱色谱纯化而产生化合物23a(330mg，78％)。1h
‑
nmr(400mhz，cdcl3)δ3.81(t，j＝6.4hz，2h)，3.72
‑
3.59(m，44h)，3.47(t，j＝6.4hz，2h)。
[1014]
化合物23b的制备
[1015]
在0℃向化合物23a(330mg，0.54mmol)在丙酮(2ml)中的溶液添加jones试剂(2ml)。在0℃下15小时后，将反应混合物过滤并浓缩。将剩余物用h2o(15ml)稀释并用etoac(2
×
20ml)提取。合并有机层，经无水mgso4干燥，过滤并浓缩。所得的粗化合物23b不经进一步纯化即使用。
[1016]
化合物23c的制备
[1017]
在n2下于0℃向化合物23b(266mg，0.43mmol)在meoh(5ml)中的溶液添加草酰氯(0.054ml，0.64mmol)。16小时后，将反应混合物浓缩并通过柱色谱纯化，产生化合物23c(200mg，58％for 2steps)。1h
‑
nmr(400mhz，cdcl3)δ4.17(s，2h)，3.81(t，j＝6.4hz，2h)，3.79
‑
3.64(m，43h)，3.48(t，j＝6.4hz，2h)。
[1018]
化合物23d的制备
[1019]
在n2下于0℃向化合物23c(200mg，0.31mmol)在dmf(3ml)中的溶液添加n,n
‑
二boc
‑
羟胺(95mg，0.40mmol)和nah(在油中60％，16mg，0.37mmol)。17小时后，将反应混合物浓缩。将剩余物用h2o(5ml)稀释并用etoac(3
×
10ml)提取。合并有机层，经无水mgso4干燥，过滤并浓缩。将粗产物通过柱色谱纯化而产生化合物23d(120mg，49％)。1h
‑
nmr(400mhz，cdcl3)δ4.17(s，2h)，4.13(t，j＝8.0hz，2h)，3.75
‑
3.64(m，45h)，1.53(s，18h)。
[1020]
化合物23e的制备
[1021]
在n2下于0℃向化合物23d(120mg，0.15mmol)在thf/meoh/h2o(3ml/1ml/1ml)中的溶液添加naoh(15mg，0.38mmol)。将反应混合物在室温下搅拌1小时。然后用1n hcl水溶液将所述溶液的ph调节到4～5。将所述反应混合物倒入h2o(10ml)并用chcl3(2
×
20ml)提取。合并有机层，经无水na2so4干燥。过滤并浓缩产生化合物23e(100mg)，其不经进一步纯化即使用。1h
‑
nmr(400mhz，cdcl3)δ4.23(t，j＝8.0hz，2h)，4.15(s，2h)，4.08(t，j＝4.0hz，1h)，4.01(t，j＝4.0hz，1h)，3.74
‑
3.64(m，40h)，1.53(s，9h)。
[1022][1023]
化合物23f的制备
[1024]
将dipea(0.052ml，0.29mmol)和hbtu(75mg，0.20mmol)添加到化合物21f(80mg，0.09mmol)和化合物23e(100mg，0.15mmol)在dmf(3ml)中的搅拌过的溶液中。在n2下于室温搅拌6小时后，将反应混合物用h2o(50ml)稀释并用etoac(3
×
50ml)提取。将合并的有机层经无水na2so4干燥，过滤并减压浓缩。将粗产物通过柱色谱纯化而产生化合物23f(140mg，97％)。1h
‑
nmr(400mhz，cdcl3)δ7.38
‑
7.31(m，10h)，5.44(br，2h)，5.09(s，4h)，4.34(s，2h)，4.26
‑
4.17(m，4h)，4.09
‑
4.08(m，1h)，4.07(br，1h)，3.73
‑
3.47(m，76h)，3.39
‑
3.38(m，4h)，1.53(s，9h)。ei
‑
ms m/z：[m+na]
+
1491.6，[m+h
‑
boc]
+
：1369.6。
[1025]
化合物23g的制备
[1026]
向化合物23f(140mg，0.09mmol)在meoh(20ml)中的溶液添加pd/c(10wt％，20mg)，然后在氢气下将所述反应混合物在室温下搅拌4小时。将所述反应混合物通过硅藻土垫过滤并用meoh(20ml)洗涤。浓缩提供化合物23g，为无色油(120mg)，其不经进一步纯化即使用。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1201.7，[m+na]
+
1223.7。
[1027]
化合物23h的制备
[1028][1029]
通过与实施例30中制备化合物20q类似的方法，从化合物1i和化合物23g制备化合物23h。ei
‑
ms m/z：1/2[m+h]
+
1620.3，1/2[m+na]
+
1632.1。
[1030]
实施例34.化合物24l的制备
[1031][1032]
化合物24a的制备
[1033]
在0℃下将jones试剂(90ml)缓慢添加到化合物2
‑
[2
‑
(2
‑
氯乙氧基)乙氧基]乙醇(15.0g，88.9mmol)在丙酮(600ml)中的溶液。在0℃下15小时后，将反应混合物过滤并浓缩。剩余物用h2o(200ml)稀释并用chcl3(5x 300ml)提取。合并有机层，经无水mgso4干燥。浓缩提供化合物24a(20.0g)，其不经进一步纯化即使用。1h
‑
nmr(400mhz，cdcl3)δ4.18(s，2h)，3.81
‑
3.64(m，8h)。
[1034]
化合物24b的制备
[1035]
在n2下用30分钟向化合物24a(20.0g，88.9mmol)在meoh(500ml)中的溶液添加草酰氯(11.5ml，133.4mmol)。16小时后，将反应混合物浓缩并通过柱色谱纯化，产生化合物24b(13.0g，75％)。1h
‑
nmr(400mhz，cdcl3)δ4.18(s，2h)，3.78
‑
3.67(m，9h)，3.65(t，j＝5.6hz，2h)。
[1036]
化合物24c的制备
[1037]
将化合物24b(13.0g，66.1mmol)和nan3(6.4g，99.2mmol)溶解在dmf(130ml)中。在100℃搅拌2小时后，将反应混合物用浓盐水(200ml)稀释并用chcl3(2
×
100ml)提取。合并有机层，经无水mgso4干燥。浓缩提供化合物24c(11.7g，87％)，其不经进一步纯化即使用。1h
‑
nmr(400mhz，cdcl3)δ4.18(s，2h)，3.76
‑
3.67(m，9h)，3.41(t，j＝5.6hz，2h)。
[1038]
化合物24d的制备
[1039]
在0℃向化合物24c(11.5g，56.6mmol)在thf/meoh/h2o(300ml/100ml/100ml)中的溶液添加naoh(4.53g，113.2mmol)。在n2和0℃下2小时后，用4m hcl水溶液将所述溶液的ph值调节到2。将所述反应混合物倒入h2o(100ml)并用chcl3(3x 500ml)提取。合并有机层，经mgso4干燥。过滤并浓缩产生化合物24d(10.7g，99％)，为无色油，其不经进一步纯化即使
用。1h
‑
nmr(400mhz，cdcl3)δ4.19(s，2h)，3.79
‑
3.77(m，2h)，3.72
‑
3.70(m，4h)，3.44(t，j＝5.2hz，2h)。
[1040][1041]
化合物24e的制备
[1042]
将三颈烧瓶连续加载h2o(40ml)、1,4
‑
二噁烷(70ml)和h
‑
lys(z)
‑
oh(10g，35.7mmol)。搅拌所述混合物直到完全溶解。通过添加2m的na2co3水溶液将ph调节到约10.5。在通过同时添加2m的na2co3水溶液将ph保持在约10
‑
11的同时，添加氯甲酸苄酯(6.69g，39.2mmol)。完成添加后，将反应混合物在20℃下搅拌1小时。然后添加etoac(50ml)并用c
‑
hcl将所得混合物的ph调节到2～3。分离有机层并将水层用etoac(50ml)提取。将合并的有机层用浓盐水(50ml)洗涤，并经na2so4干燥。过滤并减压浓缩，产生化合物24e，为浅黄色油(14.7g，99％)。1h
‑
nmr(400mhz，cdcl3)δ7.33
‑
7.27(m，10h)，5.07
‑
5.04(d，4h)，4.08(m，1h)，3.09(t，2h)，1.51(br s，1h)，1.49(bs，1h)，1.47
‑
1.40(m，4h)。
[1043]
化合物24f的制备
[1044]
将dipea(0.40ml，2.37mmol)、hobt(143mg，1.06mmol)和edc
·
hcl(240mg，1.25mmol)添加到化合物24e(400mg，0.96mmol)和化合物2d(261mg，0.86mmol)在dmf(3ml)中的搅拌过的混合物中。在n2下于室温搅拌14小时后，将反应混合物倒入h2o(50ml)中，用etoac(3
×
50ml)提取，用nahco3水溶液(50ml)和浓盐水(50ml)洗涤并经无水na2so4干燥。过滤并减压浓缩后，将所得剩余物通过柱色谱提纯而产生化合物24f(380mg，59％)。1h nmr(400mhz，cdcl3)δ8.16(s，1h)，7.34
‑
7.28(m，10h)，7.49(s，1h)5.08
‑
5.07(m，5h)，4.17(m，1h)，3.99(t，2h)，3.68
‑
3.16(m，10h)，3.17(d，2h)，1.66(m，1h)，1.51
‑
1.27(m，14h)。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
661.0。
[1045]
化合物24g的制备
[1046]
在0℃向化合物24f(370mg，0.55mmol)和pd/c(10wt％，74mg)在meoh(10ml)中的搅拌过的混合物添加hcl(在1,4
‑
二噁烷中4n，0.27ml，1.1mmol)。在氢气下于室温搅拌2小时后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用meoh(40ml)洗涤。浓缩滤液而产生化合物24g
(223mg，87％)，为无色油，其不经进一步纯化即使用。1h
‑
nmr(400mhz，dmso
‑
d6)δ10.02(s，1h)，8.62(s，1h)，8.22(br，2h)，7.90(br，2h)，3.81(t，2h)，3.56(m，4h)，3.46(t，2h)，3.39
‑
3.27(m，26h)，2.75(m，2h)，1.73(q，2h)，1.55(p，2h)，1.40
‑
1.33(m，14h)。
[1047]
化合物24h的制备
[1048]
将dipea(1.6ml，9.45mmol)、hobt(746mg，5.52mmol)和edc
·
hcl(1.19g，6.42mmol)添加到化合物24g(1.0g，5.29mmol)和化合物24d(1.1g，2.35mmol)在dmf(15ml)中的搅拌过的混合物中。在n2下于室温搅拌14小时后，将反应混合物倒入h2o(20ml)，用dcm(3
×
50ml)提取并经无水na2so4干燥。过滤并减压浓缩后，将所得剩余物通过柱色谱提纯而产生化合物24h(1.25g，70％)。1h
‑
nmr(400mhz，cdcl3)δ8.36(s，1h)，7.30(d，1h)，7.08(s，1h)，7.68(t，1h)，4.46(q，1h)，4.07
‑
3.98
‑
4.01(m，4h)，3.98(s，2h)，3.75
‑
3.663(m，h)3.57(t，2h)，3.44(m，6h)，3.28(m，2h)，1.87(m，1h)，1.66(m，1h)，1.59
‑
1.52(p,2h)，1.48(s，9h)，1.41
‑
1.33(m，2h)。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
735.0。
[1049]
化合物24i的制备
[1050]
在0℃向化合物24h(1.2g，0.163mmol)和pd/c(10wt％，250mg)在meoh(30ml)中的搅拌过的混合物添加4n hcl(1,4
‑
二噁烷，0.81ml，3.26mmol)。在氢气下于室温搅拌1.5小时后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用meoh(100ml)洗涤。浓缩滤液而产生化合物24i(1.39g，99％)，为无色油，其不经进一步纯化即使用。1h
‑
nmr(400mhz，dmso
‑
d6)δ9.99(s，1h)，8.22(t 1h)7.74(t，1h)，7.61(d，1h)，4.31，(q，1h)，3.93(s，2h)，3.86(s，2h)，3.79(t，2h)，3.60
‑
3.50(m，18h)，3.06(q，2h)，2.97(p，4h)，1.60
‑
1.49(m，2h)，1.39(m，11h)，1.20(m，2h)。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
683。
[1051][1052]
化合物24j的制备
[1053]
将dipea(0.021ml，0.125mmol)和hbtu(29mg，0.078mmol)添加到化合物1i(85mg，0.069mmol)和化合物24i(23mg，0.031mmol)在dmf(0.7ml)中的搅拌过的混合物中。在n2下于室温搅拌14小时后，将反应混合物溶解在h2o/dmso(1.5ml/1.5ml)中并通过hplc纯化。将具有相同保留时间的纯级分合并并浓缩，而产生化合物24j(67mg，68％)。ei
‑
ms m/z：1/2[m+h]
+
1552.5。
[1054]
化合物24k的制备
[1055]
在0℃向化合物24j(67mg，0.021mmol)在meoh(1.7ml)中的溶液添加在h2o(1.7ml)中的lioh一水合物(16mg，0.388mmol)。在0℃下搅拌2小时后，用乙酸(0.018ml)中和反应混合物并减压浓缩。将所述反应混合物溶解在h2o/dmso(1.5ml/1.5ml)中并通过hplc纯化。将具有相同保留时间的纯级分合并并浓缩，产生化合物24k(37mg，62％)。ei
‑
ms m/z：1/2[m+h]
+
1412.3。
[1056]
化合物24l的制备
[1057]
将tfa(0.4ml)添加到化合物24k(37mg，0.013mmol)在dcm(2.0ml)中的搅拌过的溶液中。在0℃下搅拌2小时后，用n2吹除溶剂和过量的tfa。将剩余物溶解在h2o/乙腈(1ml/1ml)中并通过hplc纯化。将具有相同保留时间的纯级分合并并冻干，产生化合物24l(19.8mg，53％)，为白色固体。ei
‑
ms m/z：1/2[m+h]
+
1362.3。
[1058]
实施例35.化合物25e的制备
[1059][1060]
化合物25a的制备
[1061]
将化合物22c(1.0g，2.67mmol)和nan3(261mg，4.01mmol)溶解在dmf(3ml)中。the reaction mixture was heated at 100for 5hours.所述反应混合物在100℃加热5小时。反应完成后，将反应混合物过滤并浓缩。将剩余物通过柱色谱(etoac到etoac/meoh 10/1)纯化，产生化合物25a(854mg，95％)。
[1062]1h
‑
nmr(400mhz，cdcl3)δ4.17(s，2h)，3.76
‑
3.64(m，21h)，3.39(t，j＝5.2hz，2h)。
[1063]
化合物25b的制备
[1064]
在0℃向化合物25a(854mg，2.54mmol)在meoh(25ml)中的搅拌过的溶液添加2m naoh(6.3ml，12.64mmol)水溶液。将反应混合物在室温下搅拌3小时。然后将所述溶液减压浓缩。所得悬液在0℃下冷却的同时，用2n hcl水溶液酸化。将剩余物通过chcl3(8x 500ml)提取。合并有机层，经na2so4干燥并浓缩，产生化合物25b(783mg，96％)。1h
‑
nmr(400mhz，cdcl3)δ4.16(s，2h)，3.76
‑
3.65(m，18h)，3.40(t，j＝5.2hz，2h)。
[1065]
化合物25c的制备
[1066]
将dipea(0.30ml，1.70mmol)和hbtu(483mg，1.27mmol)添加到化合物25b(337mg，1.05mmol)和化合物24g(198mg，0.42mmol)在dmf(3ml)中的搅拌过的混合物中。在n2下于室温搅拌14小时后，将反应混合物浓缩并通过柱色谱(etoac到etoac/meoh 10/1)纯化，产生化合物25c(358mg，84％)。1h
‑
nmr(400mhz，dmso
‑
d6)δ9.98(s，1h)，8.09(t，j＝5.2hz，1h)，7.63(t，j＝5.2hz，1h)，7.55(d，j＝8.4hz，1h)，4.31
‑
4.25(m，1h)，3.90(s，2h)，3.84(s，2h)，3.80(m，2h)，3.62
‑
3.46(m，34h)，3.42
‑
3.36(m，6h)，3.25
‑
3.17(m，2h)，3.08
‑
3.03(m，2h)，1.61
‑
1.51(m，2h)，1.39(s，9h)，1.26
‑
1.10(m，7h)。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
999.1。
[1067]
化合物25d的制备
[1068]
向化合物25c(358mg，0.35mmol)在meoh(7ml)中的溶液添加pd/c(10wt％，38mg)和hcl(在1,4
‑
二噁烷中4n，0.18ml，0.72mmol)。在氢气下于室温搅拌5小时后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用meoh(400ml)洗涤。浓缩滤液而产生化合物25d(314mg，93％)，为无色油，其不经进一步纯化即使用。1h
‑
nmr(400mhz，dmso
‑
d6)δ9.98(s，1h)，8.10(m，1h)，7.68(m，1h)，7.57(m，1h)，4.31
‑
4.25(m，1h)，3.90(s，2h)，3.84(s，2h)，3.80(m，2h)，3.62
‑
3.46(m，30h)，3.42
‑
3.36(m，10h)，3.45
‑
3.16(m，4h)，3.08
‑
3.03(m，3h)，2.72
‑
2.66(m，3h)，1.61
‑
1.51(m，2h)，1.39(s，9h)，1.26
‑
1.10(m，6h)。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
947.1。
[1069]
化合物25e的制备
[1070][1071]
通过与实施例34中制备化合物24l类似的方法，从化合物1i和化合物25d制备化合物25e。ei
‑
ms m/z：1/2[m+h]
+
1493.7。
[1072]
实施例36.化合物25f的制备
[1073][1074]
通过与实施例34中制备化合物24l类似的方法，从化合物1j和化合物25d制备化合物25f。ei
‑
ms m/z：1/2[m+h]
+
1508.2。
[1075]
实施例37.化合物26e的制备
[1076][1077]
化合物26a的制备
[1078]
将dipea(0.65ml，0.004mmol)、hobt(218mg，1.61mmol)和edc
·
hcl(364mg，1.9mmol)添加到化合物24e(1.0g，2.43mmol)和化合物3e(810mg，1.52mmol)在dmf(10ml)中的搅拌过的混合物中。在n2下于室温搅拌14小时后，将反应混合物倒入h2o(50ml)并用etoac(3
×
50ml)提取。将合并的有机层用1n hcl水溶液(30ml)、饱和nahco3水溶液(30ml)和浓盐水(30ml)洗涤，并经无水na2so4干燥。过滤并浓缩后，将剩余物通过柱色谱纯化，产生化合物26a(988mg，73％)。
[1079]1h
‑
nmr(400mhz，cdcl3)δ7.33
‑
7.26(m，8h)，6.85(s，1h)，5.63(s，1h)，5.08
‑
5.02(s，4h)，4.16
‑
4.11(m，1h)，4.09
‑
4.05(m，2h)，3.72
‑
3.70(m，2h)，3.62
‑
3.59(m，14h)，3.53(s，2h)，3.44
‑
3.43(m，2h)，3.18
‑
3.16(m，2h)，1.82(m，1h)，1.72(s，7h)，1.66(m，1h)，1.52(s，18h)，1.38
‑
1.36(m，2h)，1.24
‑
1.27(s，1h)。ei
‑
ms m/z：[m+h
‑
2boc]
+
693.1。
[1080]
化合物26b的制备
[1081]
在0℃向化合物26a(988mg，1.1mmol)和pd/c(10wt％，196mg)在meoh(6ml)中的搅拌过的混合物添加hcl(在1,4
‑
二噁烷中4n，0.55ml，2.2mmol)。在氢气下于室温搅拌1.5小时后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用meoh(40ml)洗涤。浓缩滤液而产生化合物26b(767mg，99％)，为黄色泡沫，其不经进一步纯化即使用。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
625.0，[m+h
‑
boc]
+
525.0，[m+h
‑
2boc]
+
424.9。
[1082]
化合物26c的制备
[1083]
将dipea(0.2ml，1.14mmol)、hobt(89mg，0.66mmol)和edc
·
hcl(142mg，0.74mmol)添加到化合物26b(200mg，0.29mmol)和化合物25b(202mg，0.63mmol)在dmf(5ml)中的搅拌过的混合物中。在n2下于室温搅拌14小时后，将反应混合物倒入h2o(10ml)并用dcm(3
×
10ml)提取。将合并的有机层经无水na2so4干燥。过滤并浓缩后，将剩余物通过柱色谱纯化，产生化合物26c(270mg，77％)。1h
‑
nmr(400mhz，cdcl3)δ8.07(t，1h)，7.62(t，1h)，7.54
‑
7.52(m，1h)，5.73(s，2h)，4.27
‑
4.25(q，1h)，3.96(t，2h)，3.88(s，2h)，3.82(s，2h)，3.58
‑
3.48(m，52h)，3.19
‑
3.18(m，3h)，3.04
‑
3.03(m，3h)，1.44(s，18h)，1.39
‑
1.37(m，3h)，1.21
‑
1.19(m，3h)。ei
‑
ms m/z：[m+h
‑
2boc]
+
1031.6。
[1084]
化合物26d的制备
[1085]
在0℃向化合物26c(160mg，0.13mmol)和pd/c(10wt％，28mg)在meoh(20ml)中的搅拌过的混合物添加hcl(在1,4
‑
二噁烷中4n，0.07ml，0.28mmol)。在氢气下于室温搅拌30分钟后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用meoh(30ml)洗涤。浓缩滤液而产生化合物26d(140mg，91％)，为无色油，其不经进一步纯化即使用。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1179.7。
[1086]
化合物26e的制备
[1087][1088]
通过与实施例34中制备化合物24l类似的方法，从化合物1i和化合物26d制备化合物26e。ei
‑
ms m/z：1/2[m+h]
+
1560.6，1/3[m+h]
+
1040.7。
[1089]
实施例38.化合物27e的制备
[1090][1091]
化合物27a的制备
[1092]
将dipea(0.19ml，1.1mmol)、hobt(64mg，0.47mmol)和edc
·
hcl(91mg，0.47mmol)添加到化合物24e(228mg，0.55mmol)和化合物4e(256mg，0.36mmol)在dmf(4ml)中的搅拌过的混合物中。在n2下于室温搅拌4小时后，将反应混合物倒入h2o(10ml)并用etoac(3
×
15ml)提取。将合并的有机层用1n hcl水溶液(20ml)、饱和nahco3水溶液(10ml)和浓盐水(10ml)
洗涤，并经无水na2so4干燥。过滤并浓缩后，将剩余物通过柱色谱纯化，产生化合物27a(327mg，85％)。
[1093]1h
‑
nmr(400mhz，cdcl3)δ7.73(s，1h)，7.33
‑
7.26(m，11h)，6.91(s，1h)，5.67(br，1h)5.08
‑
5.07(m，5h)，4.15(m，1h)，4.02(t，2h)，3.72
‑
3.44(m，46h)，3.16(d，2h)，1.82(m，1h)，1.63(m，1h)，1.55
‑
1.36(m，13h)。
[1094]
化合物27b的制备
[1095]
在0℃向化合物27a(327mg，0.309mmol)和pd/c(10wt％，65mg)在meoh(6ml)中的搅拌过的混合物添加hcl(在1,4
‑
二噁烷中4n，0.15ml，0.618mmol)。在氢气下于室温搅拌1.5小时后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用meoh(40ml)洗涤。浓缩滤液而产生化合物27b(244mg，91％)，为无色油，其不经进一步纯化即使用。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
789.2。
[1096]
化合物27c的制备
[1097]
将dipea(0.19ml，1.13mmol)、hobt(95mg，0.707mmol)和edc
·
hcl(135mg，0.707mmol)添加到化合物25b(227mg，0.707mmol)和化合物27b(244mg，0.283mmol)在dmf(6ml)中的搅拌过的混合物。在n2下于室温搅拌3小时后，将反应混合物倒入h2o(5ml)并用dcm(3
×
10ml)提取。将合并的有机层经无水na2so4干燥。过滤并浓缩后，将剩余物通过柱色谱纯化，产生化合物27c(339mg，85％)。1h nmr(400mhz，cdcl3)δ7.69(s，1h)，7.29(d，1h)，6.99(s，1h)，6.82(s，1h)，4.39(q，1h)，3.99
‑
3.94(m，6h)，3.69
‑
3.58(m，80h)，3.51(t，2h)，3.44
‑
3.34(m，8h)，3.25(m，2h)，1.68
‑
1.64(m，1h)。1.53
‑
1.48(m，2h)，1.44(s，9h)，1.33(m，2h)。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1395.6。
[1098]
化合物27d的制备
[1099]
在0℃向化合物27c(339mg，0.242mmol)和pd/c(10wt％，67mg)在meoh(6ml)中的搅拌过的混合物添加hcl(在1,4
‑
二噁烷中4n，0.12ml，0.484mmol)。在氢气下于室温搅拌30分钟后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用meoh(30ml)洗涤。浓缩滤液而产生化合物27d(300mg，87％)，为无色油，其不经进一步纯化即使用。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1343.5。
[1100]
化合物27e的制备
[1101][1102]
通过与实施例34中制备化合物24l类似的方法，从化合物1i和化合物27d制备化合物27e。ei
‑
ms m/z：1/2[m+h]
+
1692.5。
[1103]
实施例39.化合物28d的制备
[1104]
化合物28c的制备
[1105][1106]
通过与实施例35中制备化合物25d类似的方法，从h
‑
d
‑
lys(z)
‑
oh制备化合物28c。
[1107]
化合物28d的制备
[1108][1109]
通过与实施例35中制备化合物25e类似的方法，从化合物1i和化合物28c制备化合物28d。ei
‑
ms m/z：1/2[m+h]
+
1494.9。
[1110]
实施例40.化合物28e的制备
[1111][1112]
通过与实施例35中制备化合物25e类似的方法，从化合物1j和化合物28c制备化合物28e。ei
‑
ms m/z：1/2[m+h]
+
1509.2。
[1113]
实施例41.化合物29j的制备
[1114][1115]
化合物29a的制备
[1116]
在n2下于0℃向六乙二醇(25.0g，88.5mmol)在dcm(100ml)中的溶液添加三乙胺(61.7ml，443mmol)和对甲苯磺酰氯(50.6g，266mmol)。在0℃下5小时后，将反应混合物倒入1n hcl水溶液(200ml)并用dcm(2
×
200ml)提取。将合并的有机层用饱和nahco3水溶液(100ml)和浓盐水(100ml)洗涤，并经无水na2so4干燥。过滤并浓缩后，将剩余物通过柱色谱纯化，产生化合物29a(45.0g，87％)，为棕色油。1h
‑
nmr(400mhz，cdcl3)δ7.79(d，j＝7.6hz，4h)，7.34(d，j＝7.6hz，4h)，4.16
‑
4.14(m，4h)，3.69
‑
3.67(m，4h)，3.64
‑
3.56(m，16h)，2.44(s，6h)。
[1117]
化合物29b的制备
[1118]
向化合物29a(17.6g，29.7mmol)在dmf(100ml)中的溶液添加nan3(9.65g，148mmol)和四丁基碘化铵(550mg，1.49mmol)。将反应混合物加热至80℃。在80℃下搅拌16小时后，使所述反应混合物冷却至室温。将所述反应混合物通过硅藻土垫过滤并用dcm(100ml)洗涤。浓缩后，将剩余物通过柱色谱纯化，产生化合物29b(9.4g，94％)。1h
‑
nmr(400mhz，cdcl3)δ3.68(m，20h)，3.39(t，4h)。
[1119]
化合物29c的制备
[1120]
向29b(8.4g，24.9mmol)在dcm(24ml)和甲苯(24ml)中的溶液添加1n hcl水溶液(40.3ml)和三苯基膦(6.9g，23.6mmol)。将反应混合物在n2下于室温搅拌16小时。减压除去溶剂后，将水(20ml)加入反应混合物中，并将水层用etoac(20ml)提取。然后将水相的ph调节到13。所得的水相用dcm(3
×
30ml)提取。将合并的有机层经无水na2so4干燥，过滤，并减压浓缩而产生化合物29c(6.6g，84％)，为无色油。1h
‑
nmr(400mhz，cdcl3)δ3.67(m，20h)，3.52(t，2h)，3.39(t，2h)，2.86(t，2h)。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
306.9。
[1121][1122]
化合物29d的制备
[1123]
在0℃下将dipea(2.67ml，15.4mmol)和hbtu(3.49g，9.21mmol)添加到l
‑
谷氨酸二甲酯盐酸盐(1.3g，6.14mmol)和化合物20e(1.72g，6.14mmol)在dmf(15ml)中的搅拌过的混合物中。将反应混合物在0℃下搅拌30分钟，并使其在n2下经16小时升温至室温。将所述反应混合物倒入水(50ml)中并用dcm(3
×
50ml)提取。将合并的有机层用0.5n hcl(50ml)、饱和nahco3水溶液(50ml)和浓盐水(50ml)依次洗涤，并经无水na2so4干燥。过滤并减压浓缩
后，将所得的粗产物通过柱色谱纯化而产生化合物29d(2.18g，81％)。1h
‑
nmr(400mhz，dmso
‑
d6)δ10.00(s，1h)，8.04(d，1h)，4.34(m，1h)，3.93(s，1h)，3.77(s，1h)，3.63(s，3h)，3.58(s，9h)，3.38
‑
3.34(t，2h)，2.14(m，h)，1.90(m，1h)，1.39(s，9h)。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
437.35。
[1124]
化合物29e的制备
[1125]
在n2下于室温向化合物29d(2.18g，4.99mmol)在thf:meoh:h2o(12ml:4ml:4ml)中的溶液添加naoh(499mg，12.5mmol)。3小时后，将反应混合物的ph调至4并浓缩。然后剩余物用dcm/meoh(80ml/20ml)提取。浓缩提供化合物29e(1.0g，49％)，为黄色油，其不经进一步纯化即使用。ei
‑
ms m/z：[m+h
‑
boc]
+
309.20。
[1126]
化合物29f的制备
[1127]
在0℃下将dipea(1.7ml，9.79mmol)和hbtu(2.79g，7.35mmol)添加到化合物29e(1.0g，2.45mmol)和化合物29c(2.25g，7.35mmol)在dmf(10ml)中的搅拌过的混合物中。将反应混合物在0℃下搅拌30分钟，并使其在n2下经16小时升温至室温。将所述反应混合物倒入水(50ml)中并用dcm(3
×
50ml)提取。将合并的有机层用0.5n hcl水溶液(50ml)、饱和nahco3水溶液(50ml)和浓盐水(50ml)依次洗涤，并经无水na2so4干燥。过滤并减压浓缩后，将所得的粗产物通过柱色谱纯化而产生化合物29f(611mg，25％)。1h
‑
nmr(400mhz，dmso
‑
d6)δ9.97(s，1h)，8.08(t，1h)，7.85(t，1h)，7.64(d，1h)，4.27(m，1h)，3.83(s，2h)，3.82
‑
3.61(m，2h)，3.61
‑
3.50(m，42h)，3.42
‑
3.37(m，8h)，3.28
‑
3.15(m，4h)，2.90(s，h)，2.08
‑
2.04(m,2h)，1.88(m，1h)，1.75(m，1h)，1.39(s，9h)。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
986.73。
[1128]
化合物29g的制备
[1129]
向化合物29f(611mg，0.62mmol)在meoh(50ml)中的搅拌过的混合物添加pd/c(10wt％，132mg 0.62mmol)。在氢气下于室温搅拌2小时后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用meoh(40ml)洗涤。浓缩滤液而产生化合物29g，为无色油(518mg，crude)，其不经进一步纯化即使用。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
933.85。
[1130][1131]
化合物29h的制备
[1132]
将dipea(0.026ml，0.150mmol)和hbtu(40mg，0.105mmol)添加到化合物29g(35mg，0.037mmol)和化合物1i(106mg，0.086mmol)在dmf(3ml)中的搅拌过的混合物中。在n2下于室温搅拌16小时后，将反应混合物用水(20ml)稀释并用etoac(3
×
10ml)提取。将合并的有
机层用0.5n hcl(20ml)、饱和nahco3水溶液(20ml)和浓盐水(20ml)依次洗涤，并经无水na2so4干燥。过滤并减压浓缩后，将所得的粗产物通过柱色谱纯化而产生化合物29h(81.4mg，65％)。ei
‑
ms m/z：1/2[m+h]
+
1677.94，1/3[m+h]
+
1119.03。
[1133]
化合物29i的制备
[1134]
在
‑
10℃向化合物29h(81mg，0.024mmol)在meoh(1ml)中的溶液添加在h2o(1ml)中的lioh一水合物(8.1mg，0.19mmol)。在
‑
10℃下搅拌2小时后，将反应混合物用乙酸中和并减压浓缩。然后将所述反应混合物溶解在h2o/dmso(1.5ml/1.5ml)中并通过hplc纯化，产生化合物29i(53mg，72％)，为白色固体。ei
‑
ms m/z：1/2[m+h]
+
1537.86，1/3[m+h]
+
1025.66。
[1135]
化合物29j的制备
[1136]
将tfa(0.3ml)在0℃下添加到化合物29i(53mg，0.017mmol)在dcm(1.0ml)中的搅拌过的溶液中。搅拌1小时后，通过n2流除去溶剂和过量的tfa。然后剩余物溶解在h2o/mecn(1ml/1ml)中并通过hplc纯化。将具有相同保留时间的纯级分合并并冻干，而产生化合物29j(23.1mg，43％)，为白色固体。ei
‑
ms m/z：1/2[m+h]
+
1487.99，1/3[m+h]
+
992.40。
[1137]
实施例42.化合物29k的制备
[1138][1139]
通过与实施例41中制备化合物29j类似的方法，从化合物1j和化合物29g制备化合物29k。ei
‑
ms m/z：1/2[m+h]
+
1501.93，1/3[m+h]
+
1001.69。
[1140]
实施例43.化合物30b的制备
[1141]
化合物30a的制备
[1142][1143]
通过与实施例41中制备化合物29g类似的方法，从d
‑
谷氨酸二甲酯盐酸盐制备化合物30a。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
933.89。
[1144]
化合物30b的制备
[1145][1146]
通过与实施例41中制备化合物29j类似的方法，从化合物1i和化合物30a制备化合物30b。ei
‑
ms m/z：1/2[m+h]
+
1488.07，1/3[m+h]
+
992.40。
[1147]
实施例44.化合物30c的制备
[1148][1149]
通过与实施例41中制备化合物29j类似的方法，从化合物1j和化合物30a制备化合物30c。ei
‑
ms m/z：1/2[m+h]
+
1501.93，1/3[m+h]
+
1001.69。
[1150]
实施例45.化合物31f的制备
[1151]
[1152]
化合物31a的制备
[1153]
三颈烧瓶连续加载h2o(18ml)、1,4
‑
二噁烷(30ml)和l
‑
鸟氨酸单盐酸盐(3.0g，17.8mmol)。搅拌过的混合物直到完全溶解。通过加入2m na2co3水溶液将ph调节到约10.5。在通过同时添加2m na2co3水溶液将ph保持在约10
‑
11的同时，添加氯甲酸苄酯(6.37g，37.4mmol)。添加结束后，将反应混合物在20℃下搅拌1小时。然后添加etoac(50ml)并用c
‑
hcl将所得混合物的ph调节到2～3。分离有机层并将水层用etoac(50ml)提取。将合并的有机层用浓盐水(50ml)洗涤，并经na2so4干燥。过滤并减压浓缩提供化合物31a(7.1g)。1h
‑
nmr(400mhz，dmso
‑
d6)δ12.54(s，1h)，7.54(s，1h)，7.44
‑
7.29(m，10h)，7.24
‑
7.22(m，1h)，5.16
‑
5.00(d，4h)，3.95
‑
3.89(m，1h)，3.00
‑
2.96(m，2h)，1.98
‑
1.57(m，1h)，1.56
‑
1.46(m，3h)。
[1154]
化合物31b的制备
[1155]
在0℃下将dipea(1.41ml，8.12mmol)和hbtu(1.85g，4.87mmol)添加到化合物31a(1.30g，3.25mmol)和化合物2d(891mg，3.57mmol)在dmf(10ml)中的搅拌过的混合物中。将反应混合物在0℃下搅拌30分钟，并使其在n2下经16小时升温至室温。将所述反应混合物倒入水(50ml)中并用dcm(3
×
50ml)提取。将合并的有机层用0.5n hcl水溶液(50ml)、饱和nahco3水溶液(50ml)和浓盐水(50ml)依次洗涤，并经无水na2so4干燥。过滤并减压浓缩后，将所得的粗产物通过柱色谱纯化而产生化合物31b(1.2g，57％)。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
647.54，[m+h
‑
boc]
+
547.47。
[1156]
化合物31c的制备
[1157]
向化合物31b(1.2g，1.86mmol)在meoh(50ml)中的搅拌过的混合物添加pd/c(10wt％，59mg 5.57mmol)。在氢气下于室温搅拌2小时后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用meoh(40ml)洗涤。浓缩滤液而产生化合物31c(717mg)，其不经进一步纯化即使用。1h
‑
nmr(400mhz，dmso
‑
d6)δ7.93(s，1h)，3.81(t，2h)，3.55(t，2h)，3.51(s，5h)，3.42
‑
3.22(m，13h)，1.37(s，9h)。
[1158]
化合物31d的制备
[1159]
在0℃下将dipea(0.55ml，3.17mmol)和hbtu(902mg，2.38mmol)添加到化合物31c(300mg，0.79mmol)和化合物25b(637mg，1.98mmol)在dmf(5ml)中的搅拌过的混合物中。将反应混合物在0℃下搅拌30分钟，并使其在n2下经16小时升温至室温。将所述反应混合物倒入水(30ml)中并用dcm(3
×
30ml)提取。将合并的有机层用0.5n hcl水溶液(30ml)、饱和nahco3水溶液(30ml)和浓盐水(30ml)依次洗涤，并经无水na2so4干燥。过滤并减压浓缩后，将所得的粗产物通过柱色谱纯化而产生化合物31d(551mg，71％)。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
985.87。
[1160]
化合物31e的制备
[1161]
向化合物31d(491mg，0.50mmol)在meoh(30ml)中的搅拌过的混合物添加pd/c(10wt％，106mg 1.00mmol)。在氢气下于室温搅拌2小时后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用meoh(40ml)洗涤。浓缩滤液而产生化合物31e(452mg)，其不经进一步纯化即使用。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
933.94。
[1162]
化合物31f的制备
[1163][1164]
通过与实施例35中制备化合物25e类似的方法，从化合物1i和化合物31e制备化合物31f。ei
‑
ms m/z：1/2[m+h]
+
1488.20，1/3[m+h]
+
992.54。
[1165]
实施例46.化合物31g的制备
[1166][1167]
通过与实施例35中制备化合物25e类似的方法，从化合物1j和化合物31e制备化合物31g。ei
‑
ms m/z：1/2[m+h]
+
1502.23，1/3[m+h]
+
1001.86。
[1168]
实施例47.化合物32c的制备
[1169][1170]
化合物32a的制备
[1171]
将dipea(0.6ml，7.07mmol)和hbtu(972mg，5.30mmol)添加到化合物24g(483mg，0.855mmol)和fmoc
‑
nh
‑
peg5
‑
ch2ch2cooh(1.0g，3.89mmol)在dmf(10ml)中的正搅拌的混合物中。在n2下于室温搅拌14小时后，将反应混合物倒入h2o(30ml)中并用etoac(3
×
30ml)提取。将合并的有机层用1n hcl水溶液(10ml)、饱和nahco3水溶液(10ml)和浓盐水(10ml)依次洗涤，并经无水na2so4干燥。过滤并浓缩后，将所得剩余物通过柱色谱提纯，产生化合物
32a(1.16g，90％)。1h
‑
nmr(400mhz，cdcl3)δ7.77(d，4h)，7.60(d，4h)，7.39(t，4h)，7.31(t，4h)，4.39(d，4h)，4.33(m，1h)，4.22(m，2h)，4.09(m，2h)，3.71
‑
3.39(m，52h)，3.19(m，2h)，2.51(m，4h)，1.50(m，1h)，1.46(m，1h)，1.43(s，9h)，1.25(m，2h)。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1520.0。
[1172]
化合物32b的制备
[1173]
在室温向化合物32a(500mg，0.328mmol)在thf(8ml)中的溶液添加哌啶(2ml)。搅拌20分钟后，将反应混合物减压浓缩。将所得剩余物通过柱色谱提纯而产生化合物32b(175mg，50％)。1h
‑
nmr(400mhz，cdcl3)δ4.41(m，1h)，4.01(m，2h)，3.75
‑
3.56(m，43h)，3.54(m，2h)，3.24(m，2h)，2.89(m，3h)，2.52(m，4h)，1.83(m，1h)，1.80(m，1h)，1.53(s，9h)，1.39(m，2h)。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
975.5。
[1174]
化合物32c的制备
[1175][1176]
通过与实施例35中制备化合物25e类似的方法，从化合物1i和化合物32b制备化合物32c。ei
‑
ms m/z：1/2[m+h]
+
1508.8。
[1177]
实施例48.化合物32d的制备
[1178][1179]
通过与实施例35中制备化合物25e类似的方法，从化合物1j和化合物32b制备化合物32d。ei
‑
ms m/z：1/2[m+h]
+
1522.8。
[1180]
实施例49.化合物33e的制备
[1181][1182]
化合物33a的制备
[1183]
将dipea(1.98ml，11.37mmol)和hbtu(2.15g，5.68mmol)添加到化合物24e(1.57g，3.79mmol)和化合物6b(1.30g，3.15mmol)在dmf(37ml)中的搅拌过的混合物中。after stirring at room temperature for 14hours under n2，the reaction mixture was poured into h2o(40ml)并用提取etoac(3x 40ml)。合并的有机层用洗涤1n hcl水溶液(40ml)，饱和水溶液nahco3(40ml)和浓盐水(40ml)依次，并经无水na2so4干燥。过滤并浓缩后，the剩余物通过柱色谱纯化，产生化合物33a(2.2g，88％)。1h
‑
nmr(400mhz，dmso
‑
d6)δ9.99(s，1h)，8.19(d，1h)，7.79(t，1h)，7.47(d，1h)，7.34
‑
7.31(m，5h)，7.24(t，1h)，5.01(d，4h)，4.55(q，1h)，3.91(q，1h)，3.79(t，2h)，3.55
‑
3.48(m，9h)，3.24
‑
3.11(m，2h)，2.75
‑
2.54(m，2h)，1.57
‑
1.49(m，2h)，1.38(s，9h)，1.25(m，2h)。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
790.47，[m+na]
+
812.4.
[1184]
化合物的制备33b
[1185]
在0℃向化合物33a(2.2g，2.78mmol)和pd/c(10wt％，400mg)在meoh(60ml)中的搅拌过的混合物添加hcl(在1,4
‑
二噁烷中4n，1.39ml，5.56mmol)。在氢气下于室温搅拌3小时后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用meoh(40ml)洗涤。浓缩滤液而产生化合物33b(1.67g，99％)，其不经进一步纯化即使用。1h
‑
nmr(400mhz，dmso
‑
d6)δ9.98(s，1h)，8.87(d，1h)，8.28(bs，3h)，8.12(1h)，7.96(bs，3h)，4.51(q，1h)，3.77(t，2h)，3.72(bs，1h)，3.57(s，3h)，3.52
‑
3.47(m，7h)，3.12(s，3h)，2.76
‑
2.61(m,4h)1.71(q，2h)，1.55(q，2h)1.36(s，9h)。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
522.4，[m+na]
+
544.3.
[1186]
化合物的制备33c
[1187]
将dipea(1.95ml，11.23mmol)和hbtu(3.19g，8.42mmol)添加到化合物25b(1.98g，6.17mmol)和化合物33b(1.67g，2.80mmol)在dmf(20ml)中的搅拌过的混合物。在n2下于室温搅拌14小时后，将反应混合物浓缩并通过柱色谱纯化，产生化合物33c(2g，63％)。1h
‑
nmr(400mhz，dmso
‑
d6)δ9.97(s，1h)，8.28(d，1h)，7.82(t，1h)，7.65(s，1h)，7.64(s，1h)，4.54(q，1h)，4.25(q，1h)，3.91(s，2h)，3.84(s，2h)，3.80(t，2h)，3.60
‑
3.49(m，48h)，3.26
‑
3.12
(m,3h)，3.07(q，2h)，2.75
‑
2.54(m，2h)，1.65
‑
1.55(m，2h)，1.39(s，10h)，1.21(m,3h)。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1128.8，[m+na]
+
1150.7。
[1188]
化合物33d的制备
[1189]
在0℃向化合物33c(1g，0.88mmol)和pd/c(10wt％，200mg)在meoh(20ml)中的搅拌过的混合物添加hcl(在1,4
‑
二噁烷中4n，0.44ml，0.88mmol)。在氢气下于室温搅拌3小时后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用meoh(20ml)洗涤。浓缩滤液而产生化合物33d(936mg，92％)，其不经进一步纯化即使用。1h
‑
nmr(400mhz，dmso
‑
d6)δ9.98(s 1h)，8.30(d，1h)，7.70(t，2h)，4.54(q，1h)，4.26(q，1h)，3.93(s，2h)，3.85(s，2h)，3.80(t，2h)，3.61
‑
3.49(m，46h)，3.22
‑
3.12(m，4h)，3.06(q，2h)，2.97(q，4h)，2.76
‑
2.54(m，2h)，1.64
‑
1.55(m，2h)，1.39(s，10h)，1.26(m，3h)。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1076.8。
[1190]
化合物33e的制备
[1191][1192]
通过与实施例35中制备化合物25e类似的方法，从化合物1i和化合物33d制备化合物33e。ei
‑
ms m/z：1/2[m+h]
+
1552.2。
[1193]
实施例50.化合物33f的制备
[1194][1195]
通过与实施例35中制备化合物25e类似的方法，从化合物1j和化合物33d制备化合物33f。ei
‑
ms m/z：1/2[m+h]
+
1566.4。
[1196]
实施例51.化合物34e的制备
[1197][1198]
化合物34a的制备
[1199]
将dipea(0.8ml，4.56mmol)和hbtu(1.3g，3.42mmol)添加到化合物24g(530mg，1.14mmol)和z
‑
asp(ome)
‑
oh(704mg，2.5mmol)在dmf(5ml)中的搅拌过的混合物中。在n2下于室温搅拌14小时后，将反应混合物倒入h2o(50ml)并用etoac(3
×
30ml)提取。将合并的有机层用1n hcl水溶液(40ml)、饱和nahco3水溶液(40ml)和浓盐水(40ml)依次洗涤，并经无水na2so4干燥。过滤并浓缩后，将剩余物通过柱色谱纯化，产生化合物34a(713mg，68％)。1h
‑
nmr(400mhz，dmso
‑
d6)：δ9.97(s，1h)，7.88(m，3h)，7.64(d，2h)，7.51(d，2h)，7.35(m，10h)，5.02(m，4h)，4.43
‑
4.31(m，2h)，4.17(m，1h)，3.80(t，2h)，3.58
‑
3.50(m，12h)，3.41
‑
3.16(m，6h)，2.98(m，2h)，2.79
‑
2.67(m，3h)，2.57(m，2h)，1.60
‑
1.34(m，13h)。
[1200]
化合物34b的制备
[1201]
向化合物34a(530mg，0.58mmol)在meoh(5ml)中的溶液添加pd/c(20wt％，106mg)和hcl(在1,4
‑
二噁烷中4n，0.29ml，1.16mmol)。在氢气下于室温搅拌3小时后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用meoh(30ml)洗涤。浓缩滤液而产生化合物34b(420mg，100％)，其不经进一步纯化即使用。1h
‑
nmr(400mhz，dmso
‑
d6)δ9.97(s，1h)，8.62(d，1h)，8.54(s，1h)，8.27(m，4h)，7.02(s，1h)，4.17(m，2h)，4.02(m，1h)，3.76(t，2h)，3.61(m，4h)，3.51
‑
3.11(m，12h)，3.09
‑
2.77(m，8h)，1.60
‑
1.24(m，13h)。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
651.5。
[1202]
化合物34c的制备
[1203]
将dipea(0.4ml，2.32mmol)和hbtu(660mg，1.74mmol)添加到化合物34b(420mg，0.58mmol)和化合物25b(299mg，0.93mmol)在dmf(5ml)中的搅拌过的混合物中。在n2下于室温搅拌14小时后，将反应混合物倒入h2o(30ml)并用etoac(3
×
30ml)提取。将合并的有机层用1n hcl水溶液(20ml)、饱和nahco3水溶液(20ml)和浓盐水(20ml)依次洗涤，并经无水na2so4干燥。过滤并浓缩后，将剩余物通过柱色谱纯化，产生化合物34c(466mg，70.8％)。1h
‑
nmr(400mhz，cdcl3)：δ8.28(s，1h)，7.78(q，1h)，7.31(d，1h)，7.71(s，1h)，6.94(s，1h)，4.85(m，2h)，4.35(m，1h)，4.07
‑
4,03(m，6h)，3.75
‑
3.41(m，56h)，3.23(q，2h)，2.92
‑
2.84
(m，4h),1.91
‑
1.32(m，15h)。ei
‑
ms m/z：[m+2h]
+
1158.1。
[1204]
化合物34d的制备
[1205]
在0℃向化合物34c(260mg，0.21mmol)和pd/c(10wt％，52mg)在meoh(20ml)中的搅拌过的混合物添加hcl(在1,4
‑
二噁烷中4n，0.10ml，0.41mmol)。在氢气下于室温搅拌2小时后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用meoh(50ml)洗涤。浓缩滤液而产生化合物34d(249mg，100％)，其不经进一步纯化即使用。ei
‑
ms m/z：[m+2h]
+
1206.1。
[1206]
化合物34e的制备
[1207][1208]
通过与实施例35中制备化合物25e类似的方法，从化合物1i和化合物34d制备化合物34e。ei
‑
ms m/z：1/2[m+h]
+
1610.4。
[1209]
实施例52.化合物34f的制备
[1210][1211]
通过与实施例35中制备化合物25e类似的方法，从化合物1j和化合物34d制备化合物34f。ei
‑
ms m/z：1/2[m+h]
+
1624.3。
[1212]
实施例53.化合物35g的制备
[1213][1214]
化合物35a的制备
[1215]
将dipea(0.61ml，3.52mmol)和hbtu(665mg，1.175mmol)添加到fmoc
‑
d
‑
glu(otbu)
‑
oh(500mg，1.17mmol)和化合物2d(424mg，1.404mmol)在dmf(10ml)中的正搅拌的混合物中。在n2下于室温搅拌14小时后，将反应混合物倒入h2o(30ml)并用etoac(3
×
30ml)提取。将合并的有机层用1n hcl水溶液(20ml)、饱和nahco3水溶液(20ml)和浓盐水(20ml)依次洗涤，并经无水na2so4干燥。过滤并浓缩后，将所得剩余物通过柱色谱提纯，产生化合物35a(708mg，89％)。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
672.7。
[1216]
化合物35b的制备
[1217]
在室温向化合物35a(708mg，1.04mmol)在thf(8ml)中的溶液添加哌啶(2ml)。搅拌20分钟后，将反应混合物减压浓缩。将所得剩余物通过柱色谱提纯，产生化合物35b(400mg，85％)。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
450.1。
[1218]
化合物35c的制备
[1219]
将dipea(0.19ml，1.1mmol)和hbtu(253mg，0.66mmol)添加到化合物28a(203mg，0.484mmol)和化合物35b(200mg，0.44mmol)在dmf(10ml)中的正搅拌的混合物中。在n2下于室温搅拌14小时后，将反应混合物倒入h2o(30ml)并用etoac(3
×
30ml)提取。将合并的有机层用1n hcl水溶液(10ml)、饱和nahco3水溶液(10ml)和浓盐水(10ml)依次洗涤，并经无水na2so4干燥。过滤并浓缩后，将剩余物通过柱色谱纯化，产生化合物35c(235mg，63％)。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
847.0。
[1220]
化合物35d的制备
[1221]
向化合物35c(235mg，0.277mmol)在meoh(15ml)中的溶液添加pd/c(10wt％，
30mg)。在氢气下于室温搅拌2小时后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用meoh(50ml)洗涤。浓缩滤液而产生化合物35d(160mg，100％)，其不经进一步纯化即使用。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
578.7。
[1222]
化合物35e的制备
[1223]
将dipea(0.145ml，1.758mmol)和hbtu(262mg，1.465mmol)添加到化合物35d(160mg，0.276mmol)和化合物25b(187mg，0.581mmol)在dmf(3ml)中的正搅拌的混合物中。在n2下于室温搅拌14小时后，将反应混合物倒入h2o(30ml)并用etoac(3
×
30ml)提取。将合并的有机层用1n hcl水溶液(10ml)、饱和nahco3水溶液(10ml)和浓盐水(10ml)依次洗涤，并经无水na2so4干燥。过滤并浓缩后，将剩余物通过柱色谱纯化，产生化合物35e(260mg，79％)。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1185.4。
[1224]
化合物35f的制备
[1225]
向化合物35e(70mg，0.059mmol)在meoh(5ml)中的溶液添加pd/c(10wt％，15mg)。在氢气下于室温搅拌90分钟后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用meoh(30ml)洗涤。浓缩滤液而产生化合物35f(67mg，100％)，其不经进一步纯化即使用。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
：1133.3。
[1226]
化合物35g的制备
[1227][1228]
通过与实施例35中制备化合物25e类似的方法，从化合物1i和化合物35f制备化合物35g。ei
‑
ms m/z：1/2[m+h]
+
1559.9.
[1229]
实施例54.化合物36e的制备
[1230][1231]
化合物36a的制备
[1232]
将dipea(0.3ml，3.10mmol)和hbtu(474mg，2.275mmol)添加到fmoc
‑
d
‑
glu(otbu)
‑
oh(484mg，1.138mmol)和化合物28b(223mg，0.569mmol)在dmf(7ml)中的正搅拌的混合物中。在n2下于室温搅拌14小时后，将反应混合物倒入h2o(30ml)并用etoac(3
×
30ml)提取。将合并的有机层用1n hcl水溶液(20ml)、饱和nahco3水溶液(20ml)和浓盐水(20ml)洗涤，并经无水na2so4干燥。过滤并浓缩后，将剩余物通过柱色谱纯化，产生化合物36a(593mg，86％)。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1208.3.
[1233]
化合物36b的制备
[1234]
在室温向化合物36a(593mg，0.49mmol)在thf(8ml)中的溶液添加哌啶(1ml)。搅拌20分钟后，将反应混合物减压浓缩。将所得剩余物通过柱色谱提纯，产生化合物36b(166mg，44％)。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
763.9。
[1235]
化合物36c的制备
[1236]
将dipea(0.15ml，0.84mmol)和hbtu(247mg，0.63mmol)添加到化合物36b(166mg，0.21mmol)和化合物25b(147mg，0.441mmol)在dmf(3ml)中的搅拌过的混合物中。在n2下于室温搅拌14小时后，将反应混合物倒入h2o(30ml)并用etoac(3
×
30ml)提取。将合并的有机层用1n hcl水溶液(10ml)、饱和nahco3水溶液(10ml)和浓盐水(10ml)依次洗涤，并经无水na2so4干燥。过滤并浓缩后，将剩余物通过柱色谱纯化，产生化合物36c(195mg，68％)。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1370.6。
[1237]
化合物的制备36d
[1238]
向化合物36c(195mg，0.14mmol)在meoh(10ml)中的溶液添加pd/c(10wt％，30mg)。然后所述反应混合物在氢气下于室温搅拌90分钟。将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用meoh(50ml)洗涤。浓缩滤液而产生化合物36d(187mg，100％)，其不经进一步纯化即使用。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1318.6。
[1239]
化合物36e的制备
[1240][1241]
通过与实施例35中制备化合物25e类似的方法，从化合物1i和化合物36d制备化合物36e。ei
‑
ms m/z：1/2[m+h]
+
1624.4。
[1242]
实施例55.化合物37d的制备
[1243][1244]
化合物37a的制备
[1245]
将dipea(0.083ml，0.71mmol)和hbtu(136mg，0.36mmol)添加到炔丙基胺(0.018ml，0.285mmol)和化合物1j(300mg，0.238mmol)在dmf(3ml)中的搅拌过的混合物中。在n2下于室温搅拌14小时后，将反应混合物倒入h2o(10ml)并用etoac(3
×
30ml)提取。将合并的有机层用1n hcl水溶液(10ml)、饱和nahco3水溶液(10ml)和浓盐水(10ml)依次洗涤，并经无水na2so4干燥。过滤并浓缩后，将所得剩余物通过柱色谱提纯，产生化合物37a(300mg，97％)。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1294.0。
[1246]
化合物37b的制备
[1247]
在0℃向化合物37a(300mg，0.24mmol)在thf(2ml)和meoh(2ml)中的溶液添加在h2o(2ml)中的lioh一水合物(50mg，1.20mmol)。在0℃下搅拌2小时后，将反应混合物用乙酸中和并减压浓缩。然后剩余物溶解在h2o/dmso(1.5ml/1.5ml)中并通过hplc纯化。将具有相同保留时间的纯级分合并并浓缩，产生化合物37b(165mg，60％)。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1140.8。
[1248]
化合物37c的制备
[1249]
将cuso4·
5h2o(1mg)和抗坏血酸钠(2mg)添加到化合物37b(50mg，0.042mmol)和化合物25c(23mg，0.02mmol)在thf(2ml)和h2o(2ml)中的搅拌过的混合物中。通过添加1m na2co3水溶液将ph调节至约7。在20℃下搅拌1小时后，将反应混合物溶解在h2o/dmso(1.5ml/1.5ml)中并通过hplc纯化。将具有相同保留时间的纯级分合并并浓缩，而产生化合物37c(32.4mg，48％)。ei
‑
ms m/z：1/2[m+h]
+
1638.2。
[1250]
化合物37d的制备
[1251]
将tfa(0.4ml)添加到化合物37c(32.4mg，0.01mmol)在dcm(2ml)中的溶液中。在0℃下搅拌2小时后，通过n2流除去溶剂和过量的tfa。然后将剩余物溶解在h2o/mecn(1ml/1ml)中并通过hplc纯化。将具有相同保留时间的纯级分合并并冻干，产生化合物37d(19.6mg，62％)，为白色固体。ei
‑
ms m/z：1/2[m+h]
+
1590.2。
[1252]
实施例56.化合物38b的制备
[1253][1254]
化合物38a的制备
[1255]
将cuso4·
5h2o(1mg)和抗坏血酸钠(2mg)添加到化合物37b(60mg，0.052mmol)和化合物16b(14mg，0.025mmol)在thf(2ml)和h2o(2ml)中的搅拌过的混合物中。通过添加1m na2co3水溶液将ph调节至约7。在20℃下搅拌1小时后，将反应混合物溶解在h2o/dmso(1.5ml/1.5ml)中并通过hplc纯化。将具有相同保留时间的纯级分合并并浓缩，产生化合物
38a(61mg，82％)。ei
‑
ms m/z：1/2[m+h]
+
1430.2。
[1256]
化合物38b的制备
[1257]
将tfa(0.4ml)添加到化合物38a(59.8mg，0.02mmol)在dcm(2.0ml)中的溶液中。在0℃下搅拌2小时后，通过n2流除去溶剂和过量的tfa。然后将剩余物溶解在h2o/an(1ml/1ml)中并通过hplc纯化。将具有相同保留时间的纯级分合并并冻干，产生化合物38b(14.6mg，24％)，为白色固体。ei
‑
ms m/z：1/2[m+h]
+
1380.1。
[1258]
实施例57.化合物38e的制备
[1259][1260]
化合物38c的制备
[1261]
将dipea(0.075ml，0.428mmol)和hbtu(122mg，0.321mmol)添加到炔丙基胺(0.016ml，0.256mmol)和化合物1i(264mg，0.214mmol)在dmf(3ml)中的搅拌过的混合物中。在n2下于室温搅拌14小时后，将反应混合物倒入h2o(10ml)并用etoac(3
×
30ml)提取。将合并的有机层用1n hcl水溶液(10ml)、饱和nahco3水溶液(10ml)和浓盐水(10ml)依次洗涤，并经无水na2so4干燥。过滤并浓缩后，将剩余物通过柱色谱纯化，产生化合物38c(270mg，100％)。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1266.2。
[1262]
化合物38d的制备
[1263]
在0℃向化合物38c(270mg，0.213mmol)在thf(2ml)和meoh(2ml)中的溶液添加在h2o(2ml)中的lioh一水合物(36mg，0.853mmol)。在0℃下搅拌2小时后，将所述反应混合物用乙酸中和并减压浓缩。然后将剩余物溶解在h2o/dmso(1.5ml/1.5ml)中并通过hplc纯化。将具有相同保留时间的纯级分合并并浓缩，产生化合物38d(168mg，70％)。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1126.1。
[1264]
化合物38e的制备
[1265][1266]
通过与实施例56中制备化合物38b类似的方法，从化合物38d和化合物16b制备化合物38e。ei
‑
ms m/z：1/2[m+h]
+
1366.2。
[1267]
实施例58.化合物39e的制备
[1268][1269]
化合物39a的制备
[1270]
在0℃将化合物1g(27mg，0.039mmol)、化合物14j(45mg，0.039mmol)和无水hobt(1mg，0.0078mmol)溶解在dmf(2ml)中。然后添加吡啶(0.2ml)和dipea(0.014ml，0.078mmol)。在n2下于0℃至室温搅拌24小时后，将反应混合物溶解在dmso(1ml)中并通过hplc纯化，产生化合物39a(36mg，58％)，为白色固体。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1582.9，[m+na]
+
1604.5。
[1271]
化合物39b的制备
[1272]
将化合物39a(35mg，0.022mmol)和三苯基膦(1.5mg，0.005mmol)溶解在dcm(2ml)中。在室温下将吡咯烷(0.0025ml，0.026mmol)和pd(pph3)4(1.3mg，0.001mmol)添加至所述反应混合物中，然后使其搅拌2小时。将所述反应混合物用h2o(50ml)稀释并用正丁醇(2
×
50ml)提取。将合并的有机层经无水mgso4干燥，减压蒸发。所得剩余物溶解在dmso(1ml)中并通过hplc纯化，产生化合物39b(34mg，粗)，为白色固体。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
：1542.7。
[1273]
[1274][1275]
化合物39c的制备
[1276]
将dipea(0.0026ml，0.039mmol)和pybop(4.7mg，0.023mmol)添加到化合物39b(15mg，0.009mmol)和化合物16c(2.0mg，0.0038mmol)在dmf(0.3ml)中的搅拌过的混合物中。在n2下于室温搅拌13小时后，将反应混合物溶解在dmso(1.5ml)中并通过hplc纯化，产生化合物39c(12mg，35％)，为白色固体。ei
‑
ms m/z：1/2[m+h]
+
1788.5。
[1277]
化合物39d的制备
[1278]
在0℃向化合物39c(12mg，0.0033mmol)在meoh(1ml)中的溶液添加在h2o(1ml)中的lioh一水合物(1.4mg，0.033mmol)。在0℃下2小时后，用乙酸将所述溶液的ph调节至4～5，并将所述反应混合物减压浓缩。所得剩余物溶解在dmso(1.5ml)中并通过hplc纯化，产生
化合物39d(11mg，98％)。ei
‑
ms m/z：1/2[m+h]
+
1648.6。
[1279]
化合物39e的制备
[1280]
在0℃下将tfa(0.5ml)添加到化合物39d(11mg，0.003mmol)在dcm(3.0ml)中的搅拌过的溶液。在0℃下2小时后，通过n2流除去溶剂和过量的tfa。然后剩余物溶解在dmso(1ml)中并通过hplc纯化，产生化合物39e(1.2mg，11％)，为白色固体。ei
‑
ms m/z：1/2[m+h]
+
1598.3。
[1281]
实施例59.化合物40c的制备
[1282]
[1283][1284]
化合物40a的制备
[1285]
将dipea(0.004ml，0.021mmol)和hbtu(5.0mg，0.013mmol)添加到化合物39b(20mg，0.012mmol)和化合物25d(5.0mg，0.005mmol)在dmf(1.5ml)中的搅拌过的混合物中。在n2下于室温搅拌14小时后，将反应混合物溶解在dmso(1.0ml)中并通过hplc纯化，产生化合物40a(14.5mg，30％)。ei
‑
ms m/z：1/2[m+h]
+
1998.8。
[1286]
化合物40b的制备
[1287]
在0℃向化合物40a(10mg，0.0025mmol)在meoh(1ml)中的溶液添加在h2o(1ml)中的lioh一水合物(1.0mg，0.025mmol)。在0℃下2小时后，将反应混合物用乙酸中和并减压浓缩。然后将剩余物溶解在dmso(1.5ml)中并通过hplc纯化，产生化合物40b(6.9mg，74％)。ei
‑
ms m/z：1/2[m+h]
+
1858.3。
[1288]
化合物40c的制备
[1289]
将tfa(0.2ml)添加到化合物40b(6.9mg，0.0018mmol)在dcm(2.0ml)中的搅拌过的溶液中。在0℃下2小时后，通过n2流除去溶剂和过量的tfa。然后将剩余物溶解在dmso(1ml)中并通过hplc纯化。将具有相同保留时间的纯级分合并并冻干，而产生化合物40c(1.5mg，23％)，为白色固体。ei
‑
ms m/z：1/2[m+h]
+
1808.6。
[1290]
实施例60.化合物41c的制备
[1291][1292]
化合物41a的制备
[1293]
将dipea(0.116ml，0.66mmol)和pybop(127mg，0.24mmol)添加到化合物16c(280mg，0.22mmol)和化合物1j(587mg，1.10mmol)在dmf(10ml)中的搅拌过的混合物中。在n2下于室温搅拌2小时后，将反应混合物用h2o(200ml)稀释并用etoac(2
×
100ml)提取。将合并的有机层经无水mgso4干燥，过滤并浓缩。将粗产物通过柱色谱纯化而产生化合物41a(250mg，64％)。ei
‑
ms m/z：1/2[m+h]
+
883.2，[m+h]
+
1766。
[1294]
化合物41b的制备
[1295]
将dipea(0.0017ml，0.0096mmol)和pybop(2.0mg，0.0038mmol)添加到化合物41a(5.7mg，0.0032mmol)和化合物39b(5.0mg，0.0032mmol)在dmf(0.5ml)中的搅拌过的混合物中。在n2下于室温搅拌3小时后，将反应混合物溶解在mecn(1ml)中并通过hplc纯化，产生化合物41b(8.0mg，75％)。ei
‑
ms m/z：1/2[m+h]
+
1645。
[1296]
化合物41c的制备
[1297]
在0℃向化合物41b(8.0mg，0.0024mmol)在meoh(0.5ml)中的溶液添加在h2o(0.1ml)中的lioh一水合物(1.2mg，0.028mmol)。在0℃下2小时后，将反应混合物用2n hcl水溶液中和并减压浓缩。将所得剩余物用dcm(2ml)和h2o(3滴)稀释。然后在0℃添加tfa(0.1ml)。在0℃下2小时后，通过n2流除去溶剂和过量的tfa。然后将剩余物溶解在dmso(1ml)中并通过hplc纯化。将具有相同保留时间的纯级分合并并冻干，产生化合物41c(3.1mg，44％)，为白色固体。ei
‑
ms m/z：1/2[m+h]
+
1448，1/2[m+na]
+
1459。
[1298]
实施例61.化合物42d的制备
[1299][1300]
化合物42a的制备
[1301]
将dipea(0.026ml，0.23mmol)和hbtu(22mg，0.06mmol)添加到化合物1j(60mg，0.048mmol)和化合物25d(214mg，0.19mmol)在dmf(3ml)中的搅拌过的混合物中。在n2下于室温搅拌14小时后，所述反应混合物溶解在dmso(1.0ml)中并通过hplc纯化，产生化合物42a(64mg，58％)。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
2286.8。
[1302]
化合物42b的制备
[1303]
将dipea(0.011ml，0.06mmol)和hbtu(14mg，0.036mmol)添加到化合物42a(68mg，0.03mmol)和化合物39b(46mg，0.03mmol)在dmf(3ml)中的搅拌过的混合物中。在n2下于室温搅拌14小时后，将所述反应混合物溶解在dmso(1.0ml)中并通过hplc纯化，产生化合物42b(60mg，52％)。ei
‑
ms m/z：1/2[m+h]
+
1906.3。
[1304]
化合物42c的制备
[1305]
在0℃向化合物42b(60mg，0.016mmol)在meoh(2ml)中的溶液添加在h2o(2ml)中的lioh一水合物(5mg，0.126mmol)。在0℃下2小时后，将反应混合物用乙酸中和并减压浓缩。然后将剩余物溶解在dmso(1ml)中并通过制备型hplc纯化，产生化合物42c(37mg，65％)。ei
‑
ms m/z：1/2[m+h]
+
1759.3。
[1306]
化合物42d的制备
[1307]
将tfa(0.3ml)添加到化合物42c(37mg，0.01mmol)在dcm(3ml)中的搅拌过的溶液中。在0℃下搅拌2小时后，通过n2流除去溶剂和过量的tfa。然后将剩余物溶解在dmso(1ml)中并通过hplc纯化。将具有相同保留时间的纯级分合并并冻干，产生化合物42d(15mg，45％)，为白色固体。ei
‑
ms m/z：1/2[m+h]
+
1659.6。
[1308]
实施例62.化合物43i的制备
[1309][1310]
化合物43a的制备
[1311]
将dipea(10.4ml，23.8mmol)和hbtu(13.5g，35.7mmol)添加到h
‑
lys(z)
‑
ome盐酸盐(7.0g，23.8mmol)和化合物24e(9.86mg，23.8mmol)在dmf(50ml)中的搅拌过的混合物中。在n2下于室温搅拌8小时后，将所述反应混合物用水(100ml)稀释并用etoac(3
×
50ml)提取。将合并的有机层用0.5n hcl水溶液(50ml)、饱和nahco3水溶液(50ml)和浓盐水(50ml)依次洗涤，并经无水na2so4干燥。过滤并减压浓缩后，将所得的粗产物通过柱色谱纯化而产生化合物43a(9.3g，57％)。1h
‑
nmr(400mhz，dmso
‑
d6)δ8.22(d，1h)，7.37
‑
7.29(m，15h)，7.22(m，2h)，5.00(s，6h)，4.18(m，1h)，4.00(m，1h)，3.59(s，3h)，2.96(m，4h)，1.67
‑
1.50(m，4h)，1.38
‑
1.29(m，4h)，1.19
‑
1.18(m，4h)。ei
‑
ms m/z：[m+na]
+
712.96。
[1312]
化合物43b的制备
[1313]
在n2下于0℃向化合物43a(9.3g，13.5mmol)在thf:meoh:h2o(60ml:30ml:30ml)中的溶液添加lioh一水合物(1.13g，26.9mmol)。2小时后，将反应混合物用1n hcl水溶液酸化至ph 4，并用etoac(3
×
100ml)提取。将合并的有机层经无水na2so4干燥。过滤并减压浓缩提供化合物43b(9.1g，粗)，其不经进一步纯化即使用。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
677.48，2[m+h]
+
1353.82。
[1314]
化合物的43c制备
[1315]
将dipea(1.47ml，8.44mmol)、hobt(484mg，3.58mmol)和edc
·
hcl(809mg，4.22mmol)添加到化合物43b(2.5g，3.71mmol)和化合物3e(1.8g，3.38mmol)在dmf(20ml)中的搅拌过的混合物中。在n2下于室温搅拌14小时后，将反应混合物倒入水(50ml)中并用etoac(3
×
50ml)提取。将合并的有机层用0.5n hcl水溶液(50ml)、饱和nahco3水溶液(50ml)和浓盐水(50ml)依次洗涤，并经无水na2so4干燥。过滤并减压浓缩后，将所得剩余物
通过柱色谱提纯而产生化合物43c(2.3g，59％)。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1155.92，[m+h
‑
boc]
+
1055.83。
[1316]
化合物43d的制备
[1317]
向化合物43c(2.3g，1.99mmol)和pd/c(10wt％，424mg 3.98mmol)在meoh(200ml)中的搅拌过的混合物添加hcl(在1,4
‑
二噁烷中4n，0.99ml，3.98mmol)。在氢气下于室温搅拌2小时后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用meoh(100ml)洗涤。浓缩滤液而产生化合物43d(1.5g，crude)，其不经进一步纯化即使用。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
753.29。
[1318]
化合物43e的制备
[1319]
将dipea(0.14ml，0.80mmol)、hobt(59mg，0.43mmol)和edc
·
hcl(102mg，0.53mmol)添加到化合物43d(2.5g，3.71mmol)和化合物25b(150g，0.46mmol)在dmf(5ml)中的搅拌过的混合物中。在n2下于室温搅拌14小时后，将反应混合物倒入水(50ml)中并用etoac(3
×
50ml)提取。将合并的有机层用1n hcl水溶液(30ml)、饱和nahco3水溶液(30ml)和浓盐水(30ml)依次洗涤，并经无水na2so4干燥。过滤并减压浓缩后，将所得的粗产物通过柱色谱纯化而产生化合物43e(100mg，45％)，为无色油.ei
‑
ms m/z：[m+na]
+
1685.11，1/2[m+h
‑
boc]
+
731.82。
[1320]
化合物43f的制备
[1321]
向化合物43e(100mg，0.06mmol)和pd/c(10wt％，20mg 0.192mmol)在meoh(20ml)中的搅拌过的混合物添加hcl(在1,4
‑
二噁烷中4n，0.045ml，0.18mmol)。在氢气下于室温搅拌2小时后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用meoh(30ml)洗涤。浓缩滤液而产生化合物43f(95mg)，为棕色泡沫，其不经进一步纯化即使用。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1586.30，1/2[m+h]
+
793.02。
[1322]
[1323][1324]
化合物43g的制备
[1325]
将dipea(0.030ml，0.170mmol)和hbtu(36mg，0.094mmol)添加到化合物43f(45mg，0.028mmol)和化合物1j(114mg，0.091mmol)在dmf(3ml)中的搅拌过的混合物中。在n2下于室温搅拌16小时后，将反应混合物溶解在h2o/dmso(1.5ml/1.5ml)中并通过hplc纯化。将具有相同保留时间的纯级分合并并浓缩，产生化合物43g(31mg，21％)。ei
‑
ms m/z：1/3[m+h
‑
boc]
+
1705.74，1/4[m+h
‑
2boc]
+
1254.79。
[1326]
化合物43h的制备
[1327]
在
‑
20℃向化合物43g(31mg，0.006mmol)在meoh中(1ml)的溶液添加在h2o(1ml)中的lioh一水合物(3.7mg，0.088mmol)。在
‑
20℃下搅拌2小时后，用乙酸中和反应混合物并减压浓缩。然后将所述反应混合物溶解在h2o/dmso(1.5ml/1.5ml)中并通过hplc纯化，产生化合物43h(18mg，64％)，为白色固体。ei
‑
ms m/z：1/3[m+h
‑
boc]
+
1735.19，1/4[m+h]
+
1301.95，
1/5[m+h
‑
boc]
+
1021.71。
[1328]
化合物43i的制备
[1329]
在
‑
0℃将tfa(0.3ml)添加到化合物43h(18mg，0.004mmol)在dcm(1.0ml)中的搅拌过的溶液中。搅拌1小时后，通过n2流除去溶剂和过量的tfa。然后将剩余物溶解在h2o/mecn(1ml/1ml)中并通过hplc纯化。将具有相同保留时间的纯级分合并并冻干，产生化合物43i(6mg，33％)，为白色固体。ei
‑
ms m/z：1/3[m+h]
+
1547.75，1/4[m+h]
+
1161.14。
[1330]
实施例63.化合物43j的制备
[1331][1332]
通过与实施例62中制备化合物43i类似的方法，从化合物1i和化合物43f制备化合物43j。ei
‑
ms m/z：1/3[m+h]
+
1532.37，1/4[m+h]
+
1149.69。
[1333]
实施例64.化合物44i的制备
[1334][1335]
化合物44a的制备
[1336]
将dipea(1.9ml，11.0mmol)和hbtu(2.5g，6.64mmol)添加到化合物h
‑
lys(z)
‑
ome盐酸盐(1.3g，4.43mmol)和化合物43b(3.0g，4.43mmol)在dmf(30ml)中的搅拌过的混合物中。在n2下于室温搅拌14小时后，将反应混合物用水(100ml)稀释并用etoac(3
×
50ml)提取。将合并的有机层用0.5n hcl水溶液(50ml)、饱和nahco3水溶液(50ml)和浓盐水(50ml)洗涤，并经无水na2so4干燥。过滤并减压浓缩后，将所得剩余物通过柱色谱提纯而产生化合物44a(3.9g，93％)。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
953.42。
[1337]
化合物44b的制备
[1338]
在n2下于室温向化合物44a(2.1g，2.20mmol)在thf:meoh:h2o(24ml:8ml:8ml)中的溶液添加lioh一水合物(185mg，4.40mmol)。2小时后，将反应混合物用1n hcl水溶液酸化至ph 4，并用etoac(3
×
50ml)提取。将合并的有机层经无水na2so4干燥。过滤并减压浓缩提供化合物44b(2.0g)，其不经进一步纯化即使用。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
939.35，[m+na]
+
961.37。
[1339]
化合物44c的制备
[1340]
将dipea(0.93ml，5.33mmol)和hbtu(1.21g，3.20mmol)添加到化合物44b(2.0g，2.13mmol)和化合物3e(1.14g，2.13mmol)在dmf(20ml)中的搅拌过的混合物中。在n2下于室温搅拌14小时后，将反应混合物倒入水(50ml)中并用etoac(3
×
50ml)提取。将合并的有机层用0.5n hcl水溶液(50ml)、饱和nahco3水溶液(50ml)和浓盐水(50ml)依次洗涤，并经无水na2so4干燥。过滤并减压浓缩后，将所得剩余物通过柱色谱提纯而产生化合物44c(2.60g，86％)。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1418.44，[m+na]
+
1440.39，[m+h
‑
boc]
+
1318.47。
[1341]
化合物44d的制备
[1342]
向化合物44c(2.60g，1.83mmol)和pd/c(10wt％，781mg 7.34mmol)在meoh(50ml)中的搅拌过的混合物添加hcl(在1,4
‑
二噁烷中4n，0.9ml，3.67mmol)。然后将反应在氢气下于室温搅拌2小时，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用meoh(50ml)洗涤。浓缩滤液而产生化合物44d(1.73g)，为黄色泡沫，其不经进一步纯化即使用。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
881.90。
[1343]
化合物44e的制备
[1344]
将dipea(1.58ml，9.08mmol)和hbtu(2.58g，6.81mmol)添加到化合物44d(1.0g，1.13mmol)和化合物25b(1.82g，5.67mmol)在dmf(20ml)中的搅拌过的混合物中。在n2下于室温搅拌14小时后，将反应混合物用水(100ml)稀释并用etoac(3
×
50ml)提取。将合并的有机层用0.5n hcl(50ml)、饱和nahco3水溶液(50ml)和浓盐水(50ml)依次洗涤，并经无水na2so4干燥。过滤并减压浓缩后，将所得剩余物通过柱色谱提纯而产生化合物44e(848mg，36％)。ei
‑
ms m/z：1/2[m+h
‑
2boc]
+
947.63。
[1345]
化合物44f的制备
[1346]
向化合物44e(848mg，0.40mmol)和pd/c(10wt％，172mg 1.62mmol)在meoh(50ml)中的搅拌过的混合物添加hcl(在1,4
‑
二噁烷中4n，0.4ml，1.62mmol)。在氢气下于室温搅拌2小时后，将反应混合物通过硅藻土垫过滤并用meoh(50ml)洗涤。浓缩滤液而产生化合物44f(625mg，crude)，其不经进一步纯化即使用。ei
‑
ms m/z：1/2[m+h]
+
996.40，1/3[m+h]
+
664.59
[1347]
[1348][1349]
化合物44g的制备
[1350]
将dipea(0.067ml，0.386mmol)和hbtu(110mg，0.289mmol)添加到化合物44f(96mg，0.048mmol)和化合物1j(303mg，0.24mmol)在dmf(3ml)中的搅拌过的混合物中。在n2下于室温搅拌16小时后，将反应混合物溶解在h2o/dmso(1.5ml/1.5ml)中并通过hplc纯化。将具有相同保留时间的纯级分合并并浓缩，产生化合物44g(67mg，20％)。ei
‑
ms m/z：1/3[m+h]
+
2315.93，1/4[m+h]
+
1737.60，1/5[m+h]
+
1390.37。
[1351]
化合物44h的制备
[1352]
在
‑
20℃向化合物44g(67mg，0.009mmol)在meoh(1ml)中的溶液添加在h2o(1ml)中的lioh一水合物(8.1mg，0.192mmol)。在
‑
20℃下搅拌2小时后，用乙酸中和反应混合物并减压浓缩。然后将反应混合物溶解在h2o/dmso(1.5ml/1.5ml)中并通过hplc纯化，产生化合物44h(27.9mg，45％)，为白色固体。ei
‑
ms m/z：1/3[m+h]
+
2110.24，1/4[m+h]
+
1582.97，1/4[m+h
‑
boc]
+
1557.91。
[1353]
化合物44i的制备
[1354]
在0℃将tfa(0.3ml)添加到化合物44h(27.9mg，0.004mmol)在dcm(1.0ml)中的搅拌过的溶液中。搅拌1小时后，通过n2流除去溶剂和过量的tfa。然后将剩余物溶解在h2o/mecn(1ml/1ml)中并通过hplc纯化。将具有相同保留时间的纯级分合并并冻干，产生化合物44i(13.6mg，50％)，为白色固体。ei
‑
ms m/z：1/3[m+h]
+
2043.49，1/4[m+h]
+
1532.96，1/5[m+h]
+
1226.62。
[1355]
实施例65.化合物44j的制备
[1356][1357]
通过与实施例64中制备化合物44i类似的方法，从化合物1i和化合物44f制备化合物44j。ei
‑
ms m/z：1/3[m+h]
+
2025.37，1/4[m+h]
+
1519.10，1/5[m+h]
+
1215.60。
[1358]
实施例66.化合物45k的制备
[1359][1360]
化合物l的制备
[1361]
在氮气下于室温将d
‑
葡醛
‑
6,3
‑
内酯(25.0g，141.9mmol)溶解在meoh(250ml)中，并向其中缓慢添加naoh(141mg)在meoh(100ml)中的溶液。搅拌24小时后，将反应混合物减压浓缩，然后在低于10℃下加入吡啶(66ml)和乙酸酐(71ml)。在室温下搅拌4小时后，将反应混合物减压浓缩并进行柱色谱层析，产生化合物l(41.6g，77％)。1h
‑
nmr(600mhz，cdcl3)δ5.77(d，j＝7.8hz，1h)，5.31(t，j＝9.6hz，1h)，5.24(t，j＝9.6hz，1h)，5.14(m，1h)，4.17(d，j＝9hz，1h)，3.74(s，3h)，2.12(s，3h)，2.04(m，9h)。
[1362]
化合物m的制备
[1363]
在氮气下于0℃将化合物l(10.0g，26.6mmol)溶解在hbr(在acoh中33％，20ml)中。将反应混合物升温至室温。搅拌2小时后，向其中添加甲苯(50ml)，并将混合物减压浓缩。将所得剩余物通过柱色谱提纯而产生化合物m(10.9g，99％)。1h
‑
nmr(600mhz，cdcl3)δ6.64(d，j＝3.6hz，1h)，5.61(t，j＝3.6hz，1h)，5.24(t，j＝3.6hz，1h)，4.85(m，1h)，4.58(d，d，j＝10.2hz，1h)，3.76(s，3h)，2.10(s，3h)，2.06(s，3h)，2.05(s，3h)。
[1364][1365]
化合物45a的制备
[1366]
在氮气下于0℃将3
‑
氨基
‑1‑
丙醇(3.0g，66.57mmol)溶解在dcm(150ml)中，并向其中添加二碳酸二叔丁酯(16g，73.23mmol)。所得混合物在室温下搅拌12小时。反应完成后，将溶剂减压浓缩。将剩余物进行柱色谱层析，产生化合物45a(6.4g，92％)。1h
‑
nmr(400mhz，cdcl3)δ4.78(s，1h)，3.65(m，2h)，3.30(m，2h)，2.90(s，1h)，1.68(m，2h)，1.48(s，9h)。
[1367]
化合物45b的制备
[1368]
在氮气下于0℃将化合物45a(6.04g，34.47mmol)和三乙胺(14.4ml，103.4mmol)溶解在thf中，然后用甲磺酸酐(7.21g，41.36mmol)缓慢处理。将得到的混合物在氮气下于室温搅拌12小时。反应完成后，将溶剂减压浓缩。将剩余物进行柱色谱层析，产生化合物45b(9.01g，98％)。1h
‑
nmr(400mhz，cdcl3)δ4.73(s，1h)，4.30(t，j＝5.9hz，2h)，3.31
‑
3.24(m，2h)，3.04(s，3h)，1.94(t，j＝6.1hz，2h)，1.44(s，9h)。
[1369]
化合物45c的制备
[1370]
在氮气下于室温将化合物45b(3.0g，11.84mmol)溶解在dmf(40ml)中，然后用nan3(924mg，14.21mmol)处理，将得到的混合物在60℃下搅拌12小时。反应完成后，向其中添加etoac(50ml)、蒸馏水(50ml)和1n hcl水溶液(5ml)。将有机层经无水na2so4干燥，过滤并减压浓缩。将剩余物进行柱色谱层析，产生化合物45c(2.3g，99％)。1h
‑
nmr(600mhz，cdcl3)δ4.63(s，1h)，3.36(t，j＝6.6hz，2h)，3.24
‑
3.18(m，2h)，1.80
‑
1.75(m，2h)，1.45(s，9h)。
[1371]
化合物45d的制备
[1372]
在氮气下于0℃将化合物45c(3.8g，18.98mmol)溶解在dcm(10ml)中，然后向其中缓慢添加在二噁烷(10ml)中的4m
‑
hcl。搅拌12小时后，将反应混合物减压浓缩，产生化合物45d(2.5g，99％)。1h
‑
nmr(600mhz，dmso
‑
d6)δ8.06(s，3h)，3.47(t，j＝6.6hz，2h)，2.82(t，j＝7.2hz，2h)，1.84
‑
1.79(m，2h)。
[1373][1374]
化合物45e的制备
[1375]
在氮气下于0℃将化合物45d(58mg，0.42mmol)和5
‑
甲酰水杨酸(100mg，0.60mmol)溶解在dmf(2ml)中，然后将dipea(0.2ml，1.20mmol)和pybop(375mg，0.72mmol)添加到反应混合物。在室温下搅拌3小时后，向其中添加etoac(30ml)和蒸馏水(10ml)。将有机层经无水na2so4干燥，过滤并减压浓缩。将剩余物进行柱色谱层析，提供化合物45e(82mg，79％)。1h
‑
nmr(400mhz，cdcl3)δ13.39(s，1h)，9.87(s，1h)，8.29(s，1h)，7.89(dd，j＝1.6，7.2hz.1h)，7.60(s，1h)，7.10(d，j＝8.8hz，1h)，3.63
‑
3.57(m，2h)，3.48(t，j＝6.4hz，2h)，1.99
‑
1.92(m，2h)。
[1376]
化合物45f的制备
[1377]
在氮气下于室温将化合物45e(78mg，0.31mmol)和化合物m(125mg，0.31mmol)溶解在mecn(3ml)中，然后向其中添加氧化银(291mg，1.26mmol)和分子筛(125mg)。在室温下搅拌3小时后，将混合物进行硅藻土过滤，并将滤液减压浓缩。将剩余物进行柱色谱层析，产生化合物45f(160mg，90％)。1h
‑
nmr(400mhz，cdcl3)δ10.00(s，1h)，8.66(d，j＝2.4hz，1h)，8.02(dd，j＝2.0，6.4hz，1h)，7.46(t，j＝6.4hz，1h)，7.14(d，j＝8.4hz，1h)，5.48
‑
5.33(m，4h)，4.28(d，j＝8.8hz，1h)，3.74(s，3h)，3.73
‑
3.64(m，1h)，3.50
‑
3.42(m，3h)，2.09
‑
2.07(m，9h)，2.00
‑
1.92(m，2h)。
[1378]
化合物45g的制备
[1379]
在氮气下于0℃将化合物45f(160mg，1.51mmol)溶解在2
‑
丙醇(0.4ml)和氯仿(2ml)中，然后向其中添加硅胶(2g)和硼氢化钠(27mg，0.71mmol)。在0℃搅拌2小时后，将反应物进行硅藻土过滤，并将滤液减压浓缩。将剩余物进行柱色谱层析，产生化合物45g(115mg，71％)。1h
‑
nmr(600mhz，cdcl3)δ8.06(d，j＝2.4hz，1h)，7.50
‑
7.44(m，2h)，7.01(d，j＝9.0hz，1h)，5.45
‑
5.31(m，4h)，4.38(s，2h)，4.22(d，j＝9.0hz，1h)，3.74(s，3h)，3.67
‑
3.61(m，1h)，3.46
‑
3.41(m，3h)，2.07
‑
2.04(m，9h)，1.97
‑
1.91(m，2h)。
[1380]
化合物45h的制备
[1381]
在氮气下于0℃将化合物45g(100mg，0.18mmol)溶解在dmf(1ml)中，然后向其中添
加双(4
‑
硝基苯基)碳酸酯(110mg，0.35mmol)和dipea(0.050ml，0.27mmol)。在室温下搅拌2小时后，向其中添加etoac(30ml)和蒸馏水(10ml)。将有机层经无水na2so4干燥并减压浓缩。将剩余物进行柱色谱层析而产生化合物45h(75mg，58％)。1h
‑
nmr(600mhz，cdcl3)δ8.29
‑
8.27(m，2h)，8.23(d，j＝2.4hz，1h)，7.54(dd，j＝2.4，6.6hz，1h)，7.49(t，j＝6.4hz，1h)，7.39
‑
7.37(m，2h)，7.04(d，j＝8.4hz，1h)，5.45
‑
5.29(m，4h)，5.28(s，2h)，4.23(d，j＝9.0hz，1h)，3.75(s，3h)，3.68
‑
3.64(m，1h)，3.46
‑
3.42(m，3h)，2.08
‑
2.05(m，9h)，1.98
‑
1.93(m，2h)。
[1382]
化合物45i的制备
[1383]
在氮气下于室温将化合物45h(50mg，0.068mmol)溶解在dmf(0.8ml)中，然后向其中添加mmaf
‑
ome(51mg，0.068mmol)。将所得混合物用hobt(2mg，0.013mmol)、吡啶(0.24ml)和dipea(0.012ml，0.068mmol)处理。在室温下搅拌18小时后，向其中添加etoac(20ml)和蒸馏水(10ml)。将有机层经无水na2so4干燥并减压浓缩。将剩余物进行柱色谱层析而产生化合物45i(71mg，78％)。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1339。
[1384]
化合物45j的制备
[1385]
在氮气下于室温将化合物45i(30mg，0.022mmol)和苯乙炔(3.7μl，0.033mmol)溶解在etoh(0.2ml)和水(30μl)中，然后向其中添加0.1m cuso4水溶液(30μl)和1.0m抗坏血酸钠水溶液(30μl)。将所得混合物用hobt(2mg，0.013mmol)、吡啶(0.24ml)和dipea(12μl，0.068mmol)处理。在室温下搅拌5小时后，向其中添加etoac(20ml)和蒸馏水(5ml)。将有机层经无水na2so4干燥并减压浓缩。将剩余物进行柱色谱层析而产生化合物45j(26mg，81％)。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1441。
[1386]
化合物45k的制备
[1387]
在氮气下于0℃将化合物45j(20mg，0.013mmol)溶解在meoh(0.2ml)中，然后向其中添加在水(0.2ml)中的lioh
·
h2o(6mg，0.14mmol)。在室温下搅拌1小时后，向其中添加氯仿(10ml)、meoh(1ml)、蒸馏水(10ml)和0.5n hcl水溶液(1ml)。将有机层经无水na2so4干燥并减压浓缩。将剩余物进行柱色谱层析而产生化合物45k(17mg，87％)。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1286。
[1388]
实施例67.化合物46b的制备
[1389][1390]
化合物46a的制备
[1391]
在氮气下于0℃将5
‑
甲酰水杨酸(1.0g，6.02mmol)溶解在dmf(20ml)中，然后向其中添加n
‑
溴代琥珀酰亚胺(1.07g，6.11mmol)，并将混合物在70℃下搅拌3小时。反应完成后，向其中添加etoac(100ml)、2n hcl水溶液(2ml)和蒸馏水(100ml)。将有机层经无水na2so4干燥并减压浓缩。将剩余物进行柱色谱层析而产生化合物46a(1.2g，84％)。1h
‑
nmr(400mhz，dmso
‑
d6)δ9.64(s，1h)，8.19(d，j＝2.4hz，1h)，8.00(d，j＝2.0hz，1h)，3.16(s，1h)。
[1392]
化合物46b的制备
[1393]
通过与实施例4中制备化合物2h类似的方法，从化合物46a制备化合物46b。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1328。
[1394]
实施例68至70.化合物47a、化合物48a和化合物49a的制备
[1395][1396]
化合物n通过韩国专利公开公布no.10
‑
2014
‑
0035393中公开的方法制备。
[1397]
实施例68.化合物47a的制备
[1398]
在氮气下于室温将化合物2h(20mg，0.014mmol)溶解在etoh(0.7ml)中，然后向其中添加化合物n(3.7mg，0.017mmol)，并将所述混合物在45℃下搅拌2小时。反应完成后，利用hplc得到化合物47a(10.2mg，49％)。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1441。
[1399]
实施例69和70.化合物48a和49a的制备
[1400]
通过与实施例68中制备化合物47a类似的方法制备化合物48a(实施例69)和化合物49a(实施例70)。化合物48a的ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1353。化合物49a的ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1520。
[1401]
比较例66.化合物50k的制备
[1402][1403]
化合物50a的制备
[1404]
在氮气下于室温将4
‑
溴丁酸酯(4
‑
bromobutanoate)(5.0ml，34.6mmol)溶解在meoh(7 5ml)中，然后向其中添加在水(25ml)中的nan3(4.5g，69.2mmol)并在85℃搅拌8小时。反应完成后，减压浓缩溶剂，并向其中添加氯仿(300ml)和蒸馏水(200ml)。将如上所述获得的有机层经无水na2so4干燥并减压浓缩。将剩余物进行柱色谱层析而产生化合物50a(5.1g，94％)。1h
‑
nmr(600mhz，cdcl3)δ4.15(q，j＝7.2hz，2h)，3.36(t，j＝7.2hz，2h)，2.41(t，j＝7.2hz，2h)，1.94
‑
1.89(m，2h)，1.28(t，j＝8.4hz，3h)。
[1405]
化合物50b的制备
[1406]
在氮气下于0℃将化合物50a(2.0g，12.7mmol)溶解在meoh(32ml)中，然后向其中缓慢添加在水(26ml)中的koh(3.56g，63.6mmol)。在室温下搅拌6小时后，减压浓缩溶剂，向其中添加氯仿(300ml)、1n hcl水溶液(100ml)和蒸馏水(100ml)。将如上所述获得的有机层经无水na2so4干燥并减压浓缩。将所得剩余物进行柱色谱层析而产生化合物50b(1.28g，78％)。1h
‑
nmr(600mhz，cdcl3)δ3.38(t，j＝7.2hz，2h)，2.48(t，j＝7.2hz，2h)，1.95
‑
1.90(m，2h)。
[1407]
化合物50c的制备
[1408]
在氮气下于0℃将化合物50b(850mg，6.58mmol)溶解在meoh(10ml)中，然后向其中添加草酰氯(1.1ml，13.2mmol)和dmf(1滴)并在室温下搅拌6小时。反应完成后，将溶剂减压浓缩而产生化合物50c(965mg)，其不经进一步纯化即使用。
[1409][1410]
化合物50d的制备
[1411]
在氮气下于0℃将4
‑
羟基
‑3‑
硝基苯甲酸(5.0g，27.3mmol)溶解在thf(120ml)中，然后向其中添加1m bh3‑
thf复合物(54.6ml，54.6mmol)并在室温下搅拌20小时。反应完成后，向其中添加etoac(200ml)、0.5n hcl水溶液(20ml)和蒸馏水(100ml)。将如上所述获得的有机层经无水na2so4干燥并减压浓缩。将所得剩余物进行柱色谱层析而产生化合物50d(4.2g，91％)。1h
‑
nmr(600mhz，cd3od)δ8.06(d，j＝1.2hz，1h)，7.59(dd，j＝1.2，7.8hz，1h)，7.12(d，j＝8.4hz，1h)，4.83(s，2h)。
[1412]
化合物50e的制备
[1413]
在氮气下于室温将化合物50d(937mg，5.54mmol)溶解在mecn(15ml)中，并向其中添加化合物m(2.0g，5.04mmol)、氧化银(4.66g，20.1mmol)和分子筛(2.0g)，并在室温下搅拌14小时。反应完成后，将混合物进行硅藻土过滤，并将滤液减压浓缩。将所得剩余物进行柱色谱层析而产生化合物50e(1.0g，40％)。1h
‑
nmr(600mhz，cdcl3)δ7.81(d，j＝1.8hz，1h)，7.54(dd，j＝1.8，6.6hz，1h)，7.37(d，j＝8.4hz，1h)，5.37
‑
5.27(m，3h)，5.20(d，j＝6.6hz，1h)，4.72(d，j＝6.0hz，2h)，4.21(d，j＝9.0hz，1h)，3.75(s，3h)，2.12(s，3h)，2.06(s，3h)，2.05(s，3h)，2.04
‑
2.02(m，1h)。
[1414]
化合物50f的制备
[1415]
将化合物50e(900mg，6.35mmol)溶解在etoac(100ml)中，然后向其中添加氧化铂(iv)(84.2mg，0.370mmol)并在氢气下于室温搅拌3小时。反应完成后，将混合物进行硅藻土过滤，并将滤液减压浓缩而产生化合物50f(700mg，83％)，其不经进一步纯化即使用。
[1416]
化合物50g的制备
[1417]
在氮气下于0℃将化合物50f(350mg，0.77mmol)溶解在dcm(10ml)中，然后向其中添加化合物50c(136mg，0.92mmol)和dipea(0.27ml，1.54mmol)，并在室温下搅拌20分钟。反应完成后，向其中添加etoac(50ml)和蒸馏水(50ml)。将如上所述获得的有机层经无水na2so4干燥并减压浓缩。将所得剩余物进行柱色谱层析而产生化合物50g(280mg，65％)。1h
‑
nmr(600mhz，cdcl3)δ8.37(d，j＝1.2hz，1h)，8.00(s，1h)，7.07(dd，j＝1.8，6.6hz，1h)，6.93(d，j＝8.4hz，1h)，5.43
‑
5.28(m，3h)，5.06(d，j＝7.8hz，1h)，4.63(s，2h)，4.19(d，j＝9.6hz，1h)，3.76(s，3h)，3.44
‑
3.41(m，2h)，2.56(t，j＝7.8hz，2h)，2.17
‑
2.00(m，12h)。
[1418]
化合物50h的制备
[1419]
在氮气下于0℃将化合物50g(250mg，0.44mmol)溶解在dmf(4ml)中，然后向其中添加双(4
‑
硝基苯基)碳酸酯(270mg，0.88mmol)和dipea(0.12ml，0.66mmol)，并在室温下搅拌1小时。反应完成后，向其中添加etoac(50ml)和蒸馏水(50ml)。将如上所述获得的有机层经无水na2so4干燥并减压浓缩。将所得剩余物进行柱色谱层析而产生化合物50h(290mg，90％)。1h
‑
nmr(600mhz，cdcl3)δ8.54(d，j＝1.8hz，1h)，8.28
‑
8.25(m，2h)，8.02(s，1h)，7.40
‑
7.36(m，2h)，7.11(dd，j＝1.8，6.6hz，1h)，6.96(d，j＝8.4hz，1h)，5.44
‑
5.29(m，3h)，5.23(s，2h)，5.10(d，j＝7.8hz，1h)，4.21(d，j＝9.6hz，1h)，3.76(s，3h)，3.45
‑
3.42(m，2h)，2.58(t，j＝7.2hz，2h)，2.11
‑
2.00(m，12h)。
[1420]
化合物50i的制备
[1421]
在氮气下于室温将化合物50h(250mg，0.34mmol)溶解在dmf(4ml)中，然后向其中添加mmaf
‑
ome(255mg，0.34mmol)。所得混合物用hobt(9mg，0.068mmol)、吡啶(1.2ml)和dipea(0.060ml，0.34mmol)处理。在室温下搅拌2天后，向其中添加etoac(50ml)、2n hcl水溶液(5ml)和蒸馏水(50ml)。将如上所述获得的有机层经无水na2so4干燥并减压浓缩。将剩余物进行柱色谱层析而产生化合物50i(340mg，74％)。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1339.
[1422]
化合物50j的制备
[1423]
在氮气下于0℃将化合物50i(210mg，0.156mmol)溶解在meoh(2ml)中，然后向其中添加在水(2ml)中的lioh
·
h2o(66mg，1.56mmol)。在室温下搅拌1.5小时后，向其中添加氯仿(50ml)、meoh(5ml)、蒸馏水(50ml)和0.5n hcl水溶液(5ml)。将如上所述获得的有机层经无水na2so4干燥并减压浓缩。将所得剩余物进行柱色谱层析而产生化合物50j(107mg，57％)。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1184。
[1424]
化合物50k的制备
[1425]
在氮气下于室温将化合物50j(10mg，0.008mmol)和苯乙炔(0.92μl，0.008mmol)溶解在etoh(0.15ml)和(10μl)中，然后向其中添加0.1m cuso4水溶液(10μl)and 1.0m抗坏血酸钠水溶液(10μl)。在室温下搅拌5小时后，向其中添加etoac(10ml)和蒸馏水(5ml)。将如上所述获得的有机层经无水na2so4干燥并减压浓缩。将所得剩余物进行柱色谱层析而产生化合物50k(5mg，46％)。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1286。
[1426]
实施例71.化合物51h的制备
[1427][1428]
化合物51a的制备
[1429]
通过与实施例23中制备化合物14h类似的方法，从化合物7b制备化合物51a。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1392.8，[m+h
‑
boc]
+
1292.7，[m+na]
+
1414.8。
[1430]
化合物51b的制备
[1431]
在0℃将化合物51a(1.8g，1.29mmol)、炔丙基胺(0.1ml，1.55mmol)和无水hobt(35mg，0.25mmol)溶解在dmf(5ml)中。然后添加吡啶(0.2ml)和dipea(0.45ml，2.59mmol)。在n2下于室温搅拌24小时后，将反应混合物用h2o(100ml)和饱和nh4cl水溶液(50ml)稀释。用etoac(2
×
100ml)提取后，将合并的有机层经无水mgso4干燥，过滤并浓缩。将剩余物通过柱色谱纯化而产生化合物51b(1.15g，68％)。1h
‑
nmr(400mhz，cdcl3)δ8.01(s，1h)，7.48
‑
7.31(m，2h)，7.02(d，j＝8.4hz，1h)，5.45
‑
5.20(m，4h)，5.09(s，2h)，4.19(d，j＝9.2hz，1h)，4.10
‑
4.05(m，2h)，3.97(s，2h)，3.85
‑
3.45(m，49h)，2.24(s，1h)，2.05(s，9h)，1.53(s，18h)。ei
‑
ms m/z：[m+na]
+
1330.3。
[1432]
化合物51c的制备
[1433]
在0℃向化合物51b(1.15g，0.879mmol)在thf/meoh(20ml/20ml)中的溶液添加在h2o(20ml)中的lioh一水合物(151mg，3.603mmol)。在0℃下2小时后，用乙酸中和反应混合物并减压浓缩。将所得剩余物溶解在dmso(5ml)中并通过制备型hplc纯化，产生化合物51c(600mg，60％)。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1169.2。
[1434][1435]
化合物51d的制备
[1436]
将dipea(0.92ml，5.30mmol)和hbtu(1.0g，2.64mmol)添加到4
‑
叠氮丁酸(228mg，1.76mmol)和n
‑
me
‑
ala
‑
ome(298mg，1.94mmol)在dmf(10ml)中的搅拌过的混合物中。在n2下于室温搅拌14小时后，将反应混合物用h2o(50ml)稀释并用etoac(2
×
50ml)提取。将合并的有机层经无水mgso4干燥，过滤并浓缩。将所得剩余物通过柱色谱提纯而产生化合物51d(310mg，77％)。1h
‑
nmr(400mhz，cdcl3)δ5.22(q，1h)，3.71(s，3h)，3.39(t，j＝6.6hz，2h)，2.95(s，3h)，2.52
‑
2.39(m，2h)，1.98
‑
1.92(m，2h)，1.41(d，3h)。
[1437]
化合物51e的制备
[1438]
在
‑
20℃向化合物51d(310mg，1.36mmol)在meoh(3ml)中的溶液添加在h2o(3ml)中的lioh一水合物(114mg，2.72mmol)。在0℃下搅拌1小时后，将反应混合物用h2o/2n hcl水溶液(50ml/2ml)稀释并用et2o(2
×
30ml)提取。将合并的有机层经无水na2so4干燥。过滤并浓缩产生化合物51e(246mg)，其不经进一步纯化即使用。1h
‑
nmr(400mhz，cdcl3)δ5.15(q，1h)，3.39(t，j＝6.6hz，2h)，2.98(s，3h)，2.49
‑
2.45(m，2h)，1.98
‑
1.92(m，2h)，1.41(d，3h)。
[1439][1440]
化合物51f的制备
[1441]
在n2下向美登醇(50mg，0.088mmol)和化合物51e(113mg，0.528mmol)在dcm(6ml)中的溶液添加dic(0.087ml，0.557mmol)在dcm(1.4ml)中的溶液。1分钟后，添加zncl2溶液(在et2o中1m，0.11ml，0.11mmol)。在室温下搅拌2小时后，将反应混合物用etoac(10ml)稀释。将有机层用饱和nahco3水溶液(4ml)和浓盐水(2ml)洗涤，经无水na2so4干燥并减压蒸发。将所得剩余物通过柱色谱提纯以产生非对映体美登素类化合物的混合物51f(50mg，74％)。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
761.7。
[1442]
化合物51g的制备
[1443]
将cuso4·
5h2o(2mg)和抗坏血酸钠(10mg)添加到化合物51f(78mg，0.102mmol)和化合物51c(132mg，0.112mmol)在dmso(4ml)和h2o(1ml)中的正搅拌的混合物中。通过添加1m na2co3水溶液将ph调节至约7。在20℃下搅拌1小时后，将反应混合物溶解在h2o/dmso(1.5ml/1.5ml)中并通过hplc纯化。将具有相同保留时间的纯级分合并并浓缩，产生化合物51g(72.1mg，37％)。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1930.9，[m+h
‑
boc]
+
1830.9。
[1444]
化合物51h的制备
[1445]
将tfa(0.2ml)添加到化合物51g(72.1mg，0.037mmol)在dcm(1ml)中的正搅拌的溶液中。在0℃下搅拌2小时后，通过n2流除去溶剂和过量的tfa。然后将剩余物溶解在h2o/mecn(1ml/1ml)中并通过hplc纯化。将具有相同保留时间的纯级分合并并冻干，产生化合物51h(极性较大的异构体17mg和极性较小的异构体6.0mg，36％)，为白色固体。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1730.8。
[1446]
实施例72.化合物52c的制备
[1447][1448]
化合物52a的制备
[1449]
在0℃将他托布林乙酯(tfa盐，80mg，0.029mmol)、化合物14h(128mg，0.0142mmol)和无水hobt(3.5mg，0.026mmol)溶解在dmf(3ml)中。然后添加吡啶(0.5ml)和dipea(0.045ml，0.26mmol)。在n2下于室温搅拌24小时后，将反应混合物用h2o(10ml)稀释并用etoac(2
×
10ml)提取。将合并的有机层经无水na2so4干燥，过滤并浓缩。将所得剩余物通过柱色谱提纯而产生化合物52a(70mg，43％)。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1258.6，[m+h
‑
boc]
+
1158.6。
[1450]
化合物52b的制备
[1451]
在
‑
20℃向化合物52a(70mg，0.055mmol)在meoh(1.4ml)中的溶液添加在h2o(1.4ml)中的lioh一水合物(11.7mg，0.275mmol)。在0℃下1小时后，用乙酸将所述溶液的ph调节到4～5。所得溶液溶解在dmso(1ml)中并通过hplc纯化，产生化合物52b(4.5mg，8％)，为白色固体。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1090.4。
[1452]
化合物52c的制备
[1453]
在0℃向化合物52b(4.5mg，0.0041mmol)在dcm(1ml)中的溶液添加tfa(0.2ml)。在
0℃下2小时后，通过n2流除去溶剂和过量的tfa。然后将剩余物通过hplc纯化，产生化合物52c(2.4mg，59％)，为白色固体。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
990.4。
[1454]
实施例73.化合物53f的制备
[1455][1456]
化合物53b的制备
[1457]
在0℃将化合物53a(300mg，0.31mmol，化合物53a通过专利wo2013/055987a1中公开的方法制备)、化合物15a(355mg，0.31mmol)和无水hobt(10mg，0.06mmol)溶解在dmf(0.5ml)中。然后添加吡啶(0.3ml)和dipea(0.14ml，0.78mmol)。在n2下于室温搅拌23小时后，将反应混合物用h2o/饱和nh4cl水溶液(100ml/50ml)稀释并用etoac(2
×
100ml)提取。将合并的有机层经无水mgso4干燥，过滤并浓缩。将剩余物通过柱色谱纯化而产生化合物53b(250mg，41％)。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1943.6，[m+na]
+
1965.6。
[1458]
化合物53c的制备
[1459]
在n2下于0℃向化合物53b(300mg，0.31mmol)在thf中/h2o(2ml/1ml)中的溶液添加乙酸(3ml)。22小时后，反应混合物用h2o(100ml)稀释并用etoac(2
×
100ml)提取。将合并的有机层经无水na2so4干燥，过滤并浓缩。将所得剩余物通过柱色谱提纯而产生化合物53c(140mg，68％)。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1713.6。
[1460]
化合物53d的制备
[1461]
在n2下于室温向化合物53c(120mg，0.07mmol)在dcm(10ml)中的溶液添加氯铬酸吡啶鎓(158mg，0.42mmol)和分子筛(50mg)。搅拌18小时后，所述反应混合物经硅藻土垫过滤并减压浓缩。获得所生成的化合物53d(95mg，75％)，为无色油，其不经进一步纯化即使用。ei
‑
ms m/z：[m+na]
+
1732.8。
[1462]
化合物53e的制备
[1463]
在0℃向化合物53d(95mg，0.056mmol)在meoh(1ml)中的溶液添加在h2o(1ml)中的
lioh一水合物(12mg，0.278mmol)。在0℃下2小时后，将反应混合物用乙酸中和并减压浓缩。将所得剩余物溶解在dmso(1ml)中并通过制备型hplc纯化，产生化合物53e(6mg，7％)。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1569.7。
[1464]
化合物53f的制备
[1465]
将tfa(0.2ml)添加到化合物53e(6mg，0.004mmol)在dcm(2ml)中的搅拌过的溶液中。在0℃下搅拌2小时后，通过n2流除去溶剂和过量的tfa。然后将剩余物溶解在dmso(1ml)中并通过hplc纯化。将具有相同保留时间的纯级分合并并冻干，产生化合物53f(2.7mg，53％)，为白色固体。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1251.3。
[1466]
实施例74.化合物54a的制备
[1467][1468]
通过与实施例73中制备化合物53f类似的方法，从化合物53a和化合物14h制备化合物54a。
[1469]
实施例75.化合物55a的制备
[1470][1471]
通过与实施例73中制备化合物53f类似的方法，从化合物53a和化合物51a制备化合物55a。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
1516.7，1/2[m+h]
+
758.7。
[1472]
实施例76.化合物56d的制备
[1473][1474]
化合物56b的制备
[1475]
在0℃将化合物56a(hcl盐，100mg，0.27mmol，化合物56a通过在curr.med.chem.2009，16，1192
‑
1213中公开的方法制备)，化合物14h(242mg，0.27mmol)和无水hobt(7.3mg，0.05mmol)溶解在dmf(3ml)中。然后添加吡啶(0.4ml)和dipea(0.09ml，0.60mmol)。在n2下于室温搅拌16小时后，将反应混合物用饱和nh4cl水溶液(10ml)稀释并用etoac(2
×
20ml)提取。将合并的有机层经无水mgso4干燥，过滤并浓缩。将剩余物通过柱色谱纯化而产生化合物56b(184mg，63％)。ei
‑
ms m/z：[m+h]+1091.9，[m+h
‑
boc]
+
991.7。
[1476]
化合物56c的制备
[1477]
在
‑
20℃向化合物56b(90mg，0.08mmol)在meoh(2ml)中的溶液添加在h2o(2ml)中的lioh一水合物(17mg，0.41mmol)。在
‑
20℃搅拌2小时后，将反应混合物用乙酸中和并减压浓缩。然后将反应混合物溶解在h2o/dmso(1.5ml/1.5ml)中并通过hplc纯化，产生化合物56c(35mg，45％)，为黄色固体。ei
‑
ms m/z：[m+h]+951.7，[m+h
‑
boc]
+
851.5。
[1478]
化合物56d的制备
[1479]
在0℃将tfa(0.3ml)添加到化合物56c(35mg，0.04mmol)在dcm(2.0ml)中的搅拌过的溶液中。搅拌1小时后，通过n2流除去溶剂和过量的tfa。然后将剩余物溶解在h2o/mecn(1ml/1ml)中并通过hplc纯化。将具有相同保留时间的纯级分合并并冻干，产生化合物56d(24.9mg，68％)，为黄色固体。ei
‑
ms m/z：[m+h]+851.6。
[1480]
实施例77.化合物57a的制备
[1481][1482]
通过与实施例76中制备化合物56d类似的方法，从化合物56a和化合物15a制备化合物57a。ei
‑
ms m/z：[m+h]
+
983.3。
[1483]
实施例78.adc2合成
[1484][1485]
实施例79.adc2合成
[1486]
实施例80.adc86合成
[1487][1488]
实施例81.adc86合成
[1489][1490]
实施例82.adc4合成
[1491][1492]
实施例83.adc4合成
[1493]
实施例84.adc75合成
[1494][1495]
实施例85.adc75合成
[1496]
实验例1.关于β
‑
葡糖醛酸糖苷酶的反应性比较试验
[1497]
为了比较实施例66的化合物45k和比较例66的化合物50k对β
‑
葡糖醛酸糖苷酶的反应性，如下进行比较试验。
[1498]
将实施例66的化合物45k和比较例66的化合物50k各自制备成500μm和50μm的dmso
储液。制备反应溶液，其中将880μl的磷酸盐缓冲生理盐水(pbs)溶液分别与100μl的化合物45k和化合物50k储液互相混合(其最终浓度分别为50μm和5μm)。向所述反应溶液添加20μl的大肠杆菌β
‑
葡糖醛酸糖苷酶(1mg/ml，sigma：e.c.3.2.1.31型ix
‑
a；在pbs中1mg/ml；3.6μg，13μmol)，在37℃的恒温水浴中启动反应。分别在0min、25min、60min和90min分配100μl的所述混合溶液，并向其中添加200μl的乙腈。从对所述混合物样品进行离心(4℃，15分钟，14000rpm)而获得的各上清液释放的mmaf利用lc
‑
ms/ms定量分析(所述实验通过类似于美国专利no.8,568,728中公开的方法进行，所述美国专利特此通过引用被并入)。
[1499]
试验结果在图2中示出，并且从图2证实，通过在β
‑
葡糖醛酸糖苷酶的酶反应后的1,6
‑
消除反应(美国专利no.8,568,728，特此通过引用被并入)，mmaf从实施例66的化合物45k和比较例66的化合物50k各自显著地迅速释放。
[1500]
实验例2.接头毒素的血浆稳定性比较试验
[1501]
比较实施例66的化合物45k和比较例66的化合物50k的血浆稳定性。
[1502]
将10μl的化合物45k或50k以5mm溶解在dmso中，并将各组合物与990μl小鼠血浆混合，由此制备50μm样品，用于评估血浆稳定性。将所述血浆/化合物溶液在37℃温育7天。在这6天温育期间，在0、1、2和7天取100μl等分试样并与200μl含有内标的乙腈混合用于监测血浆蛋白沉淀。通过离心所述乙腈/血浆样品(4℃，15分钟，14000rpm)获得上清液，通过对所述上清液进行lc
‑
ms/ms来定量各化合物和产物的量。(该实验利用类似于在j.chromatography b，780：451
‑
457(2002)中公开的那些方法进行)。
[1503]
利用ls
‑
ms/ms获得的实施例66的化合物45k和比较例66的化合物50k的结果如图3和表1所示。比较例66的化合物50k的稳定性和实施例66的化合物45k的稳定性在第1天分别为14％和80％。因此，实施例66的化合物45k在小鼠血浆中的稳定性优于比较例66的化合物50k。
[1504]
表1.化合物45k和化合物50k在小鼠血浆中的稳定性
[1505][1506]
化合物47a、48a和49a的血浆稳定性用上述方法进行(图4
‑
图6)。
[1507]
实验例3.抗体
‑
药物缀合物的制备
[1508]
步骤1.异戊二烯化抗体的方法(根据韩国专利公开公布no.10
‑
2014
‑
0035393的方法制备)
[1509]
制备抗体的异戊二烯化反应混合物并在30℃下反应16小时。使用包含添加到每条轻链c
‑
端的gggggggcvim序列(“g7cvim”)的抗体。在重链(adc86
‑
91)或重链和轻链二者(adc75
‑
77)的c
‑
端添加g7cvim序列。所用抗体的序列来源如下表2。
[1510]
表2.adc制备使用的抗体列表
[1511][1512]
所述反应混合物由含有24μm抗体、200nm ftase(calbiochem#344145)和144μm lcb14
‑
0606的缓冲溶液(50mm tris
‑
hcl(ph7.4)，5mm mgcl2，10μm zncl2，0.25mm dtt)构成(根据韩国专利公开公布no.10
‑
2014
‑
0035393的方法在机构内部制备，特此通过引用被并入)。反应完成后，将异戊二烯化的抗体通过fplc纯化。
[1513]
步骤2.制备adc的方法
[1514]
通过混合100mm乙酸钠缓冲液(ph4.5，10％dmso)、12μm异戊二烯化抗体和120μm接头
‑
毒素(机构内部)并温和地在30℃搅拌而制备异戊二烯化抗体和接头
‑
毒素之间的肟键形成反应混合物。将反应温育24小时后，经由fplc和疏水相互作用色谱
‑
hplc通过脱盐来纯化所述抗体
‑
药物缀合物。
[1515]
表3.抗
‑
her2 adc(dar2)列表
[1516][1517]
表4.抗her2 adc(dar4)列表
[1518]
adc编号化合物编号adc2316fadc2416gadc2517dadc2618cadc2719cadc2820qadc2921iadc3022hadc3123hadc3224ladc3325eadc3425fadc3526e
adc3627eadc3728dadc3828eadc3929jadc4029kadc4130badc4230cadc4331fadc4431gadc4532cadc4632dadc4733eadc4833fadc4934eadc5034fadc5135gadc5236eadc5337dadc5438badc5538eadc762hadc8816fadc8916gadc9025fadc9125e
[1519]
表5.抗
‑
her2 adc(dar4<)列表
[1520] adc编号化合物编号<dar6>adc6043i adc6143j<dar8>adc6244i adc6344j adc7716f
[1521]
表6.使用鹅膏蕈碱作为有效载荷的抗
‑
her2 adc列表
[1522][1523]
表7.使用靶向各种蛋白质的抗体的adc列表
[1524][1525]
实验例4.抗
‑
her2 adc的细胞毒性
[1526]
使用可商购的人乳腺癌细胞系mcf
‑
7(her2阴性至正常)、oe
‑
19(her2阳性)、nci
‑
n87(her2阳性)、sk
‑
ov
‑
3(her2阳性)、jimt
‑
1(her2阳性)、和sk
‑
br
‑
3(her2阳性)。根据与所述可商购的细胞系一起提供的推荐说明培养所述细胞系。
[1527]
测量所述抗体、药物和缀合物对于所述癌细胞系的抗增殖活性。将所述细胞以每孔1
×
104个细胞铺在96孔组织培养板中。温育24小时后，添加各种浓度的所述抗体、药物和缀合物。利用srb测定来计数72小时后的活细胞数量。使用spectramax 190(molecular devices，usa)在540nm处测量吸光度。
[1528]
表8.不同抗
‑
her2 adc(dar2)的ic
50
值
adc2416g0.140.260.170.37>33.33adc2517d0.030.100.360.37>33.33adc2618c0.080.14
‑‑
>33.33adc2719c0.050.430.290.38>33.33adc2820q0.030.120.360.36>33.33adc2921i0.030.410.310.49>33.33adc3022h0.050.410.300.35>33.33adc3123h0.140.24
‑‑
>33.33adc3224l0.030.400.320.35>33.33adc3325e0.040.230.270.33>33.33adc3526e0.130.19
‑‑
>33.33adc3627e0.130.22
‑‑
>33.33adc3728d0.040.07
‑‑
>33.33adc3929j0.030.11
‑‑
>33.33adc4130b0.030.10
‑‑
>33.33adc4331f0.030.04
‑‑
>33.33adc4532c0.030.08
‑‑
>33.33adc4733e0.040.07
‑‑
>33.33adc4934e0.030.05
‑‑
>33.33adc5135g0.040.240.34
‑
>33.33adc5236e0.070.400.37
‑
>33.33adc5538e0.040.07
‑‑
>33.33
[1537]
表12.混合adc的ic
50
值
[1538][1539]
两种不同的毒素缀合的adc和相同毒素缀合的adc的比较
[1540]
表13.各种dar
‑
adc的ic
50
值
[1541][1542]
实验例5.爱必妥(lc)
‑
葡糖苷酸接头
‑
mmaf的细胞毒性
[1543]
将表达高水平egfr的a431细胞和表达低水平egfr的mcf
‑
7细胞以约1000个细胞/孔在100μl培养基内铺在96孔板中。将表达中等水平的egfr的hcc
‑
827细胞以约5000个细胞/孔100μl在培养基内铺在96孔板中。将所述细胞在37℃下5％co2中温育24小时。然后，将连续稀释的单甲基奥瑞他汀f
‑
ome(mmaf
‑
ome)、爱必妥(lc)
‑
g7cvim以及包含爱必妥(lc)
‑
g7cvim和mmaf的抗体药物缀合物adc64以100至0.00128nm的浓度添加给所述细胞。将所述细胞温育72小时，然后在向每孔添加100μl冰冷的10％三氯乙酸后，在4℃下固定1小时。利用srb染料(磺酰罗丹明b，sigma s1402)和运行softmax pro v5的molecular devices spectramax 190读板器，监测540nm处的吸光度，来对活细胞计数(表14)。
[1544]
爱必妥(lc)
‑
g7cvim对于每个细胞系(a431、mcf
‑
7和hcc
‑
827)都有大于100nm的ic
50
。mmaf
‑
ome对mcf
‑
7细胞的ic
50
为1.81nm，对hcc
‑
827细胞的ic
50
为1.99nm，对a431细胞的ic
50
为1.11nm。抗体
‑
药物缀合物adc64、65和66对mcf
‑
7细胞的ic
50
大于100nm，对hcc
‑
827细胞的ic
50
分别为0.47、0.17和0.11nm。adc64对a431细胞显示1.3nm，因此显示出优于mmaf
‑
ome的特异性和优于爱必妥(lc)
‑
g7cvim的效能。
[1545]
表14.基于抗
‑
egfr mab的爱必妥的adc的ic
50
值
[1546][1547]
实验例6.abt
‑
806(lc)
‑
葡糖苷酸接头
‑
mmaf的细胞毒性
[1548]
测试了基于abt
‑
806的adc对三星医疗中心(samsung medical center)(首尔，大韩民国)建立的患者源性细胞系的细胞毒性。将所述细胞维持在补充有l
‑
谷氨酰胺(200nm)、bfgf(20ng/ml)、egf(20ng/ml)、n2补充剂和b27补充剂的培养基(thermo fisher scientific)中。对于细胞存活率测试，将细胞等分至96孔板(5000个细胞/孔)，并在37℃，5％co2下温育1天，然后处理。adc处理后，将细胞温育72小时。将100μl的试剂(promega)添加到每个孔以分析细胞存活率。温育10分钟后，用发光光
度计分析发光信号。
[1549]
正如预期，dar4 adc(adc74，adc75)比dar2 adc(adc73)具有更好的效能。有些患者细胞显示出对有效载荷的敏感性有点不同。22&780细胞对mmae比mmae更敏感，464细胞反之。
[1550]
表15.基于abt
‑
806的adc对患者源性细胞系的细胞毒性活性
[1551][1552]
实验例7.抗
‑
cd19 adc的细胞毒性
[1553]
将作为人类伯基特氏(burkitt’s)淋巴瘤细胞的ramos细胞在100μl生长培养基中被以20,000个细胞/孔接种在96孔板中。将所述细胞在37℃，5％co2下温育1天。将在100μl培养基中从33.33nm至5.1pm连续稀释的抗cd19抗体di
‑
b4
‑
(lc)
‑
g7cvim和adc添加至所述孔中，并将所述细胞与抗体&adc一起温育72小时。利用wst
‑
1(takara mk400)和运行softmax pro v5的molecular devices spectramax 190读板器，监测450nm处的吸光度(表16)，来评估细胞存活率。
[1554]
将对ramos细胞中的实验与对k562细胞的实验平行进行，k562细胞是不表达cd19的人骨髓性白血病细胞，作为评估任何非特异性细胞毒性的阴性对照。
[1555]
adc68和adc69对ramos细胞表现出ic
50
为0.09nm，优于未缀合的di
‑
b4(表16)。对于k562对照细胞，没有抗体在低于33.33nm下显示出细胞毒性。
[1556]
表16.基于抗cd19抗体的adc的细胞毒活性
[1557][1558]
实验例8.基于利妥昔单抗的adc的细胞毒性
[1559]
将人类伯基特氏淋巴瘤细胞ramos细胞在100μl生长培养基内以20,000个细胞/孔接种在96孔板中。将细胞在37℃，5％co2温育1天。将在100μl培养基中从33.33nm至5.1pm连续稀释的利妥昔单抗(lc)
‑
g7cvim和adc添加到所述孔中，并将所述细胞与抗体&adc一起温育72小时。使用wst
‑
1(takara mk400)和运行softmax pro v5的molecular devices spectramax190读板器，监测450nm处的吸光度，来评估细胞存活率(表17)。
[1560]
将对ramos细胞的实验与对k562细胞的实验平行进行，k562细胞是不表达cd20的人骨髓性白血病细胞，作为评估任何非特异性细胞毒性的阴性对照。
[1561]
adc70、adc71和adc72表现出对ramos细胞的ic
50
分别为4.56nm、1.47nm和1.78nm，其优于未缀合的抗cd20抗体(表17)。对于k562对照细胞，没有抗体在低于33.33nm下显示出细胞毒性。
[1562]
表17.基于利妥昔单抗的adc的细胞毒活性
[1563][1564]
实验例9.在β
‑
葡糖醛酸糖苷酶敏感性方面的差异
[1565]
将在0.06m乙酸钠缓冲液(ph5.2)中的adc等分装到1.5ml微管中。将混合物中adc的终浓度调节至12μm。向每管添加0.001μg的人β
‑
葡糖醛酸糖苷酶(r&d systems：6144
‑
gh
‑
020)。然后，将混合物在37℃水浴中温育3小时。通过加入冷pbs缓冲液(ph7.4)至15倍稀释来终止反应。通过hic
‑
hplc分析β
‑
葡糖醛酸糖苷酶对adc试样的改变。酶活性的功效通过剩余％显现(图10)。
[1566]
敏感性属性似乎在于接头
‑
毒素部分的分支单元(br)。当lys位于br中时，非常有效地发生毒素释放。酰胺和胺比lys显示出较小敏感性。
[1567]
实验例10.adc的血浆稳定性
[1568]
为了比较adc2(赫赛汀
‑
lbg
‑
mmaf，dar2)和kadcyla之间的血浆稳定性，将这些adc在小鼠和人血浆中温育5秒(0h)或96小时(96h)，然后利用sk
‑
br3细胞进行srb体外细胞毒性测试72小时。
[1569]
血浆温育的adc2保留了强效的细胞毒性(ic
50
不变；对mp为0.06(0h)和0.07nm(96h)，对hp为0.08(0h)和0.08nm(96h))，而与0h kadcyla相比血浆温育的kadcyla显示出细胞毒性降低(ic
50
增加；对mp为0.26(0h)和1.59nm(96h)，对hp为0.29(0h)和4.21nm(96h))(图11)。
[1570]
为了表征由各种抗体制成的adc的血浆稳定性，将adc在人血浆中温育5秒(0小时)或168小时(168小时)，然后利用sk
‑
br3细胞进行srb体外细胞毒性测试72小时。(表18
‑
20和图12)
[1571]
表18.基于赫赛汀的adc的血浆稳定性(nm)
[1572][1573]
表19.基于抗cd19抗体的adc的血浆稳定性(nm)
[1574][1575]
表20.基于抗cd20抗体的adc的血浆稳定性(nm)
[1576][1577]
实验例11.和adc的药代动力学
[1578]
对雄性sprague dawley大鼠静脉注射3mg/kg的抗体或抗体
‑
药物缀合物。给药后在多个时间点取血样，在冰水中激冷，并分离血浆。将血浆在
‑
80℃冷冻直至后续的lc/ms/ms分析。
[1579]
将20μl的各样品与340μl的pbs和60μl的蛋白a磁珠混合，并在室温下伴随温和振荡温育2小时。将所述磁珠用pbs洗涤三次。然后，将25μl内标(10μg/ml同位素标记肽)、75μl的rapigest sf(waters)和10μl的二硫苏糖醇添加到所述磁珠中。将所述混合物振荡1分钟，然后在60℃温育1小时。向混合物添加25μl碘乙酸，振荡混合物1分钟，然后在室温下温育30分钟。将10μl测序级修饰胰蛋白酶(promega)添加到所述混合物中，振荡混合物1分钟，并将混合物在37℃温育过夜。向混合物添加15μl盐酸，振荡混合物1分钟，并将混合物在37℃温育30分钟。将混合物在4℃下以5000
×
g离心10分钟，并将上清液转移到hplc小瓶中。
[1580]
液相色谱
‑
质谱系统由两台shimadzu lc
‑
20ad泵、shimadzu cbm
‑
20a hplc泵控制器(shimadzu corporation，columbia，md，usa)、ctc hts pal自动进样器(ceap technologies，carrboro，nc，usa)和三重飞行时间5600质谱仪(triple tof ms)(ab sciex，foster city，ca，usa)组成。分析柱是phenomenex kinetex xb
‑
c18柱，2.1
×
30(2.6μm)。hplc用水/乙腈梯度进行并用0.1％甲酸酸化。进样量为10μl。用配备了duospray
tm
离子源的triple tof ms来完成高分辨率实验。所述triple tof ms以正离子模式运行。雾化器/duospray
tm
和气帘气使用高纯氮气。气源温度设定在500℃，气帘气流量为30l/min。离子喷雾电压设定为5500v，去簇电压为145v，碰撞能量为38v。产物离子模式被用作扫描模式。用(microsoft)操作的tf 1.6版(ab sciex)被用于仪器控制和数据采集。用2.1.1版(ab sciex)进行峰整合。用2.1.1版进行峰面积比、标准曲线回归、样品浓度值和描述性统计的计算。所述lc/ms/ms使用浓度为0.1μg/ml、0.4μg/ml、1μg/ml、2μg/ml、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml、和100μg/ml的标准溶液校准。图13显示代表性的pk曲线。adc2(赫赛汀(lc)
‑
mmaf，dar2)的pk曲线与赫赛汀的非常相似。
[1581]
实验例12.分支接头
‑
毒素中的peg(连接单元)组合效应
[1582]
为了鉴别影响adc的pk曲线的关键属性，测试连接单元的不同长度和结构(peg数量和排列)。pk分析实验如实验例9所述进行。虽然adc23(dar4adc)在体外和体内比dar2 adc更强效，但其pk曲线在半衰期和auc(曲线下面积)方面降低(图14)。通过将接头
‑
毒素从16f替换为25f(在分支单元(br)之后连接附加的连接单元(3peg))，pk曲线恢复到高达与赫赛汀相似(图14)。这些效应在基于mmae的adc、adc24&adc33中再现(图15)。因为mmae比mmaf更疏水，所以基于mmae的adc的pk曲线变差，如adc1和adc24所示。添加更长的peg单元是延长半衰期和auc的传统应用。然而，当将adc1与adc5比较时，peg单元数从3到12的简单延长没有显示出大差异。另一方面，通过用线性接头单元(化合物2g或4f)代替分支接头单元(化合物11j，adc15)，pk曲线显着改善(图16)，表明对于pk的关键属性可能不只是单纯的长度，而是连接单元的结构。
[1583]
实验例13.亲水性连接单元在adc的pk方面的效应
[1584]
用于adc的许多有效载荷具有疏水特性，导致pk特性不佳。为了补偿疏水性，将亲水性化合物作为连接单元的一部分进行测试。插入亲水性化合物例如asp提高了adc的auc和半衰期(图17、图18、图19)。在dar2的情况下，具有包含asp的连接单元的adc显示出比赫赛汀更高的auc(图17、图18)。在有dar4的adc中可观察到极性氨基酸例如asp或glu的补偿效应(图19、图20)。adc49(2个asp)和adc52(2个d
‑
glu)在auc和半衰期方面分别优于adc47(1个asp)和adc51(1个d
‑
glu)。
[1585]
实验例14.体内功效
[1586]
将冷冻的jimt
‑
1细胞原液在37℃，5％co2条件下解冻并培养。jimt
‑
1细胞的存活率超过95％的最佳条件被用于植入。将悬浮在50μl冷生理盐水中的5
×
106个细胞植入balb/c
‑
裸小鼠的右后腿。每组5只小鼠用于实验。定期监测肿瘤形成和生长。肿瘤体积通过下式计算：体积＝(a2b)/2，“a”是指短直径而“b”是指长直径。
[1587]
当肿瘤体积达到约200mm3时，根据肿瘤体积选择具有平均值的小鼠并分组。然后，将小鼠用pbs(介质对照)或图21和22中指出的adc处理。在实验期间，隔3～4天一周2次测定肿瘤大小。绘制从给药第一天至结束日所测量的肿瘤体积，用于肿瘤生长曲线。
[1588]
通过单次注射对代表性的adc进行测试。一般而言，具有含有lys的分支单元(br)的adc比具有含有酰胺的br的adc具有更好的功效。
[1589]
通过引用并入
[1590]
本文中援引的每个专利、公布的专利申请和非专利参考文献特此以其整体通过引用被并入。
[1591]
等同方案
[1592]
本领域技术人员将认识到或者能够利用不多于常规实验就确定，本文中所述的本发明具体实施方式的许多等同方案。这样的等同方案旨在由所附权利要求包涵在内。