一种贝伐珠单抗多模态分子探针的制备方法和应用与流程

1.本发明属于分子探针技术领域，具体涉及一种贝伐珠单抗多模态分子探针、其制备方法和应用。


背景技术：

2.目前，在临床上对肿瘤进行精准的定位定量治疗仍是个难题。不断提高肿瘤的诊断与监测水平，对提高肿瘤患者的疗效，改善预后和生存质量具有重要意义。
3.分子影像技术是随着医学影像技术和分子生物学、材料科学、化学、生物工程学等的发展和融合形成的新的研究领域，是应用影像学手段研究人体的内在运作情况，在活体组织、细胞及分子水平使体内复杂的生化过程可视化，从而对其生物学行为进行定性和定量研究，为疾病诊断、药物设计、治疗评估、监测功能分子在体活动规律等提供了新技术。分子影像主要成像方法包括5类：
①
光学成像：包括生物发光成像、荧光成像(fluorescence imaging，fi)、光声成像(photoacoustic imaging，pai)和光学层析成像；
②
放射性核素成像：包括单光子发射型计算机断层成像(spect)和正电子发射型计算机断层显像(pet)；
③
ct；
④
mri；
⑤
超声(us)。单一的显像方法往往存在局限性，难以同时满足对灵敏度、特异性、靶向性等的要求。
4.放射性核素成像主要包括正电子发射型计算机断层显像(positron emission computed tomography，pet)和单光子发射计算机断层成像术(single-photon emission computed tomography，spect)，具有敏感性高、可进行定量分析、联合治疗、不受深度限制，可全身成像，能在分子水平评估活体内生化改变等优势。尽管大量的临床和临床前研究证实了使用放射性核素分子成像在探测肿瘤、预测治疗反应等的可行性，但较低的空间分辨率，缺乏解剖结构信息使其需要结合ct、mri等其它成像手段以在临床应用中发挥更大的作用。放射安全性和需要产生放射性核素的加速器也限制了放射性核素成像使用。光学成像主要包括生物发光(bioluminescence imaging，bli)和荧光成像(fluorescence imaging，fi)两种技术。前者利用荧光素酶基因(如fluc，rluc，gluc)标记细胞或dna，其表达产物与萤火虫素类底物反应产生荧光。后者包括多种荧光蛋白基因(如gfp，rfp，yfp等)、有机荧光染料、荧光上转换纳米粒子、量子点等的应用。通过光学分子成像技术，可以直接检测活体内代谢动态过程、探测蛋白质及蛋白酶的活动、基因行为等，在活体肿瘤的发生发展及转移及特定分子及基因表达的监测中具有重要价值。但荧光分子的不稳定性及潜在的毒性、光在体内散射及探测深度表浅等限制了光学成像在体内的应用。
5.多模态分子影像技术在体内同时导入具有多种显像功能的分子探针，然后通过多种成像技术的检测，获取病变部位的多种信息。它融合了不同影像技术的优势，能够无创、在体、实时、精细、特异性地显示体内复杂的生化过程，提供更加全面和精确的信息。多模态分子影像技术在肿瘤的早期诊断、个性化检测、特定细胞群及功能分子的监测、基因及靶向药物跟踪、预后判断、疗效评价等方面具有广阔的应用前景。近年来，由于大量联合光学成像的多模态分子探针被开发出来，因此光学和其它影像学技术融合的双模态及更多模态的
成像方式得到了迅速发展。目前已经成功开发了多种基于或bli和ct、mri、pet等传统影像融合的多模态成像系统。临床前研究证明，fi与pet或ct的多模态融合影像对肿瘤定位和定量化研究具有重要价值。目前，基于荧光和放射性核素多模态成像探针的开发仍处于起步阶段，无产品进入临床研究阶段。此类产品的开发需要解决诸如安全性、靶向性、灵敏度、特异性以及从实验室研究到临床转化的可行性问题。
6.《贝伐珠单抗在肿瘤治疗中的应用研究进展》(药学进展，2015年第39卷第7期第525-532页)中提到，肿瘤血管系统的形成和生长依赖于血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，vegf)。贝伐珠单抗是一种重组人源化免疫球蛋白g1(igg1)单克隆抗体，可特异性靶向结合vegfa，抑制其与vegf受体-2(vegfr-2)结合，从而抑制vegf的生物学作用，达到抑制肿瘤血管生成、生长以及转移的效果。
7.基于以上，本发明构建一种基于贝伐珠单抗的多模态分子探针，对多种肿瘤具有靶向性，可在放射性核素和/或光学两种模态进行活体成像。


技术实现要素：

8.为了克服上述单一显像方法存在的局限性，满足对安全性、灵敏度、特异性和靶向性的要求，本发明旨在以精准诊断为导向，利用贝伐珠单抗的靶向特性，设计并合成一种能够在活体原位靶向成像的贝伐珠单抗多模态分子探针。
9.本发明的一个目的在于提供所述分子探针的制备方法。
10.本发明的另一个目的在于提供一种分子探针组合物。
11.本发明的另一个目的在于提供多模态分子探针在制备肿瘤诊断试剂中的应用。
12.一方面，本发明提供了一种贝伐珠单抗多模态探针，具有如下结构：
[0013][0014]
其中b为贝伐珠单抗；
[0015]
t选自如下结构：
[0016][0017]
n为1-8中的一个整数；
[0018]
l1、l2和l3分别各自独立的选自包含如下基团的组：
[0019]
直链或支链c
1-c
20
饱和或不饱和烷基、c
1-c
20
饱和或不饱和环烷基、直链或支链c
1-c
20
饱和或不饱和烷氧基、直链或支链c
1-c
20
饱和或不饱和酰胺基、直链或支链c
1-c
20
饱和或不饱和羰基、直链或支链c
1-c
20
饱和或不饱和羧基、直链或支链c
1-c
20
烯基、直链或支链c
1-c
20
炔基、氧基、硫基、双硫基、亚胺基、氨基酸残基；
[0020]
其中r1、r2分别各自独立的选自金属离子络合基团、荧光基团或peg基团。
[0021]
优选地，l1、l2和l3分别各自独立的选自包含如下基团的组：
[0022]-ch
2-、-ch2ch2o-、-c(＝o)-、-c(＝o)o-、-c(＝o)nh
2-、-s-s-、-o-、-s-、-nh-、-nh-c(sc)-c(＝o)-、-hc＝ch-和-hc≡ch-，其中sc为20种天然氨基酸的残基；这些基团在l1、l2、l3中是重复或不重复的。
[0023]
优选地，l1、l2和l3还具有如下单元中的一种或几种：
[0024][0025]
其中r4选自氢基、取代或未取代的c
1-c
20
饱和或不饱和烷基、取代或未取代的c
6-c
20
芳基、取代或未取代的c
6-c
20
杂芳基、取代或未取代的c
6-c
20
稠环基、取代或未取代的c
6-c
20
稠杂环基。
[0026]
优选地，所述金属离子络合基团选自如下结构：
[0027][0028]
其中，
●
代表放射性核素，选自
68
ga、
64
cu、
89
zr、
177
lu或
99m
tc；
[0029]
优选地，所述荧光基团选自如下结构：
[0030][0031]
优选地，peg基团的结构如下：
[0032][0033]
r3为-h或-ch3，m为1-100中的一个整数。
[0034]
优选地，贝伐珠单抗双模态分子探针具有如下结构：
[0035][0036]
另一方面，本发明还提供了一种制备如上所述贝伐珠单抗多模态分子探针的方法，其包括如下步骤：
[0037][0038]
(1)贝伐珠单抗b与异型双功能交联剂a-x发生反应生成中间产物3；
[0039]
(2)中间产物3进一步与负载衍生物2反应得到如上所述的贝伐珠单抗多模态分子探针，
[0040]
即终产物4；其中，
[0041]
l1、l2、l3、r1、r2、t的结构如上述限定结构；步骤(2)中所述负载衍生物r
1-l
2-y-l
3-r2中y具有以下结构中的一种：
[0042][0043]
其中，d选自如下结构：
[0044][0045]
优选地，步骤(1)所述异型双功能交联剂a-x选自如下结构：
[0046][0047]
作为优选实施例，步骤(2)中所述负载衍生物r
1-l
2-y-l
3-r2具有以下结构中的一种：
[0048][0049]
优选地，步骤(1)所述贝伐珠单抗上的氨基酸残基活性反应基团上的cooh或nh2与异型双功能交联剂a-x反应，其中所述氨基酸残基包括glu、asp、cys、lys或gln。
[0050]
再一方面，本发明还提供了一种组合物。
[0051]
所述的组合物中包括包括如上所述贝伐珠单抗多模态分子探针。
[0052]
所述的组合物中还包括其他药学上可接受的载体。
[0053]
又一方面，本发明提供了前述的贝伐珠单抗多模态分子探针和/或其制备方法和/或其组合物在制备多模态成像剂方面的应用。
[0054]
又一方面，本发明提供了一种多模态成像剂。
[0055]
所述的多模态成像剂利用前述的贝伐珠单抗多模态分子探针和/或其制备方法和/或其组合物进行制备。
[0056]
又一方面，本发明提供了前述的贝伐珠单抗多模态分子探针和/或其制备方法和/或其组合物和/或多模态成像剂在制备用于肿瘤诊断药物中的应用。
[0057]
所述的肿瘤包括但不限于所有过表达血管内皮生长因子vegf-a的肿瘤。
[0058]
所述的肿瘤包括但不限于乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、食管癌、胰腺癌、肝门胆管癌等。
[0059]
本发明与现有技术相比，具有如下的有益效果：
[0060]
(1)本发明提供的贝伐珠单抗多模态分子探针，利用探针对vegf-a的特异性，使探针在肿瘤部位选择性富集，通过放射性和/或光学活体成像技术，实现肿瘤的精准定位和诊断，有望为肿瘤的诊断提供新的药物和方法，具有重要的研究价值和应用价值。
[0061]
(2)本发明提供的贝伐珠单抗多模态分子探针可以提高肿瘤成像的灵敏度和成像速度，具有灵敏度高、特异性和靶向性强的特点。
[0062]
(3)根据本发明所述方法制备得到的贝伐珠单抗多模态探针，对多种肿瘤具有靶向性，包括乳腺癌、结直肠癌、卵巢癌、食管癌、胰腺癌、肝门胆管癌等，可同时或分别在光学和放射性两种模态下成像。
附图说明
[0063]
图1为skov3卵巢癌细胞系皮下瘤小鼠模型在注射贝伐珠双抗多模态探针后spect-ct核医学成像图。
[0064]
图2为skov3卵巢癌细胞系皮下瘤小鼠模型在注射贝伐珠双抗多模态探针后的活体荧光成像图。
具体实施方式
[0065]
通过以下实施例进一步例示本发明，但所述实施例不是对本发明的限制。
[0066]
下述实施例中所用的材料、试剂等，若无特殊说明，均可从商业途径获得；若未特别指明，实施例均按照常规实验条件或按照制造厂商说明书建议条件。
[0067]
实施例1
[0068]
贝伐珠单抗与一种异型双功能交联剂dbco-nhs(结构如式ⅰ所示)偶联合成中间产物a(此处字母a与前述a-x中的a无结构上的一致性，仅代表此实施例中由贝伐珠单抗与一种异型双功能交联剂发生偶联反应合成的中间产物)：
[0069][0070]
避光条件下，将20mg贝伐珠单抗溶于生理盐水中配制成800μl贝伐珠单抗溶液，加入1.2ml 1.0m ph8.5的pbs混匀制成贝伐珠单抗缓冲液；将4当量的dbco nhs溶解在10μl的dmso中，加入到贝伐珠单抗缓冲液中，在20℃温水浴2h，中间震荡数次。反应结束后，使用去盐柱(pierce zebra，5ml)，以0.01m的pbs作为流动相，1200rpm离心4次；收集过滤液，冻干得到18mg中间产物a。
[0071]
实施例2
[0072]
合成中间体化合物b：
[0073][0074]
将25mg，0.15mmol的化合物b-1和37.3mg，0.15mmol的化合物b-2溶解于1ml dmf中，加入31mg，0.225mmol的k2co3，在加热60度反应8小时，加热1ml水冷却，用高效液相色谱法纯化，冷冻干燥得到25mg化合物b(收率：44％)。
[0075]
实施例3
[0076]
合成中间体化合物c：
[0077][0078]
将20mg，0.053mmol的化合物b和15.4mg，0.106mmol的化合物c-1溶解于0.5ml dmf中，加入14.6mg，0.106mmol的k2co3，在加热60度反应8小时，加热0.5ml水冷却，用高效液相色谱法纯化，冷冻干燥得到20mg化合物c(收率：77.58％)。
[0079]
实施例4
[0080]
合成中间体化合物d：
[0081][0082]
4.3mg(8.80mmol)化合物c溶于丙酮中，并添加4.2mg(22.0
×
10-3
mmol)4-甲基苯磺酸一水合物。将反应物在45℃下搅拌过夜，减压去除挥发性物质。在残渣加入0.2ml dmf，再加入溶有6.77mg(12.9mmol)化合物d-1的三乙胺(7.3mg，72.0
×
10-3
mmol)。反应混合物用1ml水稀释，振荡2小时后用高效液相色谱法纯化，冷冻干燥后得5mg化合物d。
[0083]
实施例5
[0084]
合成中间体化合物e：
[0085][0086]
将5mg，5.7
×
10-3
mmol的化合物d溶解三氟乙酸的二氯甲烷溶液(tfa/ch2cl2＝1:3，0.2ml)中，在室温下反应45min，减压去除挥发性物质，加入0.5ml pbs(ph＝8.4)缓冲液，0.1ml已溶解ir dye 800cw nhs(e-1)(6.6mg)的pbs(ph＝8.4)缓冲液，室温下反应60min用高效液相色谱法纯化，冷冻干燥得到6mg化合物e。
[0087]
实施例6
[0088]
合成中间体化合物f：
[0089][0090]
将实施例1中得到的9mg的中间产物a溶解制成0.7ml水溶液，取0.2mg的化合物e溶解于20μl的dmso，混合均匀，震荡30秒，在室温下反应45分钟。反应结束后，使用去盐柱(pierce zebra，5ml)，以0.01m的pbs作为流动相，1200rpm离心3次。收集过滤液，冻干得到7mg的化合物f。
[0091]
实施例7
[0092]
合成一种多模态探针：
[0093][0094]
取20μl溶度为1mg/ml化合物f水溶液，依次加入15μl新鲜配制的snc12的hc1(0.1mol/l)水溶液，2mci 99
tcmo
4-溶液，室温保温15min。反应结束后粗产品通过pd-10柱和0.1mol/l pbs溶液(ph＝6.4)纯化，分管收集洗脱获得一种多模态探针。
[0095]
实施例8
[0096]
构建skov3卵巢癌细胞系皮下瘤小鼠模型，注射5mg/kg剂量的实施例7所得到贝伐珠双抗多模态分子探针后，使用小动物近红外成像系统(ivis lumina ii)扫描拍摄并分析(ex.740nm和em.820nm)。在成像过程中，一直通3％的异氟烷来通过鼻锥系统麻醉小鼠。并使用microspect-ct在2h、4h、8h、1d时间点扫描，ct成像参数为球管电流(615μa)、球管电压(55kv)、精确扫描模式、全方位扫描模式，扫描时间为12分钟。spect扫描时间为15min老鼠在异氟烷和氧气比为1.5％，流速为0.6l/min的混合气体中麻醉。microspect-ct和近红外成像图片均显示，探针在注射后2h在肿瘤部位开始出现富集，随着时间推移，1d后肿瘤部位信号增强，而周围正常组织信号则减弱，表明探针可特异性结合至skov3卵巢癌肿瘤。结果表明，贝伐珠单抗双模态分子探针对skov3卵巢癌具有良好的靶向性，在肿瘤癌细胞处选择性富集，实现了对肿瘤的精准定位，结果如图1和图2所示。
[0097]
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
[0098]
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
[0099]
以上详细描述了本发明的实施方式，但是本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，不能因此理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些均属于本发明的保护范围。