一种从传统补血调经中药复方中提取天然黄体酮的方法及应用

本发明属于中药提取
技术领域：
，具体涉及一种从传统补血调经中药复方中提取天然黄体酮的方法及应用。
背景技术：
：黄体酮(progesterone)，又名孕酮、助孕素、孕烯二酮，为体内存在的一种天然孕激素。天然黄体酮在临床上应用十分广泛，用于治疗继发性闭经、功能性子宫出血、黄体期支持、早产、黄体功能不足、经前综合症、习惯性流产、先兆性流产。且黄体酮在体外受精—胚胎移植术(ivf)中起着重要的作用，是维持妊娠必不可少的。另外，随着人们生活水平的提高，越来越多的妇女在绝经后补充雌激素以提高生活质量，即激素补充疗法(hormonereplacementtherapy，hrt)，在激素补充疗法中，同时服用孕激素类药物能防止长期服用雌激素所引起的子宫内膜增生，降低因单用雌激素所引起的绝经后妇女患子宫内膜癌的风险，且能更好地预防骨质疏松与牙周疾病。在激素补充疗法中，应用合成孕激素类药物易产生患者高密度脂蛋白(hdl)改变、干扰糖代谢，以及头痛、情绪改变、胎儿男性化、致畸等副作用。黄体酮是一种体内存在的天然孕激素，不易产生合成孕激素类药物的副作用，因此，在hrt疗法中天然黄体酮制剂有着极大的临床需求。随着ivf和hrt的更广泛应用，黄体酮的临床应用价值会越来越大。四物汤作为中医传统汤剂在宋代《太平惠民合剂局方》中就有记载，最初用于治疗外科失血，后来一些医家在四物汤的基础上通过添加其他中药材形成了桃红、加味、香附四物汤等，在肾虚血瘀、痛经、月经推迟等妇科疾病上有较广泛的应用。近年来，围绕四物汤及其衍化方在月经、盆腔炎、痛经等妇科疾病上有很广泛的研究。但关于四物汤在影响小鼠血清孕酮、雌激素含量、子宫湿重等方面的应用，鲜有报道。技术实现要素：为了解决现有技术存在的以上问题，本发明提供了一种从传统补血调经中药复方中提取天然黄体酮的方法及应用。本发明从由熟地、当归、白芍、川芎组成的传统补血调经中药复方中，提取得到天然黄体酮成分，能有效提高血清的孕激素含量，且无明显的副作用。本发明所采用的技术方案为：一种从传统补血调经中药复方中提取天然黄体酮的方法，包括如下步骤：(1)分别取当归、白芍、川芎和熟地，切成小块，备用：(2)将切成小块的各中药混合，加入植物油进行浸泡处理；(3)浸泡完成后，过滤，滤液即为含天然黄体酮的中药提取液(四物汤药材油浸物)。当归、白芍、川芎和熟地的重量配比为0.5-3：1-4：1-11：0.5-5。当归、白芍、川芎和熟地的重量配比为1：3：9：4。步骤(2)中，所述植物油为橄榄油、葵花籽油、芝麻油、花生油、亚麻籽油中的任意一种或多种。步骤(2)中，所述中药总质量占植物油的质量分数为1-45％。步骤(2)中，所述中药总质量占植物油的质量分数为5％。步骤(2)中，所述浸泡处理的时间为1-12个月。所述浸泡处理的时间为3个月。所述方法提取得到的含天然黄体酮的中药提取液(四物汤药材油浸物)在制备提高血清孕酮浓度药物中的应用。本发明具体如下有益效果：本发明所述的从传统补血调经中药复方中提取天然黄体酮的方法，通过先分别取当归、白芍、川芎和熟地，切成小块混匀后，放入植物油，浸泡一定时间后过滤，得到含天然黄体酮的中药提取液(四物汤药材油浸物)。上述中药配方中，熟地腻润、白芍质柔、当归甘温、川芎温通，四物相配，动静相伍，补中有通，温而不燥，从而本发明方法实现从由熟地、当归、白芍、川芎组成的传统补血调经中药复方中，提取得到天然黄体酮成分，能有效提高血清的孕激素含量，且无明显的副作用。数据显示，本发明方法制得所述含天然黄体酮的中药提取液(四物汤药材油浸物)中，天然黄体酮的浓度为0.092mg/kg。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是孕酮标准曲线；图2是雌激素标准曲线；图3是实施例1不同剂量中药提取液(四物汤药材油浸物)对雌性小鼠血清孕酮的影响；图4是实施例1不同剂量中药提取液(四物汤药材油浸物)对雌性小鼠血清雌激素的影响；图5是实施例1所述中药提取液(四物汤药材油浸物)的送检报告。具体实施方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施病例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。实施例1本实施例提供一种从传统补血调经中药复方中提取天然黄体酮的方法，包括如下步骤：(1)按照重量配比1：3：9：4分别取当归、白芍、川芎和熟地，切成小块，备用：(2)将切成小块的各中药混合，加入橄榄油，所述中药总质量占橄榄油的质量分数为5％，浸泡处理3个月；(3)浸泡完成后，过滤，滤液即为含天然黄体酮的中药提取液(四物汤药材油浸物)。实施例2本实施例与实施例1的区别仅在于，步骤(1)中，当归、白芍、川芎和熟地的重量配比不同，本实施例中当归、白芍、川芎和熟地的重量配比为0.5：1：1：0.5。实施例3本实施例与实施例1的区别仅在于，步骤(1)中，当归、白芍、川芎和熟地的重量配比不同，本实施例中当归、白芍、川芎和熟地的重量配比为3：4：11：5。实施例4本实施例与实施例1的区别仅在于，步骤(2)中，采用葵花籽油替代橄榄油，所述中药总质量占植物油的质量分数为1％，浸泡时间为12个月，其他操作步骤和条件均与实施例1相同。实施例5本实施例与实施例1的区别仅在于，步骤(2)中，采用芝麻油替代橄榄油，所述中药总质量占植物油的质量分数为45％，浸泡时间为1个月，其他操作步骤和条件均与实施例1相同。实施例6本实施例与实施例1的区别仅在于，步骤(2)中，采用花生油替代橄榄油，其他操作步骤和条件均与实施例1相同。实施例6本实施例与实施例1的区别仅在于，步骤(2)中，采用亚麻籽油替代橄榄油，其他操作步骤和条件均与实施例1相同。对比例本对比例与实施例1的区别仅在于，步骤(2)中，将切成小块的各中药混合后，加入水进行煎煮，过滤后，得到煎煮液即为中药提取液。经检测，水煎法所得提取液具有雌激素样活性，对雌激素相关的疾病有一定的影响，而实施例1采用植物油浸泡制备的提取液(四物汤药材油浸物)无雌激素样作用，而具有孕激素样作用。实验例1实验材料1.1仪器小鼠代谢笼(上海玉研科学仪器有限公司)；手术器械(灌胃针、手术刀、镊子、眼科剪)；电子天平(深圳市衡之杰电子有限公司)；离心机(盐城安信实验仪器有限公司)；微量移液枪(北京索莱科技有限公司)；通用酶标仪(bio-tek公司)；欧诺摇床(天津欧诺仪器仪表有限公司)。1.2药物与试剂当归、白芍、川芎、熟地(东莞国药红棉分店)；葡萄籽维e软胶囊(批号；国食健字g20100617，青岛世纪利康商贸有限公司)；雌激素e试剂盒(上海通蔚实业有限公司)；孕酮p试剂盒(上海通蔚实业有限公司)。1.3动物雌性昆明小白鼠，体重范围在18-22g，是由广州市花都区花东信华实验动物养殖场供给，且通过广东省实验动物检测所的质量检测，生产许可证号是scxk(粤)2019-0023。2实验方法2.1雌性小鼠分组、给药取雌性小鼠50只，随机分成5组，空白组，葡萄籽维e软胶囊组，四物汤药材油浸物(实施例1所得含天然黄体酮的中药提取液)低、中、高剂量组，给药量按生药量折算，称重每只实验小鼠，根据体重逐只给药，不间断给药7天，空白组灌胃生理盐水：0.4ml/(只·次)；葡萄籽维e软胶囊组：0.38g/(kg·d)；四物汤药材油浸物低剂量组：2g/(kg·d)；四物汤药材油浸物中剂量组：4g/(kg·d)；四物汤药材油浸物高剂量组：8g/(kg·d)。2.2小鼠血清中孕酮p、雌激素e含量检测各组小鼠断头采血后，将得到的血液静置2个小时，然后在离心机上离心。按照小鼠孕酮(prog)、雌激素(e)酶联免疫分析试剂盒使用说明书操作，来检测小鼠血清中孕酮p、雌激素e的水平，具体有以下10个步骤：①标准品的稀释和加样：按照使用说明书中的方法稀释原始标准品得到5个不同浓度的标准品，各50μl分别加入到设置好的标准品孔中。②加样：酶标板孔上划分空白孔和待测样品孔，先将40μl样品稀释液加入到待测样品孔中，然后再加待测样品10μl，最终样品稀释了5倍，空白孔不做处理。加入待测样品时尽可能不要将移液枪触及酶标孔壁，应加到孔的底部然后轻轻摇荡均匀。③加酶：用微量移液枪加酶标试剂100μl到各标准品孔、待测样品孔，空白孔不做处理。④温育：用封板膜将各孔封板，然后在37℃温育1小时。⑤配液：用20倍的蒸馏水稀释浓缩洗涤液后备用。⑥洗涤：谨慎的揭开封板膜，甩干酶标孔里的液体后再加满洗涤液，静置半分钟后弃去，重复该步骤5次，拍干。⑦显色：每孔用微量移液枪先加显色剂a50μl，后加显色剂b50μl，轻轻震动使其混匀。⑧终止：每孔用微量移液枪加终止液50μl，使反应终止。⑨测定：加入终止液后的15分钟内，以空白孔调零，在450nm波长下测量各酶标孔的吸光度(od)值。⑩计算：以标准品的浓度为横坐标，吸光度(od)值为纵坐标，绘制标准曲线得到回归方程式，将样品的od值代入方程算出相应浓度再乘于稀释倍数就可以得到样品的实际浓度，孕酮标准曲线和雌激素标准曲线分别如图1和图2所示。2.3子宫指数测定小鼠断头后，用手术器械解剖小鼠腹腔并取出子宫，分离其周围的脂肪组织，然后立即用电子天平称重子宫的重量，按照公式：子宫指数＝子宫重量(mg)/100g体重来记录数据2.4统计学方法应用spss23.0统计软件对所得的数据分析，计量资料采取均数±标准差(x±s)表示，组间比较用t检验，p<0.05为差异具有统计学意义。3结果3.1对小鼠血清孕酮p、雌激素e水平的影响不同样品对小鼠血清孕酮p、雌激素e水平的影响如表1、表2所示。表1四物汤药材油浸物对雌性小鼠血清孕酮的影响组别剂量/g/kgp/nmol/l空白组——2.2612±1.5362葡萄籽维e软胶囊组0.382.5056±1.2428四物汤药材油浸物低剂量组27.1504±4.8829**四物汤药材油浸物中剂量组46.0168±2.5991**四物汤药材油浸物高剂量组84.9719±2.4646*注：与空白组比较，*p<0.05，**p<0.01从表1可以看出，与空白组比较，四物汤药材油浸物低、中、高剂量组都能一定程度升高雌性小鼠血清孕酮p含量，且差异有统计学意义(p<0.05)，升高孕酮p含量的效应为四物汤药材油浸物低剂量组>四物汤药材油浸物中剂量组>四物汤药材油浸物高剂量组；葡萄籽维e软胶囊也升高了小鼠血清孕酮p含量，但差异无统计学意义(p＞0.05)。如图3所示为四物汤药材油浸物低、中、高剂量组对雌性小鼠孕酮的影响，具体如下：**p<0.01，四物汤药材油浸物高剂量组与空白组相比；***p<0.001，四物汤药材油浸物中剂量组与空白组相比；***p<0.001，四物汤药材油浸物低剂量组与空白组相比。表2四物汤药材油浸物对雌性小鼠血清雌激素的影响组别剂量/g/kge/pmol/l空白组——0.6536±0.3603葡萄籽维e软胶囊组0.381.3464±0.2967**四物汤药材油浸物低剂量组20.5835±0.3431四物汤药材油浸物中剂量组40.4677±0.2801四物汤药材油浸物高剂量组80.4681±0.2731注：与空白组比较，*p<0.05，**p<0.01。从表2可以看出，与空白组比较，葡萄籽维e软胶囊能升高小鼠血清雌激素e含量，且差异有统计学意义(p<0.01)，四物汤药材油浸物低、中、高剂量组使小鼠血清雌激素e含量降低，但差异无统计学意义(p＞0.05)，如图4所示。综上所述，四物汤药材油浸物能提高小鼠血清孕酮p含量，且与其剂量有关，四物汤药材油浸物低剂量组的效应最好。3.2对小鼠子宫指数的影响不同样品对小鼠子宫重量及脏器指数的影响如表3所示。表3小鼠子宫重量及脏器指数的比较注：与空白组比较，*p<0.05，**p<0.01从表3可以看出，四物汤药材油浸物低、中剂量组与空白组比较，子宫重量、指数有略微的增加，但差异均无统计学意义；四物汤药材油浸物高剂量组、葡萄籽维e软胶囊组的子宫重量有所减少，子宫重量的变化与小鼠体内雌激素、孕酮的含量有关，这是由于具有雌激素活性的物质可使子宫的诱导蛋白含量增加而使子宫增重，孕酮可增加子宫腔上皮细胞的体积导致子宫增重，因此实验所得小鼠子宫湿重是雌激素、孕酮两者综合作用的结果。4.天然黄体酮含量的检测对实施例1所述四物汤药材油浸物中的11项孕激素类进行筛查，结果如表3所示。广东省测试分析研究所出具的送检报告如图5所示。表4-11项孕激素类检测结果从表4和图5可以看出，实施例1四物汤药材油浸物中含有天然黄体酮，也称孕酮，浓度为0.092mg/kg。以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。当前第1页12