一种稳定的抗CSF-1R单克隆抗体的液体制剂及应用的制作方法

一种稳定的抗csf
‑
1r单克隆抗体的液体制剂及应用
技术领域
1.本发明属于药物制剂技术领域，具体的说，是关于一种稳定的抗csf
‑
1r单克隆抗体的液体制剂及应用。


背景技术：

2.集落刺激因子1受体(csf
‑
1r)，又称巨噬细胞集落刺激因子受体(m
‑
csfr)和cd115(分化簇115)，是由csf1r基因(也称为c
‑
fms)编码的人类细胞表面蛋白。它是细胞因子集落刺激因子1的受体，属于iii型受体酪氨酸激酶家族，由原癌基因c
‑
fms编码，蛋白结构包含胞内的激酶结构域和胞外由5个免疫球蛋白类似结构组成的配体结合区。csf
‑
1r表达在单核吞噬细胞表面，对单核吞噬细胞的存活、增殖、分化起关键作用。并且csf
‑
1r也高表达在许多种肿瘤细胞表面。例如，csf
‑
1r表达与肿瘤组织大小和低存活密切相关。在卵巢癌和子宫内膜癌，northern杂交分析显示绝大多数肿瘤组织共表达csf1和csf
‑
1r，而正常的子宫内膜组织csf
‑
1r表达很弱。csf
‑
1r也表达于肿瘤浸润性巨噬细胞表面。
3.csf
‑
1r的胞外区结合csf
‑
1后，引发csf
‑
1r受体二聚化和其胞内的自身磷酸化，从而起始胞内信号传递。异常的受体酪氨酸激酶iii信号传递导致大量炎症疾病和癌症发生，提示胞内的rtk iii型在先天和获得性免疫反应中起中心作用。例如，异常的csf1r信号传递通常出现在诸如类风湿关节炎、动脉粥样硬化及肿瘤生长的多种人类疾病病理状态。
4.csf1r信号也被证实在骨重塑中发挥生理作用。基因敲除csf1或csf1r的动物通常表现为骨硬化表型。长期以来，csf1r抑制剂作为一种癌症、炎症性疾病或骨质疏松疾病的潜在疗法被深入研究。pexidartinib，一种csf1r的抑制剂，在治疗腱鞘巨细胞瘤的3期临床试验中展示出强劲的疗效。另外一种csf1r抑制剂，cabiralizumab,为一种靶向肿瘤相关巨噬细胞的单克隆抗体，正进行转移性胰腺癌的早期临床试验。另一种处于临床ii期的药物jnj
‑
40346527，为一种口服的csf1r抑制剂，其作用机理为抑制巨噬细胞存活、增殖和分化。
5.单克隆抗体的本质是蛋白质，具有确定的一级、二级、三级和高级结构，这些特定的结构使蛋白质药物在体内发挥生物学功能。与传统化药小分子药物相比，复杂大分子蛋白药物的稳定性差，易导致结构和功能改变，进而影响药物的有效性和安全性。因此，开发稳定的制剂配方，是蛋白类药物开发的重要环节。


技术实现要素：

6.本技术的发明人经过广泛的研究发现，抗csf
‑
1r单克隆抗体与特定浓度的缓冲剂、稳定剂、非离子表面活性剂组成的液体制剂在ph为5～6的条件下，在外观、不溶性微粒检测、40℃下放置一个月后的sec纯度、以及25℃下以及2～8℃条件下分别放置3个月后的sec纯度等方面均具有优异的稳定性。因此，本发明的首要目的是提供一种稳定的抗csf
‑
1r单克隆抗体的液体制剂，以解决现有的抗csf
‑
1r单克隆抗体的稳定性差、容易导致结构和功能改变的问题；本发明的第二个目的是提供该抗csf
‑
1r单克隆抗体的液体制剂的应用。
7.为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
8.本发明的第一个方面是提供一种稳定的抗csf
‑
1r单克隆抗体的液体制剂，包括如下浓度的组分：
[0009][0010]
根据本发明，所述的抗csf
‑
1r单克隆抗体包含含lcdr1、lcdr2和lcdr3序列的轻链可变区和含hcdr1、hcdr2和hcdr3序列的重链可变区，所述lcdr1的序列、lcdr2的序列、lcdr3的序列、hcdr1的序列、hcdr2的序列、hcdr3的序列分别如seq id no.5、seq id no.6、seq id no.7、seq id no.8、seq id no.9、seq id no.10所示。
[0011]
根据本发明，所述的抗csf
‑
1r单克隆抗体的轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.11所示，重链可变区的氨基酸序列如seq id no.12所示。
[0012]
根据本发明，所述的抗csf
‑
1r单克隆抗体的轻链的氨基酸序列如seq id no.1所示，重链的氨基酸序列如seq id no.3所示。
[0013]
根据本发明，所述缓冲剂为枸椽酸盐缓冲剂、醋酸盐缓冲剂、组氨酸盐酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲剂中的一种或多种的混合物，优选为组氨酸盐酸盐缓冲剂，所述的缓冲剂的浓度优选为20mm。
[0014]
根据本发明，所述的稳定剂为非还原糖、多元醇、氨基酸中的一种或多种的混合物。
[0015]
进一步的，所述的非还原糖为蔗糖、海藻糖中的一种或多种的混合物。
[0016]
优选的，所述的非还原糖为蔗糖。
[0017]
进一步的，所述的多元醇为山梨醇、甘露醇中的一种或多种的混合物。
[0018]
优选的，所述的多元醇为山梨醇。
[0019]
根据本发明，所述的非离子表面活性剂为聚山梨酯20、聚山梨酯80中的至少一种。
[0020]
优选的，所述的非离子表面活性剂为聚山梨酯80。
[0021]
优选的，所述的液体制剂的ph值为5.5。
[0022]
根据本发明，所述液体制剂包括如下浓度的组分：
[0023][0024]
优选的，所述液体制剂包括如下浓度的组分：
[0025][0026]
本发明的第二方面是提供一种用于制备治疗csf
‑
1r介导的疾病的生物制剂，包括上述所述的抗csf
‑
1r单克隆抗体的液体制剂，所述疾病为癌症、炎症性疾病或骨质疏松疾病。
[0027]
本发明的稳定的抗csf
‑
1r单克隆抗体的液体制剂，其有益效果是：稳定性好，在40℃剧烈条件下，可以稳定保存1个月，且sec
‑
hplc纯度检测显示抗csf
‑
1r单克隆抗体纯度高于98.0％以上。因此本发明的抗csf
‑
1r单克隆抗体的液体制剂能够提供抗csf
‑
1r单克隆抗体a的储存与用药稳定性，具有广阔的工业应用前景。
具体实施方式
[0028]
以下结合具体实施例，对本发明的稳定的抗csf
‑
1r单克隆抗体的液体制剂作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件进行。例如，实验例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件，抗csf
‑
1r单克隆抗体可以是按照目前已知任何的方法制备的单抗，以下示例性的抗体制备方法并不限制本发明。不溶性微粒采用flowcan8100流式影像仪进行检测。全因子doe实验采用minitab 17全因子分析方法进行检测。
[0029]
以下实施例中的sec
‑
hplc检测方法为：agilent1260高效液相色谱仪、色谱柱tskgel g3000swxl，流动相100mm kh2po4/100mm na2so4,ph6.7
±
0.02，流速1ml/min，上样量100μg，样品检测温度25℃，检测时间20min，吸收波长280nm。
[0030]
本发明的抗csf
‑
1r单克隆抗体a(也简称为，本发明抗体a或抗体a)，其为lgg1型，其轻链的氨基酸序列如seq id no.1所示，基因序列如seq id no.2所示；重链的氨基酸序列如seq id no.3所示，基因序列如seq id no.4所示。lcdr1序列、lcdr2序列、lcdr3序列、hcdr1序列、hcdr2序列、hcdr3序列、vh序列、vl序列分别如seq id no.5、seq id no.6、seq id no.7、seq id no.8、seq id no.9、seq id no.10、seq id no.11、seq id no.12所示。将wo2019/036856(dynamic human antibody light chain libraries)和wo2019/036842(dynamic human heavy chain antibody libraries)的披露，作为筛选抑制csf
‑
1r抗原的人源化抗体文库。
[0031]
实施例1本发明抗体a的药效学以及药代动力学
[0032]
1、体外药效学
[0033]
抗原亲和力、结合活性和结合部位研究
[0034]
对抗体a以elisa法进行抗原结合活性研究，结果显示本发明抗体a可以特异性结合csf
‑
1r(ec50＝33.2ng/ml)。
[0035]
对抗体a以fortibio法进行抗原亲和力研究，结果显示本发明抗体a与人csf
‑
1r的亲和力常数kd＝29.6nm。
[0036]
药代动力学
[0037]
本试验在食蟹猴单次静脉注射给药动力学研究，给药剂量分别为30mg/kg，给药体积均为10ml/kg，给药速率约2ml/min。
[0038]
药代动力学分析显示，食蟹猴静脉注射给予抗体a后，可以迅速达到血药峰浓度，达峰时间tmax为0.5
±
0.5小时，之后血药浓度随时间而逐渐下降，各组最迟末次检出时间分别为给药后672h、840h、840h。峰浓度cmax为885.3
±
160.3μg/ml。暴露量auc0
‑
840h为82933.5
±
13312.2h*μg/ml。
[0039]
2、体内药效学：
[0040]
抗体a在皮下移植h22/hcsf
‑
1细胞的hucsf
‑
1r小鼠模型中评价的抗肿瘤作用。
[0041]
为了在小鼠肿瘤模型上研究抗体a对肿瘤相关巨噬细胞促进肿瘤生长功能的阻断作用，一方面通过骨髓重建的方式构建了hu
‑
csf
‑
1r嵌合小鼠，另一方面以转基因的方式构建了稳定表达人csf
‑
1的鼠源肝癌h22细胞(h22/hcsf
‑
1)，基于此模型评价抗体a的体内抗肿瘤疗效。研究中制备hcsf1
‑
r慢病毒载体，并体外感染小鼠骨髓细胞使其表达人源csf
‑
1r，通过同种异体的骨髓移植，获得表达人csf
‑
1r的小鼠，皮下接种鼠h22/hcsf
‑
1肝癌细胞构建移植瘤小鼠模型。
[0042]
研究分为2组，每组5只小鼠，分别给予pbs和50mg/kg的抗体a，给药方式为腹腔注射，给药频率为每周三次。研究结果显示，抗体a可以抑制小鼠肝癌h22/hcsf
‑
1细胞皮下移植肿瘤的生长，给药至d17时，50mg/kg剂量组肿瘤生长抑制率为48.5％。
[0043]
以上研究结果表明本发明抗体a通过阻断csf
‑
1/csf
‑
1r信号通路，可降低csf
‑
1r阳性细胞比例，减少肿瘤微环境中促瘤的tam，进而发挥抑制肿瘤生长的作用。
[0044]
实施例2缓冲剂对液体制剂稳定性的影响
[0045]
本实施例的主要目的为评估本发明抗体a不同组成和不同ph值的缓冲剂(枸椽酸盐缓冲剂、组氨酸盐酸盐缓冲剂、醋酸盐缓冲剂、磷酸盐缓冲液)对液体制剂稳定性的影响。
[0046]
将表1所示的配方在45℃条件下放置一个月，然后对其进行sec
‑
hplc，分析其中抗csf
‑
1r单克隆抗体sec
‑
hplc纯度的变化，测试结果如表2所示。
[0047]
表1缓冲剂选择实验条件
[0048]
[0049][0050]
表2缓冲剂选择实验检测结果
[0051][0052]
结果显示，对于抗csf
‑
1r单克隆抗体a而言，在45℃条件下放置一个月后，组氨酸盐酸盐缓冲剂(f1
‑
7、f1
‑
8、f1
‑
9和f1
‑
10)和醋酸盐缓冲剂(f1
‑
1、f1
‑
2和f1
‑
3)相较于枸椽酸盐缓冲剂(f1
‑
4、f1
‑
5和f1
‑
6)以及磷酸盐缓冲剂(f1
‑
12和f1
‑
13)能够提供更高的sec
‑
hplc纯度，具有更优的稳定性。对于组氨酸盐酸盐缓冲剂和醋酸盐缓冲剂体系，数据显示组氨酸盐酸盐缓冲剂的稳定性更好，因此，根据以上检测结果，优选组氨酸盐酸盐缓冲体系进
行下一步实验。
[0053]
实施例4稳定剂对液体制剂稳定性的影响
[0054]
本实施例的主要目的为评估本发明抗体a不同浓度和组成的稳定剂(蔗糖、海藻糖、甘露醇、甘氨酸)对液体制剂稳定性的影响。
[0055]
将表3所示的配方在25℃条件下振摇6天、40℃条件下放置1月后(两个条件平行考察)，进行sec
‑
hplc检测，分析其中抗csf
‑
1r单克隆抗体纯度的变化，测试结果如表4所示。
[0056]
表3稳定剂实验条件
[0057][0058]
表4稳定剂筛选实验sec纯度检测结果
[0059][0060]
结果显示，对于抗csf
‑
1r单克隆抗体a而言，在25℃下振摇6天后，f2
‑
3表现差于其他5个处方，而其他五个处方sec
‑
hplc纯度没有差异。
[0061]
表5稳定剂筛选实验flowcam不溶性微粒检测结果
[0062]
[0063]
f2
‑
1、f2
‑
2和f2
‑
4所示的液体制剂在40℃下放置一个月之后，对f2
‑
1、f2
‑
2和f2
‑
4样品进行了不溶性微粒检测，结果如表5所示。
[0064]
结果显示，f2
‑
1在40℃下放置一个月之后，其不溶性微粒少于f2
‑
2和f2
‑
4处方，因而优选蔗糖进入下一步实验。
[0065]
实施例4非离子型表面活性剂对液体制剂稳定性的影响
[0066]
本实施例的主要目的为评估本发明抗体a不同浓度的非离子型表面活性剂(聚山梨酯20和80)对液体制剂稳定性的影响。
[0067]
将表6所示配方在25℃下分别振摇1周、2周；在40℃下放置2周；在50℃下放置2周后。取样检测sec纯度变化，测试结果如表6所示。
[0068]
表6表面活性剂筛选实验条件
[0069][0070]
表7表面活性剂筛选实验结果
[0071][0072]
表8表面活性剂筛选实验结果
[0073][0074]
结果显示，对于抗csf
‑
1r单克隆抗体a而言，在25℃下振摇1周和2周后，7个处方在sec纯度上没有明显差异，f3
‑
1作为对照(不含聚山梨酯)在外观上出现了较多颗粒，稳定性较差；在40℃下和50℃分别放置2周之后，其sec
‑
hplc纯度均随着聚山梨酯浓度的升高而降低，含聚山梨酯80的处方(f3
‑
2、f3
‑
3和f3
‑
4)的纯度普遍要高于含聚山梨酯20(f3
‑
4、f3
‑
5和f3
‑
6)的处方，因此聚山梨酯80优于聚山梨酯20，且聚山梨酯80浓度在0.1mg/ml时纯度最高，因而相较于其他稳定剂组成的液体制剂具有更好的稳定性。因此，综合考虑以上检测结果和目的抗体蛋白性质，优选配方为f3
‑
2的液体制剂配方。
[0075]
对于抗csf
‑
1r单克隆抗体而言，在40℃的条件下，本发明的抗csf
‑
1r单克隆抗体a液体制剂在40℃下考察一个月后，sec
‑
hplc纯度检测显示抗csf
‑
1r单克隆抗体纯度高于99.0％以上，稳定性较好。
[0076]
实施例5配方的doe实验
[0077]
本实施例的目的是在确定处方组分后评估一定浓度范围内的各组分即组氨酸盐酸盐缓冲剂、抗体、蔗糖、聚山梨酯80以及一定范围内ph对本发明抗体a配方稳定性的影响。因此，本实施例以20mg/ml csf
‑
1r单克隆抗体、80mg/ml蔗糖浓度、0.1mg/ml聚山梨酯80的20mm组氨酸缓冲体系(ph5.5)为中心点，设计一个五因素两水平的全因子doe实验。
[0078]
以20mg/ml csf
‑
1r单克隆抗体、80mg/ml蔗糖浓度、0.1mg/ml聚山梨酯80的20mm组氨酸缓冲体系(ph5.5)为中心点，对缓冲液浓度(5～35mm)、抗体浓度(16～24mg/ml)、ph范围(ph5.0～6.0)、蔗糖浓度(70mg/ml～90mg/ml)、聚山梨酯80浓度(0.05mg/ml～0.15mg/ml)，设计一个五因素两水平的全因子doe实验。
[0079]
将表9所示配方在40℃下放置1个月；检测一个月后sec纯度变化，测试结果如表10所示。
[0080]
表9配方的doe实验
[0081][0082][0083]
表10doe实验sec纯度结果
[0084][0085][0086]
结果显示，f4
‑
1——f4
‑
35的液体制剂经过40℃放置1个月后，sec纯度都大于98％。表明在上述实施例的组分浓度范围内，抗csf
‑
1r单克隆抗体a的液体制剂的稳定性较好。
[0087]
实施例6配方的加速稳定性与长期稳定性
[0088]
本实施例的主要目的为评估25℃和2～8℃条件下本发明抗体a处方的长期稳定
性。
[0089]
将表10所示配方在25℃下以及2～8℃条件下，分别放置3个月；在各取样点取样检测sec纯度变化，测试结果如表11所示。
[0090]
表10加速稳定性与长期稳定性
[0091][0092]
表11加速稳定性与长期稳定性实验结果
[0093][0094]
结果显示，用含80mg/ml蔗糖组氨酸盐酸盐缓冲剂和0.1mg/ml聚山梨酯80的制剂体系对本发明抗csf
‑
1r单克隆抗体a有很好的保护作用，因此，表10所示的液体制剂配方能够提供抗csf
‑
1r单克隆抗体较好的物理和化学稳定性，具有广泛的工业应用前景。
[0095]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰。这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。