一种用于治疗高同型半胱氨酸血症的益生菌与益生元结合发酵乳及其制备方法和用途与流程

1.本发明涉及一种用于治疗高同型半胱氨酸血症的益生菌与益生元结合发酵乳及其制备方法和用途，属于微生物技术领域。


背景技术：

2.高同型半胱氨酸血症(hyperhomocystinemia，hhcy)是一个普遍的公共卫生问题，特别是在发展中国家，带来了严重的健康问题和社会经济负担。当体内叶酸(folic acid，fa)缺乏时，血液中同型半胱氨酸代谢受阻引发hhcy，其会引起大量疾病，如：高血压、脑卒中、抑郁、阿尔茨海默症和糖尿病等。因此，补充叶酸成为治疗hhcy重要手段。
3.人类自身缺乏合成叶酸的基因，只能通过外界摄取或由肠道中的微生物代谢合成来补充叶酸。人们补充叶酸的形式主要有两种，一是补充膳食来源的天然叶酸，二是补充化学合成型叶酸。
4.越来越多的研究发现了过量摄入合成型叶酸的危害，如掩盖维生素b12缺乏症、改变肝脏二氢叶酸还原酶活性、导致胎儿亚甲基四氢叶酸多态性(衰弱性疾病相关)等。与之相比，天然来源的叶酸安全性更高，且在机体代谢功能缺陷的情况下也可被机体吸收利用。
5.补充天然叶酸的传统方法是从植物组织中摄取，但叶酸极不稳定，植物组织中的叶酸经过长时间的烹煮后，会损失50％
‑
90％。因此，这就需要人们在一日三餐之余通过其它途径来补充天然叶酸。
6.乳酸菌合成的叶酸不仅安全性好，而且由产叶乳酸菌制得的发酵食品食用无需加工，叶酸含量更稳定，工艺简单且成本较低，可以作为天然叶酸的重要来源。
7.但是，现有的产叶乳酸菌产出的叶酸，不稳定，易分解，生物利用度低，无法达到高同型半胱氨酸血症的治疗量，故无法治疗高同型半胱氨酸血症，故亟需一种用于治疗高同型半胱氨酸血症的益生菌与益生元结合发酵乳及其制备方法和用途。


技术实现要素：

8.本发明所要解决的技术问题是，提供一种用于治疗高同型半胱氨酸血症的益生菌与益生元结合发酵乳及其制备方法和用途。
9.为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
10.一种用于治疗高同型半胱氨酸血症的益生菌与益生元结合发酵乳，包括植物乳杆菌klds 1.0317和低聚半乳糖；所述低聚半乳糖的浓度为2mg/100ml，其聚合度为5；所述植物乳杆菌klds 1.0317的数量为≥1
×
108cfu/ml或≥1
×
108cfu/g。
11.一种用于治疗高同型半胱氨酸血症的益生菌与益生元结合发酵乳在制备预防和/或治疗、缓解高同型半胱氨酸血症的药物、保健品或食品中的用途。
12.所述发酵乳在提高同型半胱氨酸血症的血清中叶酸水平的用途。
13.所述发酵乳在提高同型半胱氨酸血症的血清中5
‑
mthf水平的用途。
14.所述发酵乳在提高同型半胱氨酸血症的肝脏中叶酸水平的用途。
15.所述发酵乳在提高同型半胱氨酸血症的肝脏中5
‑
mthf水平的用途。
16.所述发酵乳在降低同型半胱氨酸血症的血浆中同型半胱氨酸的水平的用途。
17.一种用于治疗高同型半胱氨酸血症的益生菌与益生元结合发酵乳的制备方法，包括以下步骤：取脱脂乳以超纯水配制12％w/v的溶液，用1mol/l的naoh调节ph为7.2，然后95℃巴氏杀菌5min，然后冰水浴冷却至42℃以下；在4℃条件下，将培养至对数期的菌液于12000rpm离心10min，弃上清，使用0.90％生理盐水将菌体洗涤2次后重悬，以2％的接种量加入至灭菌的牛乳混匀，获得牛乳培养基，再加入低聚半乳糖至牛乳培养基中，在37℃下培养24h后立即冰浴，冷却备用，获得新鲜发酵乳；同时，取新鲜发酵乳冻干后备用。
18.本发明首先对植物乳杆菌klds 1.0317在mrs及含有低聚半乳糖的mrs中产叶酸能力进行评价，而后研究植物乳杆菌klds 1.0317及其与半乳低聚糖在牛乳中的产叶酸能力。本发明究运用balb/c小鼠模型对高产叶酸菌株组合发酵乳缓解叶酸缺乏状态的能力进行了体内评价。本发明的目的是筛选一种高产叶酸的益生菌组合治疗高同型半胱氨酸血症。
19.本发明提供的一种用于治疗高同型半胱氨酸血症的益生菌与益生元结合发酵乳及其制备方法和用途，本发明的益生元与益生菌复合物的有益效果：所述植物乳杆菌klds 1.0317与低聚半乳糖复合物能够有效治疗高同型半胱氨酸血症小鼠，增加高同型半胱氨酸血症小鼠血液及肝脏中叶酸及5
‑
mthf水平，降低高同型半胱氨酸血症小鼠血浆半胱氨酸水平。
20.本发明中植物乳杆菌klds 1.0317与低聚半乳糖复合物能够降低提高小鼠血清、肝脏中的叶酸及5
‑
甲基四氢叶酸(5
‑
mthf)的水平，降低血液中半胱氨酸的水平，对高同型半胱氨酸血症具有缓解作用；低聚半乳糖仅在一定程度上对上述指标产生轻微影响。而植物乳杆菌klds 1.0317与低聚半乳糖结合物与植物乳杆菌klds 1.0317相比，能够在很大程度上提升单菌的缓解效果。同时，本发明中利用大鼠口服植物乳杆菌klds 1.0317和低聚半乳糖复合物研究发现可有效降低同型半胱氨酸的浓度。本发明的植物乳杆菌klds 1.0317和低聚半乳糖复合物可用于制备缓解高同型半胱氨酸血症的功能性食品和药品，可作为高同型半胱氨酸人群的日常保健。
附图说明
21.图1为本发明不同聚合度的低聚半乳糖对植物乳杆菌klds 1.0317高产叶酸的影响图；其中，相同字母表示不同组间总叶酸含量无显著差异(p>0.05)，不同字母表示有显著差异(p<0.05)；
22.图2为本发明不同浓度的低聚半乳糖对植物乳杆菌klds 1.0317高产叶酸的影响图；其中，相同字母表示不同组间总叶酸含量无显著差异(p>0.05)，不同字母表示有显著差异(p<0.05)；
23.图3为本发明纯牛乳、植物乳杆菌klds 1.0317和植物乳杆菌klds 1.0317+gos复合物的叶酸产量图；其中，1：纯牛乳；2：植物乳杆菌klds 1.0317；3：植物乳杆菌klds 1.0317+gos复合物；相同字母表示不同组间总叶酸含量无显著差异(p>0.05)，不同字母表示有显著差异(p<0.05)；
24.图4为本发明植物乳杆菌klds 1.0317与低聚半乳糖结合物对高同型半胱氨酸血
症小鼠全血叶酸的影响图；其中，1：叶酸正常组；2：叶酸缺乏组；3：只添加gos牛乳组；4：高产叶酸的植物乳杆菌发酵组；5：高产叶酸的植物乳杆菌+gos发酵组；相同字母表示不同组间该指标无显著差异(p>0.05)，不同字母表示有显著差异(p<0.05)；a为小鼠全血的fa含量图；b为小鼠全血5
‑
mthf的含量图；图c为小鼠肝脏中fa含量图；图d为小鼠肝脏中5
‑
mthf的含量图；
25.图5为本发明植物乳杆菌klds 1.0317与低聚半乳糖结合物对高同型半胱氨酸血症小鼠血浆半胱氨酸的含量的影响图；其中，1：叶酸正常组；2：叶酸缺乏组；3：只添加gos牛乳组；4：高产叶酸的植物乳杆菌发酵组；5：高产叶酸的植物乳杆菌+gos发酵组；相同字母表示不同组间血浆hcy浓度无显著差异(p>0.05)，不同字母表示有显著差异(p<0.05)。
具体实施方式
26.下面结合附图对本发明作更进一步的说明。
27.实施例1
28.本实施例中，植物乳杆菌klds 1.0317，保藏于东北农业大学菌种保藏中心。低聚半乳糖来源于飞鹤公司。本发明中的植物乳杆菌klds 1.0317的现有技术来源为：体外评估十株乳杆菌对免疫细胞活性的影响[j].食品工业科技，2018，01(39)：312
‑
317。
[0029]
一种用于治疗高同型半胱氨酸血症的益生菌与益生元结合发酵乳，包括植物乳杆菌klds 1.0317和低聚半乳糖；所述低聚半乳糖的浓度为2mg/100ml，其聚合度为5；所述植物乳杆菌klds 1.0317的数量为≥1
×
108cfu/ml。
[0030]
将不同聚合度(3、4、5、6、7、8)的低聚半乳糖gos分别添加到mrs液体培养基中，然后将植物乳杆菌klds 1.0317按2％的接种量接种到不同的培养基中，利用高效液相色谱法分析叶酸水平，观察不同低聚糖含量对植物乳杆菌klds 1.0317产叶酸水平的影响，从而确定最适添加浓度。
[0031]
植物乳杆菌klds 1.0317在聚合度为5时所得发酵液中叶酸含量很高，fa达到0.393μg/ml，5
‑
mthf达到0.223μg/ml，具体如图1所示。结果表明，相较于其他聚合度的低聚糖，通过植物乳杆菌klds 1.0317发酵的mrs中叶酸显著增加，聚合度为5时更适合植物乳杆菌klds 1.0317利用而高产叶酸。
[0032]
将确定效果优良的低聚半乳糖按照不同浓度分别添加到mrs液体培养基中，使其质量浓度分别为0、1％、2％、3％、4％、5％，然后将植物乳杆菌klds 1.0317按2％的接种量接种到不同的培养基中，对照组为将植物乳杆菌klds 1.0317同样按2％的接种量接种到无任何添加物的mrs液体培养基中，利用高效液相色谱法分析叶酸水平，观察不同低聚糖含量对植物乳杆菌klds 1.0317产叶酸水平的影响，从而确定最适添加浓度。
[0033]
植物乳杆菌klds 1.0317在低聚半乳糖质量浓度为2％时所得发酵液中叶酸含量很高，fa达到0.760μg/ml，5
‑
mthf达到0.360μg/ml，具体如图所示2。结果表明，相较于其他质量浓度的低聚被半乳糖，通过植物乳杆菌klds 1.0317发酵的mrs中叶酸显著增加，质量浓度为2％(2mg/100ml)时更适合植物乳杆菌klds 1.0317利用而高产叶酸。
[0034]
在4℃条件下，将菌液于12000rpm离心10min，弃上清，使用0.90％生理盐水将菌体洗涤2次后，加入牛乳混匀制得菌悬液(>8.00lg cfu/ml)，以2％的接种量将上述菌悬液接种于超高温灭菌(uht)牛乳中，再加入gos，gos的浓度为2mg/100ml，gos的聚合度为5，在37
℃下培养24h后立即冰浴，冷却备用。
[0035]
同时，取新鲜发酵乳冻干后动物实验备用。
[0036]
植物乳杆菌klds 1.0317与低聚半乳糖的复合物组合发酵乳产生的叶酸含量很高，达到0.810μg/ml，具体如图3所示。结果表明，通过植物乳杆菌klds 1.0317与低聚半乳糖制得的发酵乳叶酸含量显著增加，而且所产叶酸为天然无毒的，产物形式具备还原性，更易于吸收，可以替代传统工艺化学合成的叶酸补充剂。
[0037]
下表1为图3的分组情况：
[0038]
表1分组情况
[0039][0040][0041]
植物乳杆菌klds 1.0317与低聚半乳糖复合物发酵乳治疗同型半胱氨酸血症动物模型。
[0042]
实验动物及分组设计：
[0043]
首先将30只，3周龄的雌性balb/c小鼠，随机分成2组：叶酸正常对照组(folate control group)6只、叶酸缺乏对照组(folate deficient control group)24只，叶酸缺乏对照组饲喂叶酸缺乏饲料，叶酸正常对照组饲喂正常饲料，饲料配方见表2所示，由北京科澳协力公司制造提供。14d(建模期)后，将饲喂叶酸缺乏饲料的24只小鼠，随机分成4组，正常组小鼠继续饲喂正常饲料，分组情况如表3所示。
[0044]
表2小鼠饲料配方
[0045]
成分叶酸缺乏饲料(g/kg)正常饲料(g/kg)酪蛋白200200l
‑
胱氨酸33玉米淀粉397.486397.486麦芽糖糊精132132蔗糖100100纤维素5050大豆油7070重酒石酸胆碱2.52.5ain矿物质3535ain维生素(不含叶酸)1010bht0.0140.014叶酸00.002
[0046]
表3动物实验分组与饲喂方法
[0047]
[0048][0049]
实验末期收集各组小鼠于眼球静脉丛全血，之后脱颈处死小鼠，在冰台上摘取小鼠肝脏组织。血液样本3500r/min离心15min，取上清，
‑
80℃冻存，用于血液指标分析。肝脏组织取出后迅速于预冷的生理盐水中漂洗去血，于液氮中速冻并转移于
‑
80℃冻存，后续制成肝匀浆测定相关指标。
[0050]
植物乳杆菌klds 1.0317与低聚半乳糖复合物发酵乳提高高同型半胱氨酸血症小鼠的血清及肝脏的叶酸、5
‑
mthf水平：
[0051]
吸取上清液于1.5m l离心管内，得血清样品，按照相应测试试剂盒提供的测定方法测定血清及肝脏中叶酸、5
‑
mthf的含量。
[0052]
小鼠全血和肝脏中fa的浓度如图4中a和c所示。实验组的全血fa浓度与第2组相比显著提高(p<0.05)，但不及对照组(第1组是第2组的2.85倍)。第5组叶酸浓度显著高于第3组和第4组(p<0.05)分别是第3组，第4组的1.39和1.22倍。而肝脏中叶酸浓度在第3组与第4组之间无显著差异(p>0.05)，叶酸浓度最高的是第5发酵组，仅次于叶酸正常组。
[0053]
小鼠全血和肝脏中5
‑
mthf的浓度如图4中b和d所示。实验组的全血5
‑
mthf浓度与第2组相比显著提高(p<0.05)，但显著低于对照组。第5组效果最佳，5
‑
mthf的浓度最高，显著高于第3组和第4组。而全血中5
‑
mthf的浓度在第3与第4组之间无显著差异(p>0.05)。
[0054]
研究发现补充低聚半乳糖及植物乳杆菌均能提高血液中与肝脏中叶酸与5
‑
mthf的浓度，但是低聚半乳糖能够显著促进植物乳杆菌产生叶酸，因此联合效果最佳。
[0055]
植物乳杆菌klds 1.0317与低聚半乳糖复合物发酵乳降低高同型半胱氨酸血症小鼠血浆中半胱氨酸的含量：
[0056]
收集到的血浆样本，使用小鼠hcy检测试剂盒(北京诚林生物有限公司)进行测定，按照说明书进行操作。
[0057]
在第42d末，各组小鼠的血浆hcy含量如图5所示。与第1组相比，第2组小鼠血浆中的hcy浓度显著升高(2.29倍)(p<0.05)。与叶酸缺乏组相比，补充含gos的牛乳，高产叶酸植物乳杆菌发酵乳和高产叶酸植物乳杆菌+gos发酵乳后，血浆中hcy浓度显著下降(p<0.05)。但与单一处理组相比，含有gos的牛乳发酵组更有效降低了血浆中hcy浓度，具有显著性差异(p<0.05)。
[0058]
实施例2
[0059]
一种用于治疗高同型半胱氨酸血症的益生菌与益生元结合发酵乳，包括植物乳杆菌klds 1.0317和低聚半乳糖；所述低聚半乳糖的浓度为2mg/100ml，其聚合度为5；所述植
物乳杆菌klds 1.0317的数量为≥1
×
108cfu/g。
[0060]
一种用于治疗高同型半胱氨酸血症的益生菌与益生元结合发酵乳在制备预防和/或治疗、缓解高同型半胱氨酸血症的药物、保健品或食品中的用途。
[0061]
所述发酵乳在提高同型半胱氨酸血症的血清中叶酸水平的用途。
[0062]
所述发酵乳在提高同型半胱氨酸血症的血清中5
‑
mthf水平的用途。
[0063]
所述发酵乳在提高同型半胱氨酸血症的肝脏中叶酸水平的用途。
[0064]
所述发酵乳在提高同型半胱氨酸血症的肝脏中5
‑
mthf水平的用途。
[0065]
所述发酵乳在降低同型半胱氨酸血症的血浆中同型半胱氨酸的水平的用途。
[0066]
一种用于治疗高同型半胱氨酸血症的益生菌与益生元结合发酵乳的制备方法，包括以下步骤：取脱脂乳以超纯水配制12％w/v的溶液，用1mol/l的naoh调节ph为7.2，然后95℃巴氏杀菌5min，然后冰水浴冷却至42℃以下；在4℃条件下，将培养至对数期的菌液于12000rpm离心10min，弃上清，使用0.90％生理盐水将菌体洗涤2次后重悬，以2％的接种量加入至灭菌的牛乳混匀，获得牛乳培养基，再加入低聚半乳糖至牛乳培养基中，在37℃下培养24h后立即冰浴，冷却备用，获得新鲜发酵乳；同时，取新鲜发酵乳冻干后备用。
[0067]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技能的人在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
[0068]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。