一种膀胱靶向载药外泌体及应用和治疗膀胱疾病药物的制作方法

1.本发明属于生物医药技术领域，特别是一种膀胱靶向载药外泌体及应用和治疗膀胱疾病药物。


背景技术：

2.膀胱是人体尿液贮存和排泄的器官，任何原因导致膀胱失去上述正常功能，即会出现排尿次数、尿量和尿色上的异常，发生膀胱疾病。常见膀胱疾病包括膀胱炎症、膀胱息肉、膀胱肌肉收缩无力和膀胱癌。膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，也是全身十大常见肿瘤之一。占我国泌尿生殖系肿瘤发病率的第一位，而在西方其发病率仅次于前列腺癌，居第2位。
3.目前癌症治疗无论是化药还是生物分子，都涉及到以下三个问题，第一：药物在体内血清环境下容易被降解，分子体积小，容易被排泄；第二：药物在体内非特异性分布而降低靶组织浓度；第三：药物需要克服血管壁及各种组织的物理屏障才能到达靶细胞。因此，目前亟需一种药物递送系统，其应同时具备生物相容性好，稳定性高，具有组织靶向性，跨膜递送能力强的特点。
4.靶向给药体系是利用载体将药物选择性地富集于病灶或体内特定部位的给药体系。使药物在病灶中发挥最大作用,而全身的毒副作用降到最低程度。包括:被动靶向制剂：不溶性载药微粒(如脂质体、纳米囊等)依靠机体细胞吞噬作用使药物进入靶区；主动靶向制剂：用抗体等修饰药物载体作为“导弹”,将药物定向地运送到靶区。由于靶向制剂可以提高药效、降低毒性，可以提高药品的安全性、有效性、可靠性和病人用药的顺应性，所以日益受到国内外医药界的广泛重视。纳米药物递送系统的开发在一定程度上解决了上述问题。然而，基于脂质体或白蛋白的纳米载体在血液中不能稳定存在，易被网状内皮系统或单核吞噬细胞系统清除，缺乏组织靶向性；抗体修饰载体提高了药物成本，且难以达到理想的靶向效果。近年来研究发现，外泌体可以作为载体，装载药物并递送到相邻或者远处的细胞。与被广泛研究的脂质体相比，外泌体显示出更大的优势，其具备良好的生物相容性，生物可降解性，低毒性，稳定性以及低免疫原性。制备具有膀胱靶向作用的外泌体载药体系是治疗膀胱疾病理想的解决方案。
5.因此，制备一种高效的膀胱靶向外泌体载药体系对膀胱相关疾病进行治疗是亟需的。


技术实现要素：

6.本发明的目的是要解决现有技术中存在的不足，提供一种膀胱靶向载药外泌体及应用和治疗膀胱疾病药物，通过靶向膀胱组织给药，提高膀胱疾病的治疗效果，降低药物毒副反应。
7.为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：
8.本发明的第一个目的是要提供一种膀胱靶向载药外泌体，所述膀胱靶向载药外泌
体由用于治疗膀胱疾病的药物导入到具有膀胱组织靶向性的外泌体中获得，所述具有膀胱组织靶向性的外泌体来源于肾细胞。
9.当然，肾细胞也可以进行基因修饰或改造以使其对膀胱组织具有靶向性，包括但不限于基因改造，基因修饰、基因过表达或删除、分子修饰等；肾细胞的外泌体也可以进行表面修饰或改造以使其对膀胱组织具有靶向性，包括但不限于表面蛋白修饰、表面蛋白改造、表面小分子修饰等。
10.作为本发明的优选方案，所述肾细胞包括但不限于人肾细胞、动物肾细胞、人肾癌细胞、动物肾癌细胞、诱导多能干细胞诱导的肾细胞。
11.作为本发明的优选方案，所述人肾细胞包括但不限于正常人胚肾细胞hek
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293及其衍生株：ad293，crl
‑
11268，hek293
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l，hek293
‑
t，gp2
‑
293，gp2
‑
293luc，kima，hek
‑
293
‑
6e，293a，293f，293ft，293h，293
‑
l.p，293
‑
mtlr5，293t/17，293xl
‑
htlr7，293xl
‑
htlr9，2v6.11，aav
‑
293，gp
‑
293，phix
‑
293t，293e，293et，293ad5；人胚肾细胞crl
‑
11268；正常人肾细胞hkb
‑
20，fc33，hk
‑
2c，propaka.6，tcmk
‑
1；所述动物肾细胞包括但不限于非洲绿猴肾vero及其衍生株vero
‑
e6，vreo/igrcd4，vreo/igr；非洲绿猴肾成纤维细胞cos
‑
1，cos
‑
7，cos
‑
3；非洲绿猴胚胎肾细胞marc
‑
145；非洲绿猴肾细胞cv
‑
1；永生化小鼠mkf细胞；小鼠肾细胞mc53，mrgec，tcmk
‑
1，mrtec；仓鼠的肾细胞bhk，bhk
‑
n，bhk
‑
21，bhk
‑
m；大鼠的肾细胞rk1，nrk
‑
49f，hbzy
‑
1，nrk
‑
52e。
12.作为本发明的优选方案，所述用于治疗膀胱疾病的药物包括但不限于盐酸吉西他滨、microrna、sirna、蛋白、抗体、顺铂、吉西他滨、丝裂霉素、卡介苗、阿霉素。
13.进一步地，用于治疗膀胱疾病的药物导入到具有膀胱组织靶向性的外泌体的具体步骤为：
14.1)将用于治疗膀胱疾病的药物和具有膀胱组织靶向性的外泌体放入电转杯中；
15.2)采用指数或方形波，使用50
‑
300v电压对用于治疗膀胱疾病的药物和具有膀胱组织靶向性的外泌体进行电转；
16.3)将电转产物于37℃中水浴30min后，在100000g离心力下离心120min去除游离的药物，得到纯化后膀胱靶向载药外泌体。
17.本发明的第二个目的是要提供膀胱靶向载药外泌体在治疗膀胱疾病药物制备中的应用。
18.本发明的第三个目的是要提供一种治疗膀胱疾病药物，包含上述膀胱靶向载药外泌体。
19.与现有技术相比，本发明使用肾细胞分泌的外泌体不需要作任何修饰就可以在膀胱富集，用肾细胞来源的外泌体，解决了外泌体产量的问题，具有很好的应用前景；而且用肾细胞来源的外泌体可以装载不同药物或活性分子，通过靶向膀胱组织给药，提高膀胱疾病的治疗效果，降低药物毒副反应。
附图说明
20.图1为正常人胚肾细胞hek
‑
293分泌的外泌体标志性蛋白检测图。
21.图2为正常人胚肾细胞hek
‑
293分泌的外泌体粒径分布检测图。
22.图3为pkh67标记人胚肾细胞hek
‑
293分泌的外泌体在不同组织中分布图。
23.图4为载有用于治疗膀胱疾病的药物盐酸吉西他滨的膀胱靶向外泌体抗肿瘤活性体外检测图。
24.图5为载有用于治疗膀胱疾病的药物盐酸吉西他滨的膀胱靶向外泌体抗肿瘤活性体内检测图。
具体实施方式
25.为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定发明。
26.实施例1
27.收集正常人胚肾细胞hek
‑
293(本实施例以正常人胚肾细胞hek
‑
293为例)。取正常人胚肾细胞hek
‑
293的培养液(肾细胞培养液为无外泌体血清和dmem培养基进行培养的)在2000g离心力下离心10min，取上清液；再在10000g离心力下离心30min，取上清液，弃去细胞碎片及沉淀物；将离心后的细胞培养液在100000g(g为重力加速度)离心力下离心2h，沉淀用无菌pbs重悬收集，4℃短期保存，即得膀胱靶向外泌体。提取分离所得的膀胱靶向外泌体表面标记蛋白及粒径分布如图1、图2所示。对肾细胞分泌的外泌体表达量进行测定，bca法检测肾细胞分泌的外泌体蛋白浓度为(2.85μg/μl)。
28.实施例2
29.取正常人胚肾细胞hek
‑
293分泌的外泌体，用pkh67染色，对肾细胞分泌的外泌体在体内的分布进行示踪，具体步骤如下：
30.取100μg的肾细胞hek
‑
293分泌的外泌体，与1μl pkh67 4℃避光孵育过夜，在100000g(g为重力加速度)离心力下离心2h，弃掉上清，用pbs清洗两次后，无菌pbs重悬肾细胞分泌的外泌体，经尾静脉注射入c57bl/6小鼠体内，本实施例中，雄性c57bl/6(4
‑
6周)小鼠购买于北京华阜康生物科技股份有限公司，所有小鼠均培育于spf级设施；24h后，麻醉小鼠，取小鼠的肝脏，肺，脾脏，膀胱，肾脏、胃和肠做冰冻切片，hoechst33342染细胞核后，观察肾细胞分泌的外泌体在小鼠各个器官的生物分布。结果显示：本实施例的肾细胞分泌的外泌体在膀胱组织中出现明显富集(图3)，靶向效率可高达65％
‑
90％。说明本实施例制备的膀胱靶向外泌体具有膀胱组织靶向性。
31.实施例3
32.本实施例中，选用用于治疗膀胱疾病的药物盐酸吉西他滨。
33.本实施例是将用于治疗膀胱疾病的药物导入到膀胱靶向外泌体制备膀胱肿瘤靶向治疗药物，具体操作如下：
34.1)取150μg膀胱靶向外泌体与盐酸吉西他滨混合，电转缓冲液可以为(pbs、dmem、cytomix、tris
‑
hcl)将其补足至150μl，转移至不同规格(0.2cm、0.4cm)电转杯中。采用不同波形(指数波、方形波)，使用不同的电压(50v，100v，200v，300v)分别对膀胱靶向外泌体及盐酸吉西他滨进行电转；
35.2)将电转产物于100000g离心力下超速离心120min，收集上清测载药量。结果：对于盐酸吉西他滨，150μg膀胱靶向外泌体在250v的电压下进行电转，效率最高，可达35.7％。
36.实施例4
37.本实施例进一步验证体内外实验检测载有用于治疗膀胱疾病的药物盐酸吉西他
滨的膀胱靶向外泌体对膀胱癌的治疗作用，本实施例中，balb/c nude小鼠(4
‑
6周)购买于北京华阜康生物科技股份有限公司，所有小鼠均培育于spf级设施。具体步骤如下：
38.体外实验：
39.将膀胱癌细胞biu
‑
87铺于96孔板中，每孔5
×
103个细胞，分别加入膀胱靶向外泌体、载有膀胱肿瘤治疗药物盐酸吉西他滨的膀胱靶向外泌体，mtt检测载有膀胱肿瘤治疗药物盐酸吉西他滨的膀胱靶向外泌体对膀胱癌细胞biu
‑
87的杀伤作用。在体外实验中，载有膀胱肿瘤治疗药物盐酸吉西他滨的膀胱靶向外泌体相较于单纯的膀胱靶向外泌体可以有效的杀伤肿瘤细胞，其结果如图4所示。
40.体内实验：
41.在体内实验中，建立膀胱癌模型，将5
×
106个膀胱癌细胞biu
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87注射至balb/c nude小鼠皮下，待其生长到约100mm3时，尾静脉注射载有膀胱肿瘤治疗药物盐酸吉西他滨的膀胱靶向外泌体，每3天注射一次，共注射4次，随后隔天测量肿瘤体积，肿瘤体积＝1/2
×
a
×
b2。a代表长径，b代表短径。
42.在体内实验中，如图5所示，载有膀胱肿瘤治疗药物盐酸吉西他滨的膀胱靶向外泌体，较等剂量的游离抗肿瘤药物组可显著降低小鼠的肿瘤大小。
43.对于本领域技术人员而言，显然本发明实施例不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明实施例的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明实施例。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明实施例的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明实施例内。
44.此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。