一种肿瘤微环境酸响应深层渗透纳米凝胶及其应用的制作方法

1.本发明属于药物领域，具体涉及一种肿瘤微环境酸响应深层渗透纳米凝胶及其应用。


背景技术：

2.癌症是世界上最常见的疾病之一，具有高转移率和高死亡率。近年来，越来越多的科学 家把目光投向了基于纳米技术的药物递送技术，并且已经取得了激奋人心的进展。纳米药物 递送系统可以有效改善难溶药物在水中的溶解度，提高药物的稳定性，避免药物与血液中多 种蛋白的结合，从而延长血液循环时间，提高生物利用度，同时通过增强的渗透和滞留效应 (epr)被动靶向效应富集于肿瘤，增强对肿瘤的治疗效果。目前，已获批上市的代表性纳米药 物有多柔比星脂质体和紫杉醇白蛋白纳米粒等，他们多是将药物装载在磷脂双分子层或白蛋 白颗粒中，增强了药物的药代动力学参数，并在一定程度促进药物在肿瘤部位的富集，减少 药物在非靶标组织的蓄积，增强抗肿瘤效果，降低毒副作用，提高安全性。
3.然而大量研究表明，虽然纳米药物可以增强药物在肿瘤部位的富集，但是药物大部分只 分布在肿瘤外层，仍难以在肿瘤部位有效扩散或渗透。无法进入肿瘤内部达到有效浓度，也 就无法彻底根除全部肿瘤细胞。这样不仅会使存活下来的肿瘤细胞复发，同时还极易诱导耐 药肿瘤细胞的产生。因此，构建具有肿瘤深层渗透的纳米药物递送系统，促进药物在肿瘤深 层渗透的效果是进一步提升肿瘤治疗效果的关键问题。纳米药物在肿瘤富集后需要通过一系 列的空隙渗透到肿瘤组织中，从而被深部细胞摄取，发挥药效。在渗透过程中，纳米药物的 尺寸将显著影响其在肿瘤部位的扩散速率，进而影响其渗透能力。小尺寸纳米药物不会受到 细胞间隙大小的限制，具有更快的扩散速率，从而具有更强的肿瘤组织渗透能力。


技术实现要素：

4.为了解决目前纳米药物在肿瘤部位渗透能力不佳的问题，本发明提供一种尺寸可变化的 纳米递送系统，以较大的粒径在血液中循环保证药物稳定性，通过epr效应富集于肿瘤部位 后，针对肿瘤中的微酸环境(ph 6.5)响应释放出尺寸较小的载药纳米复合物，促进药物向肿瘤 深部的渗透。
5.本发明涉及一种能够促进药物肿瘤深层渗透的肿瘤微环境酸响应纳米凝胶，解决药物难 以深层渗透到肿瘤组织内部的问题。
6.本发明提供了一种肿瘤微环境酸响应深层渗透纳米凝胶及其应用，可在肿瘤部位响应释 放尺寸较小的纳米药物，促进药物在肿瘤深部的渗透，充分发挥药物效果。
7.本发明一个方面提供了一种酸响应纳米凝胶载体，所述纳米凝胶载体由双键化透明质酸、 双键化环糊精以及2,2-二甲基丙烯酰氧基-1-乙氧基丙烷在自由基聚合引发剂的作用下聚合获 得；
8.双键化透明质酸通过以丙烯酸酐类化合物在透明质酸上修饰获得；
9.双键化环糊精通过烯烃酰氯类化合物修饰环糊精类化合物后获得。
10.进一步地，所述的丙烯酸酐类化合物选自甲基丙烯酸酐、乙基丙烯酸酐、丙烯酸酐中的 一种或几种。
11.进一步地，透明质酸的分子量为5000-500000。例如5000、8000、10000、20000、30000、 40000、50000、60000、70000、80000、90000、100000、200000、300000、400000。
12.进一步地，透明质酸和丙烯酸酐类化合物的摩尔比为1:1-1:6。例如，1:1、1:2、1:3、1:4、 1:5、1:6。
13.进一步地，环糊精类化合物选自β环糊精、羟丙基β环糊精中的一种或几种。
14.进一步地，烯烃酰氯类化合物选自丁烯酰氯、4-戊烯酰氯、丙烯酰氯、甲基丙烯酰氯中 的一种或几种。
15.进一步地，自由基聚合引发剂选自过氧化氢、过硫酸铵、过硫酸钾、过氧化苯甲酰、偶 氮二异丁腈、偶氮二异庚腈和偶氮二异丁酸二甲酯、4,4
′‑
偶氮双(氰基戊酸)、过氧化苯甲酰 叔丁酯。
16.进一步地，所述纳米凝胶的平均水合粒径为150-200nm。
17.本发明另一个方面提供了一种负载活性成分的酸响应纳米凝胶，其以上述酸响应纳米凝 胶载体作为活性成分载体，且在双键化环糊精中包合活性成分。
18.进一步地，所述活性成分选自具有抗肿瘤活性的成分，或者选自具有检测作用的成分。
19.进一步地，抗肿瘤活性的成分选自抗肿瘤药物或免疫调节药。
20.进一步地，具有检测作用的成分选自荧光染料中二烷基碳菁类染料(dir)、吲哚菁绿、香 豆素6、cy系列染料的一种或几种。
21.本发明又一个方面提供了酸响应纳米凝胶载体的制备方法，其包括以下步骤：
22.s1)将透明质酸与丙烯酸酐类化合物在碱性水溶液中反应，获得双键化透明质酸；
23.s2)将环糊精类化合物溶解于有机溶剂中，调节ph值为碱性后与烯烃酰氯类化合物反 应获得双键化环糊精；
24.s3)制备或者获得2,2-二甲基丙烯酰氧基-1-乙氧基丙烷；；
25.s4)自由基聚合法制备药物装载的纳米凝胶，将双键化透明质酸、双键化环糊精和2,2
‑ꢀ
二甲基丙烯酰氧基-1-乙氧基丙烷溶于碱性溶液中，加入自由基聚合引发剂反应，获得纳米凝 胶。
26.本发明又一个方面提供了负载活性成分的酸响应纳米凝胶的制备方法，其包括以下步骤：
27.s1)将透明质酸与丙烯酸酐类化合物在碱性水溶液中反应，获得双键化透明质酸；
28.s21)将环糊精类化合物溶解于有机溶剂中，调节ph值为碱性后与烯烃酰氯类化合物反 应获得双键化环糊精；
29.s22)将活性成分溶解并与双键化环糊精进行孵育，获得活性成分与双键化环糊精的包合 物；
30.s3)制备或者获得2,2-二甲基丙烯酰氧基-1-乙氧基丙烷；
31.s4)自由基聚合法制备药物装载的纳米凝胶，将双键化透明质酸、活性成分与双键
化环 糊精的包合物和2,2-二甲基丙烯酰氧基-1-乙氧基丙烷溶于碱性溶液中，加入自由基聚合引发 剂反应，获得纳米凝胶。
32.优选地，所述步骤s1)中透明质酸的分子量为5000-500000。
33.优选地，所述步骤s1)在水溶剂中进行反应，更优选地，所述水溶液选自生理盐水、磷 酸盐缓冲液和去离子水中的一种或几种。
34.优选地，所述步骤s1)中碱性条件的ph范围选自8.0-12.0。
35.优选地，所述步骤s1)中反应结束后采用截留分子量为1000-10000的透析袋透析去除小 分子物质。
36.优选地，所述步骤s1)中透明质酸和丙烯酸酐类化合物的摩尔比为1:1-1:6。例如1:1、 1:2、1:3、1:4、1:5、1:6。
37.优选地，所述步骤s1)中丙烯酸酐类化合物选自甲基丙烯酸酐、丙烯酸酐、乙基丙烯酸 酐中的一种或几种。
38.优选地，所述步骤s2)或者s21)中环糊精类化合物选自β环糊精、羟丙基β环糊精中的 一种或几种。进一步地，环糊精类化合物上还可以包含靶向肿瘤的化合物，例如叶酸。
39.优选地，所述步骤s2)或者s21)中烯烃酰氯类化合物选自乙酰氯、苯甲酰氯、丙烯酰氯、 氯乙酰氯中的一种或几种。
40.优选地，所述步骤s2)或者s21)中环糊精类化合物与烯烃酰氯类化合物的摩尔比为 1:5-1:10，例如1:6、1:7、1:8、1:9。
41.优选地，所述步骤s22)中活性成分选自抗肿瘤活性成分或检测试剂，更优选地，所述抗 肿瘤活性成分选自抗肿瘤药物、免疫调节药。例如活性成分选自茶多酚。
42.优选地，所述步骤s3)中采用制备的方法获得2,2-二甲基丙烯酰氧基-1-乙氧基丙烷，将 2,2-二甲氧基丙烷、甲基丙烯酸羟乙酯和对甲基苯磺酸在有机溶剂中反应，反应完全后去除溶 剂，纯化后干燥。
43.更优选地，步骤s3)中用硅胶柱层析法洗脱纯化。
44.更优选地，所述步骤s3)中洗脱纯化的方法为以体积比为80-90:12-16:1的正己烷、乙酸 乙酯和三乙胺的的洗脱液进行洗脱。
45.优选地，所述步骤s4)中所述引发剂选自过氧化氢、过硫酸铵、过硫酸钾、过氧化苯甲 酰、偶氮二异丁腈、偶氮二异庚腈和偶氮二异丁酸二甲酯中的一种或几种。
46.优选地，所述步骤s4)中反应温度为60-80℃。
47.优选地，所述步骤s4)中反应在惰性气体条件下进行反应。
48.本发明又一个方面提供了上述酸响应纳米凝胶载体在制备预防或治疗肿瘤的药物或用于 制备肿瘤检测试剂的载体中的应用。
49.本发明又一个方面提供了负载活性成分的酸响应纳米凝胶的在制备预防或治疗肿瘤的药 物或在制备用于肿瘤检测试剂中的应用。
50.本发明再一个方面提供了一种预防或治疗肿瘤的药物或用于肿瘤检测试剂，其包含治疗 有效量的上述负载活性成分的酸响应纳米凝胶。
51.本发明再一个方面提供了一种预防或治疗肿瘤的方法，所述方法包含将负载活性成分的 酸响应纳米凝胶施用于受试者的步骤。
52.本发明再一个方面提供了一种检测肿瘤的方法，所述方法包含将负载活性成分的
酸响应 纳米凝胶施用于受试者的步骤。
53.本发明的有益效果在于：
54.(1)本发明制备的纳米凝胶具有良好的酸响应性能及装载药物能力，有利于纳米凝胶在 肿瘤微环境酸响应释放药物。
55.(2)本发明制备的响应纳米凝胶具有良好的生物相容性，在药物释放领域具有广阔的应 用前景。
56.(3)本发明制备的响应纳米凝胶可在肿瘤微环境响应释放小尺寸药物复合物，具有优异 的肿瘤渗透能力，利于增强药物的抗肿瘤作用。
附图说明
57.图1为(a)ham合成路线和(b)核磁氢谱图。
58.图2为(a)hcd-a合成路线和(b)核磁氢谱图。
59.图3为(a)dmaep合成路线和(b)核磁氢谱图。
60.图4为(a)ng在ph 7.4pbs中孵育24h后的粒径和(b)透射电镜图。
61.图5为(a)ng在ph 6.5的pbs中孵育24h后的粒径和(b)透射电镜图。
62.图6为(a-b)ng分别于(a)b16f10和(b)dc2.4细胞孵育24h后，细胞的存活情况。
63.图7为ng与血细胞孵育后，通过检测血红蛋白浓度评估ng可能引起的溶血程度。
64.图8为egcg@ng分别在ph 7.4和ph 6.5的pbs中的药物释放曲线。
65.图9为dir、dir@hcd-a、dir@ng和dir@nglysis(预先在ph 6.5pbs中孵育24h) 与b16f10细胞孵育1h、4h和24h后，流式细胞仪检测细胞的荧光强度(n＝3,p《0.05)。
66.图10为ifn-γ刺激的b16f10细胞分别与egcg(e)、egcg(e)、e@hcd-a、e@ng和 e@nglysis(预先在ph 6.5pbs中孵育24h)孵育24h后，流式细胞仪检测细胞表面的pd-l1 表达(n＝3,p《0.05)。
67.图11为dir、dir@hcd-a、dir@ng和dir@nglysis分别与多细胞肿瘤球孵育8h后， 荧光分布和渗透情况。
68.图12为荷瘤小鼠分别经egcg和egcg@ng治疗后的肿瘤生长曲线(n＝7,p《0.05)。
具体实施方式
69.为了使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面对本发明的具体实施方 式做详细的说明，但不能理解为对本发明的可实施范围的限定。
70.术语“治疗有效量”是有效治疗、缓解、改善、减轻癌症的一种或多种症状或特征、延 迟其发作、抑制其进展、降低其严重程度和/或减少其发生率的量。
71.术语“抗肿瘤药物”是指通过物理或化学的方式杀死肿瘤细胞或诱导肿瘤细胞凋亡的药 物，并且所述抗肿瘤药物能够被包合在环糊精内。
72.术语“免疫调节药”是指作用于免疫系统，并通过免疫系统的起效的一类药物，其能够 对激活免疫系统，引发免疫反应，进而对肿瘤进行抑制。其并不直接通过化学或者物理的方 法杀死肿瘤细胞，或不直接引起肿瘤细胞的凋亡。
73.术语“丙烯酸酐类化合物”是指所述化合物中具有丙烯酸酐结构的化合物。
74.术语“环糊精类化合物”是指所述化合物中具有环糊精母核的化合物。
75.术语“烯烃酰氯类化合物”是指具有双键基团的酰氯化合物。
76.实施例1
77.甲基丙烯酸酯透明质酸的制备：
78.将透明质酸(ha,0.5g)溶于50ml去离子水中，在冰浴条件下滴入0.59ml甲基丙烯酸酐。 然后用1m氢氧化钠调节ph值至8.0。反应24h后，将反应液在去离子水中采用截留分子量 mwco＝10000的透析袋透析72h，每隔8h换一次透析介质，随后收集透析袋内液体冷冻干燥 成甲基丙烯酸酯透明质酸(ham)。反应式如图1a所示。
79.实验结果：本实施例中制备的ham的核磁氢谱如图1b所示。
80.数据如下：(400mhz,d2o-d2,δ),1.81(3h,h-2,c＝c-ch3),1.88(3h,h-g),3.21-3.79(10h, h-b,c,d,e,f,b’,c’,d’,e’),4.32-4.42(2h,h-a,a’),5.61-6.05(2h,h-1,ch2＝c)。
81.实施例2
82.丙烯酸酯羟丙基β环糊精的制备：
83.羟丙基β环糊精(hp-β-cd,1g，0.65mmol)和三乙胺(665μl)混合在10ml冰浴的dmf中，然 后滴加丙烯酰氯(412mg，4.55mmol)到溶液中。在氮气保护中搅拌24h后，将反应液过滤并加 入乙醚沉淀。收集沉淀物并洗涤三次，真空干燥24h得丙烯酸酯羟丙基β环糊精(hcd-a)。反 应式如图2a所示。
84.实验结果：本实施例中制备的hcd-a的核磁氢谱如图2b所示。
85.数据如下：(400mhz,d2o-d2,δ),1.02(3h,h-i),3.37-4.16(9h,h-b,c,d,e,f,g,h),4.95(1h, h-a),5.92-6.34(3h,h-1,ch＝ch2)。
86.实施例3
87.酸响应交联分子2,2-二甲基丙烯酰氧基-1-乙氧基丙烷的制备：
88.将甲基丙烯酸羟乙酯(hema,2g)、2,2-二甲氧基丙烷(dmop,5g)和对甲基苯磺酸(ptsa, 60mg)加入到15ml二氯甲烷中。在氮气保护中室温反应24h后，旋转蒸发除去二氯甲烷得粗 产物。粗产物采用柱层析法，以85：14：1的正己烷/乙酸乙酯/三乙胺为洗脱剂进一步纯化得 终产物2,2-二甲基丙烯酰氧基-1-乙氧基丙烷(dmaep)。反应式如图3a所示。
89.实验结果：本实施例中制备的dmaep的核磁氢谱如图3b所示。
90.数据如下：(400mhz,cdcl
3-d,δ),1.40(6h,h-5,c(ch3)2),1.95(6h,h-1,c＝c-ch3),3.72 (4h,h-4,o-ch
2-c),4.28(4h,h-3,c-ch
2-o),5.58-6.12(4h,h-2,ch2＝c)。
91.实施例4
92.肿瘤微环境酸响应载茶多酚深层渗透纳米凝胶的制备：
93.(1)将茶多酚(egcg,2.4mg)溶于2ml乙醇，随后加入到含20mg hcd-a的2ml去离子水 中。将混合物在室温下搅拌1h，随后真空干燥得茶多酚-丙烯酸酯羟丙基β环糊精包合物 (egcg@hcd-a)。
94.(2)将上述egcg@hcd-a与40mg ham和80mg dmaep混合于50ml去离子水中，并加入 40mg过硫酸钾、160mg碳酸氢钠和24ml异丙醇，在氮气保护中于70℃下搅拌反应4h，收集得 到纳米凝胶。
95.(3)将纳米凝胶置于透析袋(截留分子量mwco＝10000)在pbs中透析12h，收集透析袋中 纯净的载茶多酚纳米凝胶(egcg@ng)。利用动态光散射仪检测纳米凝胶的水合粒径，
利用 透射电镜观察纳米凝胶的形态。
96.实验结果：如图4a所示，纳米凝胶的平均水合粒径约为170.99nm。如图4b所示透射电镜 图展现出纳米凝胶呈现规则球形。
97.实施例5
98.肿瘤微环境酸响应载茶多酚深层渗透纳米凝胶的酸响应尺寸变化的检测：
99.将egcg@ng分散在ph6.5的pbs溶液中24h，得酸裂解后的载egcg纳米凝胶 (egcg@nglysis)，利用动态光散射仪检测纳米凝胶的水合粒径，利用透射电镜观察纳米凝胶 的形态。
100.实验结果：如图5a所示，纳米凝胶的平均水合粒径增大至约为220.20nm，粒径峰由单峰 变为双峰，出现约为24.36nm的小尺寸颗粒。如图5b所示，透射电镜图展现出纳米凝胶呈现 不规则的膨胀状态，周围出现的小尺寸颗粒证明纳米凝胶可在微酸环境下释放出小尺寸载药 环糊精,。
101.实施例6
102.肿瘤微环境酸响应深层渗透纳米凝胶的生物相容性的评估：
103.(1)将20mg hcd-a、40mg ham和80mg dmaep混合于50ml去离子水中，并加入40mg 过硫酸钾、160mg碳酸氢钠和24ml异丙醇，在氮气保护中于70℃下搅拌反应4h，收集得到纳 米凝胶。
104.(2)然后将纳米凝胶置于透析袋(截留分子量mwco＝10000)在pbs中透析12h，收集透析 袋中纯净的纳米凝胶(ng)。
105.(3)以b16f10和dc2.4细胞为研究对象，测定空白纳米凝胶的体外细胞毒性。将5000个/ 孔的细胞接种于96孔板中培养24h，然后用含有不同浓度的ng(0.1,1,10,50,500μg/ml)的新 鲜培养基代替培养液。24h后加入cck-8(10μl)试剂继续孵育2h。通过使用酶标仪读取450nm 处的吸光度来评估细胞活性。
106.实验结果：如图6a和6b所示，在不同浓度的ng(0.1,1,10,50,500μg/ml)下，细胞存活 率都高于90％，说明所制备空白纳米凝胶细胞毒性较低，具有较好的生物相容性。
107.实施例7
108.肿瘤微环境酸响应深层渗透纳米凝胶对红细胞溶血效果的检测：
109.(1)取c57bl/6j小鼠红细胞，在4℃、3500rpm离心5min后，用冷生理盐水洗涤3次。
110.(2)将红细胞分别加入实施例6中含有不同浓度ng(0.001、0.01、0.1、1和10mg/ml)的冷 生理盐水中，调整红细胞的最终浓度为2％(w/v)。
111.(3)37℃孵育4h后，用酶标仪测定540nm处上清液的吸光值。
112.溶血水平由以下公式计算：
[0113][0114]
其中a
saline
和a
h2o
分别为生理盐水和纯水处理的红细胞在0％(阴性)和100％(阳性)溶血时 的吸光值。
[0115]
实验结果：如图7所示，纯水会导致100％的红细胞溶血释放血红蛋白，而空白纳米凝胶 的溶血水平与生理盐水相当，可以忽略不计(《1％)，这表明空白纳米凝胶在血液循环过程中对 红细胞基本无害，具有良好的生物相容性。
到纳米凝胶。
[0134]
(3)然后将纳米凝胶置于透析袋(截留分子量mwco＝10000)在pbs中透析12h，收集透析 袋中纯净的载茶多酚纳米凝胶(egcg@ng)。
[0135]
(4)将egcg@ng分散在ph6.5的pbs溶液中24h，得酸裂解后的载egcg纳米凝胶 (egcg@nglysis)。
[0136]
(5)将b16f10细胞105个/孔的密度接种于6孔板中，在经过干扰素-γ(5ng/ml)处理2h后， 分别继续加入egcg、egcg@hcd-a、egcg@ng和egcg@nglysis，egcg浓度为20μg/ml。
[0137]
(6)收集细胞，用荧光标记的抗pd-l1抗体对细胞进行染色，并用流式细胞仪检测荧光强 度分析pd-l1的表达。
[0138]
实验结果：如图10所示，干扰素-γ诱导肿瘤细胞的pd-l1表达上升至3.1倍。egcg能够降 低干扰素-γ诱导肿瘤细胞的pd-l1表达上升，而与天然egcg、egcg@hcd-a和egcg@ng 相比，egcg@nglysis对pd-l1的抑制作用更强，可降低至干扰素-γ组的0.58倍。
[0139]
实施例11
[0140]
肿瘤微环境酸响应深层渗透纳米凝胶对肿瘤球的渗透效果的检测：
[0141]
(1)将80μl含1％(w/v)无菌琼脂糖的1m磷酸盐缓冲液预涂于48孔板中。
[0142]
(2)接种500μl b16f10细胞悬液(5
×
104个/孔)，培养6～8天。
[0143]
(3)当多细胞小球直径达到200μm后，选择均匀致密的细胞球体，分别用实施例9中的dir、 dir@hcd-a、dir@ng和dir@nglysis与细胞孵育8h，浓度为5μg dir/ml。
[0144]
(4)多细胞小球用4％多聚甲醛固定30min，然后用激光共聚焦扫描显微镜观察荧光分布及 渗透情况。
[0145]
实验结果：如图11所示，可观察到游离dir的荧光信号在多细胞小球边缘有少量的聚集， 而dir@hcd-a组中的荧光较强并且可以扩散至整个球体，提示hcd-a具有良好的渗透作用。 同时，与游离的dir相比，dir@ng的荧光强度有所改善，但是荧光也仅聚集在细胞球外层。 值得注意的是，经dir@nglysis处理后，可观察到显著增强的荧光遍及细胞球，这表明在酸 响应的情况下，从纳米凝胶释放的小尺寸hcd-a包合物可以进一步有效地渗透到深层肿瘤 中。
[0146]
实施例12
[0147]
肿瘤微环境酸响应载茶多酚深层渗透纳米凝胶治疗小鼠肿瘤的效果的检测：
[0148]
(1)6周龄雌性c57bl/6j小鼠侧背皮下注射b16f10细胞(1
×
105个/只)。
[0149]
(2)当肿瘤体积达到约50mm3时，将小鼠随机分为7组。
[0150]
(3)静脉注射含6mg egcg/kg的egcg溶液或egcg@ng纳米凝胶，每3天给药一次，共4 次。隔日记录小鼠肿瘤长(l)和宽(w)。
[0151]
(4)肿瘤体积按l
×
w2/2计算，出现死亡迹象或肿瘤体积超过2000mm3即为死亡。
[0152]
实验结果：如图12所示，egcg单独治疗的小鼠肿瘤在第22天仅将肿瘤抑制至对照组的 67.01％，而egcg@ng可增强egcg的抗肿瘤效果，将肿瘤体积抑制为对照组的37.58％，说 明肿瘤微环境酸响应载茶多酚纳米凝胶可以通过增强药物在肿瘤中的渗透来提高抑制肿瘤效 果。