一种基于重组粉尘螨Derf2蛋白的鼻腔激发试剂

一种基于重组粉尘螨der f2蛋白的鼻腔激发试剂
技术领域
1.本发明涉及一种基于重组粉尘螨der f2蛋白的鼻腔激发试剂，属于生物医药技术领域。


背景技术：

2.变应性鼻炎是发病逐年升高的常见疾病，明确诊断需要通过变应原鼻腔激发，鼻腔黏膜激发试验(nasal provocation testing,npt)是目前国际公认的诊断变应性鼻炎变应原的“金标准”,并广泛应用于评估治疗药物的有效性以及鼻对变应原刺激引发的病理生理学机制研究。尘螨是中国南方常见呼吸道变应原。该变应原目前没有标准化的鼻腔激发试剂。所以，本技术领域亟需获得一种类尘螨的呼吸道变应原用于变应原鼻腔激发试验。


技术实现要素：

3.本发明的目的是为解决如何获得一种类尘螨的呼吸道变应原用于变应原鼻腔激发试验的技术问题。
4.为达到解决上述问题的目的，本发明所采取的技术方案是提供一种基于重组粉尘螨der f2蛋白在制备变应原鼻腔激发试剂中的应用。
5.本发明提供一种基于重组粉尘螨der f2蛋白在制备诊断变应性鼻炎的诊断试剂中的应用。
6.优选地，所述试剂包括喷雾剂、滴剂或注射剂。
7.相比现有技术，本发明具有如下有益效果：
8.本发明通过提供重组尘螨蛋白的关键变应原性肽段，证实其能引起体内肥大细胞脱颗粒。将该蛋白应用于鼻腔激发实验，以检查鼻黏膜是否存在相应的ige，可以明确诊断。重组蛋白可以制成标准浓度，达到浓度梯度的要求，保证鼻腔激发试验的安全和准确性。从而获得一种类尘螨的呼吸道变应原应用于变应原鼻腔激发试验。
附图说明
9.图1为纯化的der f2蛋白凝胶电泳图谱。
10.图2为der f2特异性ige标准曲线。
11.图3为动物实验致敏和激发的流程图。
12.图4为造模鼠的鼻黏膜上皮观察照片中嗜酸粒细胞浸润情况。
13.其中a图为对照豚鼠鼻粘膜苏木精
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伊红染色切片的光显微照片；b图为实验豚鼠鼻粘膜苏木精
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伊红染色切片的光显微照片；c图为对照豚鼠肺组织苏木精
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伊红染色切片的光显微照片；d图为实验豚鼠肺组织苏木精
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伊红染色切片的光显微照片；
具体实施方式
14.为使本发明更明显易懂，兹以优选实施例，并配合附图作详细说明如下：
15.本发明提供一种基于重组粉尘螨der f2蛋白在制备变应原鼻腔激发试剂中的应用。
16.本发明提供一种基于重组粉尘螨der f2蛋白在制备诊断变应性鼻炎的诊断试剂中的应用。试剂包括喷雾剂、滴剂或注射剂。
17.实施例
18.1.材料与方法
19.1.1.材料
20.1.1.1.粉尘螨过敏患者血清26例变应性鼻炎患者接受常见变应原皮肤点刺试验，其中粉尘螨点刺反应阳性患者24例，粉尘螨反应阴性患者2例。抽取5mll静脉血，分离血清，
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80℃保存。der f2特异性ige阳性血清盘(panel)来自于美国plasmalab international和greer laboratories,inc.公司。
21.1.1.2.临床点刺试验材料：粉尘螨变应原点刺液、点刺针为allergopharma产品。
22.1.1.3.bca蛋白质定量试剂盒购自pierce公司。
23.1.1.4.粉尘螨蛋白原核表达纯化的野生型der f2。
24.1.1.5.elisa试剂及材料包被试剂：0.05m碳酸盐缓冲液(ph9.0)。洗涤液：1pbs，加入tween
‑
20至0.02％浓度。封闭液：以洗涤液配制成含3％bsa的溶液。hrp标记的抗人ige抗体、tmb底物溶液和2n h2so4终止液购自kpl公司。96孔酶标板购自nunc公司。其它试剂和商品均为进口分装或国产分析纯。酶标仪为bio
‑
tek公司产品。
25.1.2.实验方法
26.1.2.1.der f2原核表达及纯化
27.依据粉尘螨变应原蛋白质第二组分序列设计引物。上下游引物序列分别加入ecor i和bamhⅰ位点，以利于与pbv220载体连接。以粉尘螨变应原蛋白质第二组分cdna为模板，以pcr方法扩增编码序列。pcr产物经琼脂糖凝胶电泳后，切取特异性pcr条带所在的胶条，按照胶回收试剂盒提取pcr产物。将胶回收的pcr产物与t载体连接。连接产物转化dh5α感受态细胞，通过蓝白斑筛选，挑取白色菌落摇菌，质粒小抽，以ecori+bamh i双酶切重组t载体，将der f2dna片段与pbv220质粒连接。连接产物转化dh5α，转化菌送检测序。用重组质粒转化bl21菌诱导表达。
28.工程菌母液按1％体积比接种于2yt培养液中，培养至od600＝0.8，再诱导培养6h。菌体沉淀重悬于50ml细菌裂解液中；超声破菌后，4℃12000rpm离心30min，弃上清液。包涵体沉淀洗涤后，以变性液溶解包涵体沉淀。采用amersham fplc系统，在线对der f2进行纯化、复性。a280检测收集蛋白峰，每管1ml。经tricine
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sds
‑
page银染后观察，合并der f2蛋白峰。
29.der f2蛋白洗脱溶液转移至amicon ultra
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15超滤管，5000rpm 4℃离心30min；以12ml超滤置换液置换4次。最后浓缩至1ml，经bca蛋白质定量后，
‑
80℃分装保存。
30.1.2.2.皮肤点刺试验
31.按照allergopharma试剂盒说明书操作规范，在每例患者前臂点刺常见变应原，同时点刺组胺和0.9％氯化钠溶液，分别作为阳性对照和阴性对照。点刺后20min观察反应，以皮丘直径大于组胺点刺皮丘直径判定为阳性。
32.1.2.3.elisa包被蛋白质以包被液稀释成60ng.ml
‑
1的浓度，每孔加入100μl，4℃
包被过夜。以洗涤液洗涤3次，每次5min。封闭：每孔加300μl封闭液，4℃封闭过夜。反应：每孔加入100μl血清或5倍稀释的血清，37℃反应2h。以洗涤液洗涤4次，每次5min。hrp标记的抗抗体反应：每孔加入100μl1:3000稀释的hrp
‑
anti
‑
human ige，37℃反应2hr。以洗涤液洗涤4次，每次5min。底物呈色：每孔加入100μl底物液，37℃反应15min后，加入100μl终止液。读数：以570nm和450nm波长读取od570
‑
od450值。
33.1.2.4致敏和激发实验：
34.在第1天和第8天向豚鼠腹腔内注射200μg wt der f 2蛋白质和2.5mg氢氧化铝凝胶(al(oh)3凝胶)，总体积为0.5ml。向对照豚鼠腹腔内注射生理盐水(n.s.)和2.5mg al(oh)3凝胶，总体积为0.5ml。第15天，激发后30分钟注射部位的皮肤反应证实成功致敏。没有明显红斑和水肿反应的动物被排除在实验组之外。
35.将致敏豚鼠置于透明的亚克力室中，并在第16天和第23天通过暴露于由超声波雾化器产生的wt
‑
derf2气雾剂(4ml 1mg/ml生理盐水)30分钟进行激发。气雾剂通过空气泵(300ml/min)输送到室内。对照组豚鼠用生理盐水雾化吸入。
36.在第19、26和30天，通过双侧鼻腔滴注(ii)wt der f 2 20μl(每个鼻孔吸附在浓度为20μg蛋白质/0.5mg al(oh)3凝胶的al(oh)3凝胶上)对豚鼠进行强烈激发[12]。为了防止通过睫状体运动迅速消除抗原，在每次致敏之前，通过吸入4％盐酸利多卡因溶液的混合物2分钟来麻醉鼻粘膜表面。对照组用生理盐水加氢氧化铝凝胶滴鼻。致敏和激发的流程图如图3所示。
[0037]
2.结果
[0038]
2.1.pbv220
‑
wt der f2重组质粒的构建
[0039]
将wt der f2和mu der f2分别插入载体pbv220，构建成pbv220
‑
wt der f2和pbv220
‑
mu der f2重组质粒。以ecor i和bamhⅰ酶切产生与der f2基因大小一致的片段。过dna测序验证，结果表明dna序列与ncbi的序列一致。
[0040]
2.2.粉尘螨der f2重组蛋白的表达纯化
[0041]
wt der f2蛋白在42℃诱导条件下形成了包涵体。菌体经超声破碎后，充分洗涤包涵体以除去可溶性蛋白以及膜蛋白。将包涵体溶于变性液中，进行sephacryl s
‑
100hr柱层析分离及复性，通过分子筛除去包涵体中的杂蛋白，同时wt der f2蛋白通过填料介质的不断吸附
‑
解离而正确折叠，从而得到复性的wt der f2蛋白。
[0042]
2.3.检测方法的线性范围和灵敏度
[0043]
用plasmalab粉尘螨derf2变应原特异性ige标准血清(1.66iu.ml
‑1‑‑
100iu.ml
‑
1)，获得标准曲线(图2)。对测得的od值和der f2特异性ige浓度作回归分析,回归系数r2值为0.996 5。按照elisa灵敏度计算方法，对0iu.ml
‑
1标准液进行10次测试，求得零剂量点光密度均值(x)和标准差(s)，将x+2s值插值运算，得到灵敏度值为0.73iu.ml
‑1。
[0044]
2.4检测方法的重复性
‑
批内、批间cv％
[0045]
用低值(4iu.ml
‑1)，中值(12iu.ml
‑1)和高值血清(22iu.ml
‑1)进行批内、批间重复性实验。各进行10次批内、批间实验，变异系数cv值如表1所示。
[0046]
表1粉尘螨变应原der f2特异性ige elisa检测方法的重复性
[0047][0048]
2.5临床血清样品的检测
[0049]
在26例变应性鼻炎患者中24例粉尘螨点刺反应呈现阳性，2例的点刺反应阴性。以野生型der f2为包被材料的elisa试剂盒，分析24例点刺反应阳性的患者血清中der f2特异性ige的浓度，按照国际sige分级标准分为阳性和阴性。结果有22例阳性，阳性率为91.7％(表2)。
[0050]
表2皮肤点刺试验和der f2特异性ige elisa检测方法的比较
[0051][0052]
2.6豚鼠实验鼻症状评估：
[0053]
在第19天和第26天，由两名对实验组不知情的观察者独立评估鼻症状。在10分钟适应后，观察豚鼠超过10分钟的喷嚏、鼻摩擦和鼻漏事件频率。每种症状的评分标准为0
‑
3分(表3)。当得分超过5分时，认为变应性鼻炎模型成功。
[0054][0055][0056]
2.7检测鼻粘膜和肺组织中的嗜酸性粒细胞：
[0057]
如图4所示，对照豚鼠(a图，c图)或实验豚鼠(b图，d图)鼻粘膜(a图，b图)或肺组织
(c图，d图)苏木精
‑
伊红染色切片的光显微照片。
[0058]
最后一次鼻内刺激后2h处死豚鼠。取鼻和肺组织，用福尔马林缓冲液缓慢充气固定，然后石蜡包埋。组织切片(2
‑
4μm厚)用苏木精和伊红溶液染色。在随机切片上进行组织病理学评估，以检测鼻粘膜和肺组织中的嗜酸性粒细胞(放大
×
400)浸润情况。实验结果表明：变应性鼻炎模型成功。
[0059]
以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。